專利名稱：一種實(shí)時(shí)定量pcr測(cè)量樣品中染色體端粒平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及試劑盒，特別涉及ー種實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量樣品中染色體端粒平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值的試劑盒。
背景技術(shù)：
端粒(Telomere)是一段DNA重復(fù)序列，位于染色體末端，可以保持染色體的完整性。1990年，Harley等證實(shí)端粒的長(zhǎng)度可以隨著細(xì)胞分裂次數(shù)的增多而逐漸變短。這ー發(fā)現(xiàn)在端粒和細(xì)胞衰老之間建立了緊密的聯(lián)系。端粒重復(fù)序列的長(zhǎng)度可能起著ー種分子鐘(molecular clock)的作用。不同年齡的人的體細(xì)胞的壽命明顯不同,其端粒的長(zhǎng)度也不相同。是隨著年齡的增長(zhǎng)而縮短。來(lái)自新生兒的體細(xì)胞可在體外傳代培養(yǎng)80—90代，來(lái)自70歲老人的體細(xì)胞在體外只能傳代培養(yǎng)20 30代，而且端粒的重復(fù)序列長(zhǎng)度也縮短很多。
·[0003]端粒酶(Telomerase)是細(xì)胞中負(fù)責(zé)端粒延長(zhǎng)的ー種酶,是基本的核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，可將端粒DNA加至真核細(xì)胞染色體末端。端粒在不同物種細(xì)胞中對(duì)于保持染色體穩(wěn)定性和細(xì)胞活性有重要作用，端粒酶能延長(zhǎng)縮短的端粒(縮短的端粒其細(xì)胞復(fù)制能力受限)，從而增強(qiáng)體外細(xì)胞的増殖能力。但是，在正常人體細(xì)胞中，端粒酶的活性受到相當(dāng)嚴(yán)密的調(diào)控。實(shí)驗(yàn)證明，體細(xì)胞里沒有端粒酶的活性，所以體細(xì)胞每分裂一次，端粒也就縮短ー些。隨著細(xì)胞不斷地進(jìn)行分裂，端粒的長(zhǎng)度將越來(lái)越短，當(dāng)達(dá)到ー個(gè)臨界長(zhǎng)度吋，細(xì)胞染色體會(huì)失去穩(wěn)定性，使細(xì)胞不能再進(jìn)行分裂而進(jìn)入凋亡(apoptosis)。端粒的長(zhǎng)度決定了細(xì)胞的壽命，因此可用丟失的端粒重復(fù)序列的長(zhǎng)度來(lái)推測(cè)細(xì)胞有絲分裂的次數(shù)，所以端粒被稱為分子鐘或有絲分裂鐘(mitotic clock)。端粒除了涉及到染色體穩(wěn)定性,細(xì)胞的衰老和死亡外,還與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。在人體內(nèi)的各種細(xì)胞中，生殖細(xì)胞和干細(xì)胞染色體的末端比體細(xì)胞染色體的末端長(zhǎng)出幾千個(gè)堿基對(duì)，并且在這兩類細(xì)胞里能檢測(cè)到端粒酶的活性。除此之外，其他所有體細(xì)胞里都未測(cè)得端粒酶的活性。惟一的例外是來(lái)源于體細(xì)胞的惡性腫瘤細(xì)胞卻又重新出現(xiàn)了端粒酶活性，發(fā)揮其合成端粒重復(fù)序列的功能，以補(bǔ)償正常的端粒序列丟失，使端粒的重復(fù)序列不會(huì)達(dá)到導(dǎo)致細(xì)胞死亡的臨界長(zhǎng)度，從而獲得細(xì)胞的“永生性”(immortality)。這樣，惡性腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)或體外都能無(wú)限制地分裂増殖。上文提到的端粒長(zhǎng)度縮短指的是所有染色體末端端粒的平均長(zhǎng)度。近年來(lái)，很多實(shí)驗(yàn)觀察開始質(zhì)疑端粒的平均長(zhǎng)度與衰老之間的聯(lián)系。ー些研究小組提出了于端粒相關(guān)的細(xì)胞衰老是由単一或某幾個(gè)短端粒引起的觀點(diǎn)。這ー觀點(diǎn)的正確性也被越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所證明。目前，研究端粒長(zhǎng)度主要是應(yīng)用TRF法(mean length of telomere restrictionfragments)。另外,有ー些手段可以比較精確的研究染色體中短端粒的情況，例如基于突光原位雜交(Q-FISH)的技術(shù),或者 STELA (single telomere length analysis)技術(shù)等。
