專利名稱：棉花染色體熒光原位雜交的端粒標(biāo)記及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子細(xì)胞遺傳學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種可用于棉花染色體熒光原位雜交的末端端粒標(biāo)記及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
DNA熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是70年代末80年代初開始發(fā)展起來的一種重要的非放射性原位雜交技術(shù)。它的基本原理是將DNA探針用特殊修飾的核苷酸分子標(biāo)記(如biotin-dUTP或digoxigenin-dUTP )，根據(jù)DNA-DNA或DNA-RNA堿基配對原則與染色體上相對應(yīng)的序列雜交。進(jìn)行原位雜交時，先用高溫或堿處理DNA分子，使之發(fā)生變性；當(dāng)溫度下降或pH值恢復(fù)到中性，變性的DNA會按照堿基互補(bǔ)配對的原則，重新形成氫鍵恢復(fù)到原來的雙鏈結(jié)構(gòu)。如果兩條單鏈的來源不同，只有它們之間的堿基序列是同源互補(bǔ)或部分同源互補(bǔ)時，才能全部或部分復(fù)性，產(chǎn)生分子雜交。由于探針帶有熒光物質(zhì)，因此雜交的位點可直接在熒光顯微鏡下觀察到。利用該技術(shù)可以檢測DNA序列在染色體或DNA纖維上的定位、定性、相對定量分折。
隨著技術(shù)的發(fā)展與不斷完善，熒光原位雜交在植物上應(yīng)用與研究的優(yōu)越性越來越明顯(l)與用放射性物質(zhì)來標(biāo)記探針的分子原位雜交相比，它不需要放射性同位素，安全可靠，不需特殊方法處理，檢測時間短，背景清晰，檢測靈敏度高，底物可長期貯存而不失活；(2)與其它非放射性原位雜交技術(shù)相比，它可用不同熒光素標(biāo)記的探針與同 一 目的DNA進(jìn)行雜交，即進(jìn)行多重標(biāo)記， 一次定位多個DNA序列；(3)雜交信號可逐級放大，進(jìn)行定量或非定量分析，并且可通過計算機(jī)軟件圖像分析系統(tǒng)檢測并處理雜交微弱的信號，使其可視
4化更強(qiáng)。
端粒是位于真核生物線狀染色體最外端的DNA序列和蛋白質(zhì)
的復(fù)合結(jié)構(gòu)，端粒在染色體的末端起著"保護(hù)帽"的作用，能夠防止染色體末端之間的融合，重組和降解。端粒序列是由簡單串聯(lián)重復(fù)序列構(gòu)成的保守序列，其長度是可變的。脊推動物的端粒序列首
先在人類染色體中得到鑒定，由5'-TTAGGG-3'的保守序列構(gòu)成。第一個植物的端粒序列在模式植物擬南芥中得到分離到，其保守序列為5'-TTTAGGG-3'。已發(fā)現(xiàn)擬南芥類型的端粒序列存在于多種植物中。但不是所有的植物都具有擬南芥類型的端粒序列，如一些洋蔥屬的植物及其相關(guān)種中不存在擬南芥類型的端粒序列； 一些植物的端粒甚至被脊推動物類型的端粒序列所取代。另外，在一些植物中發(fā)現(xiàn)其端粒序列存在著各種重復(fù)序列的變體。到目前為止，還沒有關(guān)于棉花端粒的相關(guān)報道。
直接克隆端粒序列是很困難的，郭歌等(1996)通過染色體微切割，陳守義等(2003 )通過端粒的相關(guān)序列都沒能克隆到端粒序列。這是因為染色體末端的端粒是由線性DNA分子組成的，通?；ハ嗯鋵Φ膬蓷lDNA中一鏈中，有一條稍長于另一條，構(gòu)成了t環(huán)結(jié)構(gòu)，t環(huán)的存在使得端粒序列難以插入到載體中，因此造成端粒序列克隆的困難。理論上，由于端粒序列(TTTAGGG) n中不含有現(xiàn)有的內(nèi)切酶識別的位點，因此，通過酶切基因組構(gòu)建的文庫(例如BAC克隆文庫) 一般不含有染色末端的端粒序列，所以也無法從這些文庫中分離得到端粒序列。