專利名稱：：編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途的制作方法編碼類黃嗣途徑酶的基因序列及其用途本發(fā)明一般涉及編碼類黃酮途徑中代謝酶，更具體地，類黃酮3，-羥化酶(下文稱為"F3，H")或其衍生物的基因序列及其它們在植物和其它生物中控制色素形成的用途.本說明書中作者提及的發(fā)表文章的文獻目錄詳情收錄在說明書結尾部分。說明書和權利要求書中提及的核苷酸和氨基酸序列的序列鑒定號(SEQIDNOS)在文獻目錄后定義.SEQIDNOs的概述及其所涉及的序列在實施例前提供.在本說明書全文中，除非上下文另有要求，單詞"包含"或其諸如現(xiàn)在時(comprises)或進行時(comprising)的時態(tài)變化將理解為指包括所述元件或整體或元件或整體組但不排除任何其它元件或整體或元件或整體組.重組DNA技術迅速發(fā)展的改進極大地促進了與生物技術有關工業(yè)領域的研究和發(fā)展。園藝工業(yè)已成為該技術最近的受益者，該技術有助于在扦插后表現(xiàn)出衰老延緩的植物和花中形成疾病抗性.也有些注意力集中在控制花的顏色上.花舟工業(yè)致力于形成新的和不同的開花植物品種.產(chǎn)生這樣的新品種的一個有效的途徑是通近控制花的顏色，使用經(jīng)典育種技術已成功地產(chǎn)生了大多數(shù)商業(yè)花舟品種的許多顏色.然而，這種方法因受具體種類基因庫的局限而受到限制，因此，很少使單一種類具有全色譜的有色品種。另外，傳統(tǒng)的育種技術缺乏精確性?；ǖ拿缹W吸引力是諸如形態(tài)，香味和顏色的許多因素的組合通過雜交對一種特征的修飾常常犧牲一種同樣有價值的特征。在切花和觀賞種類中以遺傳工程精確改變顏色的能力在產(chǎn)業(yè)上將提供有意義的商業(yè)機會，它具有迅速的產(chǎn)品轉向且其中新穎性是重要的市場特征.花的顏色主要是由于兩種類型的色素類黃酮和類胡蘿卜素.類黃胡提供由黃到紅到藍的顏色范圍.類胡蘿卜素提供橙色或黃色且通常是黃色或橙色花中的主要色素.對花的顏色起主要作用的類黃嗣分子是花青苷，它是花青素，花翠素，3，-甲花翠素，甲基花青素，二甲翠雀素和花葵素的糖基化衍生物，且位于液泡中.不同的花青苷可產(chǎn)生明顯不同的顏色。花的顏色也受無色類黃嗣，金屬復合物，糖基化，乙跣化和液泡pH的輔助色素形成作用的影響(Forkmann，1991).類黃嗣色素的生物合成途徑(下文稱為"類黃嗣途徑")已充分了解并在表示于圖la和lb中(Ebel和Hahlbrock^1988;Hahlbrock和Grisebach，1979;Wiering和DeVlaming，1984;Schram等，1984;Stafford,19卯jvanTimen和Mol，1990jDooiier等,199"Martin和Gerats，1993;Holton和Cornish，1995)該途徑中第一個參與的步驟涉及3個丙二酰-CoA分子與一個對香豆酰-CoA分子的縮合.該反應由查耳嗣合成酶(CHS)催化.該反應的產(chǎn)物2，，4，，4，，6，-四羥基查耳嗣正常情況下由查耳酮黃烷酮異構酶(CHI)迅速異構化產(chǎn)生4，，5，7-三羥黃烷嗣.4，，5,7-三鞋黃烷稱隨后由黃烷酮3-羥化酶(F3H)在中央環(huán)的3位羥基化產(chǎn)生二氫四羥基黃稱(DHK),DHKB環(huán)的羥基化方式在決定花瓣顏色中起著關鍵性作用.B環(huán)可在3，處或在3，及5，兩處羥基化分別產(chǎn)生二氫櫟皮黃嗣(DHQ)和二氫楊酶黃酮(DHM),在該途徑中涉及的兩個關鍵酶是類黃稱3，-輕化酶和類黃酮3，，5，-羥化酶，兩者均是細胞色素P450類.細胞色素P450酶在自然界中廣泛分布，已從脊推動物，昆蟲，酵母，真菌，細菌和植物中分離并測序了它的基因。類黃酮3，-羥化酶作用于DHK產(chǎn)生DHQ且作用于4，，5，7-三羥黃烷嗣產(chǎn)生圣草酚.DHQ的還原和糖基化產(chǎn)生花青素糖苷和甲基花青素糖苷色素，在許多植物種類(例如玫瑰，石竹和菊)中這些色素產(chǎn)生紅色和粉紅色花色。這些花青苷的合成也可產(chǎn)生其它花色。例如，蘭色矢車菊含有花色素苷.在開花植物中控制類黃嗣3，-羥化酶活性或類黃嗣途徑中涉及的其它酶的能力可提供控制花瓣顏色的方法.由此可產(chǎn)生單一栽培品種的不同顏色形式，且在有些情況下，單一種類可產(chǎn)生更寬色譜的顏色.已克隆了編碼矮牽牛屬類黃嗣3，-羥化酶的核苷酸序列(本文稱為SEQIDNO:26)(見國際專利申請?zhí)朠CT/AU93/00127[WO93/20261).然而，該序列沒有能力調節(jié)植物中3，-羥基化花青苷的合成.因此，需要鑒定其它有效調節(jié)植物中類黃稱化合物羥基化的編碼類黃胡3，-鞋化酶的進一步的基因序列.更具體地說，需要筌定有效調節(jié)植物中3，-羥化花青香合成的編碼類黃稱3，-羥化酵的進一步的基因序列.根據(jù)本發(fā)明，編碼類黃稱3，-羥化酶的基因序列已得到鑒定和克隆，本發(fā)明的重組基因序列可以通過，例如，從頭表達，過度表達，抑制，反義抑制和核酶活性來調節(jié)編碼該酶的基因的表達.控制植物中類黃嗣3，-羥化酶合成的能力可以調節(jié)每個花青苷的組成及改變類黃醇和花青苷的相對水平，從而能控制組織的顏色，如花瓣，葉，種子和果實的顏色，下文中描述的本發(fā)明涉及花的顏色的控制，但應理解為可延伸到控制其它植物組織比如葉，種子和果實，因此，本發(fā)明的一個方面提供了分離的核酸分子，包含編碼類黃锎3，-羥化酶或其衍生物的核酸序列，其中所述的類黃嗣3，-羥化酶或其衍生物比SEQIDNO:26所述的核苷酸序列編碼的類黃胡3，-羥化酵能更有效地調節(jié)植物中類黃酮化合物的羥化，本文所用的效率涉及類黃酮3，-羥化酶在植物細胞中羥化類黃酮化合物的能力，這給植物提供了類黃酮途徑中其它酶的額外底物，從而能通過，例如，糖基化，酰基化和鼠李糖基化進一步修飾該分子以合成有助于形成一系列顏色的各種花青苷。由此，3，-羥基化的花青苷可以得到調節(jié)。其效率可以方便地通過選自下列參數(shù)的一種或多種參數(shù)來估計以產(chǎn)生的mRNA的量測定的轉錄水平；4，，5，7-三鞋黃烷嗣和/或DHK的鞋基化水平；以合成的翻譯產(chǎn)物的量測定的mRNA翻譯水平；DHQ或DHM的花青苷衍生物的合成水平；對組織如，花，種子，葉或水果的顏色的影響程度。本發(fā)明的另一方面是關于分離的核酸分子，包含定位于矮牽牛屬中名為Htl或Ht2的遺傳基因座上或其它有花植物種類相同的這類基因座上的核苷酸序列，其中所說的分離的核酸分子編碼類黃酮3，-鞋化酶或其互補于編碼該酶的序列.本發(fā)明的另一方面包含一種分離的核酸分子，包含對應于矮牽牛屬中名為Htl或Ht2的遺傳基因座，或含控制3，-羥化類黃飼合成的序列的其它有關植物種類中基因座的核苷酸序列，其中所說的分離的核酸分子編碼類黃嗣3，-羥化酶或其衍生物，后者比SEQIDNO:26所迷的類黃嗣3，-羥化酶能更有效地將DHK轉化成DHQ.根據(jù)本發(fā)明的上迷方面，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:1所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:1所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。在有關實施方案中，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:3所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:3所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.在另一相關實施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:5所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:5所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.還有另一個相關的實施方案提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:7所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:7所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。還有本發(fā)明另一個實施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:9所述的或具有與其編碼區(qū)至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:9所迷序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.在另一實施方案中，提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:14所述或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:14所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子.它包含基本上如SEQIDNO:16所述或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:16所述序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.還有另一個實施方案提供了一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:18所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:18所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.而且，本發(fā)明的另一實施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:20所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低等嚴格條件下與SEQIDNO:20所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。還有另一個實施方案涉及一種核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:22所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:22所迷的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一個核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:24所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低等嚴格條件下與SEQIDNO:24所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了一種分離的核酸分子，它包含基本上如SEQIDNO:1所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低度嚴格條件下與SEQIDNO:1所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核普酸序列，其中所述的核革酸序列定位到矮牽牛屬中稱為Htl或Ht2的遣傳基因座上或在其它開花植物種類中相應的這類基因座上，且其中所述的分離的核酸分子編碼類黃胡3，-雍化酶，或與編碼該酶的序列互補.本文參考的42x:的低度嚴格條件包括和包含用于雜交的從至少大約1%到至少大約15%的甲酰胺和從至少大約1M到至少大約2M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約1M到至少大約2M的鹽.如果需要，可使用替換的嚴格條件，如中等嚴格條件，它包^和包含用于雜交的從至少大約16%到至少大約30%的甲酰胺和從至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約0.5M到至少大約0.9M的鹽，或高度嚴格條件，它包括和包含用于雜交的從至少大約31%到至少大約50%甲酰胺和從至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽，以及作為洗滌條件的至少大約0.01M到至少大約0.15M的鹽.雜交可在不同溫度下進行，如果這樣，可據(jù)此調節(jié)其它條件.本發(fā)明的另一方面提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷^列或與該編碼序列互補的核苷酸序列.在有關實施方案中，提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:4所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或與該編碼序列互補的核苷酸序列。本發(fā)明的另一相關實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:6所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列。還有另一相關的實施方案提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:8所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列.還有另一相關的實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:10或SEQIDNO:11或SEQIDNO:12或SEQIDNO:13所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列或其互補序列。在另一實施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:15所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列.還有在另一實施方案中，提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:17所迷的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列.在另一實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:19所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基^列的核苷酸序列或其互補序列.而且，本發(fā)明的另一實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:21所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核普酸序列或其互補序列.還有一個實施方案涉及一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:23所迷的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列.在另一實施方案中，本發(fā)明提供了一種核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:25所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列.在一個特別優(yōu)選的實施方案中，提供了一種分離的核酸分子，它包括編碼基本上如SEQIDNO:2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%相似性的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補序列，其中所述的核苷酸序列定位到矮牽牛屬中稱為Htl或Ht2的遣傳基因座上或其它開花植物種類中相應的這類基因座上，其中所述的分離的核酸分子編碼類黃稱3，-鞋化酶或其衍生物或是該編碼序列的互補序列.本文使用的術語"相似性"包括在核苷酸或氨基酸水平上所比較的序列間完全相同.在核苷酸水平上沒有相同性的地方，"相似性"包括產(chǎn)生在結構，功能，生物化學和/或構象水平上互相相關的不同氨基酸的序列之間的差異.在氨基酸水平上沒有相同性的地方，"相似性"包括在結構，功能，生物化學和/或構象水平上互相相關的氨基酸，SEQIDNO:1所示的核酸分子編碼來自矮牽牛屬的類黃稱3，-羥化酶.其它適合的F3，H基因的例子來自石竹(SEQIDNO:3)，金魚草屬(SEQIDNO:5)，擬南芥屬(SEQIDNO:7),擬南芥屬基因組DNA克隆(SEQIDNO:9)，玫瑰(SEQIDNO:14),菊(SEQIDNO:16)，蝴堞草屬(SEQIDNO:18)，曰本牽?；?SEQIDNO:20)，龍膽(SEQIDNO:22)和lisianthus(SEQIDNO:24).盡管本發(fā)明特別列舉了上述F3，H基因，但本發(fā)明可延伸到任何植物種類的F3，H基因，只要這些F3，H基因在核苷酸水平上具有與選自SEQIDNO:%的相似性或在氨基酸水平上具有與選自SEQIDNO:2或4我6或8或10，11,12，13或15或17或19或21或23或25的氨基酸分子至少大約50%的相似性.本發(fā)明進一步延伸到來自任何植物種類的F3，H基因，只要這些F3，H基因在核苷酸水平上具有與SEQIDNO:9的編碼區(qū)域至少大約60%的相似性.本發(fā)明的核酸分子一般是在非天然存在狀態(tài)下的基因序列.一般來說，這意味著從其天然狀態(tài)分離出來或人工合成或在非天然存在環(huán)境中產(chǎn)生.更具體地，它包括體外形成或維持的核酸分子，包括基因組DNA片段，重組或合成的分子和與異源性核酸連接的核酸.它也延伸到編碼F3，H的基因組DNA或cDNA或其部分，或者相對于其自身的或其它啟動子方向相反的部分。它進一步延伸到相對于其它核酸序列至少部分純化的天然存在的序列。術語"核酸分子"包括核酸分離物和基因序列，在本文中以其最普遍的含義使用，它包括F3，H中的氨基'酸序列直接地或經(jīng)堿基的互補系列限定的任何核苷酸堿基的接近系列，該氨基酸序列可組成全長的F3，H或其有活性的截短形式或可相應于該酶的特定區(qū)域，如N-端，C-端或中間部分。本文涉及的核酸分子也包含作為基因探針或作為能調節(jié)植物中相應基因表達的"反義"分子的寡核苷酸。本文使用的"反義分子"也可包括含有相對于其自身的或另一啟動子反向的結構基因組或cDNA基因或其部分的基因構建體.因此，本發(fā)明的核酸分子可適用于作為共同抑制分子，核酶分子，有義分子和反義分子以調節(jié)3，-羥基化花青苷的水平。在另一實施方案中，編碼F3，H的核酸分子或其各種衍生物用于減小內源性F3，H的活性，選擇性地，編碼該酶的核酸分子或其各種衍生物以反義方向使用以減小F3，H的活性.盡管不希望以任一理論限制本發(fā)明，但將該核酸分子導入細胞中通過降低同源內源性基因的轉錄或通過增加相應mRNA的轉換來產(chǎn)生這一結果是可能的.使用含有有義或反義方向的F3，H核酸分子或其各種衍生物的基因構建體可實現(xiàn)這一點，在更進一步的改進方案中，可使用核酶滅活把核酸分子.選擇性地，核酸分子編碼一種功能性F3，H且它用于升高植物中該酶的水平.本文提及的類黃嗣F3，H活性的改變涉及將活性升高或降低到正常內源性或現(xiàn)存活性水平之上或之下達30%,或更優(yōu)選30-50%，或甚至更優(yōu)逸50_75%或更優(yōu)選75%或更大.使用Stotz和Forkmann(1982)所述方法的改進方式(見實施例7)或通過按實施例5所述測定F3，H產(chǎn)物，比如櫟皮黃稱，花青素或甲基花青素的量可較容易地測定活性水平.本發(fā)明進一步延伸到以寡核苷酸引物或探針形式存在的核酸分子，該引物或探針在高度，優(yōu)選在中等，且最優(yōu)逸在低等嚴格條件下能與上述核酸分子，特別是選自SEQIDNO:1，3，5，7，9,14，16，18，20，22或24中所述的核酸分子的一部分雜交.優(yōu)選地該部分對應于F3，H基因的5，或3，端。為了方便，本文所說的5，端定義為基本上在初級轉錄子5，端至該基因中央部分之間的區(qū)域，本文所說的3，端定義為基本上在該基因中央部分至初級轉錄子3，端之間的區(qū)域.因此，很明顯寡核苷酸或探針可與5，端或3，端或與5，和3，端共有的區(qū)域雜交.核酸分子或其互補形式可編碼全長酶或其部分或其衍生物，"衍生物"指相對于天然存在的酶有任意單一或多處氨基酸取代，缺失和增加，且包括部分，片段，分部，融合分子，同源物和類似物.關于這點，核酸包括天然存在的編碼F3，H的核苷酸序列或可包含對所述天然存在的序列的單一或多個核苷酸取代，缺失和/或增加.融合分子可以是編碼2個或多個F3，H的核苷酸序列之間的融合，或編碼F3，H的核酸序列與編碼任何其它蛋白質類分子的核苷酸序列之間的融合.融合分子在改變底物特異性中有用.本發(fā)明的核酸分子或其互補形式或F3，H的衍生物也可包括不管其是否具有活性的"部分"有活性的或有功能的核酸分子是編碼具有F3，H活性的酶的分子.有活性的或有功能的分子進一步包括具有部分活性的分子，例如，底物特異性降低的F3，H應認為具有部分活性.核酸分子的衍生物可作為寡核苷酸探針，作為用于聚合酶鏈式反應或各種突變技術的引物，用于產(chǎn)生反義分子或核酶構建體，它們也可用于形成共同抑制構建體.根據(jù)本發(fā)明這一方面的核酸分子可編碼或不編碼具有功能的F3，H。"部分"可來自該核酸分子的5，端或3，端與5，及3，.端共有的區(qū)域.本發(fā)明的F3，H的氨基酸插入衍生物包括氨基和/或羥基末端融合物以及單個或多個氨基酸的序列內插入.插入氨基酸序列的變異體是那些其中將一個或多個氨基酸殘基導入了蛋白質的預定位點的變異體，盡管也可能進行隨機插入并適當篩選所得的產(chǎn)物.缺失變異體的特征在于從序列中去掉了一個或多個氨基酸。置換氨基酸變異體是那些其中序列中的至少一個殘基被去掉并在其位置插入不同的殘基的變異體.典型的置換是根據(jù)下面表1進行的取代.表l<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>在F3，H通過氨基酸置換改變時，氨基酸一般被具有相似特性，如疏水性，親水性，電負性，側鏈大小等的其它氨基酸置換.典型的氨基酸置換是單一殘基.氨基酸插入通常是大約1-10個氨基酸殘基的級別，缺失變化范圍為1-20個殘基.優(yōu)逸地，缺失或插入在相鄰的堿基對中進行，即，缺失2個殘基或插入2個殘基。使用本領域熟知的肽合成技術，如固相肽合成(Merrifield，1964)等，或經(jīng)重組DNA操作可較容易地制備上面提及的氨基酸變異體。在含已知或部分已知序列的DNA的預定位點進行置換突變的技術是熟知的，包括，例如，M13突變.用以產(chǎn)生表現(xiàn)為置換，插入或缺失變異體的變異蛋白質的DNA序列搡作一般在，例如，Sambrook等(1989)中進行了描述.本發(fā)明的F3，H的重組或合成突變體或衍生物的其它例子包括單個或多個置換，缺失和/或增加與酶相連的任意分子，如糖類、脂類和/或蛋白質或多肽。術語"類似物"和"衍生物"也延伸到F3，H的任意的不管其是否有功能的化學等效物，還可延伸到上述任意氨基酸衍生物.如果本發(fā)明這個方面的"類似物"和"衍生物"是非功能性的，它們可作為F3，H活性的興奮劑或拮抗劑。為了方便，本文提到的"F3，H"包括提及的任何衍生物，包括其部分，突變體，片段，同源物或類似物，本發(fā)明用來自矮牽牛屬，石竹，玫瑰，金魚草屬，擬南芥屬，菊，lisianthus，蝴蝶草屬，牽?；ê妄埬懙暮怂嵝蛄袨槔?，因為它們代表了至今最常見和優(yōu)選的材料來源，然而，本領域的技術人員將馬上意識到相似的序列可以從任何來源，如從其它植物或某些徵生物中分離.其它植物的例子包括，但不限于玉米，煙草，矢車菊，天竺葵屬，蘋果，扶郎花屬和非洲紫羅蘭。本發(fā)明包括所有這些直接或間接編碼類黃嗣途徑的酶且特別是F3，H的核酸序列，而不考慮它們的來源.本文期望的核酸分子能以單獨的方式存在，也可與栽體分子，如表達載體結合.術語載體分子以其最廣的含義使用，包括用于核酸分子的載體.例如，中間載體可適合在電穿孔，微粒轟擊，土i桿菌介導的^化中使用或由DNA或RNA病毒插入。本文包含的中間栽體和/或核酸分子可以或不必穩(wěn)定整合入植物基因組.這樣的載體分子也可在原核細胞中復制和/或表達.優(yōu)選地，栽體分子或其部分能整合到植物基因組中。核酸分子可另外含有能指導核酸分子在植物細胞中表達的啟動子序列。核酸分子和啟動子也可通過如上所迷的任何方式導入細胞中.根據(jù)本發(fā)明，編碼F3，H或其衍生物或其部分的核酸分子可以任一方向導入植物來允許，許可或促進細胞質內iuRNA的生產(chǎn)水平和/或由mRNA合成酶的水平，從而提供將DHK和/或其它合適的底物(如果在植物細胞中合成)最終轉變成花色素的花青苷衍生物，如花青素和/或甲基花青素，或選擇性地通過降低或消除內源性或現(xiàn)存的F3，H活性來抑制該代謝物這種轉變.細胞質中mRNA的合成和/或由mRNA合成酶在本文中稱為"表達"，花青素的合成有助于產(chǎn)生紅或蘭色的花色.在植物中以任一方向表達核酸分子可以是組成型的，誘導型的或發(fā)育型的，也可以是組織特異性的.根據(jù)本發(fā)明的這一方面，提供了產(chǎn)生能合成F3，H或其功能性衍生物的轉基因植物的的方法，所述的方法包括在允許所述的核酸分子最終表達的條件下用含有編碼所述的F3，H的核酸序列的核酸分子穩(wěn)定轉化合適植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物并在足以允許核酸分子表達的條件下讓所述的轉基因植物生長一段時間.由此轉基因植物可以產(chǎn)生相對于可比較的非轉基因植物中表達的量更高水平的F3，H活性。本發(fā)明的另一方面涉及一種用于產(chǎn)生減少內源性或現(xiàn)存F3，H活性的轉基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼F3，H的核苷酸序列或其互補序列的核酸分子穩(wěn)定轉化合適植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物，且如果需要，則在足以允許該核酸分子表達的條件下讓所述的轉基因植物生長.