專利名稱：一種蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化學(xué)分析檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)蛋白質(zhì)濃度的檢測(cè)方法主要有Lowry法、BCA(Bicinchoninic acid)法和 Bradford法。Lowry法主要依據(jù)是堿性條件下Cu2+與肽骨架的-CO-NH-基團(tuán)形成藍(lán)色絡(luò)合物，然后將福林酚試劑中的鱗鎢酸和鱗鉬酸還原為鎢和鉬藍(lán)進(jìn)一步呈色的結(jié)果。BCA方法是利用BCA能夠與Lowry法第一步反應(yīng)形成的Cu+結(jié)合而生成的藍(lán)紫色復(fù)合物來測(cè)定的。 Bradford法的依據(jù)是染料考馬斯亮藍(lán)G-250能夠與蛋白質(zhì)或分子量3 kD以上的肽中的賴氨酸和精氨酸結(jié)合形成有色物。這三種常用方法都是利用發(fā)色物質(zhì)顏色的深淺與蛋白質(zhì)濃度間存在線性關(guān)系而繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線來測(cè)定樣品中蛋白濃度的，但在實(shí)際應(yīng)用中都有局限。Lowry法操作繁瑣，而且還會(huì)受到很多化學(xué)成分的影響，例如表面活性劑Triton X-100或SDS含量?jī)H達(dá)時(shí)，或者金屬離子螯合劑EDTA濃度達(dá)到10 mM時(shí)，或者尿素含量達(dá)3 M,或者硫酸銨濃度達(dá)0. 25 M等就會(huì)嚴(yán)重干擾檢測(cè)結(jié)果；雖然BCA方法受表面活性劑干擾影響小，但對(duì)還原劑、金屬離子螯合劑以及硫酸銨的存在很敏感。Bradford方法操作簡(jiǎn)單，但與Lowry法類似，對(duì)表面活性劑的耐受性差，當(dāng)0. 1% SDS或者0. 5%的TritonX-IOO 存在時(shí)，蛋白質(zhì)樣品吸光值會(huì)受到較大影響。所以這些方法的具體使用總會(huì)因?yàn)闇y(cè)定液或者蛋白質(zhì)裂解液的構(gòu)成而局限，或者說，如果有干擾物質(zhì)存在，蛋白質(zhì)濃度測(cè)定就需要針對(duì)不同的干擾物質(zhì)采取不同的方法，這樣給蛋白質(zhì)含量測(cè)定帶來不便。因此，基于上述需要，本發(fā)明是上述方法為基礎(chǔ)，提高了對(duì)表面活性劑、還原劑、金屬離子螯合劑等干擾物質(zhì)的耐受性，而且也是具有較好穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。英文縮寫、全稱及中文對(duì)照
DTTDithiothretol/ 二硫蘇糖醇
EDTAEthylene Diamine Tetraacetic Acid/乙二胺四乙酸
EGTAEthylene Glycol Tetraacetic Acid/乙二醇二乙醚二胺四乙酸
β -MEβ-Mercaptoethanol/ β-巰基乙醇
NP-40Nonidet Ρ-40/乙基苯基聚乙二醇
SDSSodium Dodecyl Sulfate/ 十二燒基硫酸鈉
BSABovine serum albumin/牛血清蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為提高蛋白質(zhì)檢測(cè)對(duì)表面活性劑如SDS、TritonX-100和NP-40，還原劑DTT 和β -巰基乙醇，螯合劑EDTA和EGTA以及含氮化合物硫酸銨和尿素等干擾物質(zhì)的包容性， 提供一種簡(jiǎn)單、快速而穩(wěn)定性好的蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)方法。本發(fā)明所述的蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法，流程如

圖11所示，包括如下步驟
1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備稱取牛血清蛋白(BSA)溶解于蒸餾水中，將終濃度調(diào)配為4
3mg/mL，即為配制的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液樣品；
2)試劑配制試劑①碳酸鈉1. 89 ι氫氧化鈉1. 00 ι試劑②酒石酸鈉0. 25 ι硫酸銅0. 125SDS2. 5 %
配制試劑②時(shí)，先將酒石酸鈉和硫酸銅混合靜置后再加入SDS ； 試劑③
將2 N福林酚溶液稀釋，然后調(diào)整pH為1，最后定容至10倍體積； 3)檢測(cè)蛋白質(zhì)含量
將配制好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液按照二倍稀釋法采用蒸餾水稀釋至不同梯度濃度，然后于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者試管中分別加入同體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液各梯度樣品、待測(cè)樣品、蒸餾水；
將試劑①和試劑②以50/1的體積比混合配成混合液，向上述96孔或者試管中分別加入樣品體積5倍的試劑①和試劑②的混合液；再分別加入樣品體積40倍的試劑③，混合均勻，在室溫下放置30 min，在570-630 nm范圍任一波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液各梯度樣品對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推定線性回歸方程，再將待測(cè)樣品吸光值導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明步驟3)中檢測(cè)蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)流程(微孔法和標(biāo)準(zhǔn)試管法)將配制完成的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液按照二倍稀釋法采用蒸餾水稀釋至最低濃度為0. 0625 mg/mL的7 個(gè)梯度濃度，然后于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者試管中分別加入5 yL或者100 yL的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液各梯度樣品，空白對(duì)照為同體積的蒸餾水。另外按照標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液同樣體積將0. 1-4 mg/mL濃度區(qū)間的蛋白樣品分別加入96孔板或者試管中，每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)或者待測(cè)樣品至少有3 個(gè)重復(fù)樣；