采用機(jī)械方式隨機(jī)打斷基因組構(gòu)建的文庫要比用限制性內(nèi)切酶特異切割得到的DNA片段構(gòu)建的基因組文庫更加完整全面，因此這樣的文庫中可能含有染色體末端的序列。Richard ( 1988 )和Moyzis ( 1990 )便是通過構(gòu)建隨機(jī)打斷的基因組片段的文庫，分別分離到了擬南芥的端粒序列(TTTAGGG)n和人類的端粒(TTAGGG)n序列。但是，構(gòu)成端粒序列的串聯(lián)重復(fù)序列(TTTAGGG) n也偶然插入到染色體的中間，在擬南芥與水稻的BAC庫中都發(fā)現(xiàn)了含有部分(TTTAGGG ) n的序列。這為克隆含有端粒序列的片段提供便利。本發(fā)明正是通過含有端粒序列的擬南芥3#染色體上的BAC克隆F23H6中(TTTAGGG) n兩翼的非重復(fù)序列設(shè)計引物，克隆到了擬南芥類型的端粒序列，并通過FISH和Southern雜交進(jìn)行了驗證。這為克隆端粒序列提供了 一條新的思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為棉花熒光原位雜交提供一種位于染色體最末端的端部標(biāo)記，通過該端部標(biāo)記，能夠?qū)γ藁ㄈ旧w的長度進(jìn)行估量，從而為進(jìn)一步的染色體核型分析及目的信號的染色體定位奠定基礎(chǔ)。
本發(fā)明的端粒標(biāo)記序列如序列表SEQ ID No. 1所示，用生物素標(biāo)記后即可作為單針，與棉花染色體的端粒端部雜交，從而達(dá)到標(biāo)記端粒端部的目的。
上述標(biāo)記可通過如下方法制得釆用引物對TS1(5'-TGAGGGACTCAC ATACATTG畫3') ， TS2(5'-ACC ACTGAACATCC ATTGAG-3')以擬南芥基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過膠回收純化后與T-easy載體連接得到含有目的片段的質(zhì)粒pAT 1 ，并進(jìn)行測序驗證；2)用五coRI酶切pATl,回收目的片段，并進(jìn)行生物素標(biāo)記。
用上述端粒標(biāo)記作為探針，與棉花中期染色體雜交，用安裝有CCD攝像頭的ZEISS Axioskop2 mot plus熒光顯微鏡觀察熒光信號，用ZEISS —ISIS成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行原位雜交圖像的攝取、釆集,Photoshop7.0軟件進(jìn)行圖版編排。熒光原位雜交的結(jié)果顯示，在棉花所有染色體的末端都有明亮的雜交信號。
用Bal31(核酸外切酶，它能從染色體的兩端開始消化染色體的DNA鏈)處理基因組DNA，在進(jìn)行雜交檢測，結(jié)果表明隨著Bal31消化時間的延長，雜交條帶的分子量越來越小，信號越來越弱。這說明雜交信號從Ba131消化開始就受到了影響。結(jié)合熒光原位雜交 以及Bal31酶切動力實驗得結(jié)果，證明雜交信號的確實位于染色體 最外端。
本發(fā)明方法特別適用于在棉花的熒光原位雜交中作為染色體端 部的標(biāo)記。用通過本方法得到的端粒序列克隆作為探針進(jìn)行原位雜 交，雜交信號的強(qiáng)度比使用寡核苷酸或者PCR法得到的端粒序列作 為探針的信號更強(qiáng)烈，更適合于棉花的熒光原位雜交。
將棉花的端部比標(biāo)記應(yīng)用于熒光原位雜交中，將可以對棉花的 染色體的長度進(jìn)行測量，從而對棉花染色體進(jìn)行核型分析。也可以 在核型分析的基礎(chǔ)上，將目的信號定位于相應(yīng)的染色體上。


圖1顯示的是實施例1通過PCR得到的端粒序列的電泳圖，其 中泳道1為Mark,泳道2 4是擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖2是以阿非利加棉根尖中期染色體為靶DNA，生物素標(biāo)記的 pATl作為探針，進(jìn)行熒光原位雜交的圖片，箭頭所示的是雜交信號；
