專利名稱：：一種促肝細胞生長素活性檢測方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種檢測方法，特別是一種檢測促肝細胞生長素活性的促肝細胞生長素活性檢測方法。技術背景促肝細胞生長素是一種從新鮮的乳豬肝或小牛肝中提取的生化藥品，作為治療各種重癥肝炎、慢性活動性肝炎和肝硬化的輔助用藥，其活力測定即活性檢測十分重要。中華人民共和國藥品監(jiān)督管理局的《促肝細胞生長素溶液》國家藥品標準WS-10001-(HD-0860)-2002中規(guī)定促肝細胞生長素活力測定采用附一所列MTT法。該方法采用含谷氨酰胺成分的RPMI1640培養(yǎng)基，包括試劑準備、供試品溶液制備、測定供試品組3孔吸收度平均值、對照組3孔吸收度平均值和空白對照組3孔吸收度平均值，最后計算出衡量供試品活性的刺激指數(shù)幾個步驟。檢測中發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有技術檢測方法由于RPMI1640培養(yǎng)基中有谷氨酰胺成分，在活性檢測過程中谷氨酰胺有促進肝癌細胞生長的作用，導致檢測的細胞對照組吸收值偏高，進而導致檢測計算出的剌激指數(shù)值較供試品實際具有的剌激指數(shù)值低，使測試不穩(wěn)定，重復測定一致性差，從而不能正確判斷供試品促肝細胞生長素的活性優(yōu)劣。
發(fā)明內容本發(fā)明所要解決的技術問題是，克服現(xiàn)有技術存在的缺陷，提供一種測試方法穩(wěn)定、測試結果可靠的促肝細胞生長素活性檢測方法。本發(fā)明解決上述問題所采用的技術方案是該促肝細胞生長素活性檢測方法，使用RPMI-1640培養(yǎng)液，檢測包括準備試劑步驟、供試品溶液制備步驟、測定供試品組3孔吸收度平均值、對照組3孔吸收度平均值和空白對照組3孔吸收度平均值步驟、計算刺激指數(shù)步驟，其特點是所述的RPMI-1640培養(yǎng)液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液。本發(fā)明促肝細胞生長素活性檢測方法所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液采用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基配制，所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液配制方法為，取碳酸氫鈉2.00g及不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基10.0g加超純水800ml溶解后，用lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至6.9，加超純水稀釋至1000ml，過濾除菌備用。本發(fā)明與現(xiàn)有技術相比具有以下優(yōu)點由于本發(fā)明使用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基，檢測中不會因為谷胺酰胺促進肝癌細胞生長而影響測定結果，具有測定方法穩(wěn)定、測定結果可靠等優(yōu)點，測定結果能正確反映供試品的活性，對促肝細胞生長素的生產和試驗有指導意義。使用本發(fā)明檢測方法對同一促肝細胞生長素溶液進行3次測定，測得刺激指數(shù)2次為6.5、1次為6.7，測定誤差僅為1.98%，測定一致性好，較為精確地測定了被測促肝細胞生長素溶液的活力。具體實施方式下面通過實施例，對本發(fā)明作進一步的闡述。該促肝細胞生長素活性檢測方法采用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)液，不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)液可以選用成品試劑，也可選用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基配制。實施例促肝細胞生長素活性檢測方法分試劑配制，供試品溶液制備，測定供試品組、對照組和空白對照組各3孔吸收度平均值，計算刺激指數(shù)四步驟1、0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液、RPMI-1640培養(yǎng)液、10%小牛血清培養(yǎng)液、0.25%胰蛋白酶一乙二胺四醋酸二鈉消化液和MTT噻唑藍溶液等試劑配制①配制pH7.3的0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液，取氯化鈉8.0g、氯化鉀0.2g、磷酸氫二鈉Na2HP041.15g及磷酸二氫鉀0.2g，加超純水1000ml溶解后，高壓滅菌備用。②配制RPMI-1640培養(yǎng)液，取碳酸氫鈉2.00g及不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基10.0g加超純水800ml溶解后，用lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至6.9，加超純水稀釋至1000ml，過濾除菌備用。③配制10%小牛血清培養(yǎng)液，取上述RPMI—1640培養(yǎng)液900ml，加已滅活的新生小牛血清100ml。配制0.25%胰蛋白酶一乙二胺四醋酸二鈉消化液，取0.25g胰蛋白酶及0.02g乙二胺四醋酸二鈉，加O.Olmol/L磷酸鹽緩沖液100ml溶解后，用5.6%碳酸氫鈉調節(jié)pH值至7.2，過濾除菌，一2(TC保存?zhèn)溆?。⑤配制MTT噻唑藍溶液，取MTT50mg，力口0.01mol/L磷酸鹽緩沖液10ml溶解后，過濾除菌，保存于冷處，使用不超過兩周。