本發(fā)明的另一方面涉及產(chǎn)生內源性或現(xiàn)存F3，H活性減小的遣傳修飾的植物的方法，上述的方法包含通過用導入植物細胞的適當改變的F3，H基因或其衍生物或部分經(jīng)同源重組修飾內源性序列來改變F3，H基因并從該細胞再生遺傳修飾的植物.根據(jù)本發(fā)明的這些方面，優(yōu)選的核酸分子基本上如SEQIDNO:1,3，5，7，14,16,18，20,22，24所述，或是9的編碼區(qū)域，或具有與它們至少大約60%的相似性，或能在低度嚴格條件下與它們雜交。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明包含產(chǎn)生表現(xiàn)出改變的花色的轉基因開花植物的方法，上述的方法包含用本發(fā)明的核酸分子穩(wěn)定轉化合適的植物細胞，從這些細胞再生轉基因植物并在足以允許該核酸分子表達成F3，H酶的條件下讓上述的轉基因植物生長一段時間.選擇性地，上述的方法可包括用本發(fā)明的核酸分子或其互補序列穩(wěn)定轉化合適的植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物并在足以改變內源性或現(xiàn)存F3，H活性水平的條件下讓上述的轉基因植物生長一段時間.優(yōu)選地，改變了的水平應低于可比較的非轉基因植物中內源性或現(xiàn)存的F3，H活性水平。在相關實施方案中，本發(fā)明包含產(chǎn)生表現(xiàn)了改變的花色的開花植物的方法，所述的方法包含通過用導入植物細胞的適當改變的F3，H基因或其衍生物經(jīng)同源重組修飾內源性序列來改變F3，H基因并從該細胞再生遺傳修飾的植物。本發(fā)明的核酸分子可以是或不是發(fā)育調控的.優(yōu)選地，3，-羥基化的花青苷水平的調節(jié)導致花色改變，包括根據(jù)受體植物的生理條件產(chǎn)生紅色花或其它顏色差別."受體植物"是指能合成F3，H酶的底物或合成F3，H酶本身，且具有所需顏色發(fā)育必需的適當生理特性和基因型的植物.它可包括但不限于矮牽牛屬，石竹，菊，玫瑰，金魚草屬，煙草，矢車菊，天竺葵屬，lisianthus,扶郎花屬，蘋果，秀尾，百合花，非洲紫羅蘭，龍膽，蝴蝶草屬和日本牽?；?因此，本發(fā)明推延到產(chǎn)生能調節(jié)3，-羥基化的花青苷水平的轉基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼F3，H或其衍生物的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列的核酸分子穩(wěn)定轉化合適植物的細胞或細胞團，從所述的細胞或細胞團再生轉基因植物.本領域的技術人員會馬上知道可應用于本發(fā)明的方法的各種變化，如增加或減小靶植物中天然存在的酶活性水平使得顏色的差異不同.因此，本發(fā)明延伸到含有全部或部分本發(fā)明的核酸元件和/或其任何同源或相關形式或它們中任何一個的反義形式的所有轉基因植物，特別是那些表現(xiàn)出花色改變的轉基因植物。該轉基因植物可含有導入的核酸分子，該核酸分子含有編碼F3，H的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列.一般來說，該核酸可穩(wěn)定地導入植物基因組，盡管本發(fā)明還延伸到將F3，H核苷酸序列導入能在植物細胞內復制的自主復制核酸序列，如DNA或RNA病毒.本發(fā)明還延伸到從該轉基因植物獲得的種子.這類種子，特別是如果有色，則可用作植物的特有標記.本發(fā)明的另一方面涉及F3，H的重組形式.該酶的重組形式提供了用于研究的材料來源來發(fā)展活性更大的酶，且可用于建立產(chǎn)生有色化合物的體外系統(tǒng)，本發(fā)明還有一個方面涉及本文所述的基因序列在制造用于調節(jié)植物或植物細胞中的3，-羥基化花青苷水平的基因構建體中的用途，本發(fā)明的另一方面提供了表現(xiàn)出花色改變的來自本文所述的轉基因植物的花，特別是切花。本發(fā)明的另一方面涉及含有編碼F3，H或其衍生物的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列的核酸分子，其中所述的核酸分子能在植物細胞中表達。術語"表達(expressed)"相當于上文定義的術語"表達(expression)"。根據(jù)本發(fā)明的這一和其它方面的核酸分子，相對于國際專利申請?zhí)朠CT/AU93/0012WO93/20206公開的質粒PCGP809中包含的PCGP619cDNA插入片段的效率而言允許，許可或促進更高效率地調節(jié)3，-鞋基化花青苷.術語"植物細胞"包括單個的植物細胞或植物細胞團，如愈傷組織中，小植抹或植抹或其部分，包括花和種子.本發(fā)明的另一方面提供了包括編碼F3，H的核苷酸序列或該編碼序列的互補序列的核酸分子，其中所述的核酸分子的翻譯產(chǎn)物含有氨基酸序列RPPNSGA.優(yōu)選地，所述的核酸分子的翻譯含有氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDL，且更優(yōu)選地，所述的核酸分子的翻譯產(chǎn)物包含氨基酸序列RPPNSGAXHXAYNYXDLXlnGGEK,其中X代表任意氨基酸，Xln代表0至500位氨基酸的氨基酸序列.本發(fā)明進一步由以下提及的非限制性的附圖和實施例進行描述.在附圖中圖la和lb是P.hybrida花中類黃稱生物合成途徑的示意固，顯示了轉化中涉及的酶和遣傳基因座。該途徑中涉及的酶表示如下PAL=笨丙氨酸氨基裂解酶；C4H=肉桂酸鹽-4-幾化酶；4CL=4-香豆酸CoA連接酶；CHS-查耳嗣合成酶；CHI=查耳酮異構酶；F3H=黃烷嗣-3-羥化酶；F3，H=類黃胡3，-雍化酶；F3，S，H=類黃嗣3，5，羥化酶；FLS=黃烷醇合成酶；DFR=二氫黃烷醇-4-還原酶；ANS=花青苷合成酶；3GT=UDP-葡萄糖:花青苷-3-葡萄糖苷；3RT=UDP-鼠李糖花青苷-3-葡萄糖苷鼠李糖苷轉移酶；ACT=花青苷-3-蕓香糖苷酰基轉移酶；5GT=UDP_葡萄糖花青苷5-葡萄糖苷轉移酶；3，OMT-花青苷0-甲基轉移酶；3'，5，OMT-花青苦3，，5，-O-甲基轉移酶.在該途徑中的3種類黃稱表示為P-3-G=花葵素-3-葡萄糖苷；DHM-二氫楊酶黃稱；DHQ-二氫櫟皮黃酮.在P.hybrida中僅以較低水平合成類黃醇，楊酶黃嗣且極少合成花青苷，花葵素.圖2是質粒pCGP161的示意圖，該質粒含有編碼來自P.hybrida的肉桂酸-4-羥化酶的cDNA克隆(Fl).0.7kbE^fiEI^MI片段的32P標記的片段用于探測美國國旗紅花瓣的cDNA文庫.詳情見實施例4.縮寫如下Amp=氨千青霉素抗性基因；ori。復制起點；T3=T3RNA聚合酶的識別序列；T7=T7RNA聚合酶的識別序列，也標記了限制性酶位點.圖3是質粒pCGP602的示意圖，pCGP602含有編碼來自P./y^/7'^的類黃嗣3，5，羥化酶(HCL)的cDNA克隆(617)。含Hfl編碼區(qū)的1.6kbBspHI/EseI片段的32P標記的片段用于探測國旗紅花瓣的cDNA文庫.詳情見實施例4?？s寫如下Amp-氨千青霉素抗性基因；ori-復制起點；T3=T3RNA聚合酶的識別序列；T7=T7RNA聚合酶的識別序列.還標記了限制性酶位點.圖4是質粒pCGP175的示意圖，pCGP175含有編碼來自P.hybrida的類黃胡3，5，羥化酶(皿)的cDNA克隆(H2)。一起含有1￡12_編碼區(qū)的1.3kbEcoRI/XboI和0.5kbXMI片段的標記的片段用于探測美國國旗紅花瓣cDNA文庫.詳情見實施例4.縮寫如下Amp=氨芐青霉素抗性基因；ori=復制起點；T3*T3RNA聚合酶的識別序列；T7=T7RNA聚合酶的識別序列.還標記了限制性酶位點.圖5是質粒pCGP619的示意圖，pCGP619含有編碼來自P.Aj;6〃Wfl的細胞色素P450的651cDNA克隆.1.8kbEcoRI/XhoI片段的32P標記的片段用于探測美國國旗紅花瓣的cDNA文庫.詳情見實施例4.'縮寫如下Amp-氨千青霉素抗性基因；ori=復制起點；T3=T3RNA聚合酶的識別序列；T7=T7RNA聚合酶的識別序列.還標記了限制性酶位點.圖6表示用pCGP1805中包含的OGR-38cDNA克隆的32P標記的片段探測的RNA印跡的放射自顯影照片(見實施例6).各泳道含有20pg從V23(htl/htl)xvr(Htl/htl)回交群體植物的花或葉分離的總RNA樣品.在含高水平櫟皮黃翁(Q+)的VR類(Htl/htl)花中檢測到1.8kb的轉錄物(泳道9_14).在含少量或不含櫟皮黃胡(Q-)的V23類(htl/ML)花中檢測到水平低得多的相同大小的轉錄物(泳道3-8).在VR葉(泳道1)和V23花瓣(泳道2)中也檢測到了減少的轉錄物水平.這在實施例5中描述.圖7是酵母表達質粒pCGP1646的示意圖(見實施例7).來自pCGP1805的OGR-38cDNA插入片段以"有義"的方向克隆到表達栽體pYE22m中的酵母甘油醛-3-磷酸脫氯酶啟動子(PGAP)后.TRPl。Trpl基因，IR1=2pni質粒的反應重復，TGAP-來自酵母甘油醛-3-磷酸脫氫的基因的終止子序列.還標記了限制性酶位點。圖8是雙元質粒pCGP1867的示意圖(實施例8中所述).pCGP1805的HilcDNA插入片段(OGR-38)以"有義"的方向克隆到表達載體pCGP293的Mac啟動子后.縮寫如下LB左側邊界；RB-右側邊界；Gm-慶大霉素抗性基因；35S-來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區(qū)；nptII-新霉素磷酸轉移酶II基因；tml3，=來自土壤桿菌屬ML基因的終止子區(qū)；mas3，=來自土壤桿菌屬的甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)域'oripRi=來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；oriColEl-來自ColcininEl質粒的高拷貝復制起點.還標記了限制性酶位點。圖9是雙元質粒pCGP1810的示意圖，它的構建在實施例13中描迷.來自pCGP1807的KC-1cDNA插入片段(見實施例12)以"有義"的取向克隆到表達栽體pCGP293的Mac啟動子后，縮寫如下LB=左側邊界；RB=右側邊界；Gm-慶大霉素抗性基因；35S-來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區(qū)；nptll-新霉素磷酸轉移酶II基因；tml3，=來自土壤桿菌屬lmL基因的終止子區(qū)域；mas3，-來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)域；oripRi=來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；oriColEl=來自ColcininEl質粒的高拷貝復制起點。還標記了限制性酶位點.圖10是雙元質粒pCGP1813的示意圖，其構建在實施例14中描述.來自pCGP1807的KC-lcDNA插入片段(見實施例12)以"有義"方向克隆到mac啟動子和mas終止子之間.Mac:KC-1:mas表達元件隨后克隆到雙元載體pWTT2132中.縮寫如下Tet-四環(huán)素抗性基因；LB左側邊界；RB=右側邊界，siirB=來自乙酰乳酸合成酶基因的編碼區(qū)和終止子序列；35S。來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區(qū)，mas3，=來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)；PVS1=來自綠膿假單胞菌質粒的廣譜宿主范閨的復制起點，pACYCori=來自大腸桿菌pACYC184的修飾的復制子.還標記了限制性酶位點.圖ll表示用Am3Ga差異顯示PCR片段的"P標記的片段探測的Southern印跡的放射自顯影照片(如實施例16所述).各泳道含10jig從N8(Em+)，K16(fiM')或K16xN8F2群體的植物中分離的EceRY消化的基因組DNA樣品。在來自產(chǎn)花青素的植物(表示為"+")的基因組DNA中檢測到雜交帶(泳道l，3,4,5,6,7,9，10，12和15)。在來自不生產(chǎn)花青素的植物(用"-"表示)的基因組DNA樣品中沒有觀察到特異性雜交(泳道2，8，11，13和14).圖12表示用Am3Ga差異顯示PCR片段的"P標記的片段探測的RNA印跡的放射自顯影照片.各泳道含10ng從N8(le^+)xK16(醒-)F2群體植物的花或葉分離的總RNA樣品.在產(chǎn)生化青素的K16xN8F2花(花青素+)(植物#1，#3，#4，#5和#8)中檢測到1.8Kb的轉錄物.在不產(chǎn)生花青素的K16xN8F2花(花青素-)(植物#6，#11，#12)中或在花中產(chǎn)生花青素的K16xN8F2植物的葉樣品(#13L)中沒有檢測到轉錄物。詳情在實施例17中提供.圖13是雙元質粒pCGP250的示意圖，其構建在實施例20中描述.含來自pCGP246的1至1711位核苷酸(SEQIDNO:5)的sdF3，HcDNA插入片段(見實施例18)以"有義"方向克隆到表達栽體pCGP293的Mac啟動子后.縮寫如下LB-左側邊界；RB=右側邊界；Gm-慶大霉素抗性基因；35S=來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區(qū)；nptII-新霉素磷酸轉移蘇II基因；tml3，=來自土壤桿菌屬lml基因的終止子區(qū)；mas3，-來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)；oripRi=來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；oriColEl=來自ColcininEl質粒的高拷貝的復制起.還標記了限制性酶位點。圖14是雙元質粒pCGP231的示意圖，其構建在實施例20中描迷.含來自pCGP246的104至1711位核苷酸(SEQIDNO:5)的sdF3，HcDNA插入片段以"有義"方向克隆到表達栽體pCGP293的Mac啟動子后?？s寫如下LB=左側邊界；RB=右側邊界；Gm=慶大霉素抗性基因；35S=來自花椰菜葉病毒35S基因的啟動子區(qū)；nptH-新霉素磷酸轉移酶II基因；tmi3，=來自土壤桿菌屬imL基因的終止子區(qū)；mas3，=來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)域；oripRi=來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范閨的復制起點；oriColEl=來自colcininEl質粒的高拷貝復制起點.還標記了限制性酶位點.圖15是雙元質粒pBI-Tt7-2的示意固.將來自E-5的6.5kbJtoEi/SailHL基因組片段克隆到E￡fiEl/Sall切割的pBIlOl中，代替原有的GUS基因。所示的U2_(F3，H)基因的方向(5，至3，)通過DNA測序確定.縮寫如下LB-左側邊界；RB-右側邊界；nos5，-來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的啟動子區(qū)；nptII=新霉素磷酸轉移酶II基因的編碼區(qū)；nos3，=來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的終止子區(qū)域；nptl-新霉素磷酸轉移酶I基因的編碼區(qū).還標記了限制性酶位圖16是雙元質粒pCGP2166的示意圖，其構建在實施例26中描述.來自pCGP2158的玫瑰弁34cDNA插入片段(見實施例25)以"有義"方向克隆到pCGP293表達栽體的Mac啟動子后.縮寫如下LB=左側邊界；RB-右側邊界；Gm-慶大霉素抗性基因；35S-來自花椰菜花葉病毒35S基因的啟動子區(qū)；nptll-新霉素磷酸轉移酶II基因；tml3，=來自土壤桿菌屬ML基因的終止子區(qū)域；mas3，-來自土壤桿菌屬甘露堿合成酶基因的終止子區(qū)；oripBi-來自毛根土壤桿菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點；oriColEl=來自CoIcininEl質粒的高拷貝復制起點.還標記了限制性酶位點.圖17是雙元質粒pCGP2169的示意圖，其構建在實施例27中描述。來自pCGP2158的玫瑰并34cDNA插入片段以"有義"方向克隆到CaMV35S啟動子和ocs終止子之間.隨后將35S:玫瑰#34:ocs表達元件克隆到雙元栽體pWTT2132中.縮寫如下Tet=四環(huán)素抗性基因；LB=左側邊界；RB=右側邊界；surB-來自乙酰乳酸合成酶基因的主體區(qū)域和終止子區(qū)域；35S-來自花椰茱花葉病毒35S基因的啟動子區(qū)域，OSS-來自土壤桿菌屬章魚堿合成酶基因的終止子區(qū)域；pVSl=來自綠膿假單胞菌質粒的廣譜宿主范圍的復制起點，pACYCori=來自大腸桿菌的pACYC184的修飾的復制子.還標記了限制性酶位點。圖18是雙元質粒pLN85的示意圖，其構建在實施例28中描述。來自pCHRMl的菊RM6icDNA插入片段以"反義"方向克隆到花椰菜花葉病毒35S基因啟動子(35S)之后。其它縮寫如下LB=左側邊界；RB=右側邊界；ocs3"來自土壤桿菌屬章魚堿合成酶基因的終止子區(qū)域；pnos:nptn:nos3，=含來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的啟動子區(qū)表達元件；新霉素磷酸轉移酶II基因的編碼區(qū)和來自土壤桿菌屬胭脂堿合成酶基因的終止子區(qū)；oriT-復制轉移起點；trfAA-順式作用復制功能；oriColEl=來自ColcininEl質粒的高拷貝復制起點；Tn7SpR/StR=來自轉座子Tn7的壯觀霉素和鏈霉素抗性基因；oriVRK2=質粒RK2的廣譜宿主范圍的復制起點.還標記了限制性酶位點.圖19是酵母表達質粒pYTHT6的示意圖，其構建在實施例30中描述.來自pTHT6的THT6cDNA插入片段以"有義"方向克隆到表達栽體pYE22m的酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子(PGAP)后.縮寫如下TRP1=Trpl基因；IR1-2nm質粒的反向重復；TGAP-來自酵母甘油醛-3-磷酸脫氳酵基因的終止子序列.還標記了限制性酶位點。本說明書中使用的氨基酸縮寫在下面表2中顯示.表2<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表3提供了本文提及的序列指定的SEQIDNO的總結:表3<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>相應的氨基酸序列石竹SE(JIDNO:4pCGP246的cDNA插入片段金魚草屬SEQIDNO:5相應的氨基酸序列金魚莩屬SEQIDNO:6cDNA部分序列擬南齊屬SE(JIDNO:7相應的氨基M列擬南齊屬SEQIDNO:8基因組序列擬南芥屬SEQIDNO:9外顯子I的相應的氨基酸序列擬南芥屬SEQD)NO:IO外顯子II的相應氨基酸序列擬南芥屬SEQH)NO:ll外顯子ni的相應氨基酸序列擬南芥屬SE(JIDNO:12外顯子IV的相應氨基酸序列擬南芥屬SEQIDNO:13pCGP2158的cDNA插入片段玫瑰SEQIDNO:14相應的氨基酸序列玫瑰SEQIDNO:15pCHRMl的cDNA插入片段菊SEQIDNO:16相應的氨基酸序列菊SEQIDNO:17THTcDNA序列蝴蝶草屬SEQIDNO:18相應的氨基酸序列蝴蝶草屬SE(JIDNO:19MHT85cDNA序列曰本牽?；⊿E(JIDNO:20相應的氨基酸序列曰本牽?；⊿EQIDNO:21GHT13cDNA序列龍膽SEQIDNO:22相應的氨基酸序列龍膽SE(JIDNO:23pL3-6的cDNA插入片段LiskuithusSEQIDNO:24相應的氨基酸序列LisianthusSEQIDNO:25出自WO93/20206的cDNA序列矮牽牛屬SEQIDNO:26寡核普酸polyT-anchASEQIDNO:27寡核普酸polyT-anchCSEQIDNO:28寡核脊酸ployT-anchGSEQIDNO:29保守的氨基酸引物區(qū)SEQIDNO:30相應的寡核苷酸序列SEQIDNO:31保守的氨基酸引物區(qū)SEQIDNO:32相應的寡核苷酸序列SEQIDNO:33寡核芬酸引物PetHaem-NewSEQLDNO:34保守的氨基酸引物區(qū)SEQD)NO:35相應的寡核苷酸序列SEQIDNO:36寡核苦酸SnapredRaceASEQIDNO:37寡核芬酸SnapredRaceCSEQIDNO:38寡核苷酸poly-CRaceSEQIDNO:39寡核苷酸引物PetHaemSEQEDNO:40分別含質粒pCGP1867,pCGP1810和pCGP231的無毒的微生物根癌土壤桿菌菌抹AfiLl于1996年2月23日保存于澳大利亞政府分析實驗室，1suakinStreet,Pymble，NewSouthWales,2037,澳大利亞，且指定的保藏號分別為96/10967,96/10968和96/10969.分離類黃嗣3，-羥化酶和相關的核酸序列實施例1植物材料所用的i^似加'a/ij^/7'rffl品種在表4中提供.表4<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>植物在光強度10,000lux，白晝長度14小時，溫度22t)至26X:的特定生長室中生長，石竹屬麝香石竹變種ii^r"7iflOrfl/ie/的花從VanWyk和SonFlowerSupply,Victoria獲得，麝香石竹花在如下限定的發(fā)育階段收獲階段l:封閉的花蕾，花瓣不可見.階段2:花蕾張開花辦尖端可見.階段3:幾乎全部花瓣尖端暴露."畫筆階段".階段4:外側花瓣與莖成45€角。階段5:花完全張開.金魚草屬使用的金魚草抹系來自親本抹系K16(鵬-)和N8(￡fls+)F3，H活性與￡01_基因之間有嚴格相關性，已知￡21_基因控制黃烷嗣，黃烷醇和花青苷的3，羥基化(Forkmann和Stotz，1981).K16是缺乏F3，H活性的純合隱性突變體，而N8是F3，H活性的野生型.這些品系相似，但不同源，親本抹系和來自自交(K16xN8)Fl植物的種子從Dr.C.Martin(JohnInnesCentre,Norwich,UK)處獲得.擬南芥屬擬南芥抹系Columbia(,Landsbergeracta(和NW88(比ZJ從諾丁漢擬南芥貯存中心(NottinghamArabidopsisStockCentre諫得。野生型擬南芥(m)種子具有特征性的棕色.It!突變體的種子具有淡棕色的種子，其植株的特征在于葉中花青苷含量減小(Koornneef等，1982),BL植物合成花青素，而til突變體中積累花葵素，表明m基因控制類黃嗣3，-羥基化。玫瑰Aj^〃V/fl變種Kardinal的花從VanWyk和SonFlowerSupply,Victoria獲得。/^6r《'rffl花發(fā)育階段限定如下階段l:未沉積色素，緊密關閉的花蕾(10-12mm高；5mm寬).階段2:沉積有色素，緊密關閉的花蕾(15mm高；9mm寬)。階段3:沉積有色素，關閉的花蕾；萼片剛開始打開(20-25mm高；13-15mm寬)階段4:花蕾開始張開；花瓣著色較重；萼片分離(花蓊25-30mm高且18mm寬).階段5:萼片完全展開；其中一些巻曲?；ㄞk著色較重且展開(花蕾30-33mm高且20mm寬)，菊菊花發(fā)育階段限定如下階段0:未見花蕾.階段l:花蕾可見小花完全被苞片覆蓋.階段2:花蕾張開小花頂端可見.階段3:小花緊緊地重疊'階段4:幾乎所有小花頂端暴露；外側小花開放但不水平.階段5:外側小花水平。階段6:花達到成熟.實施例2細菌菌抹使用的大腸桿菌菌抹是DH5asupE44,A(lacZYA-ArgF)U169,e801acZAM15,h5dR17mk+),tscAlendAl,gyiA96,ihH,re!Al,dSflR(Hanah叫1^83和BRL，1986).XU-BlueMRF'A(mciA)183,A(mctCB-hsdSMR-腿)173,endAl,卿E44'卦l,lfiCAl,g^A96，re!AI.kcfFpioAB,kcIqZiM15,Tn〗0(Ieir)Jc(Stratagene)XL1-Blue卿E44，]lsdR17(rk-,叫+)，ISCAI,endAI,^yrA96，ifiiAI,lac[f.ptqAB,laciq,lacZAM15'Tal0(iei1)SOLRel4'(mcrA),A(證CB掘SMR-inn)171，siicC,recB，iecJ，UinilC::Tn5tar),UYlC,lac，gyr八96，lhi-l，ielAl,[F'piQAB,lacNZAM15，Sir非抑制性的(Stratagene)DH10B(Zip)F-mcrA,A(膨hsd廳-mcrBC),a80dlacZAM15,厶iacX74,dfifiR,recAl,araD139,A(ara,leu)7697,galU,galKJ入，即L'mpGY腦r-AlacU169,(Alonl，araD139,sirA,supF,皿A,Hp￡22::TnlO(Tetr)[pMC9Ampr,Tet1],mcrB,hsdR喪失毒性的根癌土壤桿菌菌抹AGLO(Lazo等，1991)從R.Ludwig處(加利福利亞大學，生物學系，SantaCruz，USA)獲得.克隆載體pBluescript從Stratagene公司獲得.根據(jù)Inoue等(1990)所述的方法進行大腸桿菌菌抹DHSa細胞的轉化.實施例3—般方法DNA探針的32標記使用寡聚核苷酸標記試劑盒(Bresatec)用SOpcia-32P-dCTP放射性標記DNA片段(50-lOOng).未摻入的a-32p-dCTP通過用SephadexG-50(Fine)柱層析去除.DNA序列分析使用來自應用生物系統(tǒng)的PRISMReady反應染色引物循環(huán)測序試劑盒進行DNA測序.按照廠商提供的方法進行.使用PerkinElmerPCR儀(GeneAmpPCRSystem9600)進行循環(huán)測序反應并在自動373ADNA測序儀(應用生物系統(tǒng))上走肢.使用FASTA和TFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)或BLAST程序(Altschul等，19卯)進行與Genban、SWISS-PROT和EMBL數(shù)據(jù)庫的同源性研究.