圖3顯示的是新海7弁棉根尖中期染色體為靶DNA,生物素標(biāo)記 的pATl作為探針，進(jìn)行熒光原位雜交的圖片，箭頭所示的是雜交信 號；
圖4是Bal31酶切動力學(xué)實驗的圖片。
具體實施例方式
以下實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明 的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步 驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所 熟知的常規(guī)手段。
在本發(fā)明中，2xSSC表示的配置為0.3M NaCl, 0.03M C6H5Na307.2H20，其中2x表示濃度的倍數(shù)，相應(yīng)的20xSSC表示的
7配置為3M NaCl， 0. 3M C6H5Na307.2H20。
在本發(fā)明中，涉及到的百分號"％",若未特別說明，是指質(zhì)量 百分比；但溶液的百分比，除另有規(guī)定外，是指溶液100ml中含有 溶質(zhì)若干克；液體之間的百分比，是指在2(TC時容量的比例。溶液 未具體指明溶劑的，所用溶劑為水。
在本發(fā)明中諸如"3x5分鐘洗滌"，表示洗滌3次每次5分鐘。
實施例l端粒序列的克隆
通過對NCBI上公布的核酸序列進(jìn)行搜索，發(fā)現(xiàn)一個位于擬南 芥3#染色體上的BAC克隆(F23H6)中含有一段擬南芥類型的端粒序 列。根據(jù)該端粒序列兩端的非串聯(lián)重復(fù)序列設(shè)計 一 對引物 TS1 (5 '-TGAGGGACTCACATACATTG-3') ; TS2(5'-ACCACTGAAC ATCCATTGAG-3')。以擬南芥基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)的條件為反應(yīng)體系首先在9fC下變性5min，緊接著執(zhí)行30 個循環(huán)，每個循環(huán)由如下反應(yīng)條件所組成94'C下變性45s，55'C下 退火30s，72'C延伸45s,最后一步是在72匸下延伸5min。 PCR反應(yīng) 的產(chǎn)物通過膠回收純化后與T-easy載體連接。得到的含有目的片段 的克隆被命名為pATl， pATl作為端粒序列被應(yīng)用于以下所有的實 驗。pATl的測序結(jié)果表明，目的片段長353bp，含有294bp端粒重 復(fù)序列，其中(TTTAGGG) n重復(fù)42次，其核苷酸序列如SEQID No.l所示。
實施例2 二倍體(2n=2x=26)棉花染色體熒光原位雜交的端粒標(biāo) 記
材料阿非利加棉(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究科貿(mào)公司)
一、根尖中期染色體的制備
取阿非利加棉種子數(shù)十粒，用手術(shù)刀切開種子生長點處的種殼，
然后將種子播種于經(jīng)煮沸消毒的潮濕的細(xì)沙中，置25-3(TC萌發(fā)。待根長至l-2cm時(約1天半)，取根尖(0.5mm )，于放線菌酮(25ppm) 2(TC預(yù)處理(破環(huán)紡錘絲，使前期染色體提前濃縮，形成分散的中 期染色體)，春、秋天預(yù)處理2h，夏天1.5h,冬天2.5h。預(yù)處理結(jié)束 后，用蒸餾水洗10min，固定液(95%乙醇冰乙酸3 : 1 )固定2-24h。 然后，水洗10min， 2%纖維素酶(Cellulase R誦IO ) (Sigma)和0.5%果 膠酶(Pectinase )混合液37°C處理30m (分解細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞核)， 45%或60%乙酸(軟化細(xì)胞)壓片。鏡檢，選擇分裂相較好和多的 制片保留。-2(TC預(yù)冷，-70°<3揭蓋片，80。C水洛鍋表面迅速烤干(防 止染色體變形)。4'C保存?zhèn)溆谩?br> 二、 探針的標(biāo)記