2、供試品溶液制備用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)液將供試品制成每lml中含多肽lO(mg的溶液。3、測定供試品組3孔吸收度平均值、對照組3孔吸收度平均值和空白對照組3孔吸收度平均值①用10%小牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)S腿C一7721細胞至對數(shù)增長期，用0.25%胰蛋白酶一乙二胺四醋酸二鈉消化液消化，加10%小牛血清培養(yǎng)液稀釋至每lml中含2.5X1()45X104個細胞，將上述細胞懸液在96孔細胞培養(yǎng)板上鋪板，每孔IOOix1，其中留3孔加10%小牛血清培養(yǎng)液100111作為空白對照，置37r、5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)34小時使鋪在細胞培養(yǎng)板孔上的對照品和空白對照品貼壁。②在細胞培養(yǎng)板每孔上加供試品溶液100u1，每批供試品均做3孔。③細胞對照組和空白對照組每孔分別加不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基配制的RPMI—1640培養(yǎng)液100ul，置37。C、5%二氧化碳飽和水汽培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，結束培養(yǎng)前4小時取出細胞培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液，每孔加入pH7.3的0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液洗一次，然后再在每孔中加入上述磷酸鹽緩沖液100ul和MTT溶液20ul，繼續(xù)培養(yǎng)。④培養(yǎng)結束后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100ixl二甲基亞砜，搖勻，在酶標儀上以550nm的波長處分別測定供試品組3孔吸收度平均值l、對照組3孔吸收度平均值^和空白對照組3孔吸收度平均值X。。4、按照下面公式計算表示促肝細胞生長素活性的刺激指數(shù)值刺激指數(shù)=_供試品組3孔吸收度平均值X-空白對照組3孔吸收度平均值I。對照組3孔吸收度平均值X_空白對照組3孔吸收度平均值X)本實施例配制RPMI1640培養(yǎng)液選用不含谷氨酰胺成分的RPMI1640A型培養(yǎng)基，也可以選用不含谷胺酰胺的其他類似RPMI1640的培養(yǎng)基配制。本實施例使用的不含谷氨酰胺成分的粉末型RPMI1640A型培養(yǎng)基和現(xiàn)有技術使用的含谷氨酰胺成分的粉末型RPMI1640培養(yǎng)基成分分別見表1和表2。表1粉末型RPMI1640A型培養(yǎng)基成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表2粉末型RPMI1640培養(yǎng)基成分表<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>采用本發(fā)明促肝細胞生長素活性檢測方法和現(xiàn)有技術對同一促肝細胞生長素溶液進行3次對照檢測，檢測結果如表3所示采用本發(fā)明不含谷氨酰胺成分的RPMI1640A型培養(yǎng)基的檢測方法檢測數(shù)據(jù)重復率較高、一致性較好，而現(xiàn)有技術檢測方法不穩(wěn)定、一致性差。表3兩種檢測方法三次檢測結果表<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權利要求1、一種促肝細胞生長素活性檢測方法，使用RPMI-1640培養(yǎng)液，檢測包括準備試劑步驟、供試品溶液制備步驟、測定供試品組3孔吸收度平均值、對照組3孔吸收度平均值和空白對照組3孔吸收度平均值步驟、計算刺激指數(shù)步驟，其特征在于所述的RPMI-1640培養(yǎng)液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液。2、根據(jù)權利要求1所述的促肝細胞生長素活性檢測方法，其特征在于所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液采用不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基配制，所述的不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液配制方法為，取碳酸氫鈉2.OOg及不含谷胺酰胺成分的RPMI-1640培養(yǎng)基10.0g加超純水800ml溶解后，用lmol/L鹽酸溶液調節(jié)pH值至6.9，加超純水稀釋至1000ml，過濾除菌全文摘要本發(fā)明公開了一種促肝細胞生長素活性檢測方法。該檢測方法，采用RPMI-1640培養(yǎng)液，檢測包括準備試劑步驟、供試品溶液制備步驟、測定供試品組3孔吸收度平均值、對照組3孔吸收度平均值和空白對照組3孔吸收度平均值步驟、計算刺激指數(shù)步驟，其特點是所述的RPMI-1640培養(yǎng)液采用不含谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術存在的測試不穩(wěn)定，重復測定一致性差等缺陷，具有測定方法穩(wěn)定，測定結果可靠，檢測數(shù)據(jù)重復率較高、一致性較好等優(yōu)點，測定結果能正確反映供試品的活性。文檔編號G01N21/00GK101226138SQ20081005981公開日2008年7月23日申請日期2008年2月4日優(yōu)先權日2008年2月4日發(fā)明者俞保彬,周正兵,高留根申請人:杭州華錦藥業(yè)有限公司