Sirt6的調(diào)節(jié)物及其篩選分析的制作方法
【專利說明】SIRT6的調(diào)節(jié)物及其篩選分析
[0001 ] 本申請(qǐng)是申請(qǐng)?zhí)枮?01180068116.3、申請(qǐng)日為2011年12月21日、發(fā)明名稱為 "SIRT6的調(diào)節(jié)物及其篩選分析"的中國發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)為國際申請(qǐng)?zhí)枮?PCT/US2011/066480的國家階段申請(qǐng)，該國際申請(qǐng)要求申請(qǐng)日為2010年12月22日，申請(qǐng)?zhí)枮?61 /426，231的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)。 關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究的聲明
[0002] 本申請(qǐng)是在美國國立衛(wèi)生研究院提供的合同號(hào)為GM086703的政府資助下進(jìn)行。政 府對(duì)本申請(qǐng)享有一定權(quán)利。 發(fā)明背景
[0003] 去乙酷化酶（SirtUin)是一類稱為煙酷胺腺嚷嶺二核巧酸(NAD)依賴性去乙酷基 酶的酶。人類有屯種Sbtuin, Sbtl-7,其調(diào)控多種生物學(xué)過程，包括衰老、轉(zhuǎn)錄和代謝。因 此，能夠調(diào)節(jié)Sbtuin活性的小分子可W用于治療若干人類疾病。
[0004] 在運(yùn)屯種人類Sbtuin中，Sirte特別重要，因?yàn)槠渥饔脼檎{(diào)控代謝和基因組的穩(wěn) 定性。Sirte的生物學(xué)功能使其有望成為治療脂肪肝疾病、肥胖癥和糖尿病的祀點(diǎn)。因而，能 夠活化、抑制或W其他方式調(diào)節(jié)Sbte的小分子將在治療此類疾病和狀況中非常有益。
[0005] 追疾寄生蟲惡性追原蟲含有兩個(gè)3山村111，？'51^3和?'5山213。已知運(yùn)些31的11111 調(diào)控致病基因的表達(dá)、抗原變異和抗原基因的表達(dá)，其有助于追疾寄生蟲逃避宿主免疫系 統(tǒng)的檢測(cè)。因而，能夠抑制或W其他有益方式調(diào)節(jié)運(yùn)些Siduin的小分子能夠用于治療追 疾，運(yùn)也將是非常有益的。
[0006] Sirte和PfSir2a抑制物的研發(fā)受到缺乏對(duì)Sbte和PfSir2a有效的活性分析特別 是能夠用于高通量篩選的方法的阻礙。研發(fā)有效的Sbte和PfSirfa活性分析的運(yùn)種困難主 要是由Sid6和Pf Sir2a的去乙酷基酶活性非常弱造成的。在運(yùn)屯種哺乳動(dòng)物Siduin中， Sirtuin 4-7具有較弱的或不具有去乙酷基酶活性。已知Sbte的功能為是組蛋白H3K9-和 H3K56-特異性去乙酷基酶，因?yàn)槠渌峄w不能被Sbte水解。然而，去乙酷基酶的活性非 常弱，迄今為止尚無 kcat和Km檢測(cè)的報(bào)告。類似地，已知PfSir2a的去乙酷基酶活性比人 Sirtl弱得多。 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0007] 本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)了當(dāng)賴氨酸上的酷基基本上是疏水的，特別是當(dāng)酷基含有較高碳原子 數(shù)(例如，至少5、6、7、8、9、10或更高的碳原子數(shù)）的控基如長鏈烷基或締基時(shí)，Sirte是酷 基-賴氨酸殘基的選擇性去酷基酶。Sirte的運(yùn)種選擇性活性與已知的其他Sbtuin的選擇 性形成鮮明對(duì)比。例如，Sirtuin 1、2和3已知具有強(qiáng)勁的去乙酷酶活性，而Sbtuin 5已知 能夠容易地從賴氨酸殘基上除去丙二酷基、班巧酷基和戊二酷基。相反地，本申請(qǐng)發(fā)現(xiàn)了與 其去乙酷基酶活性相比，Sirte明顯能夠更加有效地(例如，有效性超過30倍W上)從賴氨酸 殘基上除去長鏈?zhǔn)杷灾究峄ＥcSbte類似，人們發(fā)現(xiàn)PfSir^i和51巧的去乙酷基酶活 性也非常弱，但其能夠更高效地除去長鏈脂肪酷基。
