甲哌佐酯光學活性體和以其作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑的制作方法【專利摘要】本發(fā)明提供溴化甲哌佐酯的光學活性體，并提供含有該光學活性體作為有效成分的基于支氣管擴張作用和抗炎作用的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其是(3R)或(3S)?3?[(羥基)(二苯基)乙酰氧基]?1,1?二甲基哌啶鎓溴化物(以下稱為“(R)或(S)?溴化甲哌佐酯”)，是含有該(R)或(S)?溴化甲哌佐酯作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑，另外，是給藥方式為經(jīng)氣道給藥或吸入給藥的慢性阻塞性肺疾病改善劑?！緦＠f明】甲哌佐酯光學活性體和以其作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑
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[0001]本發(fā)明涉及慢性阻塞性肺疾病改善劑，具體而言，涉及含有溴化甲哌佐酯（以下，有時也簡稱為"甲哌佐酯(mepenzolate)"）的光學活性體作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑?！?br>背景技術：
】[0002]慢性阻塞性肺疾病(COPD:ChronicObstructivePulmonaryDisease:以下有時也記為"C0PD"）是由于各種原因、特別是由于吸煙而使肺產(chǎn)生慢性炎癥，并因此而引起肺胞的破壞、支氣管粘液腺的肥大，結果造成氣促、或者增加咳嗽或咳痰的疾病。[0003]以前，稱為肺氣腫(PE:pulmonaryemphysema)的疾病與稱為慢性支氣管炎（CB:chronicbronchitis)的疾病二者多以各種比例并發(fā)，因此目前將由二者引起的疾病統(tǒng)稱為慢性阻塞性肺疾病(coro)。[0004]根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的估算，2005年全世界一年有300萬人因⑶PD而喪命，占死亡原因的第4位，預測今后10年間將進一步增加30%。在日本根據(jù)厚生勞動省的統(tǒng)計，2005年日本人死亡總數(shù)的1.3%是因coro而死亡，占死亡原因的第10位，僅男性則占第7位。[0005]C0PD發(fā)病的最大原因是吸煙。coro患者的90%為吸煙者（非專利文獻1)，與非吸煙者相比，吸煙者中C0PD發(fā)病的風險為6倍以上。吸煙者的約10~15%會出現(xiàn)C0PD發(fā)病，而僅高齡者則吸煙者的近50%為C0PD。作為其他原因，可列舉出室內(nèi)空氣污染或大氣污染、化學物質(zhì)或粉塵的吸入、遺傳所導致的coro、幼兒期肺炎/支氣管炎等。[0006]作為其病狀，是以氣流受限、即呼氣困難為特征的疾病，而病狀的本質(zhì)是氣道的慢性炎癥。由于吸煙、吸入物質(zhì)，從中樞氣道至細支氣管(peripheralbronchus)，在肺的各種水平上引起炎癥。其結果，認為由于蛋白酶-抗蛋白酶的不均等、氧化劑-抗氧化劑的不均等等，導致肺胞的破壞、支氣管粘液腺的肥大。[0007]該coro會產(chǎn)生不可逆的氣道破壞，因此是無法治愈的疾病。通過禁煙、由支氣管擴張劑、祛痰劑、鎮(zhèn)咳劑等的給藥進行的藥物療法、或者氧療法等僅使癥狀緩解，C0PD是極其麻煩的疾病。[0008]從上述觀點出發(fā)，現(xiàn)狀是迄今提出了各種coro改善劑、或者改善方法(例如專利文獻1、2)，但期待更為優(yōu)異的coro改善劑的出現(xiàn)。[0009]基于上述背景，本發(fā)明人等為了進行C0PD改善藥的開發(fā)，從已上市藥物中進行了探索研究，結果確認作為腸易激綜合征（irritablebowel)的治療藥而被用于臨床的溴化甲哌佐酯[商品名：Trancolon(注冊商標）]顯示出基于支氣管擴張作用和抗炎作用的C0PD的治療效果，完成了專利申請(專利文獻3)。[0010]此次，本發(fā)明人等進行了進一步研究，著眼于溴化甲哌佐酯的化學結構，發(fā)現(xiàn)將其作為兩種光學活性體制成的（R)型溴化甲哌佐酯、以及（S)型溴化甲哌佐酯也具有優(yōu)異的coro改善作用，從而完成了本發(fā)明。