探針標(biāo)記試劑盒為德國Roche公司的Bio-Nick Translation標(biāo)記 系統(tǒng)。為了獲得良好的標(biāo)記效果，在50pL體系中，用10U的五coi I酶消化pATl載體，將端粒序列從質(zhì)粒pATl上分離，電泳后回收 含有端粒序列的片段，并純化。標(biāo)記的步驟如下取純化后的DNA 片段ljig，用雙蒸水稀釋至16|iL，加入Biotin-Nick Translation Mix 4jiL,混勻后于15。C反應(yīng)90min，最后加入0.5M的EDTA lpL終止反 應(yīng)，-201:保存。
三、 熒光原位雜交的流程
(一)染色體制片的準(zhǔn)備
1. 制片在6(TC烘箱中干燥過夜。
2. 用100嗎/ml的RNase A (2xSSC配制)加塑膜蓋片，包裝 于37°C， 1小時。
3. 2xSSC漂去塑膜蓋片，2xSSC, 3x5分鐘洗滌。
4. 用0.1%Pepsin ( 10mMHCl配制)37°C， 30分鐘。
5. PBS， 2x5分鐘洗滌。
6. 4。/。的多聚甲醛37。C, IO分鐘。
7. 2xSSC， 3x5分鐘洗滌。
98. 2xSSC配制70。/。去離子甲酰胺溶液，80°C, 2min。
9. -20。C條件下，用75%、 95%、 100%的乙醇逐級脫水，每級 5分鐘。
10. 自然風(fēng)干，備用。
(二) 雜交混合液的準(zhǔn)備 20fil雜交混合液
1. lO(il 100%去離子甲酰胺
2.4^1 50%硫酸葡聚糖(放入37。C溶解后備用)
3. 2^1 20xSSC
4. 1^1 10%SDS (放入37。C溶解后備用)
5. ljLil探針(步驟二標(biāo)記的探針，濃度50ng/|Lil)
6. 2^1 封阻DNA(片段大小200~ 1000bp,濃度是探針的 35倍)
在渦流混合器上混勻，在PCR儀上97。C變性IO分鐘，迅速轉(zhuǎn) 入冰水中2分鐘，37°C， lh。
(三) 雜交
1. 取20^d雜交液滴于制片上，加塑膜蓋片，包裝于8(TC水洛 鍋中共變性10分鐘。
2. 轉(zhuǎn)入37'C水洛中雜交過夜(注意檢查封袋有沒有進(jìn)水)。
(四) 洗脫和信號檢測
1. 雜交制片用2xSSC漂洗去塑膜蓋片。
2. 2xSSC (含有0.1。/。SDS) 37°C, 3x5分鐘洗滌。
3. 0.2xSSC (含有0.1%SDS) 37°C， 3 x 5分鐘洗滌。
4. 2xSSC室溫下沖洗2次，甩干制片。
5. 力口 50(^1 /片5%BSA (水或4 x SSC/Teween20配制)加塑膜 蓋片，37t:封阻30分鐘。
6. 甩干封阻液(制片不能見干)，力口 30(!l/片Avidin-FITC或Avidin-Fluorescein抗體(工作液濃度10jig/ml),加塑膜蓋片，37°C 溫育1小時。
7. 1 x PBS/Teween20 ( 1 x PBS, 0.3%Teween20 )中，37°C ， 3 x 5分鐘洗滌。
8. 用DAPI (工作液濃度2昭/ml， 1 x PBS配制)30^1 /片襯
染5分鐘。
9. lxPBS, 3x3分鐘洗去襯染劑，甩干或涼干，用抗熒光衰 減劑(Vectashied)封片。
四、熒光觀察
用安裝有CCD攝像頭的Leica MRA2熒光顯微鏡觀察熒光信 號，用Leica—QFISH成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行原位雜交圖象的攝取、釆集 和加工，以及分析。結(jié)果如圖2所示，通過熒光顯微鏡可以觀察到 明亮的雜交信號。
實施例3四倍體(4n=4x=52)棉花染色體熒光原位雜交的端粒標(biāo) 記
材料四倍體棉新海7# (中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究科貿(mào)公司)
一、根尖中斯染色體的制備