使用LFASTA程序(Pearson和Lipman，1988)獲得序列的相似百分數(shù)，除非另有說明，在所有情況下核苷酸序列比較使用的缺口值(ktup)為6,氨基酸序列比較使用的缺口值(ktup)為2。使用在MacVectorTM6.0(OxfordMolecularLtd.)中應用的ClustalW程序進行多個序列排列(缺口值為2).實施例4從P.Zij6/7Wfl變種國旗紅中分離對應于mL基因座的類黃胡3，-羥化酶(F3，H)的cDNA克隆為了分離連鎖到迅JL基因座且編碼矮牽牛屬類黃飼途徑中的類黃酮3，-鞋化酶(F3，H)的cDNA克隆，從階段1至3的矮牽牛屬國旗紅(OGR)花中分離RNA并制備花瓣的cDNA文庫。OGR花含以花青素為基礎的色素且有高水平的類黃嗣3，-羥化酶活性.用從已知在類黃嗣途徑中包含的3種細胞色素P450cDNA克隆和在酵母中具有類黃嗣3，-羥化酶活性的一種細胞色素P450cDNA克隆(651)分離的"P標記片段的混合物錄選OGRcDNA文庫，這些包括一個編碼肉桂酸-4-羥化酶(C4H)的矮牽牛屬cDNA克隆和2個編碼類黃^3，，5，-羥化酶(F3，5，H)(Holton等，1993)的矮牽牛屬cDNA克隆(由Hfl和H^基因座編碼).矮牽牛屬變種OGRcDNA文庫的構建使用Turpen和Griffith(1986)的方法從尸.~Z/7^變種OGR階段l至3的花的花瓣組織分離總RNA.使用oligotex-dTTM(Qiagen)從總RNA篩選Poly(A)+RNA。用5叫從OGR的1至3階段分離的poly(A)+RNA作模板，使用ZAP-cDNAGigapackIHGold克隆試劑盒(stratagene)在人ZAP中構建定向花瓣cDNA文庫.獲得的重組子總數(shù)為2.46xio6.轉染XL1-B，ueMRF，細胞后，包裝的cDNA混合物以每15cm直徑平板50，000pfu涂板。平板在37X:培養(yǎng)8小時，噬菌體在lOOmMNaCl，8mMMgS04，50mMTris-HClpH8.0,0.01%(W/V)明膠l噬菌體絵存緩沖液(PSB)I中洗脫(Sambrook等，1989).加入氯仿，并在4TC貯存作為擴增文庫的噬菌體.轉染XL1-BlueMRF，細胞后，lOO，OOOpfu的擴增文庫以每15cm平板lO，OOOpfu的密度在NZY平板上鋪板(Sambrook等，1989),并在37t:培養(yǎng)8小時，在4"放置過夜后，取一式二份轉移到Colony/PlaqueScreenTM濾膜(DuPont)上并按廠商建議進行處理。探針的分離F3，5，H探針按Holton等(1993)和美國專利號5,349,125所述分離的對應于HfL或Hf2基因座的2個類黃嗣3，，5，羥化酶在篩選方法中應用。來自矮牽牛屬的C4HcDNA克隆在用于分離對應于HIL或m基因座的2個類黃酮3，，5，-羥化酶cDNA克隆的篩選方法中(Holton等，1993;美國專利號5,349,125)分離了許多細胞色素P450cDNA克隆.這些cDNA克隆中一個(Fl)(包含于pCGP161中)(圖2)根據(jù)與以前鑒定的來自緣豆的C4H克隆的序列相同性筌定為編碼肉桂酸4-羥化酶(C4H)(Mizutani等，1993).序列數(shù)據(jù)從矮牽牛屬FlcDNA克隆5，端的295個核普酸產(chǎn)生.在測序的295個核苷酸中與綠豆C4H克隆有83.1。/。的相似性且在推測的氫基酸序列中有93.9%的相似性.651cDNA克隆包含于pCGP619(圖5)中的651cDNA克隆的分離與鑒定在公開號為WO93/20206的國際專利申請中描述.在pYE22m(Tanaka等，1988)的酵母甘油醛-3-轔酸脫氫酶啟動子控制下的含651cDNA克隆的酵母蛋白質提取物表現(xiàn)出F3，H活性.OGR文庫的篩選雜交前，一式兩份的噬菌斑轉移膜于65"在預洗溶液(50mMTirs國HClpH7.5，1MNaCl，lmMEDTA，0.P/o(W/N)肌氨酸)中洗滌30分鐘；于651C在0.4M氫氧化鈉中變性30分鐘；然后于65x:在0.2MTris-HapH8.0，0.1xssc，0,1%(W/V)SDS溶液中洗30分鐘并最后在2xSSC，1.0%(W/V)SDS中漂洗.用(1)來自含C4HcDNA克隆的pCGP161(圖2)的0.7kbEcflRl/XimI片段，(2)來自含HflcDNA克隆的pCGP602(圖3)的1.6kb歸HI/EspI片段，(3)來自含HGcDNA克隆編碼區(qū)的pCGP175(圖4)的1.3kbEmRI/XMI片段和0.5kbMfiI片段和(4)來自含651cDNA克隆的pCGP619(圖5)的1.8kbEmRI/XMI片段的32P標記片段篩逸OGRcDNA文庫的轉移膜。雜交條件包括在10%(V/V)甲酰胺，1MNaCl，10%(W/V)硫酸葡聚糖，1%(W/V)SDS中42x:至少1小時的預雜交步寐.然后將"P標記的片段(各以1x106cpm/ml)加入雜交溶液中，接著在42X:下再雜交16小時.然后在2xsSC,1%(W/V)SDS中于42n洗膜2x1小時并用具有增感屏的柯達XAR膠片在-70X:下膝光16小時。將230個強雜交噬菌斑挑入PSB中。使用所述的對cDNA文庫起始篩逸的雜交條件再次篩選得到其中39個噬菌斑為分離純化的噬菌斑.找出包含于XZAP噬菌體載體中的質粒，序列數(shù)據(jù)從cDNA插入片段3，和5'端產(chǎn)生.根據(jù)序列同源性，39個中的27個與矮牽牛屬肉桂酸4-羥化酶cDNA克隆相同，39個中的2個與HflcDNA克隆相同，39個中的7個不代表細胞色素P450.與篩選方法中所用的細胞色素P450克隆相比，剩下的3個cDNA克斷命名為OGR-27，OGR-38，OGR-39)代表"新"細胞色素P450并將進一步得到鑒定.實施例5限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析在戶.Aj;6/7'^中有2個控制類黃胡3，—鞋化酶活性的遺傳基因座，Htl和Ht2(Tabak等，1978;Wiering和deVlaming，1984).膽在i3./^6/7'rffl花的花瓣和花粉管中均有表達且比僅在花粉管中表達的Ht^產(chǎn)生更高的F3，H活性水平.F3，H能將二氳四羥基黃嗣和4，，5，7-三羥黃烷嗣分別轉變成二氫櫟皮黃嗣和圣草酚.在產(chǎn)生以花翠素為基礎的色素的花中，F(xiàn)3，H活性被F3，5，H活性掩蓋.因此，F(xiàn)3，H/F3，5，H測定(Stotz和Forkmann，1982)在測定是否存在F3，H活性中無用.類黃醇合成酶能將二氳四羥基黃嗣轉變成四鞋基黃嗣并將二氫櫟皮黃酮轉變成櫟皮黃嗣(圖la)。在矮牽牛屬花中以較低水平合成楊酶黃嗣，3，，5，-羥基化類黃醇.因此，分析花中的3，羥基化類黃醇，櫟皮黃嗣可指示F3，H活性的存在。對從在VR(Htl/htl)xV23(htl/htl)回交中的植物個體分離的DNA進行的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析用于確定哪一種(如果有的話)代表P450的cDNA克隆與HtL基因座連鎖.對從這些植物分離的RNA進行的Northern分析用于檢測在這些抹系中是否存在轉錄物.分析VR(Htl/htl)xV23(htl/htl)回交群體花中類黃醇，四羥基黃嗣和櫟皮黃嗣的存在.VR(miZML)花積累櫟皮黃嗣和低水平的四羥基黃嗣，而V23(M1/ML)花積累四幾基黃酮但極少或沒有櫟皮黃嗣.來自VR(Htl/htl)xV23(htl/htl)回交的植物個體，如果在花提取物中檢測到高水平的櫟皮黃嗣，則命名為VR類(Htl/htl),如果在花提取物中檢測到極少或沒有櫟皮黃胡但有高水平的四羥基黃酮，則命名為V23類(M1/MJL)(見圖6).基因組DNA的分離基本上按Dellaporta等(1983)所述從葉組織分離DNA.以CsCl浮力密度離心進一步純化該DNA制品(Sambrook等，1989),Southern印跡用60單位的E￡fiRI消化基因組DNA(10蹄)16小時并通過在TAE電泳緩沖液(40mMTris-乙酸鹽，50mMEDTA)中的0.7%(W/V)瓊脂糖凝膠走電泳.然后在變性溶液(1.5MNaCl/0.5MNaOH)中變性DNA1至1.5小時，在0.5MTris-HCl(pH7.5)/1.5MNaCl中和2至3小時，然后轉移到在20xSSC中的HybondN(Amersham)濾膜上.RNA印跡使用Turpen和Griffith的方法(1986)從P.hybrida變種OGR階段l至3的花的花瓣組織中分離總RNA.RNA樣品使用含40mM嗎啉代丙磺酸(pH7.0)，5mM乙酸鈉，O.lraMEDTA(pH8.0)的電泳緩沖液通過2.2M甲醛/1.2%(W/V)瓊脂糖凝膠走電泳。按廠商所迷將RNA轉移到Hybond-N濾膜(Amersham)上.雜交和洗滌條件Southern和RNA印跡用32P標記的cDNA片段(108cpm/|ig,2x106cpm/mL)探測.預雜交(42"1小時)和雜交(42t:16小時)在50%(V/V)甲酰胺，1MNaCl，1%(W/V)SDS，10%(W/V)疏酸葡聚糖中進行.濾膜在2xSSC，1%(W/V)SDS中于65"洗滌1至2小時，然后在0.2xSSC，1%(W/V)SDS中于65t!洗滌0.5至1小時，濾膜用具有增感屏的柯達XAR膠片在-70t:曝光16小時。細胞色素P450片段的RFLP和Northern分析使用RFLP分析研究對應于OGR-27，OGR-38和OGR-39cDNA克隆的基罔與HtL基因座的連鎖關系.OGR-27，OGR-38和OGR-39cDNA克隆的32P標記片段用于探測從VRxV23回交群體的植物個體中分離的基因組DNA的RNA印跡和Southern印跡.從VRxV23回交群體分離的EcoRI消化的基因組DNA的分析揭示了與HtL連鎖的OGR-38探針的RFLP.而且與在VR類抹系中檢測到的高水平的轉錄物相比，在V23類抹系中檢測到的轉錄物水平要低得多(圖6)。這些數(shù)據(jù)提供了強有力的證據(jù)，證明包含于質粒pCGP1805中的OGR-38cDNA克隆對應于HtL基因座且代表F3，H。V23xR51F2回交的RFLP分析RFLP分析用于研究對應于OGR-38cDNA的基因與已知遺傳基因座的連鎖關系.使用MapMaker圖譜程序的Macintosh2.0版本(DuPont)(Lander等，1987)進行RFLP連鎖分析.LOD分數(shù)3.0用來作為連鎖閾值。從V23xR51F2群體分離的EmRI或血I消化的基因組DNA的分析揭示了與PAc4連鎖的OGR-38探針的RFLP。PAc4，矮牽牛屬肌動蛋白cDNA克隆(Baird和Meagher,1987)，是染色體III的分子標記且與HLi基因座(Mcbean等，19卯)連鎖.在44抹V23xR51F2植抹中有36抹存在OGR-38與PAc4RFLP的共分離。這代表8%的重組頻率，相似于所報道的HtL基因座與PAc4之間16%的重組頻率(Cornu等，19卯).OGR-38的進一步筌定通過用OGR-38cDNA插入片段的32P標記的片段作為針對含2(Hig從5個矮牽牛屬OGR花瓣發(fā)育階段的各階段以及從葉，萼片，根，莖，花梗，子房，花藥和花柱分離的總RNA的RNA印跡的探針測定OGR花瓣以及其它OGR組織中的發(fā)育表達情況.OGR-38探針能與在花發(fā)育的更低的1至3階段達到高峰的1.8kb轉錄物雜交，與OGR-38雜交的轉錄物在花瓣和子房中最豐富且也在OGR植物的萼片，花梗和花藥中檢測到.在莖中也檢測到低水平的轉錄物.在所用的條件下，通過對從葉，花柱或根分離的總RNA的Northern分析檢測不到雜交的轉錄物。實施例6OGR-38的完整序列通過編輯使用產(chǎn)生隨機重疊克隆的標準方法(Sambrook等，1989)獲得的不同PUC18亞克隆的序列來測定OGTR-38cDNA克隆的完整序列(SEQIDNO:1).該序列包含有1536個堿基的開放閱讀框架，該開放閱讀框架編碼含512個氨基酸的推斷的多肽.使用lfasta排列(Pearson和Lipman，1988)將OGR-38的核苷酸及推測的氨基酸序列(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)與在篩選方法中使用的細胞色素P450探針和其它矮牽牛屬細胞色素P450序列(美國專利號5,349,125)比較.OGR-38的核苷酸序列與代表來自P./rj6/vV/fl的Hfl和HR基閎座的類黃胡3，，5，-鞋化酶的核酸序列最相近(Hoiton等，1993).HfL克隆在1471個核苷酸上顯示出與OGR-38cDNA克隆59.6。/o的相似性，且在513個氨基酸上顯示出49.9%的相似性，而Hi^克隆在1481個核芬酸上顯示出與OGR38cDNA克隆59.1%的相似性，在511個氨基酸上顯示出49.0%的相似性.實施例7在酵母中表達的micDNA克隆(OGR-38)的F3，H測定.pCGP1646的構建通過將來自pCGP1805的OGR-38cDNA插入片段以"有義"的方向克隆到pYE22m的酵母甘油醛-3-褲酸脫氫酶啟動子(Tanaka等，1988)之后構建質粒pCGP1646(圖7).通過用A級718消化使質粒pCGP1805線型化.根據(jù)標準方法(Sambrook等，1989)使用DNA聚合酶(Klenow片段)補平突出的5，端.用smaI消化釋放1.8kb的OGR-38cDNA片段.使用Bresaclean試劑盒(Bresatec)分離和純化cDNA片段并與補平的pYE22m的E￡qRI末端連接。用EmRI消化質粒pY22m并根據(jù)標準方法(Sambrook等，1989)使用DNA聚合酶(Klenow片段)除去伸出的5，端.使用lOOng1.8kb的OGR-38片段和150ng制備的酵母栽體pYE22m用Amershatn連接試劑盒進行連接.通過對從氨千青霉素抗性轉化子分離的質粒DNA的I/smI限制性酶分析確認插入片段在pYE22m中的正確插入'酵母轉化用根據(jù)Ito等(1983)所述的用pCGP1646轉化酵母菌抹G—1315(Mata.trpl)(Ashikari等，1989)。轉化子通過它們將G-1315恢復到色氨酸原養(yǎng)型的能力選擇.制備酵母抽提物以測定F3，H活性使用G-1315/pCGP1646的單個分離物接種于50ml改良的Burkholder，s培養(yǎng)基(20.0g/L葡萄糖，2.0g/LL-天冬酰胺，1.5g/LkH2P04,0.5g/LMgS047H20，0.33g/LCaCl2，2g/L(NH4)2S04，O.lmg/LKI，0.92g/L(NH4)6Mo7024.4H20，O.lg/L次氮基三乙酸，0.99mg/LFeS047H20，1.25mg/LEDTA，5.47mg/LZnS047H20，2.5mg/LFeS047H20,0.77mg/LMnS047H20，0.196mg/LCuS04-5H20，0.124mg/LCo(NH4)2(S04)26H20，0.088mg/LNa2B40710H2O，0.2mg/L疏胺素，0.2mg/L吡*醇，0.2mg/L煙酸，0.2mg/L泛酸，0.002mg/L生物素，10mg/L肌醇)中，隨后在30"下進行培養(yǎng)直到OD6(M)值達到1.8。離心收集細胞并重懸于緩沖液含2M山梨醇，O.lmMDTT，O.lmMEDTA，0.4mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和酵母裂解酶5mg/mL的10mMTris-HCl緩沖液(pH7.5)中，30C下輕微震蕩培養(yǎng)細胞1小時后，經(jīng)離心沉淀細胞并在水冷緩沖液2[含0.65M山梨醇，O.lmMDTT，O.lmMEDTA，0.4mMPMSF的10mMTris-HCl(pH7.5)中洗滌.然后將細胞重懸于緩沖液2中并使用功率循環(huán)(dutycycle)為30%，輸出控制為10%的BransonSonifier2506次15秒釋放進行超聲波處理.將超聲破碎的懸浮液以10，000rpm離心30分鐘且上清以13，000rpm離心90分鐘。將微粒體沉淀重懸于測定緩沖液〔100mM磷酸鉀(pH87)，lmMEDTA，20mM2-巰基乙醇〕中并測定lOOjxl中的活性。F3'H測定使用stotz和Forkmapn(1982)所述方法的改良形式測定F3，H酶活性。測定反應混合物一般含有100nl酵母提取物，在測定緩沖液(100mM磷酸鉀(pH8.0),lmMEDTA和20mM2-巰基乙醇)中的5^150raMNADPH和10pCi3H-4，，5，7-三羥黃烷稱并用測定緩沖液調到終體積為210jal.231C培養(yǎng)2-16小時后，用0.5ml乙基乙酸抽提反應混合物.在真空條件下千燥乙基乙酸相，然后重懸于10nL乙基乙酸中.使用氯仿乙酸水(10:9:1V/V)溶劑系統(tǒng)在纖維素薄層平板(MerckArt5577，德國)上分離氚標記的類黃嗣分子.以放射自顯影定位反應產(chǎn)物并與在反應產(chǎn)物旁遷移且在紫外燈下可見的非放射性4，，5，7-三鞋基黃烷胡和圣草酚比較來筌定.在G1315/pCGP1646抽提物中檢測到F3'H活性，而在非轉基因酵母提取物中檢測不到.由此可推斷與HtL基因座連鎖的來自pCGP1805的cDNA片段(OGR-38)編碼F3，H.實施例8ffilcDNA克隆(OGR-38)在植物中的瞬時表達pCGP1867的構建通過將來自pCGP180S的cDNA插入片段以"有義"的方向克隆到pCGP293(Brugliera等，1994)的Mac啟動子(Comai等，19卯)之后來構建質粒pCGP1867(圖8).用XMI和KpnI消化質粒pCGP1805以釋放cDNA插入片段.使用Bresaclean試劑盒(Bresatec)分離和純化cDNA片段，并與pCGP293雙元載體的XbaJZKpflI末端連接。使用Amersham連接試劑盒進行連接.經(jīng)過對從慶大霉素抗性轉化子分離的DNA進行XhaI/KpaI限制性酶分析確定該片段在pCGP1867中的正確插入。HtlcDNA克隆(OGR-38)在矮牽牛屬花瓣中的瞬間表達為了迅速測定pCGP1867中的OGR-38cDNA片段是否編碼植物中的功能性F3，H，進行了瞬時表達研究，用以pCGP1867DNA包被的金粒(lpm直徑)轟擊突變的戶./^6rWfl抹系Skr4xSW63的花瓣.金微粒栽體在100%乙醇中預洗3次并重懸于無菌水中.對于每次轟擊，將lpgpCGP1867DNA,0.5mg金微粒栽體，lOW2.5MCaCl2和2pl100mM亞精胺(自由基)通過振蕩混合2分鐘。離心沉淀DNA包被的金顆粒，用100%乙醇洗2次并最后重懸于10^1100%乙醇中.將懸浮液直接滴在大栽體的中央并使其千燥.將階段1和2的Skr4xSW63花垂直切成兩半并部分包埋于MS固體培養(yǎng)基〔3%(W/V))蔗糖，100mg/L肌醇，1xMS鹽，0.5mg/L吡哆醇-HC1，O.lmg/L硫胺素-HC1，0.5mg/L煙酸和2mg/L甘氨酸〕中，放置花瓣使花蕾內側向上.用卯0psi氦氣壓和28英寸汞真空室的BiolisticPDS-1000/He系統(tǒng)(Bio-Rad)用于將金徵粒栽體轟擊進花瓣組織，在22t:的控制植物生長室中光照6-12小時后，在用pCGP1867包被的顆粒轟擊的花瓣組織上表皮層觀察到紅色花青苷斑點.在僅用金顆粒轟擊的對照花瓣中觀察不到有色斑點.這些結果表明在Mac啟動子控制下的OGR-38cDNA克隆在花瓣組織中，至少瞬間地，是有功能的.實施例9HtlcDNA克隆(OGR-38)在矮牽牛屬花瓣中的穩(wěn)定表達-M1/ML矮牽牛屬栽培品種的補充根癌土壤桿菌轉化通過加入5jig質粒DNA到lOOpl感受態(tài)AGLO細胞中,將質粒pCGP1867(圖8)導入根癌土壤桿菌菌抹AfiliL,其中感受態(tài)細胞通過接種50mlMG/L(Garfinkel和Nester，1980)培養(yǎng)物并在28t:振蕩生長16小時來制備.然后沉淀細胞并重懸于0.5加185%(V/V)100mMCaCh/15。/o(V/V)甘油中。DNA-土壤桿菌混合物通過在液態(tài)N2中放置2分鐘冷凍，然后在37C保溫5分鐘使其解凍.然后將DNA/細菌混合物再在冰上放置10分鐘.接著將細胞與lmLLB(Sambrook等，1989)培養(yǎng)基混合并在28r振蕩培養(yǎng)16小時.在含10ng/ml慶大霉素的LB瓊脂平板上選擇攜帶pCGP1867的根癌土壤桿菌細胞，通過對從慶大霉素抗性轉化子分離的DNA進行southern分析證實pCGP1867的存在.矮牽牛屬轉化(a)植物材料來自P.嶺6nV/fl變種Sk4xSW63的成熟植物的葉組織在1.25%(W/V)次氯酸鈉中處理2分鐘，然后在無菌水中漂洗3次.然后將葉組織切成25mm2的方塊并在補充有0.05mg/L激動素和1.0mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2，4誦D)的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，162)中預培養(yǎng)24小時。(b)土壤桿菌和矮牽牛屬組織的共培養(yǎng)含雙元栽體pCGP1867(圖11)的根癌土壤桿菌菌抹AGL^在含100mg/L慶大霉素的MG/L瓊脂平板上于4TC保存.將單個菌落在含1%(W/V)Bacto-蛋白胨，0.5%(W/V)Bacto-酵母抽提物和1%(W/V)NaCl的液體培養(yǎng)基中生長過夜，第二天通過在含維生素B5(Gamborg等，1968)和3%(W/V)蔗糖的液體MS培養(yǎng)基(BPM)中稀釋準備5x1()S個細胞/ml的終濃度.將葉片浸入含AGLfi/pCGP1867的BPM上2分鐘.然后將葉片吸干并放在共同培養(yǎng)基上4天.共同培養(yǎng)基由補充了0.05mg/L激動素和1.0mg/L2，4-D的SH培養(yǎng)基(Schenk和Hildebrandt，1972)組成且包括涂布在共同培養(yǎng)基上的煙草細胞懸液飼養(yǎng)層，其中在煙草細胞懸液上放置濾紙.(c)轉基因矮牽牛屬植物的再生共同培養(yǎng)后，將葉片轉移到選擇培養(yǎng)擬補充了3%(W/V)蔗糖，2mg/Loc-千氨基嘌呤(BAP)，0.5mg/La-萘乙酸(NAA)，300rag/L卡那霉素，350mg/Lcefotaxime和0.3%(W/V)GelriteGellanGum(Schweizerhall)的MS培養(yǎng)基〕中.4周后將再生的外植體轉移到新鮮的選擇培養(yǎng)基中。分出在卡那霉素選擇中存活的不定芽并轉移到含100mg/L卡那霉素和200mg/Lcefotaxime的BPM中進行根誘導.所有的培養(yǎng)物于23±2"在16小時光周期(60nmol，m-2，s-1白色冷熒光燈)下保存。當根長度達2-3cm時，將轉基因矮牽牛屬小植抹轉移到8cm試管中的高壓滅菌的Debco51410/2盆栽混合物中.4周后，將植物再植入使用相同盆栽混合物的15cm小盆中并在23TC14小時光周期(300pmol，m-2，s-1卣化汞燈)下保存.實施例10轉基因植物表型分析Skr4xSW63中的pCGP1867表5顯示了用pCGP1867質粒轉化Skr4xSW63植物獲得的各種花瓣和花粉顏色表型。轉基因植物然93A，5卯A，571A，589A，592A和591A產(chǎn)生花瓣顏色改變的花.而且，植物弁593A，590A，589A，與對照Skr4xSW63植物的白色相比，592A和591A的花的花藥和花粉為粉紅色.在質粒pCGP1867導入的Skr4xSW63矮牽牛屬植物觀察到花藥和花粉顏色的改變是未預料到的結果.顏色代碼取自皇家園藝學會顏色圖表(RHSCC).它們提供了描述觀察到的顏色表現(xiàn)的可供選擇的方法，然而，指定的數(shù)字應僅僅認為是對可見顏色的指南而不應當作對可獲得的可能的顏色的限制.表5在用pCGP1867轉化的Skr4xSW63植物中獲得的花瓣，花藥和花粉顏色的總結<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>導入的HtlcDNA在Skr4xSW63雜種中的表達對花色具有顯著的影響.非轉基因對照的雄蕊組織是白色的，而大多數(shù)轉基因植物中的相同組織是粉紅色.另外，HtlcDNA在Skr4xSW63雜種中的表達使花冠產(chǎn)生暗紫色，其在正常情況下是極淡的紫色.實施例11產(chǎn)物的分析以TLC分析用pCGP1867轉化的Skr4xSW63植物的花瓣和雄蕊(包括花粉，花藥和花絲)中產(chǎn)生的花青苷和類黃醇.花青苷和類黃醇的提取TLC分析前，存在于花瓣和雄蕊抽提物中的花青普和類黃醇分子經(jīng)酸水解從花青苷或類黃醇主鏈上去掉糖基部分。花青苷和類黃醇標準用于幫助筌定在花抽提物中存在的化合物.通過在lml2M鹽酸中煮沸100至200mg花瓣片或5個雄蕊30分鐘來抽提并水解花青苷和類黃醇.用200fU異戊醇抽提水解的花青普和類黃醇.然后將該混合物在真空中抽干并重懸于更小體積的甲醇/1%(V/V)HC1中.使用甲醇/1%(V/V)HC1的量根據(jù)花辦的起始鮮重，以便估測花瓣中類黃制的相對水平。將雄蕊抽提物重懸于lpl甲醇/1%(V/V)HCI中。將lpl小份的Skr4xSW63花瓣和雄蕊中來自pCGP1867的抽提物點樣到TLC平板上.花抽提物的TLC分析酸水解的花抽提物在Forestal溶劑系統(tǒng)(HOAc:水HC1;30:10:3)(Markham,1982)中遷移.表6顯示了在用pCGP1867轉化的轉基因Skr4xSW63矮牽牛屬植物的某些花和雄蕊中存在的花青苷和類黃醇的TLC分析結果.經(jīng)過比較在TLC平板上觀察到的斑點強度估測類黃醇和花青苷的指示性相對量(用"+"至"+++"表示).表6在用pCGP1867轉化的Skr4xSW63植物的花瓣片和雄蕊中檢測到的花青苷和類黃醇的相對水平Acc#花瓣顏色二甲翠雀素花青苷花青素甲基花青素類黃醇四泉基櫟皮黃酮黃嗣Skr4xSW63淡紫色+/-誦—+-對照花瓣片593A花瓣片暗粉色—++++-++571A花瓣片粉紅色一++-+589A花瓣片暗粉色+++570A花瓣片淡紫色+/-——+-Skr4xSW63對照雄蕊593A雄簽白色粉紅色一++++++—+++將mcDNA克隆導入Skr4xSW63,導致在花瓣中產(chǎn)生3，-羥基化的類黃酮，櫟皮黃嗣，甲基花青素和一些花青素.甲基花青素是花青素的甲基化衍生物(圖la和lb)。在非轉基因Skr4xSW63對照中僅檢測到四羥基黃嗣和少量二甲翠雀素(表6).盡管Skr4xSW63是HfL和m基因的純合隱性，但這些突變不能完全阻斷F3，5，H的合成(見美國專利號5，349，125)，且合成低水平的二甲翠雀素使花瓣片產(chǎn)生淡紫色的顏色.轉基因植物然93A產(chǎn)生的具有粉紅色花粉和花藥的雄蕊含甲基花青素和櫟皮黃酮，而具有白色花粉和花藥的非轉基因Skr4xSW63對照含四羥基黃酮和低水平的櫟皮黃稱(表6).在轉基因Skr4xSW63/pCGP1867植物的花瓣和雄蕊中3，—羥基化的花青苷，甲基花青素的積累與在相同植物花辦，花藥和花粉中觀察到的粉紅色和暗粉色有關。