實(shí)用新型內(nèi)容實(shí)用新型目的本專利涉及一種實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量樣品中染色體端粒平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值試劑盒。[0009]ー種用RT-qPCR法測(cè)量端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR 反應(yīng)液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設(shè)有容器空腔分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse,84-mer ;其中所；tdi的36B4 Forward 的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AAT CC 3’I ；36B4 Reverse的核苷酸序列為5’ CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3’ ；Telomere Forward 的核苷酸序列為5，CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTT 3，；TeIomereReverse 的核苷酸序列為5’ GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCT3’ ;84-mer的核苷酸序列為(TTAGGG) 14的核苷酸序列為含14個(gè)TTAGGG重復(fù)序列的核苷酸片段；36B4片段的核苷酸序列為5’ CAG CM GTG GGA AGG TGT AAT CCG TCT CCA CAGACA AGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’。所述的PCR反應(yīng)液含有PCR緩沖液、I X SYBR Green master mix，dNTPS。引物的濃度為100nM，84-mer和36B4片段的濃度為lug/uL; ー種用RT-qPCR法測(cè)量端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值的試劑盒的應(yīng)用，其特征在于按步驟實(shí)現(xiàn)A.從人外周血細(xì)胞中獲取基因組DNA ;B.使用權(quán)利要求I所述的試劑盒繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用來(lái)計(jì)算RT-qPCR反應(yīng)中樣品端粒的總長(zhǎng)度和反應(yīng)中染色體的總拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線I使用濃度梯度為L(zhǎng)IO'IO'IO'10_4，10_5，10_6的人工合成的84-mer寡核苷酸的RT-qPCR反應(yīng)的Ct值繪制；標(biāo)準(zhǔn)曲線2使用人工合成的75 bp 36B4片段RT-qPCR反應(yīng)的CT值繪制，其濃度梯度為L(zhǎng)IO'IO'IO-3，10' 1(T5,1(T6 ；C.使用RT-qPCR擴(kuò)增步驟A中獲得的樣品gDNA中的端粒片段和36B4基因片段，獲得相應(yīng)的Ct值，井根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中端粒的總長(zhǎng)度和樣品中36B4基因的拷貝數(shù)。D.計(jì)算樣品中端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值端粒平均長(zhǎng)度=端粒總長(zhǎng)度/ 36B4拷貝數(shù)；其中PCR反應(yīng)條件為95°C變性 10 min，然后 95°C 15sec，60°C I min，共 40 個(gè)循環(huán)。具體來(lái)說(shuō)I.引物設(shè)計(jì)本專利涉及的PCR引物除了常規(guī)的用于擴(kuò)增端粒片段的引物對(duì)，還包括一段84 bp的寡核苷酸片段(84-mer)和一段75 bp的36B4片段。2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線a)將 84-mer 梯度稀釋1，10' 1(T2，1(T3，10' 1(T5，10'84-mer寡核苷酸鏈總長(zhǎng)度計(jì)算方法如下(假設(shè)姆個(gè)反應(yīng)需未稀釋84-mer 60pg,即60X 1(T12 g,已知 84-mer 的分子量為 26667. 2)lmol=6. 02 X IO23 個(gè)微粒數(shù)平均ー個(gè)84-mer 的質(zhì)量為2. 6667 X IO4 / ( 6. 02 X IO23)= 0. 