[0011]已知溴化甲哌佐酯為具有下消化道的運動/收縮抑制作用的抗膽堿能藥，從1967年起作為腸易激綜合征的治療藥在臨床上使用，但未知對于coro治療有效，另外，迄今未知將該溴化甲哌佐酯作為光學活性體進行制備，各個光學活性體（即R型、s型）也有兼具支氣管擴張作用和抗炎作用的coro治療的改善效果。[0012]現(xiàn)有技術文獻專利文獻專利文獻1:日本特開2006-56890號公報專利文獻2:日本特開2008-189667號公報專利文獻3:PCT/JP2013/055476非專利文獻非專利文獻l:AnnualReviewofMedicine,V〇1.40，p411_429(1989)?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0013]發(fā)明要解決的問題因此，本發(fā)明鑒于上述現(xiàn)狀，目的在于提供溴化甲哌佐酯的光學活性體，并提供含有該光學活性體作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑。[0014]用于解決問題的方案用來解決上述問題的本發(fā)明，作為本發(fā)明的一個基本方式，是具有下式表示的立體結構的（3R)-3-[(羥基）（二苯基）乙酰氧基]-1，1-二甲基哌啶鐵溴化物（（3R)-3-[(hydroxy)(diphenyl)acetoxy]_l，1-dimethylpiperidiniumbromide，以下稱為"(R)_溴化甲哌佐酯"）。[0015]另外，作為本發(fā)明的另一基本方式，是具有下式表示的立體結構的（3S)-3_[(羥基）（二苯基）乙酰氧基]-1，1-二甲基哌啶鑰溴化物（以下稱為"(S)-溴化甲哌佐酯"）。[0016]進而，作為本發(fā)明的又一方式，是特征在于以上述各式表示的(R)或(S)-溴化甲哌佐酯作為有效成分的慢性阻塞性肺疾病改善劑，更具體而言，是給藥方式為經(jīng)氣道給藥或吸入給藥的慢性阻塞性肺疾病改善劑。[0017]另外，本發(fā)明是上述各式表示的（R)或（S)-溴化甲哌佐酯的制備方法，具體而言，是特征在于使二苯乙醇酸在縮合劑的存在下與(R)或(S)-3_羥基-1-甲基哌啶反應，接著將所得產(chǎn)物與甲基溴進行處理的(R)或(S)-溴化甲哌佐酯的制備方法。[0018]發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，對于已用作腸易激綜合征的治療藥、安全性經(jīng)確認的溴化甲哌佐酯，提供以其光學活性體即(R)或(s)-溴化甲哌佐酯作為有效成分的coro改善劑。[0019]本發(fā)明提供的C0PD改善劑的有效成分即（R)或(S)-溴化甲哌佐酯是已在臨床上使用的溴化甲哌佐酯的光學活性體，具有優(yōu)異的C0PD改善作用，特別在經(jīng)氣道給藥和吸入給藥中具有顯著效果。[0020]其作用基于支氣管擴張作用和抗炎作用，從迄今不存在兼具這兩種作用的coro改善劑的觀點考慮，本發(fā)明的coro改善劑是極其特異性的coro改善劑。[0021]另外，本發(fā)明提供的coro改善劑的有效成分即（R)或(s)-溴化甲哌佐酯特征在于，利用與毒蕈堿拮抗作用、抗膽堿能作用不同的作用機理而顯示出效果。[0022]因此，在迄今不存在有效的⑶ro改善劑的狀況下，通過給予特異性且安全的(R)或(S)-溴化甲哌佐酯，可進行其癥狀的改善，其醫(yī)療上的效果是極其特異性的。【附圖說明】[0023]圖1是表示試驗例2.1中的受體結合能力(體外），即與[3H]NMS的結合結果的圖；圖2是對于試驗例2.1中的受體結合能力(體外），以IC5Q值表示的圖；圖3是表示對于試驗例2.2中的受體(M3受體)結合能力的結果的圖；圖4是表示對于試驗例2.2中的受體(M2受體)結合能力的結果的圖；圖5是表示試驗例3.1中的溴化甲哌佐酯(外消旋體、R型、S型)在3.75yg/kg給藥量下的氣道阻力(airwayresistance)的測定結果的圖；圖6是表示試驗例3.2中的溴化甲哌佐酯(外消旋體、R型、S型)在38yg/kg給藥量下的氣道阻力(airwayresistance)的測定結果的圖；圖7是表示試驗例3.2中的溴化甲哌佐酯(外消旋體、R型、S型)在3.8yg/kg給藥量下的氣道阻力(airwayresistance)的測定結果的圖；圖8是表示試驗例4.1中的細胞總數(shù)和嗜中性粒細胞(neutrophil)數(shù)的測定結果的圖；圖9是表示試驗例4.2中的細胞總數(shù)的測定結果的圖；圖10是表示試驗例4.2中的嗜中性粒細胞數(shù)的測定結果的圖；圖11是表示試驗例4.3中的TNF-α的測定結果的圖；圖12是表示試驗例4.3中的MIP-2的測定結果的圖；圖13是表示試驗例4.3中的NCP-1的測定結果的圖；圖14是表示試驗例4.3中的KC的測定結果的圖；圖15是表示試驗例5中的糞粒排出量的結果的圖；圖16是表示試驗例6中的心率的結果的圖?！