專利名稱：識(shí)別端粒DNA片段與c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種識(shí)別端粒DNA片段與C-kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方法。
背景技術(shù)：
最常見(jiàn)的DNA是由兩條互補(bǔ)鏈通過(guò)堿基配對(duì)的方式所形成的雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)。然 而，某些含有大量鳥(niǎo)嘌呤(G)堿基重復(fù)序列的DNA可以通過(guò)G堿基間Hoogsteen氫鍵形成 四鏈螺旋結(jié)構(gòu)，因此被稱為G-四鏈體(簡(jiǎn)稱G4)。人們發(fā)現(xiàn)在染色體端粒末端以及一些重 要的腫瘤基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)，在一定條件下都能形成G-四鏈體。研究表明，85-90%惡性腫瘤的發(fā)病都與端粒酶的活性有關(guān)，而于端粒區(qū)域形成的 G4結(jié)構(gòu)可以有效抑制端粒酶的活性，進(jìn)而達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的目的。它由一段雙鏈重 復(fù)區(qū)域和一段單鏈重復(fù)區(qū)域構(gòu)成，為含有多個(gè)GGG重復(fù)單元的DNA片段。除了端粒，在生物體的基因組內(nèi)還有許多重要的DNA片段能夠在特定條件下形成 G4結(jié)構(gòu)。例如某些癌基因及抑癌基因的啟動(dòng)子區(qū)域都含有富含鳥(niǎo)嘌呤的堿基序列，能夠在 特定條件下形成G4結(jié)構(gòu)。其中，位于原癌基因c-kit啟動(dòng)子的基因片段(見(jiàn)序列表的序列 4)，在特定的條件下能夠形成一種特殊的平行結(jié)構(gòu)G4。由于其結(jié)構(gòu)涉及c-kit基因表達(dá)的 調(diào)控而備受關(guān)注。因此，識(shí)別端粒DNA片段與c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段對(duì)于腫瘤診斷治療以及抗 腫瘤藥物的研發(fā)有著非常重要的意義。物堿。
氯化兩面針堿的結(jié)構(gòu)見(jiàn)式(I)，血根堿的結(jié)構(gòu)見(jiàn)式(II)，兩者均為四苯菲啶類生式(I)
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種識(shí)別端粒DNA片段與c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方法。本發(fā)明提供的識(shí)別待測(cè)DNA為端粒DNA片段還是c_kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方 法，包括如下步驟將待測(cè)DNA分別與氯化兩面針堿或血根堿進(jìn)行反應(yīng)；如果待測(cè)DNA與氯化兩面針 堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)，與血根堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié) 構(gòu)，則待測(cè)DNA為端粒DNA片段；如果待測(cè)DNA與氯化兩面針堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫蠫4結(jié)構(gòu)，與血根堿反應(yīng)后單鏈結(jié)構(gòu)不變，則待測(cè)DNA為c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段；所述 混合G4結(jié)構(gòu)為平行G4結(jié)構(gòu)和反平行G4結(jié)構(gòu)的混合結(jié)構(gòu)。所述待測(cè)DNA與所述氯化兩面針堿的物質(zhì)的量的比值可為1 (8-50)；所述待測(cè) DNA與所述血根堿的物質(zhì)的量的比值可為1 (1-50)。所述待測(cè)DNA與所述氯化兩面針堿的物質(zhì)的量的比值具體可為1 12;所述待測(cè) DNA與所述血根堿的物質(zhì)的量的比值具體可為1 12。所述待測(cè)DNA與所述氯化兩面針堿的反應(yīng)可在pH值為6. 0 8. 0的緩沖溶液中 進(jìn)行；所述待測(cè)DNA與所述血根堿的反應(yīng)可在pH值為6. 0 8. 0的緩沖溶液中進(jìn)行。所述緩沖溶液具體可為濃度為4-40mM的Tris緩沖溶液，優(yōu)選濃度為10_40mM的 Tris緩沖溶液，如濃度為IOmM的Tris緩沖溶液。在上述兩個(gè)反應(yīng)體系中，反應(yīng)起始時(shí)，所述待測(cè)DNA在所述緩沖溶液中的濃度為 1-5 μ M，優(yōu)選為 4 μ M。所述反應(yīng)的時(shí)間為1小時(shí)以上，優(yōu)選為12小時(shí)。所述方法中，檢測(cè)待測(cè)DNA的結(jié)構(gòu)變化的方法可為以測(cè)定旋光性為基礎(chǔ)的分析方 法，具體可為圓二色譜法。所述端粒DNA片段可為含有四個(gè)以上GGG重復(fù)單元的DNA片段。所述端粒DNA片段具體可為序列表的序列1或序列表的序列2或序列表的序列3 所示的DNA片段；所述c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段具體可為序列表的序列4所示的DNA片 段。應(yīng)用圓二色譜法檢測(cè)DNA的結(jié)構(gòu)變化的判斷標(biāo)準(zhǔn)如下如果出現(xiàn)256nm左右的信 號(hào)，反應(yīng)后的溶液中含有單鏈DNA ；如果出現(xiàn)265 275nm的信號(hào)，反應(yīng)后的溶液中含有平 行G4結(jié)構(gòu)的DNA ；如果出現(xiàn)288 298nm的信號(hào)，反應(yīng)后的溶液中含有反平行G4結(jié)構(gòu)的 DNA。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)能夠非常有效的識(shí)別端粒 DNA片段與c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段；只要按本發(fā)明提供的比例將化合物與DNA混合，就 能實(shí)現(xiàn)，且不需要繁瑣的后處理，該方法簡(jiǎn)便易行，實(shí)驗(yàn)條件溫和。
圖1為實(shí)施例1中氯化兩面針堿與HT4反應(yīng)的圓二色譜。 圖2為實(shí)施例2中氯化兩面針堿與H22反應(yīng)的圓二色譜。 圖3為實(shí)施例3中氯化兩面針堿與H24A反應(yīng)的圓二色譜。 圖4為實(shí)施例4中氯化兩面針堿與C23反應(yīng)的圓二色譜。 圖5為實(shí)施例5中血根堿與HT4反應(yīng)的圓二色譜。 圖6為實(shí)施例6中血根堿與H22反應(yīng)的圓二色譜。 圖7為實(shí)施例7中血根堿與H24A反應(yīng)的圓二色譜。 圖8為實(shí)施例8中血根堿與C23反應(yīng)的圓二色譜。 圖9為實(shí)施例9中氯化兩面針堿與HT4反應(yīng)的圓二色譜。 圖10為實(shí)施例10中氯化兩面針堿與HT4反應(yīng)的圓二色譜。 圖11為實(shí)施例11中血根堿與HT4反應(yīng)的圓二色譜。
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圖12為實(shí)施例12中血根堿與HT4反應(yīng)的圓二色譜。圖13為實(shí)施例13中氯化兩面針堿與C23反應(yīng)的圓二色譜。圖14為實(shí)施例14中氯化兩面針堿與C23反應(yīng)的圓二色譜。圖15為實(shí)施例15中血根堿與C23反應(yīng)的圓二色譜。圖16為實(shí)施例16中血根堿與C23反應(yīng)的圓二色譜。
具體實(shí)施例方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購(gòu)買得到的。實(shí)施例中所用的DNA序列(均為人工合成并經(jīng)過(guò)測(cè)序鑒定)如下端粒DNA片段HT4 :5，-TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，(序列表的序列 1)。H22 :5，-AGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG-3，(序列表的序列 2)。H24A :5，-TTGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGA-3，(序列表的序列 3)。c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段C23 :5，-AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG-3，(序列表的序列 4)。氯化兩面針堿成都思科華有限公司，純度為98%。血根堿成都思科華有限公司，純度為98 %。實(shí)施例中均采用濃度為IOmM的Tris緩沖溶液。實(shí)施例1、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別HT4序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將ΗΤ4加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與ΗΤ4的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)和反平 行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)，氯化兩面針堿也在HT4的作用下，產(chǎn)生旋光性，在374nm 和416nm處分別出現(xiàn)信號(hào)。結(jié)果表明在氯化兩面針堿的作用下，HT4由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛?合G4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例2、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別H22序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將Η22加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。