44 X l(T19g ;每個(gè)PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總量為60 X 10べ2 / (0. 44 X 1(T19 )= I. 36X IO9 個(gè)；由于84-mer的長(zhǎng)度為84bp，因此每個(gè)PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總長(zhǎng)度為I. 36 X IO9 X 84 = I. 18 X IO5 kb ；[0026]同理可得不同稀釋濃度84-mer在每個(gè)反應(yīng)體系中的總長(zhǎng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線I。b)繪制75 bp的36B4片段拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將75 bp 的 36B4 梯度稀釋1，10' 1(T2，10' 1(T4，1(T5，I(T6 ；36B4片斷為75 bp,相對(duì)分子量為23268. 1，單個(gè)36B4 75 bp片段質(zhì)量為2. 32681 X IO4 / ( 6. 02 X IO23)= 0. 38 X 10_19 g ；假設(shè)反應(yīng)體系中最高濃度75 bp的36B4含量為200 pg，那么每個(gè)反應(yīng)體系中75bp 36B4的拷貝數(shù)為200 X 1(T12 / 0. 38 X 1(T19 = 5. 26X IO9 ;相當(dāng)于在二倍體的染色體組中含有5. 26 X 109/2=2. 63 X IO9個(gè)36B4基因拷貝。同理可得不同稀釋濃度反應(yīng)體系中75 bp 36B4拷貝數(shù)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線2。3. RT-qPCR擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和36B4基因； 4. RT-QPCR擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和36B4基因(內(nèi)參)，并通過(guò)兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算gDNA樣品中端粒的總長(zhǎng)度及樣品中g(shù)DNA總拷貝數(shù)，即可以計(jì)算端粒平均長(zhǎng)度端粒平均長(zhǎng)度=樣品中端?？傞L(zhǎng)度/ gDNA總拷貝數(shù)。原理說(shuō)明I、實(shí)時(shí)熒光定量PCR (RT-qPCR)原理無(wú)論是對(duì)遺傳病(如地中海貧血和血友病)、傳染病(如肝炎和艾滋病)或腫瘤進(jìn)行基因診斷，還是研究藥物對(duì)基因表達(dá)水平的影響，或者監(jiān)控藥物和療法的治療效果，定量PCR技術(shù)都可以發(fā)揮很大作用。定量PCR技術(shù)的最新進(jìn)展是實(shí)時(shí)熒光定量。該技術(shù)借助于熒光信號(hào)來(lái)檢測(cè)PCR產(chǎn)物，一方面提高了靈敏度，另ー方面還可以做到PCR每循環(huán)一次就收集一個(gè)數(shù)據(jù)，建立實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線，準(zhǔn)確地確定CT值，從而根據(jù)CT值確定起始DNA拷貝數(shù)，做到了真正意義上的DNA定量。根據(jù)最終得到的數(shù)據(jù)不同，定量PCR可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量?jī)煞N。典型的相對(duì)定量如比較經(jīng)過(guò)不同方式處理的兩個(gè)樣本中基因表達(dá)水平的高低變化，得到的結(jié)果是百分比；絕對(duì)定量則需要使用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣本中基因的拷貝數(shù)或濃度。CT值的定義是擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。定量PCR的數(shù)學(xué)原理理想的PCR反應(yīng)X=X0 X 2n非理想的PCR反應(yīng)X=X0 (1+Et) n ；n:擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)X :第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X0 :初始模板量Ex :擴(kuò)增效率在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時(shí)Xct=X0 (I+Ex)CT,(I)其中Xct :為熒光擴(kuò)增信號(hào)達(dá)到閾值強(qiáng)度時(shí)所擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值線設(shè)定以后，它為常數(shù)，設(shè)定為M ;方程式(I)兩邊同時(shí)取對(duì)數(shù)得IogM=IogX0 (I+Ex)CT(2)[0052]整理方程式(2)得IogX0=-Iog (1+Ex) *CT+logM(3)IogX0與CT呈線性關(guān)系，根據(jù)樣品擴(kuò)增的CT值可以計(jì)算出樣品中的所含的模板量。