揪唧w實施方式】[0024]本發(fā)明提供的coro改善劑中使用的(R)或(s)-溴化甲哌佐酯是臨床上使用的溴化甲哌佐酯的光學活性體。[0025]應予說明，臨床上使用的溴化甲哌佐酯在第十六次改正日本藥局方中收載為具有以下結構式。[0026]即，按照外消旋體(對映體的等量混合物）的記載規(guī)則，立體記載一方的光學活性體的結構，用加上了"以及對映異構體"的表述的記載來表示。[0027]具體而言，本發(fā)明的(R)或(S)_溴化甲哌佐酯可以通過以下制備方法來制備。[0028]即，若表示(R)_溴化甲哌佐酯的制備方法，則可按照以下化學式進行制備。[0029]即，使二苯乙醇酸（II)在適當?shù)挠袡C溶劑中、縮合劑的存在下與(R)-3_羥基-1-甲基哌啶（III)反應，接著將所得的產(chǎn)物（IV)[以下記為"(R)-t-甲哌佐酯"]與甲基溴進行處理，由此制備(R)-溴化甲哌佐酯（I)。[0030]作為所用的有機溶劑，只要是不對反應產(chǎn)生影響的有機溶劑則沒有特別限制，優(yōu)選為二甲基甲酰胺(DMF)、二乙基甲酰胺(DEF)等溶劑。[0031]作為用于反應中的縮合劑，可優(yōu)選使用CDI(羰二咪唑）。[0032]反應通過將式（II)和（III)的兩個化合物、以及作為縮合劑的⑶I溶解于例如DMF中，在30~100°C左右的溫度下攪拌1~24小時而進行。反應結束后，通過本身公知的常規(guī)后處理(提取、蒸餾除去溶劑、色譜等），可獲得作為目標的式(IV)表示的(R)-t-甲哌佐酯。[0033]所得的（R)-t-甲哌佐酯（IV)不進行純化，通過在例如醇、乙腈等有機溶劑中與甲基溴在室溫至溫和的加熱下進行攪拌，可以作為結晶得到本發(fā)明的目標化合物即式（I)表示的(R)_溴化甲哌佐酯。[0034]應予說明，上述說明為針對(R)-溴化甲哌佐酯的制備方法，在獲得(S)-溴化甲哌佐酯的情況下，可以在上述化學反應式中，使用（S)-3_羥基-1-甲基哌啶代替式（III)的(R)-3-羥基-1-甲基哌啶，采用同樣的方法得到作為目標的(S)-溴化甲哌佐酯。[0035]本發(fā)明提供的coro改善劑以具有上述立體結構的化學式表示的(R)或(S)-溴化甲哌佐酯作為有效成分，可優(yōu)選以經(jīng)氣道給藥、吸入給藥的方式給藥。[0036]上述經(jīng)氣道給藥用的經(jīng)氣道劑、吸入給藥用的吸入劑是指用于到達氣管、支氣管、肺等各組織的藥物組合物，優(yōu)選為適合于滴鼻劑或者經(jīng)鼻或經(jīng)肺給藥的組合物，這些組合物若以霧化吸入器(nebulizer)、霧化器(atomizer)、滴管(dropper)、移液管(pipette)、插管(cannula)等進行給藥則有效。[0037]此時的經(jīng)氣道劑、吸入劑可以將(R)或（S)-溴化甲哌佐酯以粉末制劑、溶液制劑、或者懸浮液制劑的形態(tài)進行制備。[0038]以粉末制劑制備經(jīng)氣道劑和吸入劑的情況下，可以通過將有效成分即（R)或（S)-溴化甲哌佐酯直接微細化進行制備，或者加入適當?shù)馁x形劑、潤滑劑、粘合劑、崩解劑、穩(wěn)定劑、矯味劑等添加劑再微細化進彳T制備。[0039]另外，以溶液制劑或懸浮制劑制備經(jīng)氣道劑和吸入劑的情況下，例如可以將(R)或(S)_溴化甲哌佐酯溶解或懸浮于水中進行制備，或者溶解或懸浮于水與輔助溶劑例如乙醇、丙二醇、聚乙二醇之類的醇系輔助溶劑所成的混合溶劑的混合物中進行制備。[0040]這種溶液或懸浮液中可以進一步含有防腐劑、增溶劑、緩沖劑、等滲劑、吸收促進劑、增桐劑等。[0041]如上所述制成的經(jīng)氣道劑和吸入劑采用吸入劑領域中的常規(guī)手段，例如滴管、移液管、插管或霧化器、霧化吸入器等噴霧器，以霧狀對鼻腔內(nèi)或口腔內(nèi)、或者氣管、支氣管、肺等組織直接給藥。