專利名稱：一種畜肉腐敗菌原位熒光染色的快速檢測方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種針對畜肉所含腐敗菌原位熒光染色的快速檢測方法，特指一種基于雙乙酸熒光素(FDA)原位熒光染色的豬肉腐敗菌快速檢測方法。
背景技術：
中國是世界上最大的豬肉生產國和消費國，2011年其產量和消費量均超過5000萬噸，均占全世界50%以上。隨著人民生活水平的提高，人們對肉品的需求發(fā)生了由量到質的變化。人們不僅關心肉類食品的營養(yǎng)價值，而且更關心其衛(wèi)生和安全。特別是近年來，禽流感等動物疫病的發(fā)生，瘦肉精等藥物殘留引發(fā)的一系列人體食物中毒事件等，更加重了人民對肉品品質安全的擔心。目前，食品安全已成為我國各級政府和社會關注的焦點，也是影響我國畜肉產品出口的關鍵問題。
新鮮度(即腐敗變質程度)是反映肉品質量與安全的重要指標。腐敗菌的生長繁殖是導致肉品腐敗變質，造成肉品營養(yǎng)價值下降甚至危及食用者健康的主要原因。目前，許多學者對腐敗菌的種類、組成比例及致腐能力等方面做了大量研究，但對腐敗菌侵染肉品的原位實時檢測及其腐敗機理研究未見報道。若能對肉品中的腐敗菌進行原位檢測，就能實時跟蹤檢測腐敗菌在肉樣組織中的動態(tài)變化及其相應造成肉樣腐敗變質的程度，即可更細致微觀地掌握其腐敗機理，并更有針對性地對腐敗菌加以控制，對保障肉品品質安全和延長肉品貨架期具有重要的現(xiàn)實意義。目前，對豬肉腐敗菌檢測的方法有壓片顯微計數(shù)法、平板菌落計數(shù)法、三磷酸腺苷(ATP)生物發(fā)光法、聚合酶鏈反應(PCR)法等，這些方法都是將細菌從肉品中分離后的體外檢測，耗時、費力、操作繁鎖，無法實現(xiàn)豬肉腐敗菌原位實時的快速檢測。隨著突光標記技術和光學成像技術的發(fā)展，突光標記結合激光共聚焦掃描顯微鏡(Laser confocal scanning microscope,LCSM)成像技術,不僅可觀察固定的細胞、組織切片，還可對活細胞進行實時動態(tài)觀察和檢測，并提供定量熒光測定和圖像分析等實用研究手段，該技術已在觀察細菌活性及活體動物體內腫瘤細胞的定位、生長、轉移及治療等方面得到廣泛應用。雙乙酸突光素(Fluorescein diacetate, FDA)是Rotman和Papermaser于1966年發(fā)現(xiàn)的一種熒光染料，該染料本身不發(fā)熒光，但它滲入活細胞內并被酯酶分解后生成熒光素，在藍色光激發(fā)下顯示強的黃綠色熒光，經LCSM或熒光顯微鏡即可檢測。死細胞由于沒有酯酶活性而不顯示熒光。此方法具有快速、簡便、靈敏等優(yōu)點，近年來在細胞活力及腫瘤細胞實時檢測方面有諸多的應用。目前尚未有將FDA熒光染色法應用于畜肉腐敗菌原位實時檢測的相關報道。

發(fā)明內容
鑒于上述現(xiàn)有技術發(fā)展情況，本發(fā)明的目的就是要提供一種畜肉腐敗菌原位熒光染色實時快速檢測的方法。將豬肉冷凍后在同一位置連續(xù)切成薄片置于載玻片上，采用熒光染料對畜肉中的腐敗菌進行原位熒光標記，通過熒光強度定量計算豬肉組織單位面積中腐敗菌相對數(shù)量，便于觀察和跟蹤腐敗菌在畜肉腐敗過程的動態(tài)變化，為進一步深入研究畜肉的腐敗變質機理及其腐敗菌的相應控制提供一種簡便可行的方法。本發(fā)明的技術方案如下本 發(fā)明所述的一種畜肉腐敗菌原位熒光染色的快速檢測方法，其特征在于，包括以下步驟(I)待測肉樣切片從待檢畜肉中切取一小塊肉樣，用冷凍切片機在同一位置連續(xù)切成一定厚度的多個薄片置于干凈載玻片上；(2) FDA的配制和染色用丙酮配制O. 5mg/mL的FDA溶液，并滴加到豬肉切片 蓋整個豬肉切片)中在室溫暗處染色15分鐘后，滴加甘油與PBS混合液(9 1)并用蓋玻片對豬肉切片進行封片；(3) LSCM檢測將染色封片后的豬肉切片倒置于LSCM中進行斷層掃描檢測，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為530nm，選取同樣的放大倍數(shù)、激光功率、光電倍增管的增益(PMT)、掃描強度等條件，調焦獲取清晰圖像，可觀察到侵染有腐敗菌的豬肉組織部位呈現(xiàn)黃綠色熒光。