一種關(guān)于抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)方法，特別涉及一種抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法。包括以下步驟：(1)配制一組不同濃度的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定所述抗體標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，由所述峰面積和濃度梯度得出標(biāo)準(zhǔn)曲線；(2)用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定抗體樣品的峰面積，由所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的濃度，即得抗體的蛋白質(zhì)含量。本方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確度高、影響因素少，不僅能檢測(cè)純化后的抗體的蛋白質(zhì)含量，還能檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的蛋白質(zhì)含量。并且可以選用不同的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)得出不同抗體樣品的蛋白質(zhì)含量，應(yīng)用范圍廣。
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)方法，特別涉及一種抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法。 一種關(guān)于抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法

【背景技術(shù)】
[0002] 蛋白質(zhì)含量測(cè)定是在生命科學(xué)研究中經(jīng)常使用的技術(shù)。目前，蛋白質(zhì)測(cè)定方法有 多種，但是各有局限。常規(guī)抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法采用UV280,即利用紫外分光光度 計(jì)，檢測(cè)抗體在波長(zhǎng)280nm處的0D值，然后根據(jù)抗體的摩爾消光系數(shù)計(jì)算出抗體的蛋白質(zhì) 含量。該方法只能對(duì)純化后的抗體進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)液的蛋白質(zhì)含量不能進(jìn)行檢測(cè)， 因?yàn)榧?xì)胞培養(yǎng)液中添加物、色素、雜質(zhì)比較多，會(huì)干擾檢測(cè)，導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。
[0003] 另外，常規(guī)的Lowry法用于蛋白質(zhì)的含量測(cè)定。利用蛋白質(zhì)在堿性溶液中可形成 銅-蛋白質(zhì)復(fù)合物，在此復(fù)合物中加入酚試劑后，產(chǎn)生藍(lán)色化合物，該藍(lán)色化合物在波長(zhǎng) 650nm處的吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，根據(jù)供試品的吸光度，計(jì)算供試品的蛋白質(zhì)含量。 該方法試劑配制相對(duì)復(fù)雜，抗體檢測(cè)結(jié)果與實(shí)際結(jié)果相差比較大，一般不采用Lowry法進(jìn) 行抗體蛋白質(zhì)含量測(cè)定。
[0004] 抗體的蛋白質(zhì)含量也可以采用Elisa來檢測(cè)，該方法是建立在抗原與抗體免疫學(xué) 反應(yīng)的基礎(chǔ)上，因此具有特異性；同時(shí)，由于酶標(biāo)記抗原或抗體是酶分子與抗原或抗體分子 的結(jié)合物，它可以催化發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生放大作用，因此，該方法靈敏度很高，并且可以同時(shí)檢 測(cè)多個(gè)樣品。但是該操作較復(fù)雜，需要多次洗板，重復(fù)性差，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，通常需要24小 時(shí)左右。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中所存在的上述不足，提供一種抗體的蛋白質(zhì)含 量的檢測(cè)方法，該方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，檢測(cè)時(shí)間短，準(zhǔn)確度高、影響因素少，不僅能檢 測(cè)純化后的抗體的蛋白質(zhì)含量，還能檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的蛋白質(zhì)含量。并且可以選用 不同的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)得出不同抗體樣品的蛋白質(zhì)含量，應(yīng)用范圍廣。 [0006] 為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案 ：
[0007] -種關(guān)于抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0008] (1)配制一組不同濃度的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定所述抗體標(biāo)準(zhǔn)品的 峰面積，由峰面積和濃度梯度得出標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0009] (2)用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定抗體樣品的峰面積，由所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的 濃度，即得抗體的蛋白含量。
[0010] 所述的用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定，其條件是采用Protein A色譜柱，以流動(dòng)相A和流 動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 5-1. OmL/min，柱溫20-30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ;
[0011] 根據(jù)抗體蛋白質(zhì)的特點(diǎn)，采用Protein A色譜柱進(jìn)行測(cè)定，Protein A色譜柱一般 只結(jié)合抗體蛋白質(zhì)，其它蛋白質(zhì)流穿出來，專一性特別強(qiáng)。
[0012] 所述的流動(dòng)相A，為磷酸鹽和氯化鈉混合的水溶液，pH為7. 0-7. 5 ;
[0013] 所述的流動(dòng)相B，為檸檬酸和氯化鈉混合的水溶液，pH為3. 4-3. 8 ;
[0014] 本發(fā)明選用磷酸鹽、氯化鈉、檸檬酸作為流動(dòng)相，均為常規(guī)試劑，價(jià)格便宜，成本 低，并且容易配制。
[0015] 所述的以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，首先用流動(dòng)相A進(jìn)行3-5min平洗， 再用流動(dòng)相B進(jìn)行10-15min洗脫；最后用流動(dòng)相A進(jìn)行3-5min洗脫。
[0016] 一般細(xì)胞培養(yǎng)液pH值在6. 8-7. 4,同時(shí)，抗體蛋白質(zhì)在中性環(huán)境下，抗體蛋白質(zhì)容 易吸附。所以我們首先用流動(dòng)相A進(jìn)行洗脫，pH控制在7. 0-7. 5,洗脫時(shí)間只需要3-5min， 抗體蛋白質(zhì)能很好吸附。然后再在偏酸性環(huán)境下，pH為3. 4-3. 8進(jìn)行洗脫。因?yàn)榭贵w蛋白 質(zhì)在偏酸性環(huán)境下容易洗脫，所以只需要l〇_15min。最后用流動(dòng)相A平衡，把層析柱再平衡 好，為下一個(gè)樣品做好準(zhǔn)備。有利于提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和精確性。
[0017] 所述的磷酸鹽為二水磷酸二氫鈉或十二水磷酸氫二鈉中的一種或兩種。
[0018] 所述磷酸鹽的濃度為10_50mM。
[0019] 所述的檸檬酸的濃度為10_50mM。
[0020] 所述的氯化鈉的濃度為0· 05-0. 3M。
[0021] 優(yōu)選的，所述磷酸鹽的濃度為18-22mM。
[0022] 優(yōu)選的，所述的檸檬酸的濃度為18_22mM。
[0023] 優(yōu)選的，所述的氯化鈉的濃度為0· 12-0. 18M。
[0024] 所述的Protein A色譜柱，優(yōu)選為Mabselect SuRe 1ml預(yù)裝柱。
[0025] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0026] 本方法操作簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，檢測(cè)時(shí)間短，一般只需要30min，檢測(cè)范圍寬，檢測(cè)濃 度為0. lmg/mL-4. Omg/mL ;準(zhǔn)確度高，影響因素少，不僅能檢測(cè)純化后的抗體的蛋白質(zhì)含 量，還能檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的蛋白質(zhì)含量。并且可以選用不同的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，得到標(biāo)準(zhǔn) 曲線，檢測(cè)得出不同抗體樣品的蛋白質(zhì)含量，應(yīng)用范圍廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1檢測(cè)純化后的抗體的蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0028] 圖2檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中抗體的蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線