2,SYBR Green I熒光染料技術(shù)原理SYBR Green I是ー種只與DNA雙鏈結(jié)合的熒光染料。當(dāng)它與DNA雙鏈結(jié)合吋，發(fā)出熒光JAdna雙鏈上釋放出來(lái)時(shí)，熒光信號(hào)急劇減弱。因此，在ー個(gè)體系內(nèi)，其信號(hào)強(qiáng)度代表了雙鏈DNA分子的數(shù)量。SYBR Green熒光染料法定量PCR的基本過(guò)程是I、開始反應(yīng)，當(dāng)SYBR Green染料與DNA雙鏈結(jié)合時(shí)發(fā)出熒光。2、DNA變性吋，SYBR Green染料釋放出來(lái)，熒光急劇減少。3、在聚合延伸過(guò)程中，引物退火并形成PCR產(chǎn)物。4、聚合完成后，SYBR Green染料與雙鏈產(chǎn)物結(jié)合，定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)到熒光的凈 增量加大。2、RT-qPCR測(cè)量端粒長(zhǎng)度原理如圖5所示，緑色區(qū)域?yàn)槎肆^(qū)，即(TTAGGG) n重復(fù)序列；藍(lán)色箭頭為與端粒特異性結(jié)合的引物。由干與端粒結(jié)合的引物數(shù)量跟端粒的長(zhǎng)度呈正相關(guān)，端粒長(zhǎng)，其可結(jié)合的引物數(shù)量多，熒光強(qiáng)度大，可以理解為拷貝數(shù)多；反之則拷貝數(shù)少，熒光強(qiáng)度弱。所以使用RT-qPCR法，得到各個(gè)樣品的CT值，即可間接反映每個(gè)樣品中端粒的平均長(zhǎng)度。有益效果端粒的縮短被認(rèn)為與細(xì)胞的衰老和癌癥等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)每條染色體兩端的端粒并不是以相同的速度縮短，有的端粒因?yàn)槟承┰驎?huì)突然大幅度變短，形成相對(duì)短的端粒。當(dāng)這些短端粒達(dá)到或超過(guò)某ー極限，就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的衰來(lái)死亡，或者如癌癥等的疾病。因此，準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞端粒長(zhǎng)度，對(duì)預(yù)防衰老和預(yù)防癌癥的發(fā)生都能起到非常大的幫助。本發(fā)明采用試劑盒可以方便，快捷測(cè)定端粒的平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值，使用エ業(yè)生產(chǎn)或檢測(cè)。


圖I.標(biāo)準(zhǔn)曲線1，用于計(jì)算每個(gè)RT-qPCR反應(yīng)中端粒的總長(zhǎng)度，橫軸為端粒長(zhǎng)度，單位為Kb，PCR反應(yīng)的Ct值與端粒長(zhǎng)度在圖I所示的范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。通過(guò)優(yōu)化樣品的濃度，使其PCR反應(yīng)的CT值落在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，應(yīng)此使用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得數(shù)值等于端粒在每個(gè)PCR反應(yīng)中的總長(zhǎng)度。圖2.標(biāo)準(zhǔn)曲線2，用于計(jì)算36B4在每個(gè)反應(yīng)中的拷貝數(shù)，間接計(jì)算每個(gè)反應(yīng)中染色體的拷貝數(shù)，即每個(gè)PCR反應(yīng)中端粒的總拷貝數(shù)。橫軸為36B4的拷貝數(shù)，PCR反應(yīng)的CT值與36B4拷貝數(shù)的LOG值在途中所示范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。圖3.使用RT-qPCR法和TRF法測(cè)得的端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值的相關(guān)性。圖4為本發(fā)明的示意圖，其中盒體1，襯墊2，PCR反應(yīng)液3，Taq酶4，136B4Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, Telomere Revers e 9,84-mer 10,36B4片段I。圖5. RT-qPCR法檢測(cè)端粒長(zhǎng)度的示意圖,其中有圓圈的區(qū)域?yàn)樗{(lán)色,無(wú)圓圈區(qū)域?yàn)榫G色。