[0042]使用噴霧器的情況下，可以作為與適當?shù)膰婌F劑（例如二氯氟甲烷、三氯氟甲烷、或二氯四氟甲烷之類的含氯氟烴、或者二氧化碳等氣體等)一起形成加壓包裝形式的氣溶膠(aerosol)進行噴霧，或者使用霧化吸入器進行給藥。[0043]本發(fā)明的coro改善劑中的有效成分即（R)或(S)-溴化甲哌佐酯的給藥量根據(jù)制劑制備的方法、劑型、疾病的癥狀、患者的年齡、體重等而不同，不能一概限定，例如作為臨床量，經(jīng)氣道劑、吸入劑給藥的情況下成人每天0.5~200mg，對于給藥次數(shù)也不能一概限定，也可以一天一次至多次進行給藥。[0044]另外，本發(fā)明的C0PD改善劑中的有效成分即（R)或（S)-溴化甲哌佐酯通過與具有抗膽堿能作用的藥物例如異丙阿托品（ipratropium)、東莨菪堿、哌侖西平、噻托溴銨(tiotropium)、氧托溴銨(oxitropium)等聯(lián)合給藥，可以更有效地使用。實施例[0045]以下通過具體的試驗例、實施例等對本發(fā)明進行更詳細的說明，但本發(fā)明并不限于這些記載。[0046]應予說明，各圖中記載的"Mep"或[(±)_Mep]是指外消旋體的溴化甲哌佐酯，"R-Mep"或[(R)-Mep]是指(R)-溴化甲哌佐酯(R型），"S-Mep"或[(S)-Mep]是指(S)-溴化甲哌佐酯(S型）。另外，"PPE"是指豬胰彈性蛋白酶(porcinepancreaticelastase)。[0047]另外，圖中的*為ρ〈〇·〇5,**為ρ〈0·01。[0048]以下實施例中，各種儀器分析按照以下測定方法進行。[0049]〈測定方法〉IR:JeolFT-IRSPX60光譜儀，薄膜法hNMR:Agi1ent400-MR光譜儀，DMS0中/400MHz13CNMR:Agilent400-MR光譜儀，DMS0中/100MHz高分辨質(zhì)譜(HRMS):JeolJMS-700MStation旋光度:JascoP-1010旋光計（polarimeter)〇[0050]實施例1:(R)_溴化甲哌佐酯(R型）的合成向?qū)Ⅳ识溥颍–DI)883mg(5.4mmo1)溶解于DMF8mL而成的溶液中加入二苯乙醇酸830mg(3.6mmo1)，室溫下攪拌15分鐘。在80°C下向該溶液中滴加將(R)-3-羥基-1-甲基哌啶500yL(4.3mmo1)溶解于DMF4mL而成的溶液。然后，在80°C下攪拌18小時。反應通過在室溫下加入水而停止。將有機物用乙酸乙酯進行提取。收集提取液用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，將溶劑減壓濃縮。將所得殘渣加到短硅膠柱色譜上，用乙酸乙酯洗脫，接著再溶解于二氯甲烷。將所得溶液用碳酸氫鈉水溶液和鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，將溶液真空濃縮，由此以黃色油狀物得到(R)-t-甲哌佐酯860mg(72%)。[0051]該產(chǎn)物不進行純化而用于下一步驟。[0052]將上述所得的（R)-t-甲哌佐酯500mg(1.5mmo1)溶解于乙腈6mL，向該溶液中加入甲基溴3.6mL(7.0mmol)，室溫下攪拌5小時。將沉淀物濾出，用乙醚洗滌，由此以無色固體得到(R)-溴化甲哌佐酯(R型）570mg(77%)。[0053]IR?ax:3432，3315，1735，1216，1093，1068，923，705cm-110H),6.82(s，1H)，5.28(m，1H)，3.63(dd，J=13.5,3.5Hz,1H),3.49(dd,J=13.5,4.7Hz,1H),3.37(m,1H),3.33(m,1H),3.10(s,3H),2.82(s,3H),1.63-1.85(m,4H)13C匪R(CDC13)S:171.9，143.0，142.7，128.0，127.9，127.7，127.6，127.0，80.7，66.8，61.6，60.8，25.2，16.2、[a]D25：-8.12(c1.00,MeOH)熔點：224.2~224.9°HRMS(FAB):以C12H19O5計算：[M+l]+:340·1913，實測值:m/z=340·1905。[0054]實施例2:(S)_溴化甲哌佐酯(S型）的合成除了使用（S)-3-羥基-1-甲基哌啶代替(R)-3-羥基-1-甲基哌啶以外，通過與實施例1同樣的方法以無色固體得到(S)-溴化甲哌佐酯。收率為72%。