專利名稱：：一種具有抗癌活性的Ru(Ⅱ)配合物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及金屬配合物，具體為一種具有抗癌活性的Ru(n)配合物及其制備方法。技術(shù)背景金屬配合物與DNA有三種作用方式，它們分別為l、靜電結(jié)合；2、溝渠結(jié)合；3、插入結(jié)合。靜電結(jié)合是指帶正電荷的金屬配合物與DNA中帶負(fù)電荷的磷酸根以靜電吸引的方式相結(jié)合；溝渠結(jié)合是指配合物結(jié)合到雙螺旋DNA的溝渠部位；插入結(jié)合是指配合物利用其含有的平面芳香雜環(huán)插入到DNA的堿基對(duì)中，并與其堿基對(duì)發(fā)生堆積。這三種方式中以第三種方式為最佳的結(jié)合方式，因?yàn)榭梢圆迦氲紻NA的堿基對(duì)中，直接使堿基對(duì)受損，在癌癥等遺傳病中由于其母代DNA的錯(cuò)配導(dǎo)致子代DNA也以錯(cuò)配形式復(fù)制，若金屬配合物能夠識(shí)別這樣的錯(cuò)配并插入到錯(cuò)配的堿基對(duì)中，它便阻止其復(fù)制，這樣我們便可將其作為一種好的抗癌藥物，從根本上治療遺傳病或分子病。目前，有人合成芳香環(huán)Co配合物，但芳香環(huán)Co配合物與DNA的鍵合常數(shù)的數(shù)量級(jí)一般在10、—'左右，在抗腫瘤活性方面表現(xiàn)平平，并且由于在制備該種含有芳香環(huán)Co配合物的時(shí)候，使用噻吩為原料，而噻吩中的S雜原子為親軟金屬原子，不親硬金屬，無(wú)法同人體內(nèi)的生命金屬進(jìn)行絡(luò)合，因而該種含有芳香環(huán)Co配合物的抗腫瘤活性難盡人意o
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明目的在于提供一種具有抗癌活性的Ru(II)配合物及其制備方法。本發(fā)明提供的一種具有抗癌活性的Ru(II)配合物，其分子結(jié)構(gòu)式為本發(fā)明提供的一種具有抗癌活性的Ru(II)配合物的制備方法，包括如下步驟第一步取lmol1,10-菲咯啉，分5次加入到1.2L濃硫酸中，并攪拌使之溶解，再加入lmol的溴化鈉，然后緩慢加入0.6L濃硝酸，加熱回流2小時(shí)，冷卻到室溫，緩慢倒入800mol的冰水中，用10M的氫氧化鈉將上述溶液中和至pH值二6.57.4，靜置30min后過(guò)濾，再將濾餅用沸水溶解、過(guò)濾，然后將兩份濾液混合，用CH2Cl2進(jìn)行萃取，將無(wú)水硫酸鎂加入萃取液中除去萃取液中的水分，再將除去水分的萃取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，使其產(chǎn)生黃色固體，再用甲醇將黃色固體重結(jié)晶，得黃色針狀產(chǎn)物l,10-菲咯啉(phen)-5,6-二酮，反應(yīng)式第二步在氬氣保護(hù)下，將第一步制成的1,10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮與等摩爾的3,4-二胺基呋喃溶于30L乙醇中，回流反應(yīng)68h;等待反應(yīng)混合物冷卻后，過(guò)濾析出的固體，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得配體b聯(lián)吡啶并[3,2-a;2'，3-0|-呋喃-[3，4《]吖嗪，反應(yīng)式第三步將lmolRuCl:,H20和2mo1的1，IO-菲咯啉,溶于6LN，N'一二甲基甲酰胺中，在氬氣保護(hù)下，加熱回流34h，接著旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑，剩余溶液冷卻至室溫，加入52L丙酮，置于O'C的環(huán)境中過(guò)夜；抽濾所得晶體，并用冰水洗滌；然后將粗產(chǎn)品溶于1:1的乙醇和水中，加熱回流l2h，過(guò)濾后除去不溶物，于濾液中加入124mo1LiCl，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶液中的乙醇，剩余水溶液于冰浴中冷卻，得到墨綠色晶體[Ru(phen)2Cl2]2H20，反應(yīng)式第四步:在氬氣保護(hù)下，將第二步所得的配體L溶解在5(TC-6(rC100L的甲醇中，將第三歩所得到的[Ru(phen)2ClJ2H20溶入25L沸騰的乙腈溶液中，再將沸騰液滴加入上述含有配體L的甲醇溶液中，.