每個切片測量5個視野，拍攝保存圖像，并計算平均熒光強度代表豬肉組織該切片部位單位面積相對的細胞數(shù)量?？蓪崟r地觀察和跟蹤腐敗菌在豬肉組織的分布、侵染情況及其動態(tài)變化。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供的一種畜肉腐敗菌原位熒光染色的快速檢測方法。在不破壞畜肉樣本的前提下，實現(xiàn)畜肉腐敗菌的快速檢測。本發(fā)明操作簡單、檢測速度快、無危害性，在不破壞生理狀態(tài)下利用熒光染料對腐敗菌活體進行原位熒光染色，利用LSCM掃描拍攝圖像，并計算平均熒光強度代表豬肉組織該切片部位單位面積相對的細胞數(shù)量。本發(fā)明能實時地觀察和跟蹤腐敗菌在豬肉組織的分布、侵染情況及其動態(tài)變化。為進一步深入研究畜肉的腐敗變質機理，以更有針對性地對腐敗菌加以控制，為延長肉品貨架期，保障肉品品質安全，維護消費者健康有著直接的現(xiàn)實意義。


圖I是激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察染色后的P. koreensis PSl效果圖。圖2是激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察接種有P. koreensis PS豬肉切片熒光染色及區(qū)域放大效果圖。圖3是激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察接種有P. koreensis PSl豬肉切片不同深度肌纖維熒光染色效果圖。圖4是激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察接種有P. koreensis PSl豬肉切片不同深度脂肪細胞熒光染色效果圖。
具體實施例方式本發(fā)明對畜肉腐敗菌原位實時檢測具有通用性，但由于畜肉及腐敗菌種類較多，因此本發(fā)明只以里脊豬肉和優(yōu)勢腐敗菌Pseudomonas koreensis PSl的檢測為實施實例，其它畜肉腐敗菌檢測可參照該實施實例的方法，具體針對所測畜肉腐敗菌污染情況，選取適當?shù)拇郎y樣本，對其冷凍切片F(xiàn)DA熒光染色后LSCM掃描檢測。
實例實施步驟結合附圖進行詳細描述。實施例一將從變質豬肉中分離鑒定保存的優(yōu)勢腐敗菌P. koreensis PSl (該菌種已被SoonWo Kwon, M. Hultberg 和襲鳳娟等人報道；Pseudomonas koreensis sp. nov. , Pseudomonasumsongensis sp. nov. and Pseudomonas jinjuensis sp.nov.，novel species fromfarm soils in Korea ；Internationa IJournal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology (2003)，53，21-27)。先將該菌種在大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基(TSA培養(yǎng)基)試管斜面中培養(yǎng)活化，并用無菌水制成104 105CFU/mL的細胞懸液；同時割取大小約3CmX3CmX2Cm的里脊豬肉樣本，于菌液中浸泡IOs進行接種，浙干后取出放入無菌塑料袋中密封于4°C冰箱保存。用冷凍切片機從接種有優(yōu)勢腐敗菌P. koreensis PSl的肉樣表面切取厚度60 μ m的薄片，置于干凈載玻片上，同時將優(yōu)勢腐敗菌P. koreensis PSl細胞懸液涂在載玻片上，分別滴加O. 5mg/mL FDA染料將其覆蓋，在室溫暗處染色15分鐘后，滴加甘油與PBS混合液 (91)并用蓋玻片對豬肉切片進行封片。