[000引利用Sbte運(yùn)種新發(fā)現(xiàn)的活性，本申請(qǐng)描述了一種方法，該方法能夠在不同條件下 和存在任意多種可能的Side調(diào)節(jié)物的情況下，有效測(cè)定Side (和具有類似活性的 sbtuin，如PfSir2a和Sbt7)的活性水平。因此，盡管通過觀察去酷基酶的活性幾乎無法測(cè) 定Sbt6、PfSir2a或Sbt7的活性水平或鑒定其調(diào)節(jié)物（即，調(diào)控物，包括活化物或抑制物）， 但是本申請(qǐng)已發(fā)現(xiàn)了一種通過引入含有長鏈脂肪酷賴氨酸結(jié)構(gòu)的底物測(cè)定Sbt6、PfSir2a 或Sbt7的活化水平或鑒定其調(diào)節(jié)物（即，調(diào)控物，包括活化物或抑制物）W及測(cè)定不同條件 下Sbt6-、PfSir2a-或Sbt7-介導(dǎo)酷基水解的效能的有效方法。本申請(qǐng)描述的方法還能有 利地用于對(duì)能夠調(diào)節(jié)Sbt6、PfSir2a或Sid7活性的小分子進(jìn)行高通量篩選。
[0009] 通過本申請(qǐng)描述的方法鑒定的51的6-、？'5^2曰-或51的7-特異性調(diào)節(jié)物能夠用于 治療或預(yù)防多種WSbt6、PfSir2a或Sbt7活性異?；蛱幱诜亲罴褷顟B(tài)為特征的多種疾病。 運(yùn)些疾病包括與代謝(例如，肥胖癥）、糖尿病、追疾和基因組穩(wěn)定性相關(guān)的那些疾病。
[0010] 本申請(qǐng)還發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物的組蛋白具有長鏈脂肪酷基賴氨酸修飾，Sirte的生理學(xué) 作用可能是除去運(yùn)些脂肪酷基修飾。因此，Sirte可能能夠通過除去組蛋白上的修飾來調(diào)控 某些基因的轉(zhuǎn)錄，運(yùn)提示了組蛋白賴氨酸長鏈脂肪酷化是參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的新型表觀遺傳學(xué) 修飾。盡管短鏈脂肪酷修飾如乙酷化能夠調(diào)控轉(zhuǎn)錄是公知的，但是長鏈脂肪酷化如在組蛋 白上的豆違酷化參與表觀遺傳學(xué)修飾迄今為止仍是未知的。由于轉(zhuǎn)錄調(diào)控對(duì)正常和病變細(xì) 胞均很重要，因而所述的新型表觀遺傳學(xué)修飾能夠有針對(duì)性地治療多種疾病。
[0011] 更具體地，用于鑒定Sid6、PfSir2a或Sid7去酷基酶活性調(diào)節(jié)物的方法（即，分 析)包括：（i)在Sbt6、PfSir2a或Sid7使底物去酷基的條件下，在存在候選化合物的情況 下將酷基化的底物與Sbt6、PfSir2a或Sbt7接觸W提供去酷基的底物，其中所述酷基化的 底物含有酷基-賴氨酸部分和指示物部分，所述酷基含有至少=個(gè)、四個(gè)或五個(gè)通過碳-碳 鍵連接的碳原子的控基，其中所述控基任選地包括一個(gè)選自〇、N和S的雜原子，所述雜原子 打斷所述控基的碳-碳鍵或者取代所述控基中的碳原子，但是所述雜原子為〇H、SH或N此基 團(tuán)形式的不包括在內(nèi)，并且其中在所述控基中的一個(gè)或多個(gè)氨原子任選地被氣原子取代， W及其中所述賴氨酸的側(cè)鏈E-氨基下基基團(tuán)可W衍生化；（ii)將去酷基的底物與裂解試劑 接觸，所述裂解試劑裂解所述賴氨酸和指示物部分之間的連接W釋放所述指示物部分并產(chǎn) 生具有信號(hào)強(qiáng)度的可檢測(cè)信號(hào)；W及（iii)將所述信號(hào)強(qiáng)度與Sbt6、PfSir2a或Sbt7去酷 基酶活性相關(guān)聯(lián);其中通過存在所述候選化合物的條件下的Sbt6、Pf Sir2a或Sbt7去酷基 酶活性相對(duì)于不存在所述候選化合物的條件下的Sbt6、PfSir2a或Sbt7去酷基酶活性的 變化，將所述候選化合物鑒定為Sbt6、PfSir2a或Sid7去酷基酶活性的調(diào)節(jié)物。