混合溶液保持在8(TC反應(yīng)68h，冷卻到室溫，再攪拌3小時(shí)，形成懸浮液體，過(guò)濾，用乙腈洗滌被過(guò)濾掉的固體，將洗漆液與過(guò)濾液混合后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，加入高氯酸鈉的飽和溶液，直到沉淀量不再增加為止，過(guò)濾，用水、乙醇、乙醚依次洗滌沉淀物，真空干燥；然后將干燥后的沉淀物在乙腈/甲醇/飽和高氯酸鈉中重結(jié)晶，最終得到Ru(II)配合物，反應(yīng)式Ru(II)配合物具有明顯的抗癌活性，可用于制備抗癌藥物。實(shí)驗(yàn)證明濃度在O.lnM時(shí)便能夠與胃癌細(xì)胞株7901作用，并且有效抑制率(11%)=36.60%，當(dāng)配合物濃度為lnM時(shí)有效抑制率達(dá)到最大(11%)=49.33%。Ru(II)配合物還可以用于制備抗艾滋病的藥物。由于Ru(II)配合物具有分子光開(kāi)關(guān)功能，同時(shí)具有抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶的活性，因此可以用于制備抗艾滋病的藥物。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明Ru(II)配合物的抗癌活性明顯優(yōu)于Co配合物及順鉑藥物;Ru(II)配合物與DNA具有很高的親和性，鍵合常數(shù)的數(shù)量級(jí)一般在105M—'左右；在插入配體的選擇上，由于選用呋喃為原料，呋喃中含有0原子，0親硬金屬，即Cu、Fe、Ca等生命原子，同時(shí)0又可與H"等形成氫鍵。Ru(II)配合物不僅可用于制備抗癌藥物，還可以用于制備抗艾滋病的藥物。圖l配合物對(duì)胃癌細(xì)胞株7901的抑制效應(yīng)圖2complex+DNA的紫外吸收光譜圖3配合物與EB-DNA復(fù)合物的熒光光譜圖4配合物在不同的濃度下對(duì)DNA黏度的影響圖5配合物在不同的濃度下與pBR322DNA作用的電泳圖，圖中Lane1:DNAcontrol;Lane2-6:[complex]=0.5，1，2,3，5xl0-5mol*L-1。具體實(shí)施方式實(shí)施例lRU(II)配合物的制備第一步將5克(25翻1)1,10-菲咯啉(phen)分批加入到30ml濃硫酸中，并不斷攪拌使之溶解，再加入2.5克溴化鈉，然后緩慢加入15ml濃硝酸，將所有物質(zhì)溶于酸性介質(zhì)后，反應(yīng)物加熱回流2小時(shí)，冷卻到室溫，緩慢倒入400克冰水中，用150mllOM的氫氧化鈉中和至pH值=7，靜置30min后過(guò)濾，濾餅用100ml沸水溶解，除去不溶物，將兩份濾液混合，用5X100mlCH2Cl2萃取，有機(jī)相用50ml水洗滌，于無(wú)水硫酸鎂中干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)產(chǎn)生黃色固體，用甲醇重結(jié)晶，得2.76克黃色針狀產(chǎn)物(1，10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮)；第二歩在氬氣保護(hù)下，將1,10-菲咯啉(phen)-5,6-二酮(0.24g,1.14畫(huà)1)，3,4_二胺基呋喃(0.074g，lmmol)溶于乙醇中，回流反應(yīng)6h。等待反應(yīng)混合物冷卻后，濾出析出的固體，用無(wú)水乙醇重結(jié)晶，得配體b聯(lián)吡啶并[3，2-a;2'，3'-c]-呋喃-[3，4-c]吖嗪；第三步將RuCl;,.H20lg(4.82畫(huà)1)，1,10-菲咯啉(phen)1.91g(9.64mmol)溶于30mlN,N-二甲基甲酰胺中，在氬氣保護(hù)下，加熱回流3h，接著旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去大部分溶劑，剩余溶液冷至室溫，加入丙酮250ml,置于O'C過(guò)夜。抽濾所得晶體并用冰水洗滌。然后將粗產(chǎn)品溶于乙醇和水(l:l)混合溶劑中加熱回流lh，過(guò)濾所得溶液除去不溶物，于濾液中加入23gLiCl，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶液中的乙醇，剩余水溶液于冰浴冷卻得到墨綠色晶體。