取新海7#種子在約6(TC的溫水中浸種過夜，播種于經(jīng)煮沸消毒 的潮濕的細(xì)沙中，置25-3(TC萌發(fā)。待根長至3-5cm時(約2天半)， 取根尖(0.5mm)，于放線菌酮(25ppm) 2(TC預(yù)處理(破環(huán)紡錘絲， 使前期染色體提前濃縮，形成分散的中期染色體)，春、秋天預(yù)處理 2h,夏天1.5h，冬天2.5h。預(yù)處理結(jié)東后，用蒸餾水洗10min，固 定液(95%乙醇冰乙酸3 : 1)固定2-24h。然后，水洗10min， 2% 纖維素酶(CellulaseR-lO) (Sigma)和0.5%果膠酶(Pectinase )混合 液37。C處理30m(分解細(xì)胞壁，釋放細(xì)胞核)，45%或60%乙酸(軟 化細(xì)胞)壓片。鏡檢，選擇分裂相較好和多的制片保留。-2(TC預(yù)冷,-70°(:揭蓋片，8(TC水浴鍋表面迅速烤干(防止染色體變形)。4'C保 存?zhèn)溆谩?br> 二、 探針的標(biāo)記
探針標(biāo)記試劑盒為德國Roche公司的Bio-Nick Translation標(biāo)記 系統(tǒng)。為了獲得良好的標(biāo)記效果，在5(HU體系中，用10U的Ecor I酶消化pATl載體，將端粒序列從質(zhì)粒pATl上分離，電泳后回收 含有端粒序列的片段，并純化。標(biāo)記的步驟如下取純化后的DNA 片段l|ig，用雙蒸水稀釋至16^1,加入Biotin-Nick Translation Mix 4pl， 混勻后于15。C反應(yīng)90min，最后加入0.5M的EDTAlpl終止反應(yīng)，-20 'C保存
三、 熒光原位雜交的流程
(一) 染色體制片的準(zhǔn)備 制片在6(TC烘箱中干燥過夜。
1. 用100fig/ml的RNase A (2xSSC配制)加塑膜蓋片，包 裝于37"C, l小時。
2. 2xSSC漂去塑膜蓋片，2xSSC, 3x5分鐘洗滌。
3. 用0,"/oPepsin ( 10mM HC1配制)37。C , 30分鐘。
4. lxPBS, 2x5分鐘。
5. 4%的多聚甲醛37°(:， 10分鐘。
6. 2xSSC， 3x5分鐘洗滌。
7. 2xSSC配制70%去離子甲酰胺溶液，80°C， 2min。
8. -20°。條件下，用75%、 95%、 100%的乙醇逐級脫水，每 級5分鐘。
9. 自然風(fēng)干，備用。
(二) 雜交混合液的準(zhǔn)備 20pl雜交混合液
1. 10|^1100%去離子甲酰胺2. 4|il 50%硫酸葡聚糖(放入37。C溶解后備用)
3. 2(il 20xSSC
4. 10%SDS (放入37。C溶解后備用)
5. l^il探針(步驟二標(biāo)記的探針，濃度50ng/W)
6. 2(il 封阻DNA(片段大小200~ 1000bp,濃度是探針的 35倍)
在渦流混合器上混勻，在PCR儀上97匸變性IO分鐘，迅速轉(zhuǎn) 入冰水中2分鐘，37°C， lh。
(三) 雜交
1. 取20)al雜交液滴于制片上，加塑膜蓋片，包裝于8(TC水洛 鍋中共變性IO分鐘。
2. 轉(zhuǎn)入37匸水洛中雜交過夜(注意檢查封袋有沒有進(jìn)水)。
(四) 洗脫和信號檢測
1. 雜交制片用2xSSC漂洗去塑膜蓋片。
2. 2x SSC (含有0.1%SDS) 37°C, 3x5分鐘洗滌。
3. 0.2xSSC (含有0.1%SDS) 37°C, 3x5分鐘洗滌。
4. 2xSSC室溫下沖洗2次，甩干制片。
5. 力P 50|al /片5%BSA (水或4 x SSC/Teween20配制)加塑膜 蓋片，37'C封阻30分鐘。
6. 甩干封阻液(制片不能見干)，力口 30ul/片Avidin-FITC或 Avidin-Fluorescein抗體(工作液濃度10ug/ml),加塑膜蓋片，37°C 溫育1小時。
7. 1 x PBS/Teween20中，37°C ， 3x5分鐘洗滌。
8. 用PI(碘化丙啶)(工作液濃度2jig/ml， 1 x PBS配制)30^1 / 片襯染3-7分鐘。9. lxPBS， 3x3分鐘洗去襯染劑，甩干或涼干， 用抗熒光衰減劑(Vectashied)封片。
4,熒光觀察
13用安裝有CCD攝像頭的Leica MRA2熒光顯微鏡觀察熒光信 號，用Leica— QFISH成像系統(tǒng)軟件進(jìn)行原位雜交圖象的攝取、釆 集和加工，以及分析。結(jié)果如圖3所示，通過熒光顯微鏡可以觀察 到明亮的雜交信號。