[0012] 候選化合物可W是在上文所述的分析中檢測(cè)的任意化學(xué)物質(zhì)（例如，分子或大分 子，如蛋白或核酸）。依據(jù)分析結(jié)果，可W確定候選化合物是否是Sbt6、PfSir2a或Sbt7去 酷基酶活性的調(diào)節(jié)物(例如，抑制物或活化物）。在特定實(shí)施方式中，候選化合物或調(diào)節(jié)物具 有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0013] 在上述式（I)中，Ri是具有至少=個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、屯個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或十個(gè)通 過碳-碳鍵連接的碳原子的控基，其中所述控基任選地包括一個(gè)選自〇、N和S的雜原子，所述 雜原子打斷所述控基的碳-碳鍵或者取代所述控基中的碳原子，但是所述雜原子為〇H、SH或 N此基團(tuán)形式的不包括在內(nèi)，并且其中在所述控基中的一個(gè)或多個(gè)氨原子任選地被氣原子 取代；R2選自S、NR6和0,其中Rs是氨原子或控基R;Xi、)(2和X3獨(dú)立地選自-(C此)n-、-NRi2-、-〇-、-S-或鍵，其中Ri2是氨原子或控基R，W及其中n表示1、2或3;Rs是氨原子或控基R;R3和R4 獨(dú)立地是氨原子或控基R;其中所述控基財(cái)蟲立地為未取代的或者被一個(gè)或多個(gè)選自N、0、S、 P和F的雜原子或含有一個(gè)或多個(gè)所述雜原子的雜原子基團(tuán)所取代，其中R4還可W是OH或 SHo
[0014] 上文所述的分析中使用的酷基化底物一般具有上述式（1)中提供的上述特征，但 是其還必須含有指示物部分。在特定實(shí)施方式中，所述酷基化底物具有下述化學(xué)結(jié)構(gòu)：
[0015] 在上述式（2)中，R?是具有至少=個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、屯個(gè)、八個(gè)、九個(gè)或十個(gè)通 過碳-碳鍵連接的碳原子的控基，其中所述控基任選地包括一個(gè)選自〇、N和S的雜原子，所述 雜原子打斷所述控基的碳-碳鍵或者取代所述控基中的碳原子，但是所述雜原子為〇H、SH或 N此基團(tuán)形式的不包括在內(nèi)，W及其中在所述控基中的一個(gè)或多個(gè)氨原子任選地被氣原子 取代瓜選自S、NRi3和0,其中Ri3是氨原子或控基3而、枯和乂6獨(dú)立地選自-(C此)n-、-NRi4-、- 0-、-S-或鍵，其中化4是氨原子或控基R，W及其中n表示1、2或3;Rii是氨原子或控基R; W及化 和Rio獨(dú)立地是氨原子或控基R，其中Rio還可W是OH或甜，W及其中R9和Rio中的至少一個(gè)是 指示物部分;其中所述控基財(cái)蟲立地為未取代的或者被一個(gè)或多個(gè)選自N、0、S、P和F的雜原 子或含有一個(gè)或多個(gè)所述雜原子的雜原子基團(tuán)所取代。
[0016] 本申請(qǐng)還設(shè)及一種治療受累于特征為Sid6或Sid7去酷基酶活性異常或處于非 最佳狀態(tài)的病癥的主體的方法，其包括給予所述主體用于治療所述病癥的藥學(xué)有效量的上 文所述的調(diào)節(jié)化合物。
[0017] 本申請(qǐng)還設(shè)及一種用于鑒定Sbt6、PfSir2a或51的7去酷基酶活性的試劑盒，其包 括上文所述的酷基化底物和裂解試劑，僅當(dāng)所述酷基化底物去酷基化后所述裂解試劑裂解 所述賴氨酸和指示物部分。所述試劑盒還可W包括例如Sbt6、PfSir2a或Sbt7樣品、一種 或多種候選化合物、候選化合物前體、一種或多種酷基化底物前體、一種或多種指示物化合 物、澤滅劑、和/或一種或多種用于聯(lián)合試劑和/或檢測(cè)去酷基化酶活性的器件，如在進(jìn)行用 于測(cè)定酶活性的動(dòng)力學(xué)測(cè)試中使用的任意器件或裝置。 附圖的簡(jiǎn)要說明
[0018] 圖14，18。51的6水解乙酷基和肉豆違酷基肥6 1(12膚的高效液相色譜化口1〇圖（八） 和Sbte水解乙酷基和肉豆違酷基H4K16序列的HPLC圖（B)。未檢測(cè)到乙酷基膚的水解，但檢 測(cè)到肉豆違酷基膚的水解。