用乙醚洗滌后真空干燥；第四步在氬氣保護(hù)下，將0.0976g(0.4mmo1)配體L溶解在45ml熱的甲醇中，滴加入沸騰的[Ru(phen)2"2].2H20(0.227g，0.4隨o1)的10ml乙腈溶液。滴入幾滴冰醋酸，混合溶液保持在80'C反應(yīng)6小時(shí)，混合物冷卻到室溫后，再攪拌3小時(shí)，過(guò)濾形成的懸浮液體，然后用乙腈洗滌。在濃縮的過(guò)濾液體中，加入高氯酸鈉的飽和溶液，過(guò)濾，以水、乙醇、乙醚洗滌沉淀,在干燥器中真空干燥兩天;然后在乙腈/甲醇/飽和高氯酸鈉中重結(jié)晶,得到Ru(n)配合物。Ru(II)配合物的元素分析及核磁數(shù)據(jù)Found:C，49.23;H,2.49;N，l1.48%.Calc.ForC40H24C12N8O9Ru:C,51.50;H,2.57;N，12.02%.'HNMR(ppm,DMSO-漆):8,92(d，2H),8.72(dd，4H),8.63(s,2H)，8.34(s,4H)，8.17(m,4H),8.08(d,2H)，7.76(m,4H),7.68(t,2H).(m，multiplet).實(shí)施例2Ru(II)配合物抗癌活性實(shí)驗(yàn)抗癌活性實(shí)驗(yàn)通過(guò)細(xì)胞毒性來(lái)實(shí)現(xiàn)，是通過(guò)利用四唑鐵鹽3-(4,5-二甲噻唑)-2,5-二苯基溴化四唑錄(MTT)為染料進(jìn)行的。配合物用磷酸沖液配制置于4'C冰箱中備用。系列儲(chǔ)備溶液在96眼微孔滴定盤中的培養(yǎng)基中備好。配合物以濃度梯度(lnM-luM)的方式加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，并且24小時(shí)內(nèi)不用更換介質(zhì)。在設(shè)定反應(yīng)時(shí)間結(jié)束時(shí)，培養(yǎng)基被移到含有0.5mg/mlMTT的200iiL的介質(zhì)中同時(shí)微孔滴定盤被放置在培養(yǎng)箱中37'C恒溫4小時(shí)。介質(zhì)中加入100ulDMSO以增加這種紫色染料的溶解度。最后，產(chǎn)品通過(guò)在595nm熒光下測(cè)定每個(gè)孔的光密度得數(shù)值。抑制率(11%)通過(guò)下列公式計(jì)算II(%)=(l-7/C)X100%，其中分別代表經(jīng)過(guò)配合物處理過(guò)的部分和未處理過(guò)的部分的光密度值。重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)三次。本次實(shí)驗(yàn)利用胃癌細(xì)胞株7901來(lái)完成，配合物濃度在O.lnM時(shí)便能夠與胃癌細(xì)胞株7901作用，并且有效抑制率(11%)=36.60%。當(dāng)配合物濃度為lyM時(shí)有效抑制率達(dá)到最大(11%)=49.33%。如圖1所示。這些結(jié)果表明Ru(II)配合物能夠有效抑制胃癌細(xì)胞，這可為藥物制備提供一些有價(jià)值的信息。實(shí)施例3Ru(II)配合物與DNA的相互作用實(shí)驗(yàn)吸收光譜研究圖2曲線a為Ru(II)配合物的紫外吸收光譜，曲線bh為Ru(II)配合物中加入DNA后的紫外吸收光譜，由圖可見(jiàn)當(dāng)加入DNA后配合物的吸收峰強(qiáng)度降低。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[1(']，當(dāng)小分子以嵌入方式結(jié)合于CT-DNA雙螺旋堿基對(duì)之間時(shí)，其吸收光譜表現(xiàn)出減色效應(yīng)；當(dāng)小分子以靜電方式結(jié)合于CT-DNA時(shí)，其吸收光譜表現(xiàn)出增色效應(yīng)；因此，Ru(II)配合物此時(shí)與CT-DNA之間的相互作用應(yīng)以嵌插作用為主。配合物對(duì)DNA-EB熒光光譜的影響溴化乙錠(EB)為一共扼平面分子，本身熒光很弱，但能專一性地插入DNA雙螺旋或三螺旋內(nèi)部的堿基對(duì)之間使熒光顯著增強(qiáng)，當(dāng)EB從DNA中出來(lái)或DNA雙螺旋減少時(shí)，熒光發(fā)生猝滅，因而EB可用作DNA結(jié)構(gòu)探針。".由圖3可看出，在緩沖溶液中，隨著配合物濃度的不斷增加，DNA-EB熒光逐漸下降。說(shuō)明Ru(II)配合物與DNA是以嵌插方式相結(jié)合的。