實施例4通過Bal31酶切動力實驗驗證FISH信號
熒光原位雜能夠證明雜交的信號位于染色體的末端，但不能證 明該信號位于染色體的最外端。本發(fā)明釆用了 Bal31酶切動力實驗 來檢測雜交信號是否位于染色體的最外端。Bal31酶是一種核酸外切 酶，它能從染色體的兩端開始消化染色體的DNA鏈。如果雜交信號不是位于染色體的最外端，那么從Bal31消化開始，就不會愛莫能助到酶消化的影響。
試驗方法取新海7#的基因組DNA100昭，在30 W體系中分 別用20U的Bal31消化0min, 10min, 20min, 40min, 80min，加入EDTA 至終濃度20mM以中止反應(yīng)。用酴氯仿抽提后，再分別加入10U的 HaeIII消化基因組DNA,最后將消化的基因組DNA轉(zhuǎn)移到帶正電的 尼龍膜上，用DIG標(biāo)記的pATl作為探針與之進(jìn)行Southern雜交。
結(jié)果如圖4所示，隨著Bal31消化時間的延長，雜交條帶的分 子量越來越小，信號越來越弱。這說明雜交信號從Bal31消化開始 就受到了影響。結(jié)合熒光原位雜交以及Ba131酶切動力實驗得結(jié)果， 證明雜交信號的確實位于染色體最外端。序列表
<110>中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所
〈120>棉花染色體炎光原位雜交的端粒標(biāo)記及其應(yīng)用
<130> KHP08112212.7
<160〉 3
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 353
<212〉 DNA
<213> AraWc/cp57.s t力ah.3朋
<400> 1
tgagggactcacatacattgagtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggttt60
agggtttagggtttagggttggtttagggtttaaggtttagggtt哪gt120
ttagggtttagggtttsgggtttagggtttgtttagggtttagggtttag180
ggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggttt郷gtttagggttt兆ggU240
t鄉(xiāng)gttt3gggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagggtttagg300
gtUagggtttagggttagggttcttgacgatg犯cagtggta353
<210〉 2 <211〉 20 〈212〉 DNA <213>人工序列 <400> 2
tgagggactc acatacattg
20
<210〉 3 <211> 20 <212>腿 〈213>人工序列 <400> 3
accactgaac atccattgag
20
1權(quán)利要求
1、棉花染色體熒光原位雜交的端粒標(biāo)記，其為生物素標(biāo)記的SEQ ID No.1所示的序列。
2、 一種制備權(quán)利要求l所述端粒標(biāo)記的方法，包括如下步驟1) 采用引物TSl: 5'-TGAGGGACTCACATACATTG-3', TS2: 5'-ACCACTGAACATCCATTGAG-3'以擬南芥基因組為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物通過膠回收純化后與T-easy載體連接得到質(zhì)粒 pATl，并進(jìn)行測序驗證；2) 用五coRI酶切pATl，回收目的片段，并進(jìn)行生物素標(biāo)記。
3、 如權(quán)利要求1所述的端粒標(biāo)記在棉花染色體熒光原位雜交中 的應(yīng)用。
4、 一種棉花染色體熒光原位雜交端粒標(biāo)記方法，其使用權(quán)利要 求1所述的端粒標(biāo)記作為探針與棉花染色體雜交。