[0019] 圖2。不同膚（20咖）與Sid6(化M)和32P-NAD(0.化Ci)在37°C下解育2小時(shí)的32P-NAD放射自顯影分析的結(jié)果。通過薄層層析巧LC)板對(duì)反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)，通過放射自顯影對(duì) 32P-標(biāo)記NAD末端產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。所有肉豆違酷基膚均檢測(cè)到了 Sid6催化的去肉豆違酷基化， 但僅H3 K9乙酷基膚檢測(cè)到了Sbte催化的去乙酷基化。基于32P-NAD分析發(fā)現(xiàn)肉豆違酷基膚 的水解比乙酷基膚更加有效。
[0020] 圖3。根據(jù)圖2使用的方法獲得的不同膚的32P-NAD分析結(jié)果，但是在H3K9膚中比較 乙酷基、辛酷基、十二燒酷基和肉豆違酷基。如圖所示，更長的酷基(辛酷基、十二燒酷基和 肉豆違酷基)能夠被Sbte更有效地水解。
[0021] 圖44,48。（4化31(9肉豆違酷基膚與51^6和口'51'加的3中-歴0分析結(jié)果顯示， PfSir2a具有更低的肉豆違酷基膚檢測(cè)限，其能夠檢測(cè)低至0.03iiM的肉豆違酷基膚的去肉 豆違酷化。（B)當(dāng)將小牛胸腺組蛋白與Pf Sirfa和3中-NAD解育時(shí)H3K9肉豆違酷基膚的中-NAD 檢測(cè)結(jié)果顯示形成了脂肪酷基ADPR斑點(diǎn)（根據(jù)已檢測(cè)的），其支持了組蛋白具有脂肪酷基賴 氨酸修飾的觀點(diǎn)。
[0022] 圖5。對(duì)具有強(qiáng)勁的去酷乙基酶活性的31的11111(51的1、2和3)的巧光分析和水解更 長脂肪酷基鏈的3山村;[]1(5;[的6和?'5山2曰)的巧光分析進(jìn)行比較的示意圖。1(表示膚中的賴 氨酸殘基和X表示膚序列中的任意氨基酸。
[0023] 圖6A，6B。圖中顯示了巧光乙酷基膚-AMC底物(A)和庚基膚-AMC底物(B)對(duì)Sirte和 PfSIr2活性的檢測(cè)能力之間的差異。如圖所示，發(fā)現(xiàn)庚基膚-AMC能夠高效檢巧USirte和 Pf Sir 2的活性，而乙酷基膚-AMC對(duì)此目的無效。
[0024] 圖7A，7B。式la中硫代酷胺化合物通式的化學(xué)結(jié)構(gòu)（上圖，圖7A)，和通式內(nèi)的特定 硫代酷胺化合物(下圖，圖7B)。 發(fā)明詳述
[0025] 為方便起見，在進(jìn)一步描述本申請(qǐng)之前，在此對(duì)說明書、實(shí)施例和所附的權(quán)利要求 所使用的某些術(shù)語進(jìn)行描述。應(yīng)根據(jù)整個(gè)公開的內(nèi)容和本領(lǐng)域技術(shù)人員的理解來解讀運(yùn)些 定義。
[0026] 本文所使用的術(shù)語"一"和"一個(gè)"指文章中一個(gè)或一個(gè)W上（即，至少一個(gè))的語法 對(duì)象。舉例來說，除非另有明示，否則"一個(gè)元素"可W指一個(gè)或多個(gè)元素。
[0027] 術(shù)語"氨基酸"旨在包括所有分子，無論是天然的還是合成的，其包括一個(gè)氨基官 能團(tuán)和一個(gè)酸官能團(tuán)并且能夠包括在天然存在的氨基酸的聚合物中。示例性的氨基酸包括 天然存在的氨基酸;其類似物、衍生物和同源物;具有變體側(cè)鏈的氨基酸類似物;和前述任 意一項(xiàng)的所有立體異構(gòu)體。在某些實(shí)施方式中，術(shù)語"氨基酸"僅指二十個(gè)已知的必需氨基 酸，或其亞類，即甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、鄉(xiāng)氨酸(V)、亮氨酸化）、異亮氨酸（I)、半脫氨酸 (C)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、絲氨酸（S)、蘇氨酸 (T)、天冬酷胺(N)、谷氨酷胺(Q)、天冬氨酸(D)、谷氨酸巧）、組氨酸化）、賴氨酸化)和精氨酸 (R)。在某些實(shí)施方式中，前述分類中的任意一種或多種或者特定類型的氨基酸被排除。
[0028] 術(shù)語"多膚"W及術(shù)語"蛋白"和"膚"，在本文中互換使用，指氨基酸的聚合物。示例 性的多膚包括基因產(chǎn)物、天然存在的蛋白、同系物、直系同源物、旁系同源物、片段，W及前 述的其他等價(jià)物、變體和類似物。其可W包括上文所述任意氨基酸殘基中的一種或多種，或 其修飾形式，并且一般包括至少10、20、30、40或50個(gè)和高達(dá)80、100、120、15、200、300、400、 500或！，000個(gè)氨基酸殘