具體實(shí)施方式
[0066]RT-QPCR使用PCR反應(yīng)液購(gòu)自Qiagen，所有引物或核苷酸片段為生工合成。實(shí)施例I外周血基因組DNA (gDNA)的提取I).血液樣品分裝成I mL/管，干-70で儲(chǔ)存。2).將樣品解凍，每管樣品加入0. 8 mL檸檬酸緩沖液，混勻后12000轉(zhuǎn)離心Imin,去上清。3).加入I mL IX檸檬酸緩沖液，震蕩后12000轉(zhuǎn)離心I min，去上清。4).カロ 入 375 uL 0. 2M 的 Na2OAc,震蕩后加入 25 uL 10% 的 SDS 和 5 uLproteinase K (20 mg/mL H2O),震蕩混勻后 55 度孵育 I h。5).加入 120 uL 酚 / 氯仿 / 異戊醇(v/v :25/24/1),震蕩 30 sec 后于 12000 轉(zhuǎn)離心2 min。 6).將水相層移至新的I. 5 mL離心管仲，加入I mL，冷的100%こ醇，混勻并于-20度孵育15 min。7). 12000轉(zhuǎn)離心2 min，去上清并烘干。8).加入180 uL 10 1的TE緩沖液，震蕩后于55で孵育10 min。9).加入20 uL，2M的醋酸鈉溶液，混勻后加入500 uL，冷的100%こ醇，混勻后于12000轉(zhuǎn)離心I min,去上清。10).用I mL，80%的こ醇洗滌沉淀，之后于12000轉(zhuǎn)離心I min，去上清。11).真空干燥沉淀10 min。12).將沉淀重新溶解于200 uL TE緩沖液中，55 °C孵育過(guò)夜，獲得gDNA。實(shí)施例2 RT-QPCR法測(cè)端粒平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值I、ー種用RT-qPCR法測(cè)量端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值的試劑盒，包括盒體1，襯墊2，PCR反應(yīng)液3,Taq酶4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, TelomereRevers e 9,84-mer 10，36B4片段11，襯墊2上設(shè)有容器空腔分別放置PCR反應(yīng)液3，Taq酶 4, 136B4 Forward 5, 36B4 Reverse 6, Telomere Forward 7, Telomere Reverse 8,84-mer 10，36B4 片段 11 ；其中所述的36B4 Forward 的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT AATCC 3，；36B4 Reverse 的核苷酸序列為5，CCC ATT CTA TCA TCA ACG GGT ACA A 3，；Telomere Forward 的核苷酸序列為5’ CGG TTT GTT TGG GTT TGG GTT TGG GTTTGG GTT TGG GTT 3’ ；Telomere Reverse 的核苷酸序列為5’ GGC TTG CCT TAC CCT TAC CCT TAC CCTTAC CCT TAC CCT 3’ ；84-mer的核苷酸序列為(TTAGGG) 14的核苷酸序列為含14個(gè)TTAGGG重復(fù)序列的核苷酸片段；36B4 片段的核苷酸序列為5’ CAG CAA GTG GGA AGG TGT MT CCG TCT CCA CAGACA AGG CCA GGA CTC GTT TGT ACC CGT TGA TGA TAG AAT GGG 3’。2、利用84-mer繪制總長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線I) ,84-mer的RT-qPCR反應(yīng)條件RT-qPCR反應(yīng)體系為20 uL，以84-mer為模板，取84-mer I uL,100 nM 引物 Telomere Forward I uL,100 nM引物Telomere ReverseluL,余量為 PCR 反應(yīng)液。