[0055]IR?ax:3436，3299，1733，1214，1097，1066，929cm-110H),6.81(s，1H)，5.27(m，1H)，3.65(dd，J=13.4,3.4Hz,1H),3.51(dd,J=13.4,4.6Hz,1H),3.36(m,1H),3.32(m,1H),3.09(s,3H),2.81(s,3H),1.63-1.85(m,4H)13C匪R(CDC13)S:171.9，143.0，142.7，128.0，127.9，127.7，127.6，127.0，80.7,66.8,61.6,60.8,25.2,16.2[a]D25：+8.33(c1.00,MeOH)熔點:223.1~223.8°HRMS(FAB):以C12H19O5計算：[M+l]+:340·1913，實測值:m/z=340·1928。[0056]試驗例1:利用溴化甲哌佐酯(R型和S型）的氣道給藥的肺組織濃度的測定〈方法〉對4~6周齡的ICR小鼠以20mg/kg的用量將溴化甲哌佐酯的R型和S型進行經(jīng)氣道給藥，測定給藥后5分鐘、15分鐘和30分鐘之后肺組織中各溴化甲哌佐酯的量(肺組織濃度）。[0057]即，溴化甲哌佐酯給藥后，在各測定時間將小鼠的全肺取出，用含50U/mL肝素的磷酸緩沖生理鹽水(PBS)進行勻漿，通過離心分離得到試驗樣品。將試驗樣品分為各300yL，使用八111；[00111111：抑-0.5離心過濾器進行超濾，將所得樣品通過使用03；[06101；^310611八(0.46X25cm)的高效液相色譜(HPLC)，測定細胞組織中溴化甲哌佐酯量。[0058]HPLC的條件如下所示，檢測器：Waters2695Allianceseparationmodule、以及Waters2996photodiodearraydetector(Waters公司制）洗脫劑:溶劑A(含0.1M六氟磷酸鹽的水)/溶劑B(乙腈）流速:1.0mL/分鐘流動相:70%溶劑A/30%溶劑B測定波長：220nm〇[0059]〈結果〉其結果示于下表1，[表1]n.d.:未檢出。[0060]從表中結果可確認，經(jīng)氣道給藥的溴化甲哌佐酯的R型和S型以維持其光學活性的狀態(tài)殘留在肺組織中。[0061]另外，從組織濃度隨著給藥后時間的推移而減少可知，經(jīng)氣道給藥的藥物向全身移動。[0062]試驗例2.1:受體結合能力(體外）（其一)〈方法〉受體結合能力通過以下方式進行:使用人M3毒蕈堿受體超表達CH0-K1細胞的膜部分(membranefraction)，測定與1-[N_甲基-3H]甲溴東莨菪堿（[3H]NMS，82Cimmol的特異性活性）的競爭性抑制。細胞膜的蛋白質(zhì)濃度為5.Oyg/well，[3H]WS濃度為2.OnM。[0063]抑制劑濃度（甲哌佐酯）的范圍（10-14~10-5Μ)通過制作比較曲線而進行試驗。非特異性結合在ΙμΜ阿托品的存在下進行測定。[0064]試劑用結合緩沖液(磷酸緩沖液/鹽水)使總量達到200yL。室溫下培育2小時達到平衡后，反應混合液使用經(jīng)含有1.0%聚乙烯亞胺的洗滌緩沖液預處理1小時的GF/C濾板進行過濾。[0065]將結合的[3H]匪S和遊離的[3H]匪S通過快速真空過濾進行分離，用清洗緩沖液(50mM三羥甲基氨基甲烷(Tris)，100mM鹽水，pH7.4)洗滌3次。將所得的過濾器干燥后，使固態(tài)閃爍體MeltiLexA(PerkinElmer公司制）融合，使用β-計數(shù)器（MicroBetamicroplatescintillationcounter(微板閃爍計數(shù)器）（Trilux:PerkinElmer公司制)進行測定、定量。[0066]〈結果〉其結果示于圖1。[0067]從圖1所示的結果可明確，溴化甲哌佐酯的外消旋體(·）和R型（)與M3受體的結合相同程度地強，S型（▼)結合能力弱。[0068]另外，對于受體結合能力，以其50%抑制濃度(IC5Q)表示的結果示于圖2。[0069]從圖中所示的結果可明確，與溴化甲哌佐酯的外消旋體（IC5Q=32.1nM)(·)相比，R型（IC5Q=25·3nM)()具有與M3受體的結合能力更強的趨勢，S型（ID5Q=299·7nM)(▼)的結合能力更弱。[0070]試驗例2.2:受體結合能力(體外）（其二)〈方法〉受體結合能力通過以下方式進行:使用人毒蕈堿M3受體(hM3R)超表達CH0-K1細胞、或者人毒蕈堿M2受體(hM2R)超表達CH0-K1細胞的膜部分，測定與1-[N-甲基-3H]甲溴東莨菪堿([3H]NMS、85.5Cimmol的特異性活性）的競爭性抑制。