F3，H活性的共同抑制為了降低F3，H活性的水平，也將質粒pCGP1867導入i>./r，6Wrffl變種國旗紅(HtL)中。按上文實施例9所述的進行矮牽牛屬的轉化.38抹轉基因植物中有2抹產(chǎn)生表型改變的花.OGR正常情況下產(chǎn)生深紅色花(RHSCC#4613).花色改變的2抹轉基因植物產(chǎn)生亮粉色或亮紅色(RHSCC#54B和并53C)的花。對從4抹轉基因植物(二抹表型改變的轉基因植物，二抹具有通常的深紅色花的轉基因植物)產(chǎn)生的花分離的RNA進行Northern分析以檢驗OGR-38轉錄物的水平.10mg花瓣的總RNA在1.2%(W/V)瓊脂糖/甲醛凝膠(Sombrook等，1989)上分離并按前所述的方法轉移到HybondN尼龍膜(Amersham)上.還包括來自未轉化的OGR花的花瓣RNA作為對照。OGR_38cDNA插入片段的"P標記的片段用于探測RNA印跡.OGR-38探針在轉基因植物花中檢測到大約2.4kb和1.8kb的轉錄物.然而，在亮粉,色和亮紅色花中檢測到的兩種轉錄物的水平比在深紅色轉基因花中檢測到的要低得多。在未轉化的OGR花的RNA中也檢測到內源性1.8kb轉錄物'為了證實2.4kb轉化物來自導入的OGR-38轉化基因，使用mas終止子區(qū)的"P標記的片段探測相同的RNA印跡.mas探針檢測到2.4kb的轉錄物，表明至少該轉錄物來自導入的OGR-38轉化基因.花青苷水平的分析通過分光光度分析測量對照花和亮粉色轉基因花中的花青苷水平.花青苷和類黃醇的提取。通過將200至300mg花辦片在2ml甲醇/1%(V/V)HC1中4t:保溫16小時從花瓣片提取花青苷和類黃醇.然后將5(^1該溶液加入950nl甲醇/1%(V/V)HC1中，在530nm下測定稀釋的溶液的吸光率.使用公式[(吸收值(530nm)/34，000)x抽提緩沖液體積x稀釋系數(shù)x106/重量克數(shù)，測定以每克nmole表示的花青苷水平.發(fā)現(xiàn)亮粉色花中每克花瓣片組織含大約915nmoles的花青苷，而對照花含大約4000nmoles/克.這些數(shù)據(jù)表明導入有義方向的矮牛屬F3，H(OGR-38)cDNA克隆入OGR植物導致內源性和轉基因F3，H轉錄物的"共同抑制"(即，減少).觀察到更白的花色與花青苷合成減少及F3，H轉錄水平減少相關實施例12從麝香石竹分離F3，HcDNA克隆為了分離鹿香石竹(石竹屬)F3，HcDNA克隆，使用包含于pCGP1805(上述)中的矮牽牛屬HtL連鎖的F3，HcDNA克隆(OGR-38)在低度嚴格條件下篩選石竹變種KortiimChanel花瓣cDNA文庫。石竹變種KortinaChanelcDNA文庫的構建從階段1，2和3的KortinaChanel花分離的20mg總RNA(如前所述)，在含1xS叩erscriptTM反應緩沖液，10mM二硫蘇糖醇(DTT),500pMdATP,500,dGTP，500nMdTTP，500nM5-甲基-dCTP，2.8嗎來自ZAP-cDNAGigapackIHGold克隆試劑盒(stratagene)的引物-接頭寡聚核苷酸和2^1Superscript逆轉錄酶(BRL)的5(HU體積中逆轉錄.反應混合物在37TC保溫60分鐘，然后放于冰上。使用ZAP-cDNAGigapackIIIGold克隆試劑盒(Stratagene)完成文庫構建.重組子的總數(shù)為2.4x106。轉染XL1-BlueMRF，細胞后以每15cm直徑平板10,000pfu涂布共200，000pfu的包裝的cDNA,平板在37TC培養(yǎng)8小時，然后在4X:貯存過夜.取一式2分轉移到Colony/PlaqueScreen濾膜(DuPont)上并按廠商建議處理.篩選KortinaChanel花瓣cDNA文庫中的F3，HcDNA克隆。雜交前，按前迷處理一式兩份噬菌斑轉移膜，用來自pCGP1805的1.8kbJtoRI/Xlml插入片段的32p標記的片段篩選來自KortinaChanel花瓣cDNA文庫的兩份轉移膜。使用所述的用于篩選矮牽牛屬OGRcDNA文庫的低等嚴格條件.將一個強烈雜交的噬菌斑挑進PSB中并按上面的詳細描述再次篩選以分離純化的噬菌斑.找到包含于1ZAP噬菌體載體中的質粒并命名為pCGP1807,用EcoRI/XhoI消化釋放包含于pCGP1807中的KC-1cDNA插入片段，此片段大約為2Kb.通過對從KC-1cDNA插入片段的亞克隆序列的編輯測定KC-lcDNA克隆的完整序列.覆蓋458個核苷酸的部分序列以前從覆蓋KC-13，區(qū)的800bpKfifll片段產(chǎn)生，該片段亞克隆進pBluescript產(chǎn)生pCGP1808),完整序列(SEQIDNO:3)含編碼500個氨基酸的推測的多肽(SEQIDNO:4)的1508個堿基的開放閱讀框架。將石竹KC-1cDNA克隆的核苷酸和推測斷的氨基酸序列與矮牽牛屬OGR-38F3，HcDNA克隆的序列(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)進行比較.石竹屬KC-1cDNA克隆的序列(SEQIDNO:3和4)在1555個核普酸上顯示出與矮牽牛屬OGR-38F3，HcDNA克隆67.3°/。的相似性，在488個氨基酸上顯示出71.5%的相似性.在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的序列排列及核香酸和相應氨基酸序列間的序列相似性的比較的各種總結分別見表7和表8，9,10,11和12。這些表見實施例34，在說明書結尾處.實施例13克隆在矮牽牛屬的花瓣中的石竹屬F3'HcDNA(KC-1)的穩(wěn)定表達一htl/htl矮牽牛屬栽培品種的補充制備pCGP1810通過將來自pCGP1807的cDNA插入片段以"有義"的方向克隆到pCGP90(美國專利號5,349,125)的Mac啟動子(Comai等，19卯)后來構建質粒pCGP1810(圖9),其中pCGP90是以pCGP293為基礎的構建體(Brugliera等，1994).用BamHI和ApaI消化質粒pCGP1807來釋放KC-1cDNA插入片段，使用Bresaclean試劑盒(Bresatec)分離并純化cDNA片段.用BamHI和ApaI消化pCGP卯雙元栽體來釋放線型化的栽體和HflcDNA插入片段.使用Bresaclean試劑盒(Bresatec)分離并純化線型化的栽體并與KC-1cDNA克隆的BamHI/ApaI末端連接。使用Amersham連接酶進行連接.通過對從慶大霉素抗性轉化子中分離的DNA進行BamHI/ApaI限制性酶分析確認插入片段在PCGP1810中的正確插入。按實施例9所述，將雙元栽體pCGP1810導入根癌土壤桿菌菌抹AGLO細胞中。隨后使用pCGP1810/AGLO細胞轉化Skr4xSW63矮牽牛屬植物(也按實施例9所述)以檢測對應于KC-lcDNA克隆的基因編碼的酶的穩(wěn)定表達和活性.實施例14轉基因植物表現(xiàn)型分析Skr4xSW63中的pCGP1810導入的KC-lcDNA在Skr4xSW63雜種中的表達對花色具有顯著的影響。與Skr4xSW63對照(RHSCC#74C)相比，用pCGP1810轉化的12抹轉基因植物中有10抹產(chǎn)生花辦顏色改變的花(RHSCC#73A)。而且，與對照Skr4xSW63植物的花為白色相比，轉基因花的花藥和花粉為粉紅色。另外，KC-lcDNA在Skr4xSW63雜種中的表達產(chǎn)生暗粉色花冠，而在正常情況下為淡紫色.顏色代碼取自皇家園藝學會顏色圖表(RHSCC).它們提供了描述觀察到的顏色表現(xiàn)型的可供選擇的方法.然而指定的數(shù)值應僅用來作為對可見顏色的指南而不應當作是對可得到的可能的顏色的限制.酸水解的花提取物(見實施例11)在Forestal溶劑系統(tǒng)(HOAc:水HC1;30:10:3)(Markham，1982)中遷移.3'鞋基化的類黃酮，甲基花青素和櫟皮黃酮容易在轉基因植物的花瓣片中檢測到。在未轉基因的Skr4xSW63對照中僅檢測到四羥基黃嗣和少量二甲翠崔素。在轉基因Skr4xSW63/pCGP1810植物的花瓣中3'-羥基化花青苷，甲基花青素的積累與相同植物花瓣中觀察到的暗粉色有關.pCGP1813的構建通過將來自pCGP1807的cDNA插入片段以"有義"方向克隆到pCGP1958的MaC啟動子(Comai等，19卯)后來構建質粒pCGP1811.質粒pCGP1958含Mac啟動子和pUC19骨架中的甘露堿合成酶(mas)(Comai等，19卯)終止子.用EstI和xhflI消化質粒pCGP1807以釋放cDNA插入片段.使用DNA聚合酶(Klenow片段)補平突出的5'端(Sambrook等，1989).使用Bresaclean試劑盒(Bresatec)分離并純化cDNA片段并與pCGP1958載體的SmaI末端連接以制備pCGP1811.隨后用PstI消化質粒pCGP1811來釋放含有具有mas終止子和啟動的KC-1cDNA的Mac啟動子的表達元件，所有這些包含于4kb片段上，分離表達元件與pWTT2132雙元栽體(DNA植物技術公司，Oakland,California)的Pstl末端連接以產(chǎn)生pCGP1813(圖10)。用石竹屬F3'HcDNA克隆轉化麝香石竹變種KortinaChanel按實施例9所述將雙元栽體pCGP1813導入根癌土壤桿菌菌抹AGLO細胞.pCGP1813/AGLO細胞用于轉化石竹屬植物來減小3'-羥基化類黃嗣的量。(a)植物材料從VanWyK和SonFlowerSupply,Victoria,Australia獲得磨香石竹(變種KortinaChanel)插枝.去掉外側葉并先在70%v/v乙醇中簡單消毒插枝，然后在1.25%w/v次氯酸鈉(含Tween20)中處理6分鐘并用無菌水漂洗3次.共同培養(yǎng)前在解剖顯徵鏡下去掉全部可見葉和腋芽。(b)土壤桿菌和石竹屬組織的共培養(yǎng)含雙元栽體pCGP1813的根癌土壤桿菌菌抹AGL0(Lazo等，1991)在含50mg/L四環(huán)素的LB瓊脂平板上于4C保存.單個菌落在含50mg/L四環(huán)素的液體LB培養(yǎng)基中生長過夜并在第二天接種前稀釋至5x108個細胞/ml.將石竹莖組織與土壤桿菌在補充了3%w/v蔗糖，0.5mg/lBAP，0.5mg/L2，4-二氯笨氧乙酸(2，4-D)，lOOmM乙酸丁香酮和0.25%w/vGelrite(pH5.7)的MS培養(yǎng)基中共同培養(yǎng)5天.(c)轉基因石竹屬植物的再生為了選擇轉化的莖組織，將每個共同培養(yǎng)的莖頂端6-8mm切成3-4mm段，然后轉移進補充了0.3%w/v蔗糖，0.5mg/LBAP,0.5mg/L2,4-D，lpg/L氯磺酸(chlorsulfuron),500mg/Lticarc出in和0.25%w/vGelrite的MS培養(yǎng)基(Murashige和Skoog，1962)中.2周后，將外植體轉移進含3%蔗糖，0.16mg/L苯基噻二唑基脲(TDZ)，0.5mg/L丐l哚-3-丁酸(IBA)，2pg/Lch服orsulfuron，500mg/Lticarcillin和0.25%w/vGelrite的新鮮MS培養(yǎng)基中并在此階段小心地取出從莖外植體上去掉腋技.3周后，將健康的不定枝轉移進含3%w/v蔗糖，5pg/Lchlorsulfuron，500mg/Lticarcillin，0.25o/ow/vGelrite的無激素MS培養(yǎng)基中.將在5叫/Lchlorsuifuron下存活的枝條轉移進相同培養(yǎng)基中使枝條伸長，為正?；蜕?，將伸長的枝條轉移進含5pg/Lchlorsulfuron，500mg/Lticarc川in和0.4%w/vGelrite的無激素MS培養(yǎng)基的玻璃罐中。所有培養(yǎng)物在16小時光周期(120mE/mVs冷白色熒光燈)23土2C保存.將大約1.5-2cm高的正?；男≈材ㄞD移進土壤(75%珍珠石/25r泥炭)中在14小時光周期(200mE/m2/s卣化汞燈)23t:下生長3-4周.植物用含lg/LCaN03和0.75g/L加了以4.7:3.5:29.2比例的N:P:K的微量元素石竹屬混合物施肥，實施例15使用差異顯示方法從金魚草(金魚草屬)分離F3'HcDNA克隆采用新方法從金魚草(金魚草屬)分離編碼F3'H的cDNA序列。改進方法以(i)使用過剩的寡核苷酸分離植物細胞色素P450序列(Holton等，1993)和(ii)真核信使RNA的差異顯示(Liang和Pardee,1992)方案的組合為基礎，來以比較野生型(EOS+)和F3'H突變體(eos_)金魚草抹系之間的花瓣細胞色素P450轉錄物群體.差異表達cDNA片段的直接克隆允許通過Northern,FRLP和序列分析進行進一步的鑒定以鑒定推斷的F3'H編碼序列.使用Frohman等(1988)的RACE方案獲得全長cDNA，并表明該克隆在矮牽牛屬花瓣細胞中瞬間和穩(wěn)定表達后編碼功能性FVH,植物材料所用的金魚草抹系來自親本抹系K16(eos)和N8(Eos+)，K16是缺乏F3'H活性的純合隱性突變體，而N8是F3'H活性的野生型.這些抹系盡管不是同基因的，但是相似的.來自自交K16xN8F1植物的蒴果E2282的種子(#E228)萌發(fā)，對所得的植物(K16xN8F2植物)是否存在花青素，F(xiàn)3'H活性的產(chǎn)物進行評分(見圖la和lb)?；ㄇ嗨氐拇嬖诳赏ㄟ^肉眼評分，因為花為深紅色，不同于粉紅色(來自花葵素產(chǎn)生的色素)的突變植物.按實施例11所述進行的花瓣花青苷的TLC分析證實肉眼評分的精確性.E2282種子產(chǎn)生的13抹植物中，9抹(#3，#4，#5，#6,#7,#9,#10，#12，#15)產(chǎn)生具有花青素的花(Eos+/Eos+和Eos十/eos—),而4抹(#8，#11，#13,#14)僅合成花葵素衍生的色素(eos一/eos一)。cDNA的合成使用Turpen和Griffith(1986)的方法從金魚草K16xN8F2分散群體(E2282)的植物#13的葉及植物#3，#5和#12的花瓣組織分離總RNA.在40單位RNasii^核糖核酸酶抑制劑(Promega)存在的條件下，用1單位RQ1無RNA酶的DNA酶(Promega)在廠家提供的緩沖液中37"C處理50pg總RNA3小時去除污染的DNA.然后通過用酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提進一步純化RNA并隨后用乙醇沉淀.互補于聚腺苷酸化序列的上游區(qū)的錨定poly(T)寡核苷酸用于從金魚草花瓣和葉RNA引發(fā)cDNA合成.合成的寡核苷酸序列是(5'_3z)二polyT-anchATTTTTTTTTTTTTTTTTASEQIDNO:27polyT-anchCTTTTTTTTTTTTTTTTTCSEQIDNO:28polyT-anchGtTTTTTTTTTTTTTTTTGSEQIDNO:292mg總RNA和100pmo1合適的引物寡核苷酸加熱到70C10分鐘，然后在水中冷卻。然后將RNA/引物雜交體加入含20單位RNasin圾(Promega).各25nM的dNTP,lOmMDTT和1xSuperscript緩沖液(BRL)的反應體系中.將反應物在37TC加熱2分鐘，然后加入200單位的Superscript逆轉錄酶(BRL)，使反應進行75分鐘，然后經(jīng)過在95TC加熱混合物20分鐘滅活逆轉錄酶.使用PCR擴增細胞色素P450序列使用過剩的寡核苷酸(設計成互補于靠近植物細胞色素P450編碼序列3'端的保守區(qū))和poIyT錨式寡核苷酸擴增細胞色素P450序列.以前已有人使用相似方法從i^w附'fl/^6n'flffl合成細胞色素P450序列且在美國專利號5，349，125中進行了描述.合成4個寡核苷酸(稱為上游引物).它們來自植物細胞色素P450序列的保守氨基酸區(qū)。寡核苷酸(從5'到3'寫出)如下WAIGRDPTGGGCIATIGGI(A/C)GIGA(T/C)CCSEQIDNO:30SEQIDNO:31FRPERFAGGAAT丁(T/C)(A/C)GICCJGA(A/G)(A/C)GI丁丁SEQIDNO:32'SEQIDNO:33PetHae邊-NewCCITT(T/C)GGIGCIGGI(A/C)GI(A/C)GIATITG(T/G、乂(C/G)CGGSEQIDNO:34EFXPERFGAITT(T/QHCCIGAI(A/C)GITTSEQIDNO:35SEQIDNO:36使用上游引物與每一種polyT錨定寡核苷酸在使用cDNA作模板的聚合酶鏈式反應中產(chǎn)生細胞色素P450序列。50pmo1的各種寡核苷酸與2pM的每種dNTP，1.5mMMgCl2，1xPCR緩沖液(PerkinElmer),5pCia-〔33P〕dATP(Bresatec,1500Ci/mmo1)，2.5單位的AmpHTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)和1/10的可引發(fā)cDNA反應的錨定polyT(來自上文)混合.反應混合物(50fU)在94"下起始變性2分鐘的步驟后，在94TC15秒，42X:i5秒，70t:45秒間循環(huán)40次.使用PerkinElmer9600GeneAmp熱循環(huán)儀進行循環(huán)反應.使用每一種上游引物/錨定引物組合和適當?shù)目梢l(fā)的cDNA模板擴增DNA序列.各引物組合與來自￡2282植物#3和#5(合成花青素的花)和#12(不合成花青素的花)花瓣的cDNA—起使用.還包括加入來自植物#13(合成花青素的花)的葉的cDNA的反應作為陰性對照，因為在健康的，非逆境的葉組織中不存在明顯的F3'H活性水平.細胞色素P450序列的差異顯示.在5。/。(w/v)聚丙烯耽胺/尿素變性凝膠(sambrook等，1989)上分離后可觀察到33P標記的PCR片段.在凝膠上包含有33P標記的M13mpl8測序梯度用作大小標記.測序凝膠在Whatman3MM紙上干燥并用柯達XAR膠片在室溫下曝光.合成花青素的花瓣樣品與無花青素的花瓣樣品間的帶型比較揭示了代表在合成花青素的花瓣中特有的mRNA的11條帶.在這11條帶中，只有2條也存在(強度降低)于葉樣品中.從測序凝膠分離和克隆PCR片段從干燥的測序凝膠中純化PCR產(chǎn)物并用Liang等(1993)所述的方法再擴增.在1.2X(w/v)瓊脂糖/TAE凝膠上電泳分離后，使用Besaclean試劑盒(Bresatec)純化擴增的cDNA,然后將純化的片段直接連接進或商業(yè)上制備的PCR-Script載體(Stratagene)中或已使用Marchuk等(1990)的方案加上T尾的EcoRV切開的pBluescript(Stratagene)中F3'HPCR產(chǎn)物的測序11個克隆的差異顯示PCR產(chǎn)物(插入片段不超過500bp)中的每一個的兩條鏈被測序并使用Pearson和Lipman(1988)的FASTA程序與花青苷生物合成中涉及的其它已知的細胞色素P450序列進行比較.在11個克隆的cDNA中，2個(AmlGb和Am3Ga)表現(xiàn)了與矮牽牛屬OGR-38F3'H序列(實施4到11)和F3'5'H序列(Holton等，1993)較強的同源性?？寺mlGb和Am3Ga之間的保守序列表明它們代表相同mRNA的重疊片段，克隆Am3Ga從編碼分子的血紅素結合區(qū)的序列(被"PetHaem-New"寡核苷酸識別；SEQIDNO:34)延伸到多腺苷酸化序列.克隆AmlGb從編碼保守的"WAIGRDP"氨基酸基序列模式的細胞色素P450序列(互補于引物1;SEQIDNO:30和SEQIDNO:31)延伸到被引物1("WAIGRDP")寡核苷酸錯誤識別的3'非翻譯區(qū)的一個區(qū)域.實施例16細胞色素P450cDNA的RFLP分析再次使用限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)分析研究對應于cDNA克隆Am3Ga的基因與花瓣中是否存在合成花青素活性的聯(lián)系.Am3Ga的"P標記的插入片段用于探測從K16xN8F2隔離植物及親本K16和N8抹系中分離的基因組DNA的Southern印跡。對EmRV消化的來自K16xN8F2隔離群體的13株植物的基因組DNA的分析表明僅與表現(xiàn)出花的花青素合成的N8和K16xN8F2隔離抹系的序列雜交(圖11)。在其花瓣中僅合成花葵素衍生的色素的K16xN8F2植物(包括親本抹系，K16)顯示出無特異性雜交(圖11,泳道2，8，11，13，14)。這些數(shù)據(jù)表明在突變體K16植物中對應于Am3Ga的基因組序列可能缺失，因此在該抹系中F3'H基因至少部分缺失.實施例17細胞色素P450cDNA的Northern分析使用Northern分析證實以差異顯示表示的推測的細胞色素P450片段的表達情況。在1.2。/。(w/v)瓊脂糖/甲醛凝膠(sambrook等，1989)上分離10mg來自8個K16xN8F2隔離群體的花瓣的總RNA并轉移到HybondN尼龍膜(Amersham)上。還包含來自產(chǎn)花青素的植物#13的葉RNA作為Northern分析的陰性對照.來自克隆Am3Ga的cDNA插入片段的"P標記的片段用于探測RNA印跡.Am3Ga探針識別僅在合成花青素的植物(植物#1，#3,#4，#5,#8)的花瓣中可檢測到的大約1.8Kb的轉錄物。在合成花葵素的花瓣(植物#6,#11，#12)或來自植物#13的葉樣品中檢測不到轉錄物(圖12)。這些數(shù)據(jù)與RFLP分析的結果一起提供了強有力的證據(jù)，證明Am3Ga克隆代表負責金魚草屬中F3'H活性的細胞色素P450基因的強有力的證據(jù)，在不合成花青素的抹系的花瓣中完全沒有可檢測的轉錄物這一點支持了RFLP分析的發(fā)現(xiàn)，即在K16抹系(和K16xN8F2隔離群體的純合隱性植物)中缺乏合成花青素活性是F3'H結構基因缺失的結果.實施例18分離全長的金魚草屬F3'HcDNA采用Frohman等(1988)的cDNA末端迅速擴增(RACE)方法用已知的部分An^Ga克隆的序列分離全長F3'HcDNA克隆.合成基因特異性引物("SnapredRaceA"—互補于Am3Ga序列361至334)以允許從花瓣RNA進行逆轉錄.還合成了3'擴增引物("SnapredRaceC"-互補于Am3Ga(3'UTR)序列283至259)以結合"SnaprredRaceA"的上游.使用"poly(C)"引物從cDNA分子5'端擴增序列，使用的寡核苷酸序列是(從5'-3'寫出)SnapredRaceACCACACGAGTAGTTTTGGCATTTGACCCSEqIDNO:37SnapredRaceCGTCTTGGACATCACACTTCAATCTGSEQIDNO:38PolyCraceCCGAATTCCCCCCCCCC卿IDNO:39"SnapredRaceA-引發(fā)的"花瓣cDNA是加了poly(G)尾的，使用Frohman等(1988)的方法用引物"SnapredRaceC"和"polyCrace"擴增的5'cDNA片段.E￡aDNA聚合酶(0.15單位)(Stratagenz)與2.5單位的AmpliTaqDNA聚合酶(PerkinElmer)結合以增強PCR反應的忠實性。所得的1.71kbDNA片段(sdF3'H)直接克隆進使用Marchuk等(19卯)的方法加上T尾的toRV切開的pBluescript(stratagene)栽體中。該質粒命名為pCGP246.實施例19金魚草屬F3'HcDNA完整序列采用pCGP246sdF3'HcDNA序列內的常用限制性位點以產(chǎn)生質粒載體pUC19中的一系列短的重疊亞克隆，編輯各亞克隆的序列以提供sdF3'HRACEcDNA的完整序列。將sdF3'HcDNA序列與來自克隆AM3Ga的序列結合以提供金魚草屬F3'HcDNA的完整序列(SEQIDNO:5),它含有1711個堿基的開放閱讀拒，編碼512個氨基酸的推測的多肽(SEQIDNO:6).將金魚草屬sdF3'H克隆的核苷酸和推測的氨基酸序列與矮牽牛屬OGR-38cDNA克隆的序列(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2);矮牽牛屬F3'5'HcDNA克隆Hfl和Hf2序列；和以前分離的其它矮牽牛屬細胞色素P450序列(美國專利號5，349，125)進行比較，sdF3'H的序列與代表/./0^〃V/flHtL基因座的矮牽牛屬F3'HcDNA克隆(OGR-38)的序列最相似，在核酸水平上于1573個核苷酸中有69%的相似性，在氨基酸水平上于507個氨基酸中有72.2%的相似性.HfL克隆與金魚草屬sdF3'H克隆在1563個核苷酸中有57.3%的相似性，在491個氨基酸中有49.3%的相似性，而HfL克隆與金魚草屬sdF3'H克隆在1488個核苷酸中有57.7%的相似性，在508個氨基酸中有50.8%的相似性。金魚草屬sdF3'H序列含有2個閱讀框架內ATG密碼子，它們都能啟動翻譯.從第一個密碼子(SEQIDNO:5的91位)起始合成增加了10個N端氨基酸的蛋白質，且根據(jù)翻譯的掃描模型(Koza^1989),它是優(yōu)選的，在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的排列及核苷酸和相應氨基酸序列間的序列相似性比較的各種總結分別見表7和表8，9，10，11和12。這些表在實施例34中，在說明書結尾處'實施例20sdF3'H在植物中的瞬間表達pCGP250的構建通過將來自pCGP246的完整的sdF3'HRACEcDNA插入片段〔從位置1至1711(SEQIDNO:5〗〕以"有義"的方向克隆到pCGP293(Brugliera等，1994)的Mac啟動子(Comai等，1990)之后以構建質粒pCGP250(圖13)。用EcoRI消化質粒pCGP246以釋放cDNA插入片段。通過用DNA聚合酶I的K，enow片段修復伸出端使cDNA片段變成平末端(Sambrook等，1989)，在瓊脂糖凝膠電泳后，使用Bresaclean試劑(Bresatec)純化。然后將平末端的cDNA片段連接進用XMI切開的且使用DNA聚合酶I的klenow片段補平的雙元栽體pCGP293中.使用Amersham連接試劑盒進行連接.通過對從慶大霉素抗性轉化子分離的DNA進行Ba邁HI和EslI限制性酶分析確認插入片段在pCGP250中的正確插入，pCGP231的構建通過將來自pCGP246第一個"閱讀框架內"ATG密碼子下游的RACEcDNA插入片段〔從位置104至1711(SEQIDNO:5)〕以"有義"的方向克隆到pCGP293(Brugliera等，1994)的Mac啟動子(Comai等，19卯)之后產(chǎn)生質粒pCGP231(圖14).用SseI(識別候選ATG密碼子之間的位點)和SmaI(載體多接頭序列中的位點)消化質粒pCGP246以釋放包含第二個推測的起始密碼子下游的完整編碼區(qū)的平末端cDNA片段，然后將cDNA片段連接進已用XbaI切開并用DNA聚合酶I的klenow片段補平的雙元栽體pCGP293中，使用Amersham連接試劑盒進行連接.