5、 如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述棉花染色體為根尖中期細(xì)胞染色體。
6、 如權(quán)利要求4或5所述的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟1) 制備根尖染色體取棉花根尖，于25ppm的放線菌酮中2(TC預(yù)處理1.5 2.5小時， 預(yù)處理結(jié)束后，用蒸餾水洗10min，固定液固定2-24h;水洗10min, 2%纖維素酶和0.5%果膠酶混合液37。C處理30min, 45%~60%乙酸 壓片，鏡檢，選擇分裂相較好的制片，-2(TC預(yù)冷，-70°(:揭蓋片，80 'C水洛鍋表面迅速烤干，4'C保存?zhèn)溆茫?) 預(yù)處理染色體制片將步驟1 )的制片在60。C烘箱中干燥過夜，用100嗎/ml的RNase A加塑膜蓋片，包裝于37'C， l小時；2xSSC漂去塑膜蓋片，2x SSC，洗滌3次，每次5分鐘；用0.1% Pepsin37。C處理20-40分鐘;PBS，洗滌2次，每次5分鐘；4。/。的多聚甲醛37'C處理IO分鐘；2 x SSC，洗滌3次每次5分鐘；2 x SSC配制70%去離子甲酰胺溶液， 80°C， 2min; -20。C條件下，依次用75%、 95%和100%的乙醇逐級 脫水，每級5分鐘；最后自然風(fēng)干，備用；3) 配置雜交液 20pl雜交混合液的配置如下10)ul 100%去離子甲酰胺 4|Lil 50%硫酸葡聚糖 2^1 20 x SSC 1^1 10%SDS探針權(quán)利要求1所述的端粒標(biāo)記探針，濃度10 100ng/ial 2|il封阻DNA，片段大小200~1000bp,濃度是探針的10-60倍 在渦流混合器上混勻，在PCR儀上97匸變性IO分鐘，迅速轉(zhuǎn) 入冰水中2分鐘，37°C， lh;4) 雜交取20pl雜交液滴于制片上，加塑膜蓋片，包裝于8(TC水浴鍋中 共變性10分鐘；轉(zhuǎn)入37'C水洛中雜交過夜；5) 洗脫和信號檢測雜交制片用2xSSC漂洗去塑膜蓋片；用含0.1。/。SDS的2 x SSC 在37'C下洗滌3次，每次5分鐘；用含0.1%SDS的0.2 x SSC洗滌 3次，每次5分鐘；用2xSSC室溫下沖洗2次，甩干制片；加 /片5。/。BSA加塑膜蓋片，37'C封阻30分鐘；甩干封阻液，加30^1/ 片Avidin-FITC或Avidin-Fluorescein抗體，加塑膜蓋片，37。C溫育1 小時；用含0.3% Teween20的PBS，于37。C,洗滌3次，每次5分 鐘；用PI或用DAPI30ial/片襯染3-7分鐘；PBS洗滌3次，每次3 分鐘洗去襯染劑，甩干或涼干，用抗熒光衰減劑封片。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種適用于棉花熒光原位雜交的端粒標(biāo)記，其為生物素標(biāo)記的SEQ ID No.1所示的序列。以該端粒標(biāo)記作為探針與棉花根尖體細(xì)胞中期染色體進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)，在染色體的末端都有較強(qiáng)烈的雜交信號。進(jìn)一步通過實驗證實了原位雜交的信號位于染色體的最末端，即雜交信號為端粒信號。因此，通過這種位于染色體末端的端粒標(biāo)記，就能夠?qū)γ藁w細(xì)胞中期染色體的長度進(jìn)行估量，從而為進(jìn)一步的核型分析等細(xì)胞學(xué)實驗奠定基礎(chǔ)。
文檔編號C12Q1/68GK101475992SQ20091007674
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年1月16日
發(fā)明者鍵 凌, 方 劉, 宋國立, 張香娣, 王坤波, 王春英, 王玉紅, 黎紹惠 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所