細胞膜的蛋白質(zhì)濃度為10.0yg/well，[3!1]匪5濃度為2.〇11]\1。[0071]抑制劑濃度（甲哌佐酯）的范圍~3Χ10-5Μ)通過制作比較曲線進行試驗。非特異性結合在2.5μΜ阿托品的存在下進行測定。[0072]試劑用結合緩沖液(磷酸緩沖液/鹽水)使總量達到200yL。室溫下培育2小時達到平衡后，反應混合液使用經(jīng)含有1.0%聚乙烯亞胺的清洗緩沖液（50mM三羥甲基氨基甲烷，100mM鹽水，pH7.4)預處理1小時的GF/C濾板進行過濾，用冰冷的清洗緩沖液洗滌4次。[0073]將所得的過濾器干燥30分鐘后，固定于固態(tài)閃爍體Me11iLexA(me1t-〇nscintillationsheet，PerkinElmer公司制）。使用MicroBetaTriluxmicroplatescintillationcounter(微板閃爍計數(shù)器）（PerkinElmer公司制）對殘留在過濾器上的放射活性進行測定。[0074]由對于hM3R或hM2R的[3H]匪S的實驗所得常數(shù)(Kd)和濃度求出實驗性IC5Q，將平衡時的親和性(affinity)定為平衡詰抗解離常數(shù)(ici)值。應予說明，Ki值由3次各自的曲線求出，使用Prism(GraphPadSoftware公司制）進行修正。[0075]〈結果〉外消旋體的溴化甲哌佐酯、（R)_溴化甲哌佐酯、和（S)-溴化甲哌佐酯的對于hM2RShM3R的Ki值示于下表2。[0076][表2][0077]另外，各濃度的結合能力的推移結果示于圖3和圖4。[0078]圖3是對于hM3R(M3受體)的結果，圖4是對于hM2R(M2受體)的結果。[0079]從表2所示的結果、以及圖3所示的結果可明確，關于對hM3R(M3受體）的親和性，(s)-溴化甲哌佐酯（Λ)比(R)-溴化甲哌佐酯（)和外消旋體的溴化甲哌佐酯（〇)低。[0080]試驗例3.1:對乙酉先甲膽堿（methacholine)誘發(fā)的氣道收縮（airwayconstriction)的效果(其一)〈方法〉進行由乙酰甲膽堿誘發(fā)的氣道阻力(airwayresistance)的升高測定。[0081]對4~6周齡的ICR小鼠進行5次lmg/mL乙酰甲膽堿的20秒噴霧給藥。乙酰甲膽堿的各給藥結束后，利用快照法（snapshottechnique)測定氣道阻力。所有數(shù)據(jù)采用FlexiVent軟件解析。[0082]將溴化甲哌佐酯的外消旋體、R型、S型各3.75yg/kg進行經(jīng)氣道給藥，給藥1小時后采用上述方法使小鼠暴露于噴霧化的乙酰甲膽堿中5次，測定此時的各給藥時的氣道阻力。[0083]〈結果〉其結果示于圖5。[0084]從圖5所示的結果可明確，溴化甲哌佐酯的S型（▼)幾乎未表現(xiàn)出效果，外消旋體()和R型（·)表現(xiàn)出顯著的氣道阻力抑制效果，而R型更優(yōu)異一些。[0085]試驗例3.2:對乙酉先甲膽堿誘發(fā)的氣道收縮(airwayconstriction)的效果(其二)〈方法〉進行由乙酰甲膽堿誘發(fā)的氣道阻力(airwayresistance)的升高測定。[0086]用水合氯醛(500mg/kg)麻醉4~6周齡的ICR小鼠，實施氣管切開手術，將8mm直徑的金屬管插入支氣管。[0087]以1次排氣量8.7mL/kg和呼氣末正壓通氣（positiveend-expiratorypressure)2~3cmH20使小鼠機械地按150呼吸/分鐘進行呼吸。[0088]為了由乙酰甲膽堿誘發(fā)的氣道阻力(airwayresistance)，隔開40秒的間隔，以20秒/4次暴露于噴霧狀乙酰甲膽堿(5mg/kg)中，利用快照法(snapshottechnique)測定氣道阻力。[0089]將溴化甲哌佐酯的外消旋體、R型、S型各38yg/kg和3.8yg/kg進行經(jīng)氣道給藥，給藥1小時后采用上述方法使小鼠暴露于噴霧化的乙酰甲膽堿中5次，測定此時的各給藥時的氣道阻力。[0090]各數(shù)據(jù)采用FlexiVent軟件解析。[0091]〈結果〉其結果示于圖6(38yg/kg給藥)和圖7(3.8yg/kg給藥）。[0092]可明確，給藥用量低的情況下（圖7:3.8yg/kg給藥），溴化甲哌佐酯的S型（Λ)幾乎未表現(xiàn)出效果，外消旋體(〇）和R型（)表現(xiàn)出顯著的氣道阻力抑制效果，而用量多的情況下（圖6:38yg/kg給藥），溴化甲哌佐酯的S型（Λ)表現(xiàn)出與外消旋體（〇）和R型（)相同程度的氣道阻力抑制效果。