通過對從慶大霉素抗性轉化子分離的DNA進行Ba膽HI和EstI限制性酶分析確認插入片段在pCGP231中的正確插入.瞬間表達研究為了迅速測定pCGP231和pCGP250中的pCGP246序列是否編碼植物中的活性類黃嗣3'-羥化酶，進行了瞬間表達試驗.使用實施例8中所述的方法，用pCGP231或pCGP250質粒DNA包被的金顆粒(lpm直徑)轟擊突變的jP./^6r/(/fl抹系Skr4xSW63的花瓣。在控制植物生長室中22"C光照下6-12小時后，在用pCGP231包被的顆粒轟擊的花瓣組織的表面觀察到紅色花青普斑點.在用pCGP250轟擊的花瓣中或僅用金顆粒轟擊的對照花瓣中未觀察到有色斑點，這些結果表明在Mac啟動子控制下的pCGP246編碼區(qū)(在第二個ATG，SEQIDNO:5的121位起始)在花瓣組織中具有功能.實施例21金魚草屬F3'HcDNA克隆在矮牽牛屬花瓣中的穩(wěn)定表達-htl/htl矮牽牛屬栽培品種的補充按實施例9所述將雙元栽體pCGP250和pCGP231導入根癌土壤桿菌菌林AfiLi細胞中.使用pCGP250/AGLO和pCGP231/AfiLl細胞轉化Skr4xSW63矮牽牛屬植物(也在實驗例9中描述)以檢測對應于金魚草屬sdF3'HcDNA克隆的基因編碼的酶的活性和穩(wěn)定表達.用pCGP250轉化的9抹轉基因植物中有3抹與Skr4xSW63對照(RHSCC#75C)相比產(chǎn)生花瓣顏色略有改變的花(RHSCC#73A).在用pCGP231轉化的11抹轉基因植物中，一抹植物產(chǎn)生花瓣顏色改變的花(RHSCC#73B).轉基因花的花藥和花粉與對照一樣，也是白色-代碼來自皇家園藝學會顏色圖表(RHSCC).它們提供了描述觀察到的花表型的一個可供選擇的方法。然而，應把指定的數(shù)字當作可見顏色的一種指南，而不應當作對可獲得的可能的顏色的限制.花抽提物的TLC分析酸水解的花抽提物(見實施例ll)在Forestal溶劑系統(tǒng)(HOAc:水:HC1;30:10:3)(Markham，1982)中遷移，sdF3'HcDNA克隆導入Skr4xSW63中導致花瓣中3'-羥基化類黃嗣，甲基花青素的生產(chǎn)水平升高.甲基花青素是花青素的甲基化衍生物(固la和lb).實施例22使用RCR方法從擬南芥分離F3'HcDNA克隆為了從擬南芥中分離代表類黃嗣3'鞋化酶的cDNA克隆，使用來自細胞色素P450保守區(qū)的引物合成PCR片段，發(fā)現(xiàn)一個PCR產(chǎn)物(p58092，13)與矮牽牛屬OGR-38和金魚草屬F3'HcDNA克隆具有較高的序列相似性，然后使用PCR片段與來自pCGP1805的micDNA插入片段(OGR-38)—起篩選擬南芥cDNA文庫.寡核苷酸的設計從靠近血紅素結合區(qū)的/^H"Zfl/y^〃'rfflt細胞色素P450部分序列的共有氨基酸序列設計用于PCRDNA擴增的筒并寡核苷酸.經(jīng)過在各密碼子的第三個堿基上包括脫氧次黃苷(下文稱為I)(脫氧次黃苷堿基對與A，T，G和C具有相似的效率)且在非特異性的共有序列上包括可選擇的堿基來形成引物簡并性。因此，設計了含有對血紅素結合起關鍵作用的半胱氨酸殘基的密碼子的氨基末端定向引物"PetHaem"(矮牽牛屬血紅素結合區(qū))和上游引物"WAIGRDP"(也見實施例15)。WAIGRDPTGGGCIATIGGI(A/C)GIGA(J/C)CCSEQIDNO:30SEQIDNO:31PetHaemCCIGG(A/G)CAIATIC(G/T)(C/T)(C/TTHCCIGCICC(A/G)AAIGGSEgIDNO:40使用PCR合成細胞色素P450序列使用Dellaporta等(1987)所述的方法從擬南芥生態(tài)型Columbia分離基因組DNA,用于擴增細胞色素P450同源物的聚合酶鏈式反應典型地含有100-200ngColumbia基因組DNA，10mMTris-HCl(pH8.3)，50mMKcl，1.5mMMgCl2，0.01%(w/v)明膠，0.2mM的各種dNTP，312ng"WAIGRDP"和484ng"PetHaem"及1.25單位的的Tag聚合物(Cetus)。反應混合物(5(HU)在95*C50秒，45"50秒及72"C45秒間循環(huán)40次.使用"WAIGRDP"和"PetHaem"引物在無內含子的典型的P450基因模板上產(chǎn)生的特異性PCR擴增產(chǎn)物的預期大小約為150個堿基對。分離大約140至155個堿基對的PCR片段并使用1\^1"111&13@試劑盒(BIOIOI)純化.再擴增PCR片段以獲得足夠的產(chǎn)物用于克隆，然后使用EfuDNA聚合酶進行末端修復，最后克隆進pCR-ScriptTMDirectSK(+)(Stratagene).然后使用連接的DNA轉化感受態(tài)的DH5a細胞(Inouc等，1990).PCR產(chǎn)物的序列制備來自15個轉化子的質粒DNA(DelSal等，1989).從PCR片段產(chǎn)生的測序數(shù)據(jù)顯示15個中有11個代表單一的克隆.在擬南芥PCR插入片段內編碼的翻譯序列中也發(fā)現(xiàn)了一組特有的細胞色素P450共有氨基酸。還將PCR片段的序列與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆和金魚草屬F3'HcDNA克隆的序列進行-iPCR片段p58092.13與來自矮牽牛屬和金魚草屬的F3'H序列最相似.實施例23擬南芥cDNA文庫的篩選為了分離p58092.13PCR產(chǎn)物的cDNA克隆，用32p標記的p58092.13的片段與包含于pCGP1805中的矮牽牛屬HUcDNA插入片段(OGR-38)的32p標記片段一起錄選擬南芥生態(tài)型ColumbiaCDNA文庫(Newman等，1994;D'Alessio等，1992).按D'Alessio等(1992)所述以每15cm直徑平板50,000pfus的密度涂布共600,000pfu的噬菌體，在37E生長后，將平板于4TC貯存過夜.取一式二份轉移到Colony/PlaqueScreenTM濾膜(DuPont)上并接廠家建議處理。雜交前，在預洗滌溶液(50mMTris-HClpH7.5，1MNaCl，lmMEDTA，0.1%(w/v)肌氨酸)中65"洗滌二份噬菌斑轉移膜30分鐘；在0.4M氫氧化鈉中65TC變性30分鐘，然后在0.2MTris-HClpH8.0，0.1xSSC，0.1%(w/v)SDS溶液中65"C洗滌30分鐘，最后在2xSSC，0.1%(w/v)SDS中漂洗.雜交條件包括在50%(v/v)甲酰胺，1MNaCl，10%(w/v)硫酸葡聚糖，1%(w/v)SDS中42i:下至少1小時的預雜交步稞。然后向雜交溶液中加入3印標記的p58092.13的片段(2xio6cpm/ml)，雜交在42X:下再繼續(xù)16小時，然后濾膜在2xSSC,1%(w/v)SDS中42"下洗滌2x1小時并用具有增感屏的柯達XAR膠片在-70t:膝光16小時.將11個強烈雜交的噬菌斑挑進PSB中并按上面的詳細描述再次篩選以分離純化噬菌斑'也用包含于pCGP1805中的矮牽牛屬fltlcDNA插入片段(OGR-38)的32p標記的片段在低度嚴格條件下探測這些濾膜。低度嚴格條件包括42"C下在20%(v/v)甲酰胺，1MNaCI，10%(w/v)硫酸葡聚糖，1%(w/v)SDS中的預雜交和雜交及65"下在6xSSC，1%(W/V)SDS(W/V)中洗滌1小時，OGR-38和p58092.13探針與相同的噬菌斑雜交.將ll個純化噬菌斑挑進PSB并使用細菌菌抹DH10B(Zip)存活含cDNA克隆的質粒栽體pZLl.制備質粒DNA(DelSal等，1989)并用Ba膽HI和EfflRI消化釋放cDNA插入片段.11個質粒含有800bp至lkb的cDNA插入片段.從cDNA插入片段5'端得到的序列數(shù)據(jù)表明這些克隆中的9個是相同的。序列數(shù)據(jù)從所有9個cDNA插入片段的5'端和一個cDNA插入片段的3'端得到.編輯從所有克隆得到的序列數(shù)據(jù)以得到SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示的核苷酸和其翻譯序列.將擬南芥推測的F3'H序列與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的序列(SEQIDNO:l和SEQIDNO:2)進行比較.在745個核苷酸中與矮牽牛屬F3'HcDNA克隆有64.7%相似性，在248個氨基酸中有63,7%相似性。在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的序列排列及核苷酸和相應氨基酸序列間相似性的序列比較的各種總結分別可在表7和在表8，9，10，11和12中發(fā)現(xiàn).這些表見實施例34,在說明書結尾處.從擬南芥分離F3'H基因組克隆為了分離擬南芥F3'H基因的基因組克隆，用32p標記的p60606.04片段篩選擬南芥生態(tài)型Landsbergerecta基因組DNA文庫.經(jīng)過克隆BamHI消化的X噬菌體EMBL4臂間的MllflI部分消化的基因組DNA得到該文庫.篩選前擴增一次含30,000克隆的一級文庫.用BamHI/EmRI消化含擬南芥F3'HcDNA的lkb片段的p60606,04克隆以切下插入片段，并使用GeneClean(BioIOI)純化.使用缺口轉移方法(Sambrook等，1989)以32p標記探針.在高度嚴格條件(50%甲酰胺，37X:)下探測大約20，000個噬菌斑并在2xSSPE;2xSSPE，0.1%(w/v)SDS;0.1xSSPE中65C下洗膜'在相同條件下進行再篩選.從3個陽性噬菌斑(UT7-1,XTT7_5和入TT7-6)中純化DNA并通過用EsflRl和EmRl/Sall消化建立圖諳.所有3個克隆都具有一個共同的EsaRI片段。入TT7-1和ATT7-5重疊但限制性圖譜不同'按上文所述探測這些消化產(chǎn)物的Southern印跡，對于ATT7-1和VTT7-5,雜交上了一個共同的6.5kb的EfifiRI/SalI片段，在入TT7_6中也雜交上了一個較小的EMRl/SaiI片段并很可能在插入片段的邊界處'將來自1TT7-5的EfiflRI/SaU片段克隆進pBlueScriptSK+中，通過雜交(如上)和插入片段的大小養(yǎng)定含6.5kb片段的克隆,〈命:^為E-5。使用EfflRI，Sall，Kpnl，HiMIH和J5glIl的各種組合制定該片段的限制性圖譜，并通過與來自擬南芥F3'HcDNA克隆的用BamHI/EcoRI消化的插入片段的Southern雜交編輯.m基因組克隆的完整序列使用標準技術(Sambrook等，1989)將來自pTt7-2,含有大多數(shù)m基因組片段的6.4kb的Ba瓜HI片段純化，自連，超聲處理，末端修復，根據(jù)大小分離(450bp至800bp)并克隆進Smal切割的pUC19中。分離重組克隆，純化質粒DNA并使用M13-21或M13逆向測序引物測序。將來自重疊克隆的序列組合進一個鄰近的片段，經(jīng)過用-21和REV引物測序也獲得了m基因組片段末端的序列.將所有的序列組合起來以獲得來自E-5(WEQIDNO:9)的6.5kbtoRI/Sail片段的完整序列。將擬南芥屬m基因組克隆編碼區(qū)的序列(SEQIDNO:10，11,12和13)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的序列(SEQIDNO:l和2)比較。擬南芥屬m編碼區(qū)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆編碼區(qū)在1066個核苷酸中具有65.4%的相似性，在511個氨基酸中具有67.1%的相似性。擬南芥屬突變體ttL的轉化雙元載體的制備將來自E-5的￡￡fiRl/SalI片段克隆進E￡QRI/MI切割的pBI101(Jefferson等，1987)中.鑒定了2個分離的但相同的克隆:pBI-Tt7-2(圖15)和pBI-Tt7-4.使用2個克隆轉化根癌土壤桿菌.植物轉化經(jīng)電穿孔將質粒pBI-Tt7-2，pBI-Tt7-4和pBI101轉化進土壤桿菌屬菌抹GV3101pMP90中.在含50^ig/ml卡那霉素(及50ng/ml慶大霉素來選擇殘余的pMP90)的培養(yǎng)基中選擇轉化子.分離來自各克隆的4個轉化子菌落的質粒DNA并用toRI/SaU消化，電泳，并用ItlcDNA插入片段探測Southern印跡.對于pBI-Tt7-2和pBI-Tt7-4，預期的插入片段條帶得到鑒定.使用基本上如Bechtold等(1993)所述的方法，將各質粒的一個轉化子(即一個對照〔pBI101C4〕，2個Tt7克隆〔pBI-Tt7-2-3和pBITt7-4-4〕各一個)用于真空滲入擬南芥虹突變抹系NW88(每種構建體用4盆各IO抹的植物)。從各盆收獲種子.將100mg種子(大約5,000個)涂布到含50|xg/ml卡那霉素的營養(yǎng)培養(yǎng)基(Haughn和SomerviHe，1986所述)上.7至10天后可見卡那霉素抗性轉化子。對于pBI-Tt7-2-3和pBI-Tt7-4-4，從5個不同的種子群(即:盆)分離到總共ll個轉化子，所有的卡那霉素抗性轉化子在表型上可見是m，且在葉和胚軸邊緣表現(xiàn)出特征性紅色/紫色花青苷色素。從4盆對照轉化子的一盆中分離單個卡那霉素抗性轉化子，它不表現(xiàn)出"野生型"m表型.1tL突變體的互補種植這些轉化子并生長至成熟，逐一收獲種子，在每種情況下，對于pBI-Tt7-2-3和pBI-Tt7-4-4轉化子，其種子在視覺上比40_突變植物的淡棕色種子棕色更深。來自對照轉化子的種子與ttL突變親本不可區(qū)分。將這些種子種植在營養(yǎng)培養(yǎng)基和添加有卡那霉素的營養(yǎng)培養(yǎng)基上，評價m表型(子葉邊緣和胚軸有紅色/紫色花青苷色素)和卡那霉素抗性。檢查至少一個轉化子后代的各種子群體，因為它們明顯不依賴于轉化事件。無一例外，卡那霉素抗性幼苗表現(xiàn)出m表型，而卡那霉素敏感的個體是117_.在有些情況下，卡那霉素抗性微弱且在一個種子家族中具有可變性，難以明確測定該個體是卡那霉素抗性還是卡那霉素敏感性.實施例24從/^Z>r/rffl分離F3'HcDNA克隆為了分離玫瑰F3'HcDNA克隆，用32p標記的包含于pCGP1805中的矮牽牛屬HtlcDNA克隆(OGR-38)片段和包含于pCGP246中的金魚草屬F3'HcDNA克隆(sdF3'H)篩選Rosahybrida變種Kardinal花辦cDNA文庫。從玫瑰變種Kardinal構建花瓣cDNA文庫從/仍fl/^6〃'rffl變種Kardinal階段2的花蕾制備總RNA.在此階段，緊閉的花芽1.5cm高，約0.9cm寬，具有淡粉色花瓣.冷凍的組織(l-3g)在淡氮中用梓臼研磨，放入25ml預冷的緩沖液A〔0.2M硼酸，10mMEDTA(鈉鹽)(pH7.6)〕中并快速勻漿.抽提物在旋轉搖床上混合至其達到室溫，加入用緩沖液A平衡的等體積的酚/氯仿(l:lv/v)。再混合10分鐘后，RNA制備物以10，000xg20TC下離心10分鐘.保留上部水相且如上所述再次抽提酚界面，合并水相并調到0.1M乙酸鈉(pH6.0)，加入2.5體積95%的乙醇，混合物于-20"C貯存過夜.制備物以10，000xg于4r下離心IO分鐘，沉淀輕輕溶于20ml緩沖液B〔25mM硼酸，1.25mMEDTA(鈉鹽)，0.1MNaCl(pH7.6)〕并加入0.4體積的2-丁氧乙醇(2BE),該溶液在水上保溫30分鐘。然后將其以10，000xg在0TC離心10分鐘，小心收集上清液.加入1.0體積的2BE并在冰上再保溫30分鐘后，將上清以io，oooxg在ox:下再次離心10分鐘.用緩沖液A:2BE(1:1v/v)輕輕洗滌所得的沉淀，然后用70呢(v/v)輕輕洗滌所得的沉淀，然后用70y。(v/v)乙醇，O.IM乙酸鉀洗滌，最后用95%乙醇洗滌.沉淀在空氣中干燥并溶于lml焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中.將它調至3M氯化鋰，在水上放置60分鐘并以10，000xg在0r下離心IO分鐘。沉淀用3MLiCl洗滌2次，然后用70%乙醇，0.1M乙酸鉀洗滌.所得的RNA沉淀溶于40(HilDEPC處理的水中并用等體積的酚/氯仿抽提.將RNA混合物以10，000xg在20TC下離心5分鐘，收集水相并調節(jié)至0.1M乙酸鈉，再加入2.5體積的95%乙醇.在冰上保溫30分鐘后，混合物以13，000rpm(5，000xg)在20C離心20分鐘，RNA沉淀輕輕重懸于400^1DEPC處理的水中.按照廠家方案以OHgotexdT-30(Takara，日本)從總RNA中選擇Poy(A)+RNA。根據(jù)Brugliera等(1994)的方法合成cDNA并用于在XZAPH(Stratagene)的EcoRI位點中構建非定向花瓣cDNA文庫.獲得的重組子的總數(shù)為3.5x105個.轉染XL1-Bhie細胞后，將包裝的cDNA混合物以每15cm直徑平板50，000pfu涂板。平板在37X:下培養(yǎng)8小時，噬菌體在lOOmMNaCl,8mMMgS04，50mMTris-HClpH8.0，0.01%(w/v)明膠〔噬菌體貯存緩沖液(PSB)〕(Sambrook等，1989)中洗脫.加入氯仿并將噬菌體在4t:貯存作為擴增的文庫。將200,000pfu擴增文庫在轉染XLl-BlueMRF'細胞后以每15cm平板10，000pfu的密度涂布到NZY平板(Sambrook等，1989)上，并在37t:下培養(yǎng)8小時.在4"C培養(yǎng)過夜后，取二份轉移到Colony/PlaqueScreen濾膜(DuPont)上(標記的A組和B組)并按廠家建議處理.篩選KardinalcDNA文庫中的F3'HcDNA克隆雜交前，將2份噬菌斑轉移膜在預洗溶液(50mMTris-HClpH7.5，1MNaCl，lmMEDTA，0.1%w/v)肌氨酸)中65"C洗30分鐘，在0.4M氫氧化鈉中65TC變性30分鐘；然后在0.2MTris-HC1pH8.0，0.1xSSC,0.1%(w/v)SDS溶液中65r洗30分鐘并最后在2xSSC，1.0%(w/v)SDS中漂洗。用34標記的來自pCGP1805的含矮牽牛屬迅l(OGR-38)cDNA克隆的K￡flI片段篩選KardinalcDNA文庫的2份轉移膜的A組濾膜，而用32P標記的來自pCGP246的含金魚草屬F3'H克隆的EcoRI/SspI片段篩選B組轉移膜，雜交條件包括在10%(v/v)甲耽胺，1MNaCl，10%(w/v)硫酸葡聚糖，1%(w/v)SDS中42"至少1小時的預雜交步猓.然后將"p標記的片段(2x10、mp/ml)加入雜交溶液中并在42TC繼續(xù)雜交16小時.然后轉移膜在42X:下在2xSSC,1%(w/v)SDS中洗滌2小時，然后以1xSSC，1%(w/v)SDS洗滌1小時，最后在0，2xSSC/1%(w/v)SDS中洗滌2小時.將濾膜用具有增感屏的KodakXAR膠片于-70X:下啄光16小時.將4個強烈雜交的噬菌斑(R1，R2，R3，R4)挑入PSB中并再次篩選以分離純化的噬菌斑.提取包含于入ZAP噬菌體載體中的質粒并用E￡OEI消化以釋放cDNA插入片段.克隆R1含l,0kb的插入片段而克隆R2，R3和R4各含大約1.3kb的插入片段.從R4cDNA插入片段的3'和5'端產(chǎn)生序列數(shù)據(jù).比較玫瑰R4推測的F3'H序列與矮牽牛屬OGR-38F3'H序列，在核苷酸水平上，R4cDNA克隆在5'端的389個核苷酸中及在3'端的330個核香酸中分別顯示出63.2%和62.1%的相似性.在氨基酸水平上，R4克隆在5'端的130個氨基酸中和在3'端的69個氨基酸中分別顯示出65.4%和73.9%的相似性.根據(jù)玫瑰R4cDNA克隆與矮牽牛屬F3'HcDNA克隆(OGR-38)的高度序列相似性，按下面實施例25所述分離了相應的"全長"cDNA克隆。實施例25分離全長玫瑰F3'HcDNA為了從玫瑰分離"全長"F3'HcDNA克隆，用上述玫瑰R4cDNA克隆的32p標記的片段篩選實施例24所述的及仍a/^辦ri'rffl變種Kordinal花瓣的cDNA文庫。在轉染XL1-BlueMRF'細胞后、將總共1.9x10、fu的擴增文庫以每15cm直徑平板100，000pfus的密度涂布到NZY平板上，并在37n培養(yǎng)8小時。41C培養(yǎng)過夜后，取2份轉移到Colony/PlaqueScreen濾膜(DuPont)上并按廠家建議處理.篩選KardinalcDNA文庫中的全長F3'HcDNA克隆雜交前，按實施例24所述處理二份噬菌斑轉移膜.用32p標記的來自玫瑰R4cDNA克隆的EmRI片段篩逸來自KardinalcDNA文庫的二份轉移膜，雜交條件包括在50%(v/v)甲敞胺，1MNaCl，10%(w/v)碟酸葡聚糖，1。/。(w/v)SDS中42X:下至少l小時的預雜交步驟.然后向雜交溶液中加入32p標記的玫瑰cDNA克隆的片段(1x1()6cpm/ml)并在42"C下繼續(xù)雜交16小時.然后在2xSSC，1M(w/v)SDS中42"C下洗滌濾膜2x1小時并用具有增感屏的柯達XAR膠片在-701C曝光16小時.將73個強雜交噬菌斑(l-73)挑入lmlPSB中并在4貯存過夜.然后將各lOOjil的等扮按順序排列分配進徵滴定盤中.將XL1-BlueMRF'細胞加入10ml熔化的NZY頂級瓊脂中，例在NZY平板(15cm直徑)上使其固著.使用重復的涂布裝置將73個噬菌體分離抹按順序排列轉移到以前用XL1-BlueMRF'細胞接種的NZY平板上。37"培養(yǎng)6小時，接著4TC過夜后，取三份(l,2和3列)轉移到Colony/PlaqueScreenTM濾膜(DuPont)上并按廠家建議處理.雜交前，按實施例24所述處理二份噬菌斑轉移膜。用32p標記的a)含有玫瑰R4cDNA克隆5'端的EcoRI/SalI片殺，b)含有玫瑰R4cDNA克隆5'端的EcoRl/C，al片設或c)完整的玫瑰R4cDNA克隆的EffiRl:片段篩選3列，其中使用上述雜交和洗滌條件，除了最后一次洗滌是在0.1xSSC，0.1%(w/v)SDS中65"30分鐘.將濾膜用具有增強屏的柯達XAR膠片于-70TC曝光16小時.73個噬菌斑均與全長R4cDNA克隆(JtoEI片段)雜交，而總共僅17個噬菌斑與R4cDNA克隆5'端(EffiBI/SaiI或EcoRLOaI片段)雜交.按上述再篩選17個噬菌斑分離抹以分離純化的噬菌斑.純化噬菌斑從17個中的9個(2，4，26，27，34,38，43,44,56)中獲得.提取包含于人ZAP噬菌體栽體中的質粒，并使用EfifiEI消化測定cDNA插入片段的大小.cDNA插入片段大小從0.9kb到1.9kb.在9個噬菌斑中，僅#34(命名為pCG2158)和弁38(命名為pCG2159)含大約1.9kb的cDNA插入片段。序列數(shù)據(jù)從cDNA插入片段的3'和5'端得到且表明克隆#34和#38代表相同的基因.經(jīng)過編輯使用產(chǎn)生隨機重疊克隆的標準方法(Sambrook等，1989)獲得的不同pUC18亞克隆的序列測定包含于質粒pCG2158中的玫瑰cDNA克隆(并34)的完整序列.該序列(SEQIDNO:14)包含了1696個堿基的開放閱讀拒，它編碼520個氨基酸(SEQIDNO:15)的推測多肽.比較了玫瑰F3'H#34cDNA克隆的核苷酸和預期的氨基酸序列(SEQIDNO:14和SEQIDNO:15)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)及金魚草屬sdF3'H克隆(SEQIDNO:3和SEQIDNO:4)的序列.玫瑰F3H#34cDNA克隆與矮牽牛屬OGR-38cDNA克隆在1651個核苷酸中顯示出64.7%的相似性，在509個氨基酸中顯示出7217%的相似性，與金魚草屬dF3'H克隆在1507個核苷酸上顯示出67.2%的相似性，在502個氨基酸上顯示出68.9。/。的相似性。本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫相似性比較的各種總結分別見表7和表8，9,10，11和12.這些表見實施例34，在說明書結尾處.實施例26玫瑰F3'HcDNA克隆(#34)在矮牽牛屬花辦中的穩(wěn)定表達-iltl/WJ^牽牛屬栽培品種的互補pCGP2166的制備通過將來自pCGP2158的cDNA插入片段以"有義"方向克隆到pCGP293(BrugHera等，1994)的Mac啟動子(Comai等，19卯)之后構建質粒pCGP2166(圖16)'用EfiflEI消化質粒pCGP2158以釋放cDNA插入片段，使用DNA聚合酶(Klenow片段)(Sambrook等，1989)補平伸出的5'端.分離cDNA片段并與pCGP293雙元栽體補平的BamHi端連接.經(jīng)過對從慶大霉素抗性轉化子分離的DNA進行限制性酶分析確認該片段在pCGP2166中的正確插入.按實施例9所述將雙元栽體pCGP2166導入根癌土壤桿菌菌抹AGL0細胞。然后使用pCGP2166/AGLL細胞轉化Skr4xSW63矮牽牛屬植物(也在實施例9中描述)以試驗相應于玫瑰#34cDNA克隆的基因編碼的酶的活性和穩(wěn)性表達.實施例27轉基因植物表型分析Skr4xSW63中的pCGP2166導入的玫瑰F3'HcDNA在Skr4xSW63雜種中的表達對花色具有顯著的影響.非轉基因對照的雄蕊組織為白色，而大多數(shù)轉基因植物中的相同組織為粉紅色.另外，玫瑰F3'HcDNA在Skr4xSW63雜種中的表達產(chǎn)生暗粉色(RHSCC#64C和74C)花冠，而在正常情況下，它是淡紫色(RHSCC#75C).顏色代碼取自皇家園藝學會顏色圖表(RHSCC)。它們提供了描述觀察到的顏色表型的一種可供選擇的方法.然而指定的數(shù)值應當作是對可見色的指南而不應當作是對可獲得的可能的顏色的限制。酸水解的花提取物(見實施例11)在Forestal溶劑系統(tǒng)(HOAc:水:HCI;30:10:3)(Markham，1982)中遷移.3'羥基化的類黃酮，甲基花青素和櫟皮黃嗣很容易在轉基因植物的花瓣中檢測到.在非轉基因Skr4xSW63對照中僅檢測到四羥基黃稱和少量二甲翠雀素。3羥基花青苷，甲基花青素和類黃醇，櫟皮黃胡在轉基因Skr4xSW63/pCGP2166植物花辦中的積累與在觀察到的相同植物的花的粉紅和暗粉色相關.pCGP2169的制備經(jīng)過將來自pCGP2158的cDNA插入片段以"有義"方向克隆到CaMV35S啟動子(Franck等，1980;Gu出ey等，1982)和OCS終止子(DeGreve等，1982)之間來制備雙元構建體pCGP2169(圖17).質粒pCGP1634含CaMV35S啟動子，由大腸桿菌uidA基因編碼的P—葡糖苷酸酶(GUS)報告基因(Jefferson等，1987)和pUC19載體中的ocs終止子區(qū).用Mesluteal消化質粒pCGP2158以釋放cDNA插入片段。還用to1/XbaI消化質粒pCGP1634以釋放含CaMV35S啟動子和OCS終止子的骨架載體.