CTDNA的熱變性實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定DNA的熱變性溫度(O可以區(qū)分配合物與DNA的作用模式(嵌插,外部鍵合)。配合物與DNA發(fā)生插入反應(yīng)，將穩(wěn)定DNA的雙鏈結(jié)構(gòu)，并使二急劇上升；而配合物僅與DNA發(fā)生外部鍵合時(shí)，則"上升幅度較小或不上升[12]。在本實(shí)驗(yàn)條件下,DNA的"為64'C。當(dāng)DNA與Ru(II)配合物作用后，其4為70'C。這表明Ru(II)配合物與DNA是以嵌插方式相結(jié)合的。黏度研究具有光學(xué)活性的光物理探針對(duì)于探討鍵合模式一般可以提供必要的但不是充分的證據(jù)["].在缺乏晶體數(shù)據(jù)的情況下，黏度測(cè)定一般被認(rèn)為是確定鍵合模式最有力的證據(jù)之一["]。從圖4可出，DNA與配合物相互作用后，黏度值升高。黏度對(duì)分子長(zhǎng)度變化非常敏感。當(dāng)小分子配合物以經(jīng)典插入方式與DNA相互作用時(shí)，DNA相鄰堿基對(duì)的距離會(huì)增大以容納插入的配合物分子，導(dǎo)致DNA螺旋伸長(zhǎng)，相應(yīng)DNA黏度增加。DNA本身是一多聚陰離子，在溶液中，由于負(fù)電荷之間的相互靜電排斥，使DNA大分子較為伸展，而當(dāng)配合物陽(yáng)離子與DNA帶負(fù)電荷的磷酸氧基團(tuán)以靜電作用結(jié)合時(shí)，使得DNA的負(fù)電荷被部分中和，導(dǎo)致DNA螺旋收縮，分子長(zhǎng)度變小，相應(yīng)DNA黏度降低.電化學(xué)行為研究根據(jù)循環(huán)伏安曲線所得的式量電位的移動(dòng)可以判斷小分子與DNA相互作用模式^。通常，當(dāng)外源小分子與DNA發(fā)生插入作用時(shí)，小分子的式量電位正移；反之，如果外源小分子與DNA骨架上的帶負(fù)電荷的磷酸基發(fā)生靜電作用，則其式量電位負(fù)移。由表l可見(jiàn)，純粹Ru(Il)配合物的陽(yáng)極峰電位(Epa)和陰極峰電位(Ep。)分別為1.1481V和-0.9001V，式量電位(E^)為0.1240V.Ru(II)配合物與DNA作用后的陽(yáng)極峰電位(EP)和陰極峰電位(EJ分別為I.1592V和-0.8704V，式量電位(E,")為O.1444V.式量電位正移，說(shuō)明Ru(II)配合物與DNA以經(jīng)典插入方式相互作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>凝膠電泳分析為了進(jìn)一步研究Ru(II)配合物與DNA的相互作用，我們做了凝膠電泳實(shí)驗(yàn)。由圖5可看出，當(dāng)Ru(II)配合物濃度達(dá)到0.5xl(^mol，L"時(shí)便可將pBR322DNA切割成線性(formIII)，當(dāng)配合物濃度達(dá)到1.0xl(TSmol，L"時(shí)線性很明顯，并且隨著配合物濃度增大，線性逐漸增加，超螺旋DNA(formI)逐漸減少直至消失。說(shuō)明該配合物具有較高的切割質(zhì)粒DNA的活性。權(quán)利要求1、一種具有抗癌活性的Ru(H)配合物，其特征在于，分子結(jié)構(gòu)式為全文摘要本發(fā)明提供了一種具有抗癌活性的Ru(II)配合物，其制備步驟包括氧化1，10-菲咯啉得1，10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮；1，10-菲咯啉(phen)-5，6-二酮與3，4-二胺基呋喃反應(yīng)得配體L；RuCl₃與1，10-菲咯啉反應(yīng)得到[Ru(phen)₂Cl₂]·2H₂O；再與配體L反應(yīng)得終產(chǎn)物。本發(fā)明Ru(II)配合物的抗癌活性明顯優(yōu)于Co配合物及順鉑藥物；Ru(II)配合物與DNA具有很高的親和性，鍵合常數(shù)的數(shù)量級(jí)一般在10⁵M^-1左右；在插入配體的選擇上，由于選用呋喃為原料，呋喃中含有氧原子，氧親硬金屬即Cu、Fe、Ca等生命原子，使其更具有好的抗癌效果。文檔編號(hào)C07F15/00GK101220059SQ200810054429公開(kāi)日2008年7月16日申請(qǐng)日期2008年1月8日優(yōu)先權(quán)日2008年1月8日發(fā)明者席小莉,頻楊申請(qǐng)人:山西大學(xué)