[0093]試驗例4.1:對豬胰彈性蛋白酶(PPE)誘發(fā)的炎癥的效果(其一)〈方法〉對4~6周齡的ICR小鼠，將外消旋體、R型、S型的各溴化甲哌佐酯以38yg/kg的給藥量進行1次經(jīng)氣道給藥。[0094]溴化甲哌佐酯給藥1小時后，以100yg/小鼠給予豬胰彈性蛋白酶(PPE)。接著，豬胰彈性蛋白酶給藥24小時后，從肺采集支氣管肺胞灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF)，測定細胞總數(shù)和嗜中性粒細胞數(shù)。[0095]〈結果〉其結果示于圖8。[0096]從圖8所示的結果可明確，在細胞總數(shù)和嗜中性粒細胞數(shù)的任一者中，溴化甲哌佐酯的R型具有較為優(yōu)異的減少效果，而外消旋體和S型為相同程度的效果。_7]試驗例4.2:對豬胰彈性蛋白酶(PPE)誘發(fā)的炎癥的效果(其二)〈方法〉作為給藥用量的比較，對4~6周齡的ICR小鼠，將外消旋體、R型、S型的各溴化甲哌佐酯以7.5yg/kg和38yg/kg的給藥量進行1次經(jīng)氣道給藥，由此進行研究。[0098]溴化甲哌佐酯給藥1小時后，以20U/kg給予豬胰彈性蛋白酶(PPE)。接著，豬胰彈性蛋白酶給藥6小時后，從肺采集支氣管肺胞灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid、BALF)。應予說明，BALF通過由氣管插管將肺用含有肝素（50U/mL)的生理鹽水洗滌（2次)進行米集。[00"]對于采集的BALF，使用血細胞計數(shù)板(hemocytometer)測定細胞總數(shù)。將細胞用Cytospin4(ThermoElectron公司制、注冊商標)離心分離后，用Diff-Quik試劑進行固定，作為嗜中性粒細胞數(shù)相對于細胞總數(shù)的比率來測定嗜中性粒細胞數(shù)。[0100]〈結果〉其結果示于圖9(細胞總數(shù))和圖10(嗜中性粒細胞數(shù))中。[0101]從圖中所示的結果可知，通過溴化甲哌佐酯的給藥，在細胞總數(shù)和嗜中性粒細胞數(shù)的任一者中均出現(xiàn)減少效果，外消旋體、R型、S型的各溴化甲哌佐酯之間該減少效果沒有太大差異。[0102]另外，未出現(xiàn)因給藥用量的差異造成的顯著的效果差異。[0103]試驗例4.3:對豬胰彈性蛋白酶(PPE)誘發(fā)的炎癥的效果(其三)作為對PPE誘發(fā)的炎癥的效果，測定支氣管肺胞灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid，BALF)中細胞因子和趨化因子的水平。[0104]B卩，作為炎性因子即細胞因子，測定促炎細胞因子（pro-inflammatorycytokaines)即TNF-α(腫瘤因子-α)，作為炎癥性趨化因子，測定巨·細胞炎性蛋白(macrophageinflammatoryprotein:MIP_2)、單核細胞趨化蛋白（monocytechemotactic卩1'0七6；[11:]\03-1)、以及角質(zhì)細胞衍生趨化因子（1^瓜1：；[11005^6-(161'；[￥6(1(31161]1〇1<1116:1(〇)0[0105]〈方法〉與上述"試驗例4.2"記載的方法同樣，以38yg/kg作為外消旋體、R型、S型的各溴化甲哌佐酯的給藥量進行試驗。[0106]BALF中這些細胞因子和趨化因子的測定采用ELISA法進行。[0107]〈結果〉其結果示于圖11~圖14。[0108]圖11示出TNF-α的結果，圖12示出MIP-2的結果，圖13示出MCP-1的結果，圖14示出KC的結果。[0109]從各圖中的結果可確認，外消旋體、R型、S型的各溴化甲哌佐酯有效地使炎性因子減少。[0110]如上所述，已知溴化甲哌佐酯為具有下部消化道的運動/收縮抑制作用的抗膽堿能藥，在臨床上作為腸易激綜合征的治療藥使用。[0111]所以，作為基于抗膽堿能作用的消化系統(tǒng)的副作用之一可列舉出便秘。另外，溴化甲哌佐酯對于患有心律失常的患者存在促進心臟的運動、使癥狀惡化的可能性，要求慎重給藥。[0112]因此，對于由溴化甲哌佐酯的外消旋體、R型、S型的差異所引起的這些副作用的程度進行研究。