分離這些片段并連接起來以產(chǎn)生pCGP2167,隨后用消化質粒pCGP2167以釋放含CaMV35S啟動子，玫瑰F3'HcDNA克隆和OCS終止子的表達元件，分離該表達元件片段并與pWTT2132雙元載體(DNA植物技術公司；Oakland,California)的SmaI末端連接以產(chǎn)生pCGP2169(圖17),按實施例9所述將雙元載體pCGP2169/AGL0細胞轉化玫瑰植物以減少3'羥基化類黃嗣的量.實施例28從菊分離推斷的F3'HcDNA克隆為了分離菊F3'HcDNA克隆，用"p標記的包含于pCGP1805中的矮牽牛屬HilcDNA克隆(OGR-38)片段篩逸菊變種RedMinstral花瓣cDNA文庫.從菊變種RedMinstral構建花瓣cDNA文庫使用Trizol頂試劑(LifeTechnologies)(Chomczynski和Sacchi，1987)根據(jù)廠家建議從菊變種RedMTnstral的花瓣(階段3至5)制備總RNA.使用依賴于oligo-(dT)的親和旋轉柱色譜的mRNA分離試劑盒(Pharmacia)從總RNA富集Poly(A)+RNA.使用SuperscriptTMcDNA合成試劑盒(LifeTechnologies)在Ziplox中構建花瓣cDNA文庫，其中使用5jig從RedMinstral階段3至5分離的poly(A)+RNA作模板。轉染Y10卯r-后將30，000pfus的文庫以每15cm平板3，000pfus的密度涂布到LB平板(Sambrook等，1989)上，并在37下培養(yǎng)16小時.在4"C下培養(yǎng)1小時后，取2份轉移到HybondN+TM濾膜(Amersham)上并按廠家建議處理.篩選RedMinstralcDNA文庫用32p標記的來自pCGP1805的1.8kbASE718/fiamHI插入片段篩選來自RedMinstral花辯cDNA文庫的二份轉移膜.雜交條件包括在ImMEDTA(pH8.0)，0.5MNa2HP04(pH7.2)，7%(w/v)SDS(Church和Gilbert,1984)中65C下至少1小時的預雜交步驟.然后將"P標記的片段(1x106cpm/ml)加入雜交溶液中并在65匸下繼續(xù)雜交16小時.濾膜在2xSSC，0.1%(w/v)SDS中65"下洗滌2xi小時，并用具有增感屏的柯達BioMaxTM膠片在-70"C下啄光48小時。將8個強烈雜交的噬菌斑挑入PSB(Sambrook等，1989)中.其中，對2個(RM6i和RM6ii)進行再篩選以分離純化的噬菌斑，其中所用的雜交條件如對cDNA文庫的起始篩逸所述.根據(jù)廠家方法提取包含于XZiplox噬菌體載體中的質粒，序列數(shù)據(jù)從cDNA插入片段的3'和5'端產(chǎn)生'比較R]M6i和RM6iicDNA插入片碌的部分序列與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的完整序列.RM6icDNA克隆與矮牽牛屬OGR-38cDNA克隆表現(xiàn)出相當高的序列相似性，且對其進行進一步的鑒定，用E￡Q_RI消化釋放包含于pCHRMl中的RM6icDNA插入片段，該片段大約為1.68kb.通過編輯來自RM6icDNA插入片段的亞克隆的序列測定包含于質粒pCHRMl中的RM6icDNA克隆的完整序列(SEQIDNO:16)。比較菊RM6icDNA插入片段的核苷酸和預期的氨基酸序列(SEQIDNO:16和SEQIDNO:17)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的序列(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2).菊RM6icDNA插入片段的序列與矮牽牛屬OGR_38F3'HcDNA克隆在1532核苷酸上顯示出68.5%的相似性，在511個氨基酸上顯示出73.6沐的相似性.在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的序列排列和核苷酸及相應氨基酸序列間序列相似性比較的各種總結分別見表7和表8，9，10,11和12.這些表見實施例34，在說明書結尾處.pLN85(反義雙元載體)的構建經(jīng)過將來自pCHRMl的RM6icDNA插入片段以"反義"方向克隆到包含于pART7(Gleave1992)中的完整CaMV35S啟動子之后來構建命名為pLN84的質粒.用NotI消化質粒pCHRMl以釋放cDNA插入片段，使用T4DNA聚合酶(Sambrook等，1989)補平RM6icDNA片段并經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳和GELase(EpicentreTechnologies)純化.純化的片段與pART7穿梭載體Smal末端連接以產(chǎn)生pLN84.隨后用NotI消化質粒pLN84以釋放含CaMV35S:RM6icDNA:ocs的表達元件，分離該表達元件的單一片段并與pART27雙元栽體(Gleave，1992)的Notl端連鋒以產(chǎn)生pLN85(固18),經(jīng)過對從鏈霉素抗性大腸桿菌轉化子分離的DNA進行限制性酶分析確認該片段的正確插入。經(jīng)過Ledger等1991所述的土壤桿菌屬介導的轉化將雙元載體pLM85導入菊植抹中以降低3'-羥基化類黃酮的量.實施例29從藍豬耳分離推斷的F3'HcDNA克隆為了分離蝴蝶草屬F3'HcDNA克隆，使用包含于pCGO1805中的矮牽牛屬HtL連鎖的F3'HcDNA克隆(OGR-38)在低度嚴格條件下篩選藍豬耳變種SummerWave花瓣cDNA文庫.藍豬耳變種SummerWave花瓣cDNA文庫的構建基本上按實施例4所述從SummerWave花制備定向花瓣cDNA文庫.篩選SummerWave花瓣cDNA文庫用DIG標記的來自pCGP1805的1.8kbOGR-38cDNA插入片段篩選總共200,000個擴增的SummerWave花瓣cDNA文庫的轉移膜.根據(jù)廠家建議使用來自Boehringer-Mannheim的DIGDNA標記和檢測試劑盒，雜交在30%(y/v)甲酰胺，5xSSC,1%(w/v)SDS中37"下進行16小時，然后將濾膜在5xSSC，1%(w/v)SDS中65X:下洗滌l小時.根據(jù)DIGDNA標記和檢測試劑盒的方法觀察該信號.將12個強烈雜交的噬菌斑挑進PSB中，并再次篩選以分離純化的噬菌斑。提取包含于XZAPII噬菌體栽體中的質粒并用EcoRI/XhoI消化以釋放DNA插入片段。一個克隆，即THT52含有最長的5'非編碼區(qū)序列，經(jīng)過編輯使用產(chǎn)生隨機重疊克隆的標準方法(Sambrook等1989)獲得的不同pUC18亞克隆的序列測定包含于質粒pTHT52中的蝴蝶草屬cDNA克隆(THT52)的完整序列.該序列(SEQIDNO:18)包含有1524個堿基的開放閱讀框架，它編碼有508個氨基酸的推斷的多肽(SEQIDNO:19),比較了蝴蝶草屬THT52cDNA克隆的核苷酸和預期的氨基酸序列(SEQIDNO:18和SEQIDNO:19)與矮牽牛屬OGR_38F3'HcDNA克隆的序列(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2).蝴蝶草屬THT52cDNA克隆與矮牽牛屬OGR-38cDNA克隆在1694個核苷酸中有63.6%的相似性，在515個氨基酸中有67.4%的相似性.在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的序列排列及核苷酸和相應氨基酸序列間序列相似性比較的各種總結分別見表7和表8，9,10,11和12.這些表見實施例34,在本說明書的結尾處.實施例30在酵母中表達的蝴蝶草屬THTcDNA克隆的F3'H測定pYTHT6的構建經(jīng)過將來自pTHT6的cDNA插入片段以"有義"方向克隆到pYE22(Tanaka等，1988)的酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子之后來構建質粒pYTHT6(圖19).質粒pTHT6含THT6cDNA克隆.THT6與THT52相同，除了其5'非編碼區(qū)少了75bp外.經(jīng)過用EcoRI/XhoI消化從質粒pTHT6釋放1.7kb的THT6cDNA插入片段.分離THT6cDNA片段，純化并與pYE22m的^鼎SalI末端連接以產(chǎn)生pYTHT6.酵母轉化，酵母抽提物的制備和F3'H測定在實施例6中描述.在G1315/pYTHT6提取物中檢測到F3'H活性，而在非轉基因酵母的提取物中檢測不到.從此可推斷包含于pYTHT6中的THT6cDNA插入片段編碼F3'H。實施例31從大花牽牛(日本牽牛花)分離推斷的F3'HcDNA克隆為了分離牽?；‵3'HcDNA克隆，使用包含于pCGP1805中的矮牽牛屬Htl連鎖的F3'HcDNA克隆(OGR-38)在低等嚴格條件下篩選曰本牽?；ɑㄞkcDNA文庫.構建曰本牽?；ɑò阠DNA文庫從Drlida(國家基礎生物學研究所，日本)獲得來自大花牽牛(日本牽?；?早期花瓣的花瓣cDNA文庫.篩選曰本牽?；ɑò阠DNA文庫用DIG標記的來自pCGP1805的1.8kbOGR-38cDNA插入片段的片段篩選總共200,000個擴增的日本牽?；ɑò阠DNA文庫的轉移膜.根據(jù)廠家建議使用來自Boehringer-Mannheim的DIGDNA標記和檢測試劑盒。雜交在30%(v/v)甲酰胺，5xSSC,1%(w/v)SDS中37"C進行16小時'然后在5xSSC，1%(w/v)SDS中65"下洗滌濾膜l小時.按DIGDNA標記和檢測試劑盒的方案觀察信號.將20個強烈雜交的噬菌斑挑進PSB中并再次篩選以分離純化的噬菌斑。提取包含于人ZAPH噬菌體栽體中的質粒并用EcoRI/XhoI消化以釋放cDNA插入片段'一個克隆(MHT85)含有1.8kb的插入片段.通過編輯使用產(chǎn)生隨機重疊克隆的標準方法(Sambrook等，1989)獲得的不同pUC18亞克隆的序列測定包含于質粒pMHT85中的日本牽?；╟DNA克隆(MHT85)的完整序列(SEQIDNO:20).MHT85序列似乎比"全長"短5個堿基。比較日本牽?；∕HT85cDNA克隆的核苷酸和預期的氨基酸序列(SEQIDNO:20和SEQIDNO:21)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的序列(SEQIDNO:1和SEQIDNO:2)。曰本牽?；∕HT85cDNA克隆與矮牽牛屬OGR-38cDNA克隆在869個核苷酸上顯示出69.6%的相似性，在515個氨基酸上顯示出74.8%的相似性。本說明書已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的序列排列及核苷酸和相應氨基酸序列間的序列相似性的比較的各種總結分別見表7和表8，9，10,11和12.這些表見實施例34，在說明書結尾處.實施例32從三花龍膽分離推斷的F3'HcDNA克隆為了分離龍膽F3'HcDNA克隆，使用包含于pCGP1805中的矮牽牛屬H1L連鎖的F3'HcDNA克隆(OGR-38)在低度嚴格條件下篩選三花龍膽Pall變種japonicaHara花瓣cDNA文庫。構建龍膽花瓣cDNA文庫按Tanaka等，1996所述從三花龍膽Pall變種japonicaHara花制備花瓣cDNA文庫.龍膽花瓣cDNA文庫的篩選用DIG標記的來自pCGP1805的1.8kbOGR-38cDNA插入片段的片段篩選總共200,000個擴增的龍膽花瓣cDNA文庫的轉移膜.根據(jù)廠家建議使用來自Boehringer-Mannheim的DIGDNA標記和檢測試劑盒。雜交在30%(v/v)甲酰胺，5xSSC,1%(w/v)SDS中37下進行16小時。然后在5xSSC,1%(w/v)SDS中65"C下洗滌濾膜1小時，按DIGDNA標記和檢測試劑盒的方案觀察信號.將15個強烈雜交的噬菌體挑入PSB中并再次篩選以分離純化的噬菌斑.提取包含于XZAPII噬菌體栽體中的質粒并用EcoRI^KMI消化以釋放cDNA插入片段。一個克隆(GHT13)含有1.8kb的插入片段.經(jīng)過編輯使用產(chǎn)生隨機重疊克隆的標準方法(Sambrook等，1989)獲得的不同pUC18亞克隆的序列測定包含于質粒pGHT13中的部分龍膽cDNA克隆(GHT13)的序列(SEQIDNO:22).比較龍膽GHT13cDNA克隆的核苷酸和預期的氨基酸序列(SEQIDNO:22和SEQIDNO:23)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的序列.龍膽GHT13cDNA克隆與矮牽牛屬OGR-38cDNA克隆在1519個核苷酸中有68.3%的相似性，在475個氨基酸中有71.8%的相似性。在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰菊和蝴蝶草屬序列的序列排列及核苷酸和相應氨基酸序列間的序列相似性比較的各種總結分別見表7和表8，9,10，11和12.這些表見實施例34，在說明書結尾處.實施例33從Lisianthus分離推斷的F3'HcDNA克隆為了分離LisianthusF3'HcDNA克隆，使用包含于pCGP1805中的矮牽牛屬HtL連鎖的F3'HcDNA克隆(OGR-38)在低度嚴格條件下篩選Lisianthus花瓣cDNA文庫.構建和篩選Lisianthus花瓣cDNA文庫將Davies等(1993)和Markham和Offman(1993)所述的10，000pfusLisianthus花瓣cDNA文庫在轉染Y1090r-后以每15cm平板3，000pfu的密度涂布到LB平板(Sambrook等，1989)上，在37T3下培養(yǎng)16小時.在4"C放置1小時后，取二份轉移到HybondN+TM濾膜(Amersham)上并接廠家建議進行處理.用3、標記的來自pCGP1805的1.8kbA^718/fiamHI插入片段篩選來自Lisianthus品系#54花瓣cDNA文庫的二份轉移膜.雜交雜件包括在lmMEDTA(pH8.0)，0.5MNa2HP04(pH7.2)，7%(w/v)SDS(Church和Gilbert,1984)中55匸下至少1小時的預雜交步驟'然后向雜交溶液中加入"p標記的片段(1x106cpm/ml),雜交在55匸下繼續(xù)16小時。濾膜在2xSSC,0.1%(w/v)SDS中55"下洗滌2x15分鐘，并用具有增感屏的柯達BioMaxTM膠片在-70C下曝光18小時。將12個強烈雜交的噬菌斑挑進PSB(Sambrook等，1989)中并使用對cDNA文庫起始篩選所述的雜交條件再次篩選以分離純化的噬菌斑.序列數(shù)據(jù)從四個克隆的cDNA插入片段的3'和5'端產(chǎn)生.根據(jù)序列比較，pL3-6與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆顯示出相似性且對其進行進一步的鑒定。隨后發(fā)現(xiàn)包含于pL3-6中的2.2kbcDNA插入片段含有3個截短的cDNA克隆，最長的一個(L3-6)與矮牽牛屬OGR-38cDNA序列具有高度序列相似性.經(jīng)過編輯L3-6cDNA插入片段(SEQIDNO:24)的亞克隆序列測定包含于質粒pL3_6中的該L3-6部分cDNA克隆的序列。比較了LisianthusL3-6cDNA克隆的核脊酸和預期的氨基酸序列(SEQIDNO:24和SEQIDNO:25)與矮牽牛屬OGR-38F3'HcDNA克隆的序列在1087個核苷酸中有71.4%的相似性，在362個氨基酸中有74.6%的相似性。在本說明書中已公開的矮牽牛屬，石竹屬，金魚草屬，擬南芥屬，玫瑰，菊和蝴蝶草屬序列的序列排列及核香酸和相應氨基酸序列間的序列相似性比較的各種總結分別見表7和表8，9,10,11和12。這些表見實施例34，在說明書結尾處。對從Lisianthus文庫的篩選分離的剩余克隆的進一步研究鑒定了另一個推斷的F3'HcDNA克隆(L3-10)，它包含于質粒pL3-10中.L3-10cDNA插入片段大約1.8kb長且似乎代表"全長"克隆。實施例34本文公開的核苷酸和氨基酸序列間的序列排列和對比使用實施例3所述的ClustalW程序進行多序列排列.表7(下面)提供了矮牽牛屬OGR-38(A);石竹屬(B);金魚草屬(C);擬南芥屬Tt7編碼區(qū)(D);玫瑰(E),菊(F);蝴蝶草屬(G);牽牛花(H);龍膽(部分序列)(I);Lisianthus(部分序列)(J)和矮牽牛屬651cDNA(K)的預期的氨基酸序列的多序列排列.保守的氨基酸以黑體大寫字母和方框及陰影表示.相似氨基酸以大寫字母表示且僅有輕微的陰影.不相似的氨基酸以小寫字母表示.使用實施例3所示的LFATA程序比較來自上述種類的F3'HcDNA克隆的核苷酸和氨基酸序列和來自擬南芥屬基因組克隆的編碼區(qū).相似性比較的總結在下文表8中至12中提供.表7<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>■ii~PL^Jy「LKMGFVDVVVA■■￡>Iil[^JmrLGyVDVV:VA'P丄IU丄KMGFV0VVVAilh..LRIiGFVDVVVA■P.IiMH'LRIiGYVDVVVAP.LMHIirLG0VD'VVVAhMBLKMGFV0VVyA■PIiMBLRLG國FV.DVVVAPI<MH!k|T|<3|1klD口V'VAMN.LKIiG|q|T]ntjvv|A/AsASVA0PIiKtHDAWFSsRPPNSGMAB(57AsASVAtI<KtssRPPNSgAKHIACs￡tAisVAIiKVHDAMfPsRPPsGAKHVADAS0SVA6XiKiHDAWAsPNsGAKHMAEAsASvA!>KtHDANSsRPPNsgAKHAF7yAsVs￡1IKVHDANPAsRsGAKHVAGSsASBA00XirvHDAWPPNsGAKHVAH78sAAVA3KvHDSNPSPNsGIAISsAsvA0PIiKkFsn卜PNsGAKHAI乂0v回vKiss小|kIqp|i|tPs1nfvPdvrn22/22/2"22242"72/-sfk0yp丄PIiPPOf>KPWPIIggrghqPIiPPCSPkPWPIVGIiPHMG11ysf1vkP1>pp力PKPWPIVgLPHLGfshrni:shnni:PPGWPIILPHMGfsqi:hs1PIPPGI>KPWPVVGIjPHI;Gn一—一sks:rIP3C!#WPIVCSNXiPHIiG11fsg-—r1IiPSGPRPlVG工__vq旦yp1P1*，KFVga:lglpIGIPH1*0IJV乙i」LL>gIIitfr1fr1fto-irv1fa-i1if>-sv-丄yF"FFn^Y"Ff>-t1SIcv3d>13ihVa1io-vVM.a丄frb*411tlrt1siiytctV￡sIIvVI0gdd3miyyhmpydmABCDEFGH1JKtkko-o-RjtIKKRls一KAAAA0A0A口MTaITlMIlaco"G"RHHf20"Q0*〕V3U.0*卜，.is*VI!ilo*pqptti一KKKABCDEFGHIJKABCDEFGHIJK<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage81</image><image>imageseeoriginaldocumentpage82</image><formula>formulaseeoriginaldocumentpage83</formula>表8矮牽牛屬OGR-38的F3'H序列與來自其它種類的F3'H序列及其它P450分子的序列相似性的百分數(shù)種類/克隆核芬酸數(shù)目氨基酸數(shù)目與OGR-38的與OGR-38的(nt)(aa)相似性％/核普相似性!W氨基酸數(shù)(相似區(qū)域)酸數(shù)(相似區(qū)域)矮牽牛屬1789nt512aaOGR-38金魚草屬1711nt512aa69.0%/1573nt72.2%/507aaF3'HcDNA(19-1578>(1-504)擬南齊屬971nt64.70/0/745nt63.7%/248aa部分F3'HcDNA(854-1583)(269-510)擬南芥屬Tt71774nt513aa65.40/0/1066nt67.1%/511aa編碼區(qū)石竹屬1745nt496aa67.3%/1555nt71.5%/488aaF3'HcDNA(28-157"(17-503)玫瑰1748nt513aa64.7%/1651nt72.7%/509aaF3'HcDNA(56-1699)(7-510)龍膽1667nt476aa68.3%/1519nt71.80/0/475aa部分F3'HcDNA(170-1673)(40-510)牽?；?824nt517aa63.6%/869nt74.8/515aaF3'HcDNA(60-1000)(3-510)菊1660nt508aa68.5%/1532nt73.6%/511aaF3'HcDNA(50-1580)(1-510)LJsianthus1214nt363aa71.4%/1087nt74.6%/362aa部分F3'HcDNA(520-15卯)(160-510)<table>tableseeoriginaldocumentpage85</column></row><table>表9金魚草屬F3'H序列與其它種類的F3'H序列及其它P450分子間序列相似性百分數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>表IO擬南芥屬F3'H序列與其它種類的F3'H序列及齊它P450分子間的序列相似性百分數(shù)種類/克隆核苷酸數(shù)氨基酸數(shù)與擬南芥屬相似與擬南芥屬相似乂nt)(aa)性、/核苷酸k性％/氨基酸數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage87</column></row><table>87<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table>表12擬南芥屬tt7基因組序列的編碼區(qū)與其它種類的F3'HcDNA序列及其它P450分子間的序列相似性百分數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage89</column></row><table>本領域的技術人員將會預料到本文描述的本發(fā)明可容許在具體描述的內容外做出一些變化和修改.應理解本發(fā)明也包括所有這些變化和修改.本發(fā)明還包括在本說明書中單獨或集中提及的或表示的所有步驟、特征，組合物和化合物和任意2個或多個所說的步樣或特征的任意和全部組合。參考文獻Altschul，S.F.，Gish，W.，Miller.W.，Myers,E.W.和Lipman，D丄分子生物學雜志215:403-410，1990.AshikaH，T.，Kiuchi-Goto，N.，Tanaka,Y.，Shibano，Amachi，T.，和Yoshizumi，H.應用微生物學生物技術30:515-520，1989.Baird，W.V.和Meagher,R.B.五MB0/6，3223-3231，1987.Bechtold，N.，Ellis，J.和Pelletier，G.C.R.Acad.Sci.Paris,科學delavie316:1194-1199，1993。Bethesda研究實驗室.BRLpUC宿主大腸桿菌DH5aTM感受態(tài)細胞BethesdaRes.Lab.Focus.8(2):9，1986.Brugliera，F(xiàn).，Holton，T.A.，Stevenson,T.W.，F(xiàn)arcy,E.，Lu，C-Y和Cornish,E.C.植物雜志5(1):81-92，1994Church,G.M.和Gilbert,W.jPA^S181:1991-1995.Chomczynski，P.和Sacchi，N.生化年筌162:156-159.Comai，L"Moran，P.和Maslyar，D"植物分子生物學15:373-381，1990.Corrni，A"Farcy,E，，Maizonnier，D"Haring，M"Veerman，W.和Gerats，A.G.M.，在遣傳學圖譜-復合基因組的基因座圖諳.第5版，Stephen丄O'Brien(ed.)，冷泉港實驗室出版社，美國，1990.Davies等，植物科學，95:67-77.1993.D'A，essio等，焦點，14:76-79，1992DeGreve，H.，加aese，P.，Seurinck^J.，Lemmers，M.，VanMontagu,M和Schell.丄分子應用遺傳學。1:499-511.Dellaporta，S丄，Wood,J.和Hic、J.B.，植物分子生物學報道，1:19-21，1983.DelSal,G.，Manfioletti，G.和Schneider,C.生物技術.7(5):514-519，1989.Doodeman，M.，Gerats，A.G.M.，Schram，A.W.，DeVlaming，P.和Bianchi，F(xiàn).，理論和應用遺傳學-67:357-366,1984*Dooner,H.K.，Robbins，T,R.和Jorgensen，R.A.遺傳學年鑒.25:173-199，1991.Ebel，J.andHahlbrock，K.，于類黃嗣1980以來的研究進展。Harbourne，J.B"(ed.)，學術出版社，NewYorkUSA，641-679，1988.Forkma叫G.andStotz，G.Z,胸《,/肌生36c:411-416，1981.Forkmann，G.植物培育106:1-26，1991.Franck^A.，Guilley，H.，Jonard，G.Richards,K和Hirth，L.細胞，21，285-294，1980.Frohman，M.A.，Dush，M.K.，Martin,G.R.美國國家科學院院報.85:8998-卯02，1988.Gamborg，O.L.，Miller,R.A.和Ojima，K.，細胞研究實驗50:151-158，1968.Garfinkel，D.J.，和Nester，E.W.細菌學雜志.144:732-743，1980.Gleave，A.P.植物分子生物學20:1203-1207，1992.Guilley，H.，Dudley,R.K,，Jonard，G.，Balazs，E.和Richards,K.E.細胞，30，763-773，1982.Hahlbrock，K.和Grisebach，H.，植物生理學年鲞.30:105-130，1979.Hanahan，D.，分子生物學雜志，166:557，1983.Haughn，G.W.和Somerville，C.分子和普通遺傳學204:430-434,1986.Holton，T.A"Brugliera，F(xiàn).Lester，D.R，Tanaka,Y.,Hyland，C.D.，Menting，J.G.T.