根據(jù)實(shí)際計(jì)算所需用量按照2)試劑配制說明準(zhǔn)備試劑①和試劑②的混合液，對(duì)96孔或者試管內(nèi)各樣品需分別加入25 μ L或者500 μ L的試劑①和試劑②的混合液；
然后于96孔或試管各樣品中分別加入200 yL或者4 mL試劑③，混合均勻，在室溫下放置30 min，在570-630 nm范圍任一波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。微孔法樣品可直接利用酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定，試管法樣品則將1 mL發(fā)色液倒入塑料比色杯在分光光度計(jì)中進(jìn)行檢測(cè)。獲得數(shù)據(jù)后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推定線性回歸方程，再將待測(cè)樣品吸光值導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。本發(fā)明是在Lowry法基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)完善的。Lowry法是首先在蛋白質(zhì)樣品溶液加入NaOH溶液而使之處于堿性條件下，然后與現(xiàn)配的由2% Na2CO3:1% CuS04:2%酒石酸鉀鈉(100/1/1)組成的混合液混合，室溫放置10 min，再加入福林酚試劑放置30-60 min，于 550 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。本發(fā)明將Lowry法的第一步和第二步反應(yīng)試劑做了重新安排，并且加入了表面活性劑成分SDS。此外，第三步反應(yīng)步驟沒有直接使用福林酚試劑，而是將其稀釋使用，檢測(cè)吸光值的波長(zhǎng)處于570-630 nm之間都可以，以590 nm為最佳，且發(fā)色液可以保持?jǐn)?shù)小時(shí)內(nèi)沒有顯著變化。本發(fā)明是對(duì)干擾物質(zhì)耐受性好及發(fā)色液穩(wěn)定的蛋白質(zhì)檢測(cè)方法。 本發(fā)明以Lowry法為基礎(chǔ)，結(jié)合三種常規(guī)蛋白質(zhì)濃度測(cè)定方法的優(yōu)點(diǎn)，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系好，對(duì)干擾物質(zhì)耐受性提高，見表1 表1.已測(cè)試的常見干擾物質(zhì)及最大抗干擾濃度
權(quán)利要求
1. 一種蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法，包括如下步驟1)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液的制備稱取牛血清蛋白溶解于蒸餾水中，將終濃度調(diào)配為4 mg/mL, 即為配制的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液樣品；2)試劑配制試劑①碳酸鈉1. 89 ι氫氧化鈉1. 00 ι試劑②酒石酸鈉0. 25 ι硫酸銅0. 125SDS2. 5 %配制試劑②時(shí)，先將酒石酸鈉和硫酸銅混合靜置后再加入SDS ； 試劑③將2 N福林酚溶液稀釋，然后調(diào)整pH為1，最后定容至10倍體積； 檢測(cè)蛋白質(zhì)含量將配制好的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液按照二倍稀釋法采用蒸餾水稀釋至不同梯度濃度，然后于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板或者試管中分別加入同體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液各梯度樣品、待測(cè)樣品、蒸餾水；將試劑①和試劑②以50/1的體積比混合配成混合液，向上述96孔或者試管中分別加入樣品體積5倍的試劑①和試劑②的混合液；再分別加入樣品體積40倍的試劑③，混合均勻，在室溫下放置30 min，在570-630 nm范圍任一波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液各梯度樣品對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并推定線性回歸方程，再將待測(cè)樣品吸光值導(dǎo)入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法，其特征在于，步驟3)中待測(cè)樣品在檢測(cè)前濃度調(diào)整至0. 1-4 mg/mL。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法，該方法是先配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品、試劑①、②、③，將標(biāo)準(zhǔn)蛋白樣品制成梯度，采用微孔法或標(biāo)準(zhǔn)試管法將試劑①、②、③加入到梯度樣品和待測(cè)樣品中，測(cè)定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的吸光值推算濃度。本發(fā)明方法既能準(zhǔn)確檢測(cè)蛋白質(zhì)含量，還能適用于含多種干擾物質(zhì)的蛋白質(zhì)溶液。本發(fā)明提高了蛋白質(zhì)分析檢測(cè)過程中對(duì)表面活性劑、還原劑、螯合劑以及含氮化合物等干擾物質(zhì)的包容性，是一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高而穩(wěn)定性好的蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)方法，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/31GK102252987SQ201110175208
公開日2011年11月23日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者盧山, 董源 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)