[0113]試驗例5:由壓力(stress)負荷導致的糞粒排出量(便秘發(fā)生的程度)的研究〈方法〉將4~6周齡的ICR小鼠置于可保證自由呼吸但自由活動受束縛的50mL管中1小時，施加壓力負荷，測定此時的糞粒排出量(便秘發(fā)生的程度）。[0114]將溴化甲哌佐酯的外消旋體、R型、S型分別以4.7mg/kg的用量進行氣管內(nèi)給藥，給藥1小時后，暴露于上述束縛壓力中1小時施加壓力負荷，測定此期間的糞粒排出量，從而觀察便秘發(fā)生的程度。[0115]〈結果〉其結果示于圖15。[0116]從圖中的結果也可明確，溴化甲哌佐酯的S型的便秘發(fā)生率低，R型的便秘發(fā)生率最尚。[0117]試驗例6:對心率的影響的研究〈方法〉用水合氯醛（500mg/kg)麻醉4~6周齡的ICR小鼠，在大腿部安裝傳感器，使用MouseOxsystem(STARRLifeSciences公司制）測定心率。[0118]將溴化甲哌佐酯的外消旋體、R型、S型分別以940yg/kg和4700yg/kg的用量進行氣管內(nèi)給藥，測定心率，并測定超過正常心率基線的由溴化甲哌佐酯給藥所引起的心率。[0119]〈結果〉其結果示于圖16。結果以將賦形劑(vehicle)給藥(無給藥)時的正常心率作為100%時的比率表示。[0120]從圖中的結果也可明確，溴化甲哌佐酯的外消旋體、R型、S型均劑量依賴性地加快心率，其程度也為相同程度。[0121]由以上的試驗例判斷，從氣道阻力抑制作用方面出發(fā)，在溴化甲哌佐酯的R型和S型的情況下，雖然用量低時溴化甲哌佐酯的R型與S型相比有較強的趨勢(試驗例3.1)，但高用量時二者均表現(xiàn)出相同程度的作用(試驗例3.2)。[0122]另一方面，從抗炎作用方面出發(fā)，溴化甲哌佐酯的R型和S型均未出現(xiàn)太大差異(試驗例4.1、4.2和4.3)。[0123]進而，若從副作用的觀點出發(fā)對溴化甲哌佐酯的R型和S型進行比較，則S型與R型相比抑制了便秘的發(fā)生。[0124]本發(fā)明提供的⑶PD改善劑通過溴化甲哌佐酯的光學活性體(R型和S型）的支氣管擴張作用和抗炎作用而改善慢性阻塞性肺疾病的癥狀。[0125]因此，考慮到兩種作用(支氣管擴張作用和抗炎作用）的強度的程度的平衡，只要以任意光學活性體作為有效成分即可，是顯示出能夠成為極其有效的coro改善劑的物質(zhì)。[0126]以下示出本發(fā)明的coro改善劑的具體制劑例。[0127]制劑例1:吸入劑使用(R)-溴化甲哌佐酯l%(w/w)、苯扎氯銨0.05%(w/w)、聚乙二醇10%(w/w)、丙二醇20%(w/w)、余量純水來制備吸入用液體制劑。[0128]制劑例2:吸入劑使用（S)-溴化甲哌佐酯l%(w/w)、苯扎氯銨0.05%(w/w)、聚乙二醇10%(w/w)、丙二醇20%(w/w)、余量純水來制備吸入用液體制劑。[0129]產(chǎn)業(yè)適用性綜上所述，本發(fā)明提供的coro改善劑以已在臨床上使用的溴化甲哌佐酯的光學活性體作為有效成分，在經(jīng)氣道給藥、吸入給藥中顯著表現(xiàn)出coro的改善效果，另外，在經(jīng)口給藥和直腸內(nèi)給藥中也表現(xiàn)出改善效果。因此，其在醫(yī)療上的貢獻度巨大?！局鳈囗棥?.(3R)-3-[(^基）（二苯基）乙酷氧基]-1，1-二甲基贓晚鐵漠化物，W下稱為"(R)-漠化甲贓佐醋"，其具有下式表示的立體結構：2.(35)-3-[(徑基）（二苯基）乙酷氧基]-1,1-二甲基贓晚鐵漠化物，W下稱為"(S)-漠化甲贓佐醋"，其具有下式表示的立體結構：3.慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，W權利要求1所述的(R)-漠化甲贓佐醋作為有效成分。4.慢性阻塞性肺疾病改善劑，其特征在于，W權利要求2所述的（S)-漠化甲贓佐醋作為有效成分。5.根據(jù)權利要求3或4所述的慢性阻塞性肺疾病改善劑，其中，給藥方式為經(jīng)氣道給藥或吸入給藥。6.權利要求1或2所述的(R)或(S)-漠化甲贓佐醋的制備方法，其特征在于，使二苯乙醇酸在縮合劑的存在下與(R)或(5)-3-?基-1-甲基贓晚反應，接著將所得的產(chǎn)物與甲基漠進行處理。【文檔編號】A61P11/08GK105980358SQ201480075608【公開日】2016年9月28日【申請日】2014年6月16日【發(fā)明人】水島徹【申請人】日本株式會社Ltt生物醫(yī)藥