【具體實(shí)施方式】
[0029] 下面結(jié)合試驗(yàn)例及【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。但不應(yīng)將此理解 為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例，凡基于本
【發(fā)明內(nèi)容】
所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本 發(fā)明的范圍。
[0030] -、檢測(cè)純化后的抗體的蛋白質(zhì)含量
[0031] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下：
[0032] 以貝伐珠單抗的抗體標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測(cè)定利妥昔單抗（實(shí)施例1)、依 那西普單抗（實(shí)施例2)、西妥昔單抗（實(shí)施例3)抗體樣品的峰面積，計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
[0033] 所述的利妥昔單抗為美羅華，蛋白質(zhì)濃度為10mg/ml，用緩沖液稀釋到1. Omg/ml ;
[0034] 所述的依那西普單抗為Enbrel恩利，蛋白質(zhì)濃度為25mg/ml，用緩沖液稀釋到 1. Omg/ml ；
[0035] 所述的西妥昔單抗為愛必妥，蛋白質(zhì)濃度為5mg/ml，用緩沖液稀釋到1. Omg/ml ;
[0036] 通過將本發(fā)明的檢測(cè)方法得到蛋白質(zhì)濃度與實(shí)際濃度相比，說明本發(fā)明檢測(cè)方法 的準(zhǔn)確度。
[0037] 具體實(shí)施如下：
[0038] (1)測(cè)定貝伐珠單抗的抗體標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0039] 以貝伐珠單抗配制一組濃度分別為4. Omg/ml, 2. Omg/ml, 1. Omg/ml, 0· 5mg/ ml，0. 25mg/ml，0. 125mg/ml的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定，采用Mabselect SuRe lml預(yù)裝柱，以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫的體積時(shí)間見表2所示，進(jìn)樣量 為500ul，流速為1. OmL/min，柱溫25°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ;
[0040] 所述的流動(dòng)相A，為濃度為20mM的二水磷酸二氫鈉和0. 15M的氯化鈉混合的水溶 液，pH 為 7. 2 ;
[0041] 所述的流動(dòng)相B，為濃度為20mM的檸檬酸和0. 15M的氯化鈉混合的水溶液，pH為 3. 6〇
[0042] 測(cè)定所述抗體標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積，見表1，由所述峰面積和濃度梯度得出標(biāo)準(zhǔn)曲線 (圖 1)，y = 164. 71χ+3· 1171，R2 = 0· 9998 ;
[0043] 表1抗體標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積
[0044]

【權(quán)利要求】
1. 一種關(guān)于抗體的蛋白質(zhì)含量的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟： 配制一組不同濃度的抗體標(biāo)準(zhǔn)品，用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定所述抗體標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積， 由所述峰面積和濃度梯度得出標(biāo)準(zhǔn)曲線； 用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定抗體樣品的峰面積，由所述的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品的濃度，即 得抗體的蛋白質(zhì)含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的用蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)測(cè)定，其條 件是采用Protein A色譜柱，以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，流速為0. 5-1. OmL/min， 柱溫20-30°C，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm ; 所述的流動(dòng)相A，為磷酸鹽和氯化鈉混合的水溶液，pH為7. 0-7. 5 ; 所述的流動(dòng)相B，為檸檬酸和氯化鈉混合的水溶液，pH為3. 4-3. 8 ; 所述的以流動(dòng)相A和流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫，首先用流動(dòng)相A進(jìn)行3-5min平洗，再用 流動(dòng)相B進(jìn)行10-15min洗脫；最后用流動(dòng)相A進(jìn)行3-5min洗脫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的磷酸鹽為二水磷酸二氫鈉或 十二水磷酸氫二鈉中的一種或兩種。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述磷酸鹽的濃度為10-50mM。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檸檬酸的濃度為10-50mM。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的氯化鈉的濃度為0. 05-0. 3M。
7. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述磷酸鹽的濃度為18-22mM。
8. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的檸檬酸的濃度為18-22mM。
9. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的氯化鈉的濃度為0. 12-0. 18M。
10. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述的Protein A色譜柱，為 Mabselect SuRe lml 預(yù)裝柱。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104155387SQ201410440707
【公開日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月2日
【發(fā)明者】劉玉應(yīng), 丁兆, 張仁懷, 胡勛, 雷富彬 申請(qǐng)人:四川匯宇制藥有限公司