第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液A，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與Η22的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到Η22的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到Η22的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖2。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)和反平 行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。結(jié)果表明在氯化兩面針堿的作用下，H22由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn) 變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例3、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別H24A序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將Η24Α加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與Η24Α的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到Η24Α的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到Η24Α的濃度為4μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)和 反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)，同時(shí)氯化兩面針堿也在H24A的作用下，產(chǎn)生旋光性， 在372nm和416nm處分別出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。結(jié)果表明在氯化兩面針堿的作用下，H24A由單鏈 結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例4、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別C23序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將C23加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與C23的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)，同 時(shí)氯化兩面針堿也在C23的作用下，產(chǎn)生旋光性，在334nm和397nm處分別出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。結(jié) 果表明在氯化兩面針堿的作用下，C23由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫蠫4結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例5、應(yīng)用血根堿識(shí)別HT4序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液B 將HT4加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與ΗΤ4的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris緩沖溶 液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。結(jié) 果表明在血根堿的作用下，HT4由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例6、應(yīng)用血根堿識(shí)別H22序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ M。溶液B 將Η22加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與Η22的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris緩沖溶 液將混合液稀釋到Η22的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到Η22的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖6。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。結(jié) 果表明在血根堿的作用下，H22由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例7、應(yīng)用血根堿識(shí)別H24A序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ M。溶液B 將Η24Α加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與Η24Α的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris緩沖 溶液將混合液稀釋到Η24Α的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到Η24Α的濃度為4μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖7。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。結(jié) 果表明在血根堿的作用下，H24A由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)。
實(shí)施例8、應(yīng)用血根堿識(shí)別C23序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 7. 4)中，使其終濃度為50. 0 μ M。溶液B 將C23加入Tris緩沖溶液(pH 7.4)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 7. 4)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液Α，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與C23的摩爾濃度比為12 1)；再用Tris緩沖溶 液將混合液稀釋到C23的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng)12小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1920 μ 1溶液C，然后加入160 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為4 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 12小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖8。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第二組Ep管中的溶液只有單鏈DNA信號(hào)(256nm)，沒(méi)有其它DNA信號(hào)產(chǎn) 生。結(jié)果表明在血根堿的作用下，C23結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。實(shí)施例9、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別HT4序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將ΗΤ4加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 8. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與ΗΤ4的摩爾濃度比為50 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng)18小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 18小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖9。第二組Ep管中的溶液只有單鏈 DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)和反平 行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。結(jié)果表明在氯化兩面針堿的作用下，HT4由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn) 變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例10、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別HT4序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 6.0)中，使其終濃度為50. 0 μ M。溶液B 將ΗΤ4加入Tris緩沖溶液(pH 6.0)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 6. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入800 μ 1溶液Α，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與ΗΤ4的摩爾濃度比為8 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng)1小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入800 μ 1溶液C，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 1小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖10。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)和反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。結(jié)果表明在氯化兩面針堿的作用下，HT4由單鏈結(jié) 構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例11、應(yīng)用血根堿識(shí)別HT4序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將ΗΤ4加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 8. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與ΗΤ4的摩爾濃度比為50 1)；再用Tris緩沖溶 液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng)18小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 18小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖11。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。 結(jié)果表明在血根堿的作用下，HT4由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例12、應(yīng)用血根堿識(shí)別HT4序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 6. 0)中，使其終濃度為50. 0 μ M。溶液B 將ΗΤ4加入Tris緩沖溶液(pH 6. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 6. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與ΗΤ4的摩爾濃度比為1 1)；再用Tris緩沖溶 液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng)1小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到ΗΤ4的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 1小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖12。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了反平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(288 298nm)。 結(jié)果表明在血根堿的作用下，HT4由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例13、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別C23序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將C23加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 8. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與C23的摩爾濃度比為50 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng)18小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 18小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖13。第二組Ep管中的溶液只有單
9鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)，同 時(shí)氯化兩面針堿也在C23的作用下，產(chǎn)生旋光性，在334nm和397nm處分別出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。結(jié) 果表明在氯化兩面針堿的作用下，C23由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫蠫4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例14、應(yīng)用氯化兩面針堿識(shí)別C23序列溶液A 將氯化兩面針堿加入Tris緩沖溶液(pH 6. 0)中，使其終濃度為50. 0 μ Μ。溶液B 將C23加入Tris緩沖溶液(pH 6. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 6. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入800 μ 1溶液Α，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的氯化兩面針堿與C23的摩爾濃度比為8 1)；再用Tris 緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng)1小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入800 μ 1溶液C，然后加入100 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 1小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖14。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第一組Ep管中的溶液出現(xiàn)了平行G4結(jié)構(gòu)的信號(hào)(265 275nm)，同 時(shí)氯化兩面針堿也在C23的作用下，產(chǎn)生旋光性，在334nm和397nm處分別出現(xiàn)強(qiáng)信號(hào)。結(jié) 果表明在氯化兩面針堿的作用下，C23由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫蠫4結(jié)構(gòu)。實(shí)施例15、應(yīng)用血根堿識(shí)別C23序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液B 將C23加入Tris緩沖溶液(pH 8. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 8. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液A，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與C23的摩爾濃度比為50 1)；再用Tri s緩沖 溶液將混合液稀釋到C23的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng)18小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入20 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為1 μ M ；搖勻后，反應(yīng) 18小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖15。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第二組Ep管中的溶液只有單鏈DNA信號(hào)(256nm)，沒(méi)有其它DNA信號(hào) 產(chǎn)生。結(jié)果表明在血根堿的作用下，C23結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。實(shí)施例16、應(yīng)用血根堿識(shí)別C23序列溶液A 將血根堿加入Tris緩沖溶液(pH 6. 0)中，使其終濃度為50. 0 μ M。溶液B 將C23加入Tris緩沖溶液(pH 6. 0)中，使其終濃度為50. 0μΜο溶液C =Tris 緩沖溶液(pH 6. 0)。第一組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液Α，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液(混合液中的血根堿與C23的摩爾濃度比為1 1)；再用Tris緩沖溶 液將混合液稀釋到C23的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng)1小時(shí)。第二組Ep管(設(shè)置三個(gè)重復(fù))在Ep管中加入1000 μ 1溶液C，然后加入1000 μ 1 溶液B，得到混合液；再用Tris緩沖溶液將混合液稀釋到C23的濃度為5 μ M ；搖勻后，反應(yīng)
101小時(shí)。分別將兩組Ep管進(jìn)行圓二色譜分析，結(jié)果見(jiàn)圖16。第二組Ep管中的溶液只有單 鏈DNA信號(hào)(256nm)；第二組Ep管中的溶液只有單鏈DNA信號(hào)(256nm)，沒(méi)有其它DNA信號(hào) 產(chǎn)生。結(jié)果表明在血根堿的作用下，C23結(jié)構(gòu)不發(fā)生變化。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所<120>識(shí)別端粒DNA片段與c_kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方法<130>CGGNARY92369<160>4<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1ttagggttag ggttagggtt aggg 24<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>2agggttaggg ttagggttag gg 22<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3ttgggttagg gttagggtta ggga 24<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>
<400>4agggagggcg ctgggaggag gg 2權(quán)利要求
一種識(shí)別待測(cè)DNA為端粒DNA片段還是c kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方法，包括如下步驟將待測(cè)DNA分別與氯化兩面針堿或血根堿進(jìn)行反應(yīng)；如果待測(cè)DNA與氯化兩面針堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)，與血根堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)，則待測(cè)DNA為端粒DNA片段；如果待測(cè)DNA與氯化兩面針堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫蠫4結(jié)構(gòu)，與血根堿反應(yīng)后單鏈結(jié)構(gòu)不變，則待測(cè)DNA為c kit基因啟動(dòng)子DNA片段；所述混合G4結(jié)構(gòu)為平行G4結(jié)構(gòu)和反平行G4結(jié)構(gòu)的混合結(jié)構(gòu)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述待測(cè)DNA與所述氯化兩面針堿的物質(zhì) 的量的比值為1 (8-50)；所述待測(cè)DNA與所述血根堿的物質(zhì)的量的比值為1 (1-50)。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述待測(cè)DNA與所述氯化兩面針堿的物質(zhì) 的量的比值為1 12;所述待測(cè)DNA與所述血根堿的物質(zhì)的量的比值為1 12。
4.如權(quán)利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于所述待測(cè)DNA與所述氯化兩面 針堿的反應(yīng)是在PH值為6. 0 8. 0的緩沖溶液中進(jìn)行的；所述待測(cè)DNA與所述血根堿的反 應(yīng)是在PH值為6. 0 8. 0的緩沖溶液中進(jìn)行的。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法中，反應(yīng)起始時(shí)，所述待測(cè)DNA在 所述緩沖溶液中的濃度為1-5 μ M，優(yōu)選為4 μ M。
6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于所述反應(yīng)的時(shí)間為1小時(shí)以上， 優(yōu)選為12小時(shí)。
7.如權(quán)利要求1至6中任一所述的方法，其特征在于所述方法中，檢測(cè)待測(cè)DNA的結(jié) 構(gòu)變化的方法為以測(cè)定旋光性為基礎(chǔ)的分析方法。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于檢測(cè)所述待測(cè)DNA的結(jié)構(gòu)變化的方法為圓二色譜法。
9.如權(quán)利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于所述端粒DNA片段為含有四個(gè) 以上GGG重復(fù)單元的DNA片段。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述端粒DNA片段為序列表的序列1或序 列表的序列2或序列表的序列3所示的DNA片段；所述c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段為序列 表的序列4所示的DNA片段。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種識(shí)別端粒DNA片段與c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段的方法。本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟將待測(cè)DNA分別與氯化兩面針堿或血根堿進(jìn)行反應(yīng)；如果待測(cè)DNA與氯化兩面針堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榛旌螱4結(jié)構(gòu)，與血根堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)榉雌叫蠫4結(jié)構(gòu)，則待測(cè)DNA為端粒DNA片段；如果待測(cè)DNA與氯化兩面針堿反應(yīng)后由單鏈結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槠叫蠫4結(jié)構(gòu)，與血根堿反應(yīng)后單鏈結(jié)構(gòu)不變，則待測(cè)DNA為c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的方法具有如下優(yōu)點(diǎn)能夠非常有效的識(shí)別端粒DNA片段與c-kit基因啟動(dòng)子DNA片段；只要按本發(fā)明提供的比例將化合物與DNA溶液混合，就能實(shí)現(xiàn)，且不需要繁瑣的后處理，該方法簡(jiǎn)便易行，實(shí)驗(yàn)條件溫和。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101935689SQ20091008840
公開(kāi)日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2009年6月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月29日
發(fā)明者向俊鋒, 唐亞林, 楊千帆, 楊舒 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院化學(xué)研究所