RT-qPCR 反應(yīng)條件95 °C 10 min, 40 個(gè)循環(huán)(95°C 15 sec, 60 °C Imin ノ2)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線A)將 84-mer 梯度稀釋1,10べ，1(T2，10' 1(T4，1(T5，10'84-mer寡核苷酸鏈總長(zhǎng)度計(jì)算方法如下假設(shè)姆個(gè)反應(yīng)需未稀釋84-mer 60pg,即60 X 1(T12 g,已知84-mer的相對(duì)分子量為 26667. 2 ；平均ー個(gè)84-mer 的質(zhì)量為2. 6667 X IO4 / 6. 02 X IO23 = 0. 44 X 1(T19 ;每個(gè)PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總量為60 X 10べ2 / 0. 44 X 10ィ9 = I. 36 X 109，因此每個(gè)PCR反應(yīng)體系中未稀釋84-mer總長(zhǎng)度為1.36 X IO9X 84= I. 18 X105kb ；同理可得不同稀釋濃度84-mer在每個(gè)反應(yīng)體系中的總長(zhǎng)度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線1(圖1)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為log (TL) =-4. 86Ct+40. 14，其中TL為總長(zhǎng)度。3、利用36B4繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線I) 36B4 75 bp 的 RT-qPCR 反應(yīng)條件RT_qPCR 反應(yīng)體系為 20 uL，以 36B4 為模板，取 36B4 IuL , 100 nM 36B4 Forward IuL, 100 nM 36B4 Reverse luL，余量為 PCR 反應(yīng)液。RT-qPCR 反應(yīng)條件95 °C 10 min, 40 個(gè)循環(huán)(95°C 15 sec, 60 °C I min)將75 bp 的 36B4 梯度稀釋1，10' 1(T2，10' 1(T4，1(T5，I(T6 ；36B4 為 75 bp，相對(duì)分子量為 23268. I ；平均ー個(gè)36B4 75 bp 質(zhì)量為 2. 32681 X IO4 / 6. 02 X IO23 = 0 . 38 X 1(T19 g ；假設(shè)反應(yīng)體系中最高濃度75 bp 36B4含量為200 pg，那么每個(gè)反應(yīng)體系中75 bp36B4 的拷貝數(shù)為:200 X 10べ2 / 0. 38 X 10ィ9 /2= 2. 63 X IO9 ；同理可得不同稀釋濃度反應(yīng)體系中75 bp 36B4拷貝數(shù)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線2 (圖2)。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為log (TC)=-5. 11Ct+39. 57 ，其中TC為36B4基因的拷貝數(shù)。因?yàn)?6B4基因是單拷貝基因，是做RT-qPCR常用的內(nèi)參基因之一，所以知道了 gDNA中36B4的拷貝數(shù)就等于知道了樣品中染色體的拷貝數(shù)，才可以計(jì)算端粒平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值。4、RT-qPCR擴(kuò)增gDNA樣品中端粒和75 bp的36B4 (內(nèi)參)實(shí)施例I所獲得gDNA樣品中端粒的RT-qPCR反應(yīng)條件RT_qPCR反應(yīng)體系為20uL, gDNA I uL,100 nM Telomere Forward I uL,100 nM Telomere Reverse I uL US里的引物跟84mer的引物是ー樣的)，余量為PCR反應(yīng)液；PCR反應(yīng)條件為95°C 10 min, 40個(gè)循環(huán)(95で 15 sec, 600C I min)。步驟gDNA樣品中75 bp的36B4的RT-qPCR反應(yīng)條件RT_qPCR反應(yīng)體系為20uL，其中 36B4 I uL，100 nM 引物 36B4 Forward I uL，100 nM 引物 36B4 Reverse IuL，余量為 PCR 反應(yīng)液。RT-qPCR 反應(yīng)條件95 °C 10 min, 40 個(gè)循環(huán)(95°C 15 sec, 60 °C Imin ノ。將步驟(4)獲得的gDNA樣品中端粒和36B4的Ct值，分別代入兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，即 log (TL) = (CT (telomere)-40. 14) / -4. 86，其中 TL 為樣品中端?？