然后將染色切片倒置于LSCM中進行斷層掃描檢測，激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為530nm，選取合適放大倍數(shù)、激光功率、光電倍增管的增益(PMT)、掃描頻率等,調焦獲取清晰圖像拍攝保存?？傻玫絻?yōu)勢腐敗菌P. koreensisPSl經FDA染色后呈現(xiàn)明顯黃綠色熒光(圖I)。以及可看出接種有P. koreensis PSl的肉樣經FDA染色后，豬肉組織含菌部位也同樣出現(xiàn)黃綠色熒光(圖2)，從圖2局部區(qū)域放大可看出，優(yōu)勢腐敗菌P. koreensis PSl較多分布在豬肉組織的細胞間隙處，且其數(shù)量越多發(fā)出的黃綠色熒光越強。將4°C冰箱保存3天接種有優(yōu)勢腐敗菌P. koreensis PSl的豬肉里脊和五花肉樣本，分別用冷凍切片機在肉樣中同一位置連續(xù)切成厚度60 μ m的薄片，置于干凈載玻片上，滴加O. 5mg/mLFDA染料覆蓋整個豬肉切片，在室溫暗處染色15分鐘后，滴加甘油與PBS混合液(9 1)并用蓋玻片對豬肉切片進行封片。然后將染色切片倒置于LSCM中進行斷層掃描檢測，激發(fā)光波長為488nm,發(fā)射光波長為530nm,選取合適放大倍數(shù)、激光功率、光電倍增管的增益(PMT)、掃描頻率等，調焦進行斷層掃描拍攝保存圖像，圖像以1024X1024像素JPG和LIF兩種格式保存。經分析得到不同深度豬肉肌纖維和脂肪細胞所含優(yōu)勢腐敗菌P. koreensis PSl染色的突光效果圖(圖3和圖4)。可見,利用本發(fā)明方法可以實時地觀察和跟蹤腐敗菌在豬肉組織的分布、侵染情況及其動態(tài)變化。
權利要求
1.一種針對畜肉所含腐敗菌原位熒光染色的快速檢測方法，按照以下步驟進行 待測肉樣切片從待檢畜肉中切取一小塊肉樣，用冷凍切片機在同一位置連續(xù)切成一定厚度的多個薄片置于干凈載玻片上； 熒光染料配制和染色用丙酮配制濃度為O. 5mg/mL的熒光染料溶液，并滴加到豬肉切片中，使溶液覆蓋整個豬肉切片，在室溫暗處染色15分鐘后，再滴加甘油與PBS體積比為9 :I的混合液并用蓋玻片對豬肉切片進行封片； 激光共聚焦掃描顯微鏡檢測將染色豬肉切片倒置于激光共聚焦掃描顯微鏡中，用激發(fā)光激發(fā)，并選取同樣檢測條件，調焦進行斷層掃描拍攝保存圖像，可觀察到侵染有腐敗菌的豬肉組織部位呈現(xiàn)黃綠色熒光；即達到實時觀察和跟蹤腐敗菌在豬肉組織的分布、侵染情況及其動態(tài)變化。
2.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述熒光染料是雙乙酸熒光素。
3.根據(jù)權利要求I所述的方法，其特征在于，所述檢測條件是使用激光共聚焦掃描顯微鏡的激發(fā)光波長為488nm，發(fā)射光波長為530nm，放大倍數(shù)選10 X 10，激光功率選最大功率的60%，光電倍增管的增益選750V，以xyz為掃描模式，設定分辨率1024X像素，掃描速度為200Hz，針孔大小、線平均、面平均參數(shù)均為默認值。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種畜肉腐敗菌原位熒光染色的快速檢測方法。利用熒光染料對腐敗菌活體進行原位熒光染色，結合激光共聚焦掃描顯微鏡斷層掃描拍攝圖像，并計算平均熒光強度代表豬肉組織該切片部位單位面積相對的細胞數(shù)量。本發(fā)明操作簡單、檢測速度快、無危害性，在不破壞生理狀態(tài)的前提下，實現(xiàn)畜肉腐敗菌的快速檢測，能實時地觀察和跟蹤腐敗菌在豬肉組織的分布、侵染情況及其動態(tài)變化。為進一步深入研究畜肉的腐敗變質機理，以更有針對性地對腐敗菌加以控制，延長肉品貨架期，保障肉品品質安全，維護消費者健康有著直接的現(xiàn)實意義。
文檔編號G01N21/64GK102866140SQ20121036499
公開日2013年1月9日 申請日期2012年9月26日 優(yōu)先權日2012年9月26日
發(fā)明者陳全勝, 趙杰文, 黃林 申請人:江蘇大學