傞L(zhǎng)度；L0G (TC) = (CT(36b4)-39. 57) / -5. 11，其中TC為樣品中端?？截悢?shù)，即可以計(jì)算端粒平均長(zhǎng)度=端?？傞L(zhǎng)度/端?？截悢?shù)。[0109]因?yàn)?4mer是(TTAGGG)14，相當(dāng)于人工合成的端粒重復(fù)序列，與細(xì)胞中的端粒序列并無(wú)區(qū)別，所以用人工合成的端粒序列做標(biāo)準(zhǔn)曲線是可以用于計(jì)算樣品中真正的端粒的長(zhǎng)度的；同理人工合成的36B4片段也可用于計(jì)算樣品中的36B4拷貝數(shù)。另外，計(jì)算平均長(zhǎng)度的公式只是ー個(gè)簡(jiǎn)單的數(shù)學(xué)計(jì)算，比如一輛汽車行駛的日平均里程=總的行駛里程/天數(shù)，這樣的公式是不用詳細(xì)推導(dǎo)的，同理，樣品中端粒的平均長(zhǎng)度、端粒的總長(zhǎng)度和端粒的拷貝數(shù)(即染色體拷貝數(shù))之間的關(guān)系也是顯而易見的，無(wú)需推導(dǎo)。對(duì)比例TRF法測(cè)端粒的平均長(zhǎng)度(參考Aubert等，Telomere lengthmeasurement—しaveats ana a critical assessment of tne available technologiesand tools. Mutat Res. 2012 Feb I; 730 (1-2) : 59-67.)I).將0.5 ug gDNA樣品用Hae III (購(gòu)自NEB)酶完全消化；2).消化后的gDNA片段由瓊脂糖凝膠電泳分離，然后轉(zhuǎn)移至尼龍膜上； 3).使用放射性32P標(biāo)記的探針32P- (TTAGGG) 7與尼龍膜上的端粒片段雜交；4).通過(guò)放射自顯影檢測(cè)各個(gè)樣品端粒片段的長(zhǎng)度。將TRF法測(cè)得的端粒長(zhǎng)度取對(duì)數(shù)，然后將其與RT-qPCR法測(cè)得的樣品端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值做圖，可得如圖3所示，各數(shù)據(jù)點(diǎn)的趨勢(shì)線為一條直線，顯示本專利涉及的RT-qPCR法所測(cè)得的端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值與經(jīng)典的TRF法所測(cè)得的結(jié)果有很強(qiáng)的相關(guān)性，是可信賴的結(jié)果。
權(quán)利要求1.一種用RT-qPCR法測(cè)量端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR 反應(yīng)液，Taq 酶，136B4 Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, TelomereReVerseA^menSeBA片段，襯墊上設(shè)有容器空腔分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward, 36B4 Reverse, Telomere Forward, Telomere Reverse，84_mer0
專利摘要本實(shí)用新型涉及試劑盒，特別涉及一種實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)量樣品中染色體端粒平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值的試劑盒。一種用RT-qPCR法測(cè)量端粒平均長(zhǎng)度絕對(duì)值的試劑盒，其特征在于包括盒體，襯墊，PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer，36B4片段，襯墊上設(shè)有容器空腔分別放置PCR反應(yīng)液，Taq酶，136B4Forward，36B4Reverse，TelomereForward，TelomereReverse，84-mer。本實(shí)用新型采用試劑盒可以方便，快捷測(cè)定端粒的平均長(zhǎng)度的絕對(duì)值，使用工業(yè)生產(chǎn)或檢測(cè)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK202558870SQ20122023865
公開日2012年11月28日 申請(qǐng)日期2012年5月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月25日
發(fā)明者葉汝章, 張娟, 全利, 郝小江, 朱兆云, 滕凌, 葉亞?wèn)|, 朱文華, 潘鸝, 胡娟, 路易斯伊格納羅 申請(qǐng)人:云南路易斯中藥現(xiàn)代化工程技術(shù)研究中心