，Lu，C.，F(xiàn)arcy,E.，Stevenson,T.W,和Comish,E,C.，自然，366，276-279，1993.Holton，T.A.和Cornish，E.C.植物細胞，7:1071-1083，1995.Inoue，H.，Nojima，H.andOkayama,H.基因，96:23-28，1990.Ito.H.，F(xiàn)ukuda，Y.，Murata，K.和Kimura，A.細菌學雜志153:163-168，1983.Jefferson,R.A.植物分子生物學報道.5:387-405,1987.Jefferson，R.A"Kavanagh，T.A"和Bevan，M.W.五MjB(丄6:3901-3907，1987Koornneef，M，Luiten，W.，deVlaming，P.和Schram.A.W./4ra6Wo/wi5//f/or/wfl^/o/t5W"v/ce19:113-115，1982.Kozak，M.細胞生物學雜志.108:229,1989.Lander,E.S.,Green,P.，Abrahamson，J.，Barlow，A.，Day，M.J.，Lincoln.S.E.和Newberg,L,基因組，121，185-199，1987.Lazo，G.R.，Pascal,A.S.和Ludwig，R.A.，生物/技術，9:963-967，1991.Ledger,S.E.，Delores，S.C.和Given,N.K.植物細胞報道，10:195-199，1991.Liang，P.和Pardee,A.B.科學，257:967-971，1992Liang,P.，Averboukh，L.和Pardee,A.B.核酸研究，21:3269-3275，1993MarchukD.,Drumm，M.，Saulino，A.,Collins,F.S.核酸研究.19:1154，19卯Markham，K.R.，類黃胡鑒定技術.倫敦學術出版社，1982.Markham，K.R和Offman，D.J.植物化學"34:679-685.Martin,C.和Gerats，T.在開花的分子生物學.(Jordan,B.R.ed)，UK,CABInternational,219-255，1993.McLean,M.，Gerats，A.G.M.,Baird，W.V.andMeagher,R.B.遺傳雜志81:341-346，1990.Merrifield，美國化學協(xié)會雜志，85:2149，1964.Mizutani，M.，Ward,E.，DiMaio，J.，Ohta，D.,Ryals，J.和Sato,R.脅cAe饑Co附附"".190:875-880，1993.Murashige，T.和Skoog，F(xiàn).，植物生理學，15:73-97，1962.Newman,T.，deBruijn，F(xiàn).J.，Green，P.，Keegstra，K.，Kende，H.，Mcintosh,L.，Ohlrogge，J.，Raikhel，N.，Somerville,S.，Thomashow,M.植物生理學.106:1241-1255，1994.Pearson,W.R.和Lipman，D.J"美國國家科學院院報85:2444-2448，1988.SambrookjJ，，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.分子克隆實驗室手冊(第二版)，冷泉港實驗室出版社，美國，1989.Schen、R.U.和Hilderbrandt,A.C.，Can.J.Bot.50:199-204，1972.Schram，A.W.，Jonsson，L.M.V.和Bennin、G.J.H,，矮牽牛雜種中的類黃飼合成的生物化學，In:矮牽牛庫，K.C.(ed.)，Springer-Verlag，Berlin,Germany,pp68-75，1984,Stafford,H.A.，類黃積代謝.CRC出版社，Inc.BocaRaton，F(xiàn)lorida,USA,19卯.Stota，G.和Forkmann，G.Z,A^"r/<rscA37c:19-23，1982.TabakA.J.H.，Meyer，H.和Bennink^G.J.H.，植物139，67-71，1978.Tannaka，Y.，Ashikari，T.，Shibano，Y.，Amachi，T.,Toshizumi，H，和Matsubara，H.J.生化雜志.103:954-961,1988.Tanaka，Y.，Yonekura，K.，F(xiàn)ukuchi-Mizutani，M.,Fukui，Y.，F(xiàn)ujiwara，H.，Ashikari,T.和Kusumi，T.植物細胞生理學，37(5):711-716，1996.Turpen，T.H.和Griffith,O.M.生物技術，4:11-15，1986.vanTunenA.J"和MolJ.N.M.在植物生物技術(Grierson，D.ed.)Glasgow:Blackie，2:9-31，1990.Wiering，H.和deVlaming，P.，色素的遺傳和生物化學.In:PetuniaSink，K.C(ed.)，Springer-Verlag，Berlin,Germany,pp49-65，1984*Wallroth，M"Gerats，A.G.M"Rogers,S.G"Fraley，R.T.和Horsch，R.B.，分子普通遺傳學.202:6-15，l訴6，序列表(1)基本信息(i)申請人:(除美國外)Florigenelimited(僅在美國)FiHppaBRUGLIERA，TimothyAlbertHolton，MichaelZe國MICHAEL(ii)發(fā)明名稱編碼類黃酮途徑酶的基因序列及其用途，(iii)序列數(shù)目40(iv)聯(lián)系地址(A)聯(lián)系人DaviesCollisonCave(B)街名1littlecoUinsstreet(C)城市MelBourne(D)州名Victoria(E)國家澳大利亞(F)郵政編碼(Zip):3000(v)計算機可讀形式(A)介質類型Floppy軟盤(B)計算機IBMPC兼容機(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentlnRelease#1.0，Version#1.25.(vi)目前申請資料(A)申請?zhí)?B)申請日1997年2月28日(C)分類在先申請資料(A)申請?zhí)朠N8386(B)申請日1997年2月28曰(C)分類(viii)律師/代理人信息(A)姓名Hughes,DrE.JohnL.(C)參考/摘要號EJH/AF.(ix)電信信息(A)電話+61392542777(B)傳真+61392542770(C)電報AA31787(2)關于SEQIDNO:1的信息(i)序列特征(ix)(A)長度:(B)類型:(C)鏈型:1789個堿基對:核酸::單鏈(D)拓樸結構線型分子類型DNA特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置50..1586序列描述SEQIDNO:1GCAGGAATTGGTGAACCCCATAGAAGTAAAATACTCCTATCTTTATTTCATGGAAMetGluS5ATCTTAAGCCTAATTCTGTACACCGTCATTTTClie"uSerLulieLeuTyrThrValliePhe510TCATTTCTTCTACAASerPheLeu乙euGinIS103TTCATTCTTAGATCATTTTTCCGTAAACGTTACPhelieLeuArgSerPhePheArgLysArgTyr202SCCTTTACCATTACCAProl*euProLeuPro301S1CCA'GGTCCAAAACCATGGCCAATTATAGGAAACProGlyProLysProTrpProlielieGlyAsn354045CTAGTCCATCTTGGALeuValHisLeuGlySO199CCCAAACCACATCAATCAACTGCAGCCATGGCTCAAACTTATGGACCAProLysProHisGinSerThrAlaAlaMetA二aGinThrTyrGlyPro55SO"247CTCATGTATCTTAAGATGGGGTTCGTAGACGTGGTGGTTGCAGCCTCGLeuMetTyr"uI^sMetGlyPheValAspValValValAlaAlaSer707S80295GCATCGGTTGCAGCTCAGTTCTTGAAAACTCATGATGCTAATTTCTCGAlaSer*ValAlaAlaGinPhLuLysThrHisAspAlaAsnPheSer8S90343AGCCGTCCACCAAATSerArgProProAsn100TCTGGTGCAGAACATATGGCTTATAATTATCAGSerGlyAlaGluHisMetAlaTyrAnTyrGin105110391GATCTTAspLju11SGTTValTTTGCAAlaCCTPro120TATTyrGlyCCTProArgTGGTrp12SCGTATGMetCTTLeuAAALys130435ATTlieTGCTCAGTTVlCACHis135CTTTTCTCTACCThrAAG140GCTAlaTTALeuGATAspGACA印TTCPhe14SCGC487CATHisGTCValCGCCAGGin150GATAspGAAGluGTGValAAAACAThr3LSSCTGLeuThrCGCGCAAlaCTAlieu160GCAAlaSerS35GCAAlaGGCGlyCAAGin1S5AAGCCAProGTCValAAATTA170GGTGlyCAGGinTTAL*euTTGLeuAACA抑175ValTGCACGThr583ACGThrAAC180GCAAlaCTC乙euGCGAlaCGAGTAValATGMetCTALeuGGTGlyAAGCGAArg190GTAValTTTPheGCCAlaGACAsp631Gly195ACTSerGGCGlyGATAspGTTValGATAsp200CCAProCAAGinGCGGCGAlaGAG205TTCPheAAGTCASex*ATGMetGTGVal210S79GTGGAAATGATGGTAGTCGCCTCTGTTTTTAACATTGGTGATTTTATT727V"GluMetMetValValAlaGlyValPheAsnlieGlyAspPhelie21S220CCGCAACTTAATTGGTTAGATATTCAAGGTGTAGCCGCTAAAATGAAC775ProGinLeuAsnTrpAsplieGinGlyValAlaAlaLysMetLys230235240AA(5CTCCACGCGCGTTTCGACGCGTTCTTGACTGATATACTTGAAGAG323LysI^uHisAlaArgPheAspAlaPheLeuThz*AsplieLeuGluGlu2452S025SCATAAGGGTAAAATTTTTGGAGAAATGAAAGATTTGTTGAGTACTTTG871HisL>y0GlyLysliePheGlyGluMetLysAspLeuLeuSerThrLeu2S0265270ATCTCTCTTAAAAATGATGATGCGGATAATGATGGAGGGAAACTCACT919II*SerLeuLysAsnAspAspAlaAspAfinAapGlyGlyLysLeuThr27S2802SS290GATACAGAAATTAAAGCATTACTTTTGAACTTGTTTCTAGCTGGAACA9€7AspThrGlulieLyaAlaLuLou]>uAanIjcuPheVlAlGlyThr235300305GACACATCTTCTAGTACAGTTGAATGGGCCATTGCTGAGCTTATTCGT1015AspThrSx>SerSetThx*ValGluTrpAlaIlaAlaGluLuIl310315320AATCCAAAAATACTAGCCCAAGCCCAGCAAGAGATCGACAAAGTCCTT10S3AsnProLyslieLeuAlaGinMaGinGinGlulieAspLysValVal325330335GGAAGGGACCGGCTAGTTGGCGAATTGGACCTAGCCCAATTGACATAC11UGlyAfgAapArgLeuValGlyGluLeuAspLeuAlaGinLeuThrTyr340345350TTGGAAGCTATAGTCAAGGAAACCTTTCGGCTTCATCCATCAACCCCT1159LeuGluAlalieValLyaGluThrPhArgLuHiaProSsrThrPro<formula>formulaseeoriginaldocumentpage102</formula>GAGCAGCAACAGCCCATGGAGATAACATGAGTGTTAAATGTATGAGTCTCCATATCTTGT1646TTAGTTTGTTTATGCTTTGGATTTAGTAGTTTTTATATTGATAGATCAATGTTTGCATTG170STCAGTAAGAATATCCGTTGCTTGTTTCATTAACTCCAGGTGGACAATAAAAGAAGTAATT1766TGTATGAAAAAAAAAAAAAAAAA"89(2)關于SEQIDNO:2的信息(i)序列特征(A)長度512個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(ix)序列描述SEQD)NO:2GlulieLeuSerI/eulieLeuTyrThrV"liePhoSerPhLeuiS10ISLeuGinPhelieArgSrPhePheArgLysArgTyrProPro202S30LeuProProGlyProLysProTrpProlielieGlyAsnLeuValHis3S4045丄euGlyProLyaProHisGinSerThrAlaAlaMetAlaGinThrTyr505SSOGlyProLeuMetTyr"uLysMetGlyPheValAspValValV"Ala65707580AlaSerAlaSerValAlaAlaGinPheLuLysThrHisAspAlaAsn85909SPheSerSerArgProProA抑Set"GlyAla<31uHieMetAlaTyrAan100105110TyrGinAspLeuValPhAlaProTyrGlyProArgTrpArgMetLuUS120125ArgLyslieCysSerValHieLuPhaSerThrLysAla乙佳uAspAsp13013S"0PheArgHieValArgGinApGluValLysThrLeuThrArgAlaLeu"SISO155"0AlaSerAlaGlyGinLyaProValLysLuGlyGinL*auLeuAsnVal1€5170175CyeThrThrAanAlaLouAlaArgValMetGlyLysArgValPhe1B0IBS190MaAspGlyserGlyAspValAspPro(UziAlaAlaGluPheLysSer19520020SMetValValGluMtMetValValAlaGlyValPhAsnIUGlyAop210215220PhelieProGinLeuAsnTrpLeuAsplieGinGlyVlAlaAlaLye22523023S240MetLysLys3LeuHisAlaArgPheAspAlaPheLeuThrA白plieLeu2452502SSGluGluHisLysGlyLysliePhGlyGluMetlysAapLeul^uSr2S02€S270ThrI>eulieSerLeuLysAsnAspAspAlaAspAsnAspGlyGlyLys2752802S5LeuThrAspThrGluIlLysAlaLeuLuLeuA0nIiuPheValAla290300GlyThrAspThrSerSrSerThrValGluTrpAlalieAlaGluLeu305310315320lieArgAsnProLyslieXiuAlaGinAlaGinGinGlulieAspI/y032S33033SValValGlyArgAspArgL^uValGlyGluIi<mAspAlaGinLeu34034S350ThrTyrI*euGluAlalieValLyeGluThrPheArgljeuHisProSer3S53€03"ThrProLeuSerLeuProArglieAlaSerGluSrCyeGlulieAsn37037S380GlyTyrPhelieProLyeGlySerThrLeuAsnValTrpA"38533039S400lieAlaArgAspProAsnAlaTrpAlaAspProLeuGluPheArgPro405410415GluArgPhoI^uProGlyGlyGluLy0ProLyaValAspValArgGly42042S430AsnAspPheGluVallieProPheGlyAlaGlyArgArglieCysAla440"SGlyMetAsnLeuGlylieArgMetValGinL<euMetlieAlaThr4S045S"0lieHisAlaPheAsnTrpAspLeuV"SerGlyGinLeuProGluMet4€S470475480LeuAsnMetGluGluAlaTyrGlyIiuThrLeuGinArgAlaA0pPro485"0495LeuValValH"ProArgProArg1#糾GluAlaGinAlaTyrlieGly50050S510(2)關于SEQIDNO:3的信息(i)序列特征(A)長度1745個堿基對(B)類型核酸(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O:16的信息(i)序列特征(A)長度1660個氨基酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置4..1528(xi)序列描述SEQIDNO:16AAAATGACCATTTTAGCTTTCGTATTTTACGCCCTCATCCTCGGGTCA4BMetThrlieLeuAlaPhaValPheTyrAlaLulieLeuGlySer1510ISGTACTCTATGTATTTCTTAACTTAAGTTCACGTAAATCCGCCAGACTC96ValLuTyrValPheI^uAsnLeuSerSerArgLyflAlaArgLu202S30CCACCCGGGCCAACACCATGGCCTATAGTC<3GGAACTTACCACACCTTProProGlyProThrProTrpPro35lieValGlyAsn1的40ProHisLeu4S144GGCCCAGlyProATClie50CCAPr。CACHisCACHiflGCAAlaCTClieu55GCGAlaGCCAlaTTALeuGCCAlaAAGLys60AAGTyrGGGGly192CCATTGProLeuMetCACHisCTGCGGCTC70GGGTGTValA8p7SGTTGTGValGCCAlaGCGAla240TCTGCTSorAla80TCCSerValGCTAlaGCAAla85CAGGinTTTPhTTAIi的AAALyeGTTVal$0CACHieGACAspGCAAATTTTPhe288GCTAGTAlaSerAGGArgCCGProCCAPro100AATTCTGGCGlyGCQAlaAAA105CATHisGTGValGCGTATTyrAATAsn110TATTyr33SCAGGATGinAspCTTGTGVal115TTTPhGCACCTProTATTyrGOTGly120CCAProAGGArgTGGTrpCGTTT<3Lu125TTALeuAGGArg384AAGATTI*yslieTGTCys130TC<3GTCValCATHisTTGTTT135TCTGCTAlaAAALyaGCAAlaCTTleu140GATAspGATAspTTT432CGTCATArgHie145GTTValCGAArgCAGGinGAGGluGAGGlu150ValGCAAlaGTCCTAXj的ACCThr15SCGCArgGTAValCTAlieuCTG480ACTGCTGGAAACTCACCGGTACAGCTTGGCCAACTACTTAACGTGTGTSftrAlaGlyAenSorProValGinLouGlyGinLouLeuAsnValCys5281501SS170175GCCACAAACGCCTTAGCACGGGTAATCTTAGCTACGMAGTTTTCGGA576AlaThrAsnAlaAlaArgValMetLeuGly*ArgArgVaIPhGly18018S130GACOGAATTGACAGGTCAGCCAATGAGTTCAAAGATATGGTAGTAGAG"4AspGlyIlAspArgMaAsnGluPheLysAepMetValValGlu1S520020STTAATGGTATTAGCAGGAGAATTTAACCTTGCTGACTTTATTCCTGTA672LuMetValLeuAlaGlyGluPhAsnLeuGlyiVspPheIlProVal210215220CTTGACCTATTCGACCTACAAGGCATTACTAAAAAAATGAAGAAGCTT720LuAspLeuPheAspLeuGinGlylieThr*LysLysMetLysLysXiou22523023SCATCTTCGGTTCGATTCATTTCTTACTAAGATCGTTGAGGAGCATAAA76BHisValArgPheAspSex*PheLeuSerLyoIlaVlGluGluHiaLys2402"2S025SACGGCACCTGGTGOGTTGGGTCATACTGATTTGCTQAGCACGTTGATT8ISThrAlaProGlyGlyLeuGlyHisThrAspLeuLeuSerThrLeulie2S02，5270TCACTTAAAGATGATOCTGATATTGAAGGTGGOAAGCTTACAGATACT8€4SerLeuLysAspAspAlaAsplieGluGlyGlyLysleuThrAspThz*275280GAAATCAAAGCTTTCCTTCTGAATTTATTCGCTGCGGGAACAGACACA312GlulieLyeAlaLeuLuIeuAsnLeuPheAlaAlaGlyThr*AspThr230295300TCCTCTAGTACAGTAGAATGGGCAATAGCCGAACTCATTCGTCMCCA360S*zrSerSerThrValGluTrpAlalieAlaGluLeulieArgHisPro305310315CAAATATTAAAACAAGCCCGAGAAGAGATAGACGCTGTAGTTGGTCAA1008GinIlLeuLy9GinAlaArgGluGlulieAspAlaValValGlyGin32032533033SGACCGGCTTCTAACAGAATTGGACTTGAGCCAACTAACATACCTCCAG10SSAspArgL*euValThi:GluAepLauSerGinLeuThrTyrLeuGin340345350GCTCTTGTGAAAGAGGTGTTTAGGCTCCACCCTTCAACGCCACTCTCC1104AlaLeuV"LyBGluVlPheArIeuHiaProSrThrPx*oLeuSer3SS3S03SSTTACCAAGAATATCATCCGAGACTTGTGAGGTCGATGGGTATTATATCUS2LeuProArglieSerSerGluSerCyaGluV復lAspGlyTyrTyrlie37037S380CCTAAGGGATCCACACTCCTCGTTAACGT<3TGGGCCATTGCGCGA<3AC1200ProLysGlySerThrLuLouVlAenValTrpAlalieAlaArgAsp38S390395CCAAAAATGTGOGCGGATCCTCTTGAATTTAGGCCTTCTCGGTTTTTA1248ProLysMetTrpAlaAapProGluPhProSerArgPheL糾40040S410415CCCGGGGGAGAAAAGCCCGGTGCTGATGTTAGGGGAAATGATTTTGAA工23€Ps:oGlyGlyGluLysProGlyAlaAspValArgGlyAsnAspPheGlu420430GTTATACCATTTGGGGCAGGACGAAGGATTTGTGCGGGTATGAGCCTA13"VallieProPhGlyAlaGlyArgArglieCyaAlaGlyMetSerLeu43S44044SGGCTTGAGAATGGTCCAGTTGCTCATTGCAACATTGGTCCAAACTTTT1392(5lyLeuArgM"ValGinLulieAlaThrLeuValGinThrPh"0"5"0GATTGGGAAC7GGCTAACGGGTTAGAGCCGGAGATGCTCAACATGGAA1440AspTrpGluLeuAlaAsnGlyI#auGluProGluMetLouAsnMetGlu47047SGAAGCGTATGGATTGACCCTTCAACGGGCTGCACCCTTGATGGTTCAC1483GluAlaTyrGlyLuThrGinArgAlaAlaProMetValHis4d0485490495CCGAAGCCGAGGTTAGCTCCCCACGTATATGAAAGTATTTAAGGACTAGT1S38ProLysProArgLeuAlaProHisValTyrGluSec*lie500S05TTCTCTTTTGCCTTTTTGTTTCGCAAAGGTTAATCAATAAACGATTTCATGACTCAGATAIS98GTTATCTAAACAATTGTGTTTGCTGTTTATATATTTATCTATTTTTCTAGAACAAAAAAA1658(2)關于SEQIDNO:17的信息(i)序列特征(A)長度508個氨基酸(B)類型氨基酸(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描迷SEQIDNO:17MtThrlieLeuAlaPhValPhoTyrAlaLeulieLeuGlySerValIS1015LeuTyrValPhaLeuAsnLeuSe.rSerArgLysSerAlaArgLeuPro202530ProGlyProThrProTrpProlieValGlyAsnLeuProHisLeuGly354045ProlieProHisHieAlaLeuAlaAlaLeuMaLyeLyeTyrGlyPro505S60I^uKtHisLeuArgGlyCysValAspVaIV"V"Al*Ser65707580AlaSerValAlaAlGinPhoIiuLysVlHisAspAla盡snPheAla85909SSerArgProProAsnSetGlyAlaLy0HisValMaTyrAnTyrGin10010S110AspValPheAlaProTyrGlyProArgTrpArgLeuLeuArgLy曰-11512012SlieCysSrValHisLeuPheSerAlaLyeAl豕LeuAspAspPhArg130135140HisValArgGinGluGluValAlaValLeuThrArgValLuLeuSer"5150160AlaGlyAsnSerProValGinLeuGlyGinLeuLeuAsnValCysAla"S170175ThrAsnAlaL抑AlaArgValMetLeuGlyArgArgValPheGlyAsp"0190GlylieAspArgSrAlaAenGluPheLysA印MetValValGluLeu195200205MetValL>euAlaGlyGluPheAsnleuGlyAspPhelieProVallieu21021S220AepLeuPheAspLeuGinGlylieThx*LysLyeMetLysLyaHis22S230235240ValArgPheA0pSrPhoLeuSerLyslieValGluGluHisLyaThr2"2S0255AlaProGlyGlyLeuGlyHisThrAspLeuLeuSerThrLeulieSer2S02"270LuLysAspAspAlaAaplieGluGlyGlyLysLeuThrAspThrGlu275280IloLysAlalieuIiuAatiLeuPheAlaAlaGlyThr*AspThrSer29029S300SerSex*ThrValGluTrpAlalieAlaGluLeulieArgHieProGin30531031S320IlLeuLysGinAlaAsrgGluGlulieAspAlValV"GlyGinAsp325330335ArgLeuValThrGluLeuAspLeuSerGinLeuThrTyrLeuGinAl34034S3S0LeuValLyeGluValPheArgLeuHisProSerThrProLouSerLeu3SS360365ProArglieSerSerGluSet1CysGluValAspGlyTyrTyrliePro37037S380LysGlySerThrLeuLeuValAsnValTrpAlaIlAlaArgAspPro3BS39039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34034S350LysProArgI>euAlaSrS>rMtTyrVlLys3S53S0(2)關于SEQIDNO:26的信息(i)序列特征(A)長度1757個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(ix)特征(A)名稱/鍵CDS(B)位置35..1522(xi)序列描述SEQIDNO:26CCCTTGCTCTCGAGAAAACAGAAAGAAGAGAAAAATGGACTACCTGAATATTMetAspTyrValAsnlie15ATGMetS2TTGCTGGGACTGTTTLeuLeuGlylieuPh10TTCACTTGGTTCTrpPheISTTGGT<3ValAATAanGGAGlyCTTCGALeuArgTTGCCTLeuPro40TCACTTSerLeu55TTAGGCLeuGlyGAAOTCGluValGACGTAAspVaI2SATClieGCTAhCAAGillCCAGTCProVal120ArgATClieTTGI/6uGTCVilAATAsnAAAGGAGlyCAAGinCTALeuCAAGinCATHieCTTAAC7SAMLy0GTCValTCTATCII，AATAenCGAArgGCAAlaSOACAThrCAAGinCGAArgTGGTrpTCTCTTLeu45AAAGTGGACAspAATAAALye12SAAGLys30CACHisATTlieGTCValTTALeuCACHis110ACGAAATTALeuCATHisATTlieThrTCCCTTLeuCTTLeuCTTGGTGlyTCA60TTTGATAspCGCArgCCAProGGTGlyCCTPro65TCATCCTTTPheAAALysCCAProAATAanSOATTlieTCAAATAfinTCTATClie130GGTGly3SCATHisATGMetGTCValAGGArgGTT11SATGMtCTCLeuCCAProCCTProAATA0Z1GTGValTTT100GTTValAACAsnTCASerTTTCACHisCTCGCAAla85GTCValTGGTrpCCTProAAAAAA70AGAArgCCGProTTALeuTCTAGCSer100148136244292340388436ATCTTTTCTGGTAACAAGCTTGATGGTAATCAACATCTGAGGTCTAAA484HePheSerGlyAsnIuAepGlyAsnGinHiaLeuArgSrUys13S"014S150AAOGTCCAAGAGTTAATTGATTATTGTCAAAAGTGTGCCAA。AATGGC532LysValGinGluIjulieAspTyrCyaGinLy0CysAlLy0AsnGly15S160GAAGCAGTGGATATAGGAAGAGCAACTTTTGGAACTACTTTGAATTTGSflOGluAlaValAsplieGlyArgAlaThrPhoGlyThrThr*LouAsnLeu17017S180CTATCCAACACCATTTTCTCTAAAGATTTGACTAATCCGTTTTCTGAT628IiuSez*AsnThrliePheSeirLysAspLeuThrAsnProPheSerAsp1B51901SSTCTGCTAAAGAGTTTAAGGAATTGGTTTGGAACATTATGGTTGAGGOTSerAlaLysGluPheLysGluLuValTrpAsnlieMetValGluAla20020S210GGAAAACCCAATTTGGTGGACTACTTTCCTTTCCTTGAGAAAATTGAT724GlyLysProAsnLeuValAspTyrPheProPheLeuGluLyslieAep21S22022S230CCGCAAGGTATAAAGCGACGCATGACTAATAATTTTACTAAGTTTCTT772ProGinGlylieLyeArgArgMetThr*AsnAsnPh*Thr*LysPheLeu23S240245GGCCTTATCAGC鄰TTTGATTGATGACCGGTTAAAGGAAAGGAATCTA820GlyLulieSer*GlyLulieAspAspArgIiuLysGluArgAsnlieu2S02SS260AGGGACAATGCAAATATTGATGTTTTAGACGCCCTTCTCAACATTAGCB€BArgAspA6nAlaAsnlieAspValAspAlaLeuLeuAsnlieSer270275CAAGA。AACCCAGAAGAGATTGACAGGAATCAAATCGAGCAGTTGTGT31SGinGluAsnProGluGlulieAspArgAenGinlieGluGinlieuCys28028S290CTGGACTTGTTTGCAGCAGGGACTGATACTACATCGAATACCTTGGAG$S4LauAspLeuPheAlaAlaGlyThrAspThrThrSerAsnThrGlu300305310TGGGCAATGGCAGAACTACTTCAGAATCCACACACATTGCAGAAAGCA1012TrpAlaMetAlaGluI>euIiuGinAsnProHisThrLuGinLysMa31S32032SCAAGAACTTGCACAAGTCATT郎TAAAG<3CAAACAAGTAGAAGAA10S0GinGluGluIjuAlaGinVallieGlyLysGlyLyaGinV"GluGlu33033S340GCAGATGTTGGAC幼CTACCTTACTTGCGATGCATAGTGAAAGAAACCAlaAspVal(SlyArgUeuProTyrLeu、ArgCysIlValLys<31uTbr34S3S0355TTACGAATACACCCAGCGGCTCCTCTCTTAATTCCACOTAAAGTGOAG1156LeuArg工leHisProAlaAlaProLeuL糾lieProArgLyeValGlu3S0365"0GAAGACGTTGAGTTGTCTACCTATATTATTCCAAAGGATTCACAAGTT1204GluAspValGluLeu3erThrTyrlielieProLysAopSerGinVal37S380385390CTAGTGAACGTATGGGCAATTGGACGCAACTCTGATCTATGGGAAAATLeuValAsnValTrpAlalieGlyArgAsnSerAsp"uTrpGluAen335400405CCTTTGGTCTTTAAGCCAGAAAGGTTTTGGGAGTCAGAAATAGATATC1300ProLeuValPheLysProGluArgPheTrpGluSearGlulieAsplie41041S420CGAGGTCGAGATTTTGAACTCATTCCATTTGCTGCTGGTCGAAGAATT1348ArgGlyArgAspPhoGluLeulieProPhe(SlyAlaGlyArgArglie42S430435TGCCCTGGATTQCCTTTGGCTATGAGGATGATTCCAGTAGCACTAGGTCyeProGlyI*euProLeuAlaMet44044SAtgMetIlProValAlaLeuGly4501396TCATTGCTAAACTCATTTAATTGGAAACTASerlieulieuAanSerPheA0nTrpLyslieu4SS"0TATGGTGGAATTGCACCTTyrGlyGlylieAlaPro4701444AAAGATTTG幼CATGCAGGAAAA<3TTTGGCLyeAspIeuAspMetGinGluLysPheGly47S"0ATTACCTTGGCGAAAGCClieThrI<euAlaIiyeAla4d51492CAACCTCTGCTAGCTATCCCAACTCCCGinProLeuLeuAlalieProThrPro430CTGTAGCTATAGGGATAAATTAALeu1542GTTGAGGTTTTAAGTTACTAGTAGATTCTATTGCAGCTATAGGATTTCTTTCACCATCAC1602CTATGCTTTACCGTTGGMGATGGAAAGAAATATCTATAGCTTrGGGXTTGTTTAGTTTG1"2CACATAAAAATTGAATGAATGGAATACCATGGAGTTATAAGAAATAATAAGACTATGATT1722CTTACCCTACTTGAACAATQACATGGCTATTTCAC17S7(2)關于SEQIDNO:27的信息(i)序列特征(A)長度18個減基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描迷SEQIDNO:27TTTTTTTTTTTTTTTTTA18(2)關于SEQIDNO:28的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:28TTTTTTTTTTTTTTTTTC(2)關于SEQIDNO:29的信息(i)序列特征(A)長度18個堿基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:29TTTTTTTTTTTTTTTTTG(2)關于SEQIDNO:30的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:30TrpAlalieGlyArgAspPro(2)關于SEQIDNO:31的信息(i)序列特征(A)長度20個氨基酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:31TGGGCIATIGGT{A/C)GIGA<T/C)CC20(2)關于SEQIDNO:32的信息(i)序列特征(A)長度6個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:32PheArgProGluArgPhe5(2)關于SEQIDNO:33的信息(i)序列特征(A)長度22個氨基酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描迷SEQIDNO:33AGGAATT(T/C)(A/C>GICCIGA(A/G)<A/C)GITT22(2)關于SEQIDNO:34的信息(i)序列特征(A)長度32個核普酸(B)類型核酸(D)拓樸結構線型(C)鏈型單鏈分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:34CCITT(T/C)GGIGCIGGI(A/C)GI(A/C)GIATITG(T/G)(C/G)CIGG(2)關于SEQlDNO:35的信息(i)序列特征(A)長度7個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:35GluPheXaaProGluArgPhe(2)關于SEQIDNO:36的信息(i)序列特征(A)長度20個核苷酸(B)類型:核酸(C)鏈型單鏈.(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:36GAITT(T/C)IIICCIGAI(A/C)GITT(2)關于SEQIDNO:37的信息(i)序列特征(A)長度28個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型分子類型DNA(xi)序列描迷SEQIDNO:37CCACACGAGTAGTTTTGGCATTTGACCC28(2)關于SEQIDNO:38的信息(i)序列特征(A)長度25個堿基酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:38GTCTTGGACATCACACTTCAATCTG2S(2)關于SEQIDNO:39的信息(i)序列特征(A)長度17個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:39CCGAATTCCCCCCCCCC1，(2)關于SEQIDNO:40的信息(i)序列特征(A)長度32個核苷酸(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結構線型(ii)分子類型蛋白質(xi)序列描述SEQIDNO:40(ii)分子類型DNA(xi)序列描述SEQIDNO:40<formula>formulaseeoriginaldocumentpage185</formula>權利要求1.一種分離的核酸分子，它含有編碼類黃酮3′-羥化酶或其衍生物的核苷酸序列，其中所述的類黃酮3′-羥化酶或其衍生物能比SEQIDNO:26所述的核苷酸序列編碼的類黃酮3′-羥化酶更有效地調節(jié)類黃酮化合物的羥化。2.根據(jù)權利要求1所述的分離的核酸分子，含有對應于矮牽牛屬中稱為Htl或Ht2所述的遺傳基因座或其它有花植物種類中含控制3'羥化類黃嗣合成的序列的基因座的核苷酸序列。3.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:1所述或具有與其至少大約60%相似性或能在低等嚴格條件下與SEQIDNO:1所述的序列雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。4.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:3所述的或具有與其至少大約60%相似性或能在低等嚴格條件下與SEQIDNO:3所述序列雜交的核苦酸序列或其互補核苷酸序列.5.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:5所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:5所迷的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.6.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:7所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:7所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。7.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:9所述或具有與其編碼序列至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:9所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.8.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:14所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:14所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苦酸序列或其互補核苷酸序列.9.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:16所述的或具有與其至少大約60X的相似性或能與SEQIDNO:16所迷的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.10.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:18所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:18所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。11.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:20所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:20所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。12.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:22所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:22所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列.13.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有基本上如SEQIDNO:24所述或具有與其至少大約60%的相似性或能與SEQIDNO:24所述的序列在低等嚴格條件下雜交的核苷酸序列或其互補核苷酸序列，14.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:2所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列。15.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:4所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列。16.根據(jù)權利要求2所迷的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:6所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列.17.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:8所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列.18.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:10或SEQIDNO:11或SEQIDNO:12或SEQIDNO:13所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核脊酸序列。19.根據(jù)權利要求2所迷的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:15所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列.20.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:17所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列.21.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:19所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列。22.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:21所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列.23.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:23所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列.24.根據(jù)權利要求2所述的分離的核酸分子，含有編碼或其互補于編碼基本上如SEQIDNO:25所述的氨基酸序列或具有與其至少大約50%的相似性的氨基酸序列的核苷酸序列。25—種寡聚核苷酸，它能在低度嚴格條件下與選自SEQIDNO:1,3,5，7，9,14，16,18,20，22和24的核苷酸序列雜交，26.—種能在植物中減少編碼類黃嗣3'鞋化酶的內源性基因表達的基因構建體，所述的基因構建體包含選自下列的核普酸序列(i)編碼SEQIDNO:2，4，6，8,10，11,12，13，15,17,19,21,23或25之一所述的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補形式；(H)SEQIDNO:1，3,5，7，14,16,18，20，22或24之一所述的核苷酸序列或SEQIDNO:9中的編碼區(qū)或其互補形式(iii)具有與(i)或(ii)至少大約60%相似性的核苷酸序列；和(iv)能在低等嚴格條件下與(i)，(ii)和或(iii)雜交的核普酸序列.2入一種生產(chǎn)能合成類黃嗣3'羥化酶或其功能性衍生物的轉基因植物的方法，所述的方法包含用含有編碼所迷的類黃^3'羥化酶或其衍生物的核苷酸序列的核酸分子在允許所述的核酸分子最終表達的條件下穩(wěn)定地轉化合適植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物并在足以允許該核酸分子表達的條件下讓所述的轉基因植物生長一段時間.27.28.—種生產(chǎn)降低了內源性或現(xiàn)存類黃胡3'幾化酶活性的轉基因植物的方法，所述的方法包含用含有編碼或其互補于編碼類黃閨3'羥化酶或其衍生物的核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定地轉化合適植物的細胞，從該細胞再生轉基因植物，并且，如果需要，在足以允許該核酸分子表達的條件下讓所迷的轉基因植物生長.29.根據(jù)權利要求27或28所述的方法，其中導入的核酸分子含有選自下列序列的核苷酸序列或其互補核苷酸序列(i)編碼SEQIDNO:2，4,6,8，10，11，12，13，15,17，19,21，23或25之一所述的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補形式；(ii)SEQIDNO:1,3，5，7,14，16，18，20，22或24之一所述的核苷酸序列或SEQIDNO:9的編碼區(qū)或其互補形式；(iii)具有與(i)或(ii)至少大約60%的相似性的核苷酸序列；和(iv)能在低等嚴格條件下與(i),(ii)和/或(iii)雜交的核苷酸序列。30.根據(jù)權利要求27或28的方法，其中受體植物選自矮牽牛屬，石竹屬，菊，玫瑰，金魚草屬，煙草，矢車菊，天竺葵屬，lisianthus，扶郎花屬，蘋果，蝴蝶花，百合屬，非洲紫羅蘭和牽?；?31.—種生產(chǎn)能調節(jié)類黃酮化合物羥基化的轉基因植物的方法，所述的方法包括用含有編碼或其互補于編碼類黃酮3'羥化酶或其衍生物的核苷酸序列的核酸分子穩(wěn)定地轉化合適植物的細胞或細胞團并從所述的細胞或細胞團再生轉基因植物.32.根據(jù)權利要求31所述的方法，其中轉化的核酸分子含有選自下列序列的核苷酸序列(i)編碼SEQIDNO:2，4，6,8，10,11，12，13,15，17，19,21，23或25之一所述的氨基酸序列的核苷^列或其互補形式；(ii)SEQIDNO:1，3，5,7，14,16,18，20，22或24之一所述的核苷酸序列或SEQIDNO:9的編碼區(qū)或其互補形式；(iii)具有與(i)或(ii)至少大約60%的相似性的核苷酸序列；和(iv)能在低等嚴格條件下與(i)，(ii)和/或(iii)雜交的核苷酸序列，33.—種有表現(xiàn)出顏色改變的組織的轉基因植物，所迷的轉基因植物包含含有選自下列序列的核苷酸序列的核酸分子(i)編碼SEQIDNO:2，4,6，8,10，11，12，13,15，17,19,21，23或25之一所述的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補形式;(ii)SEQIDNO:1，3,5，7,14，16，18,20,22或24之一所迷的核苦酸序列或SEQIDNO:9的編碼區(qū)或其互補形式；(iii)具有與(i)或(ii)至少大約60%的相似性的核苷酸序列；和(iv)能在低等嚴格條件下與(i)，(ii)和/或(iii)雜交的核苷酸序列，34.來自根據(jù)權利要求33的轉基因植物的切花，35.來自根據(jù)權利要求33的轉基因植物的種子.36.來自根據(jù)權利要求33的轉基因植物的果實.37，來自根據(jù)權利要求33的轉基因植物的葉片.38.含有編碼類黃嗣3'羥化酶的核苷酸序列的核酸分子在制備能調節(jié)植物或植物細胞中類黃嗣化合物羥基化的基因構建體中的用途，39.根據(jù)權利要求38所述的用途，其中的核苷酸序列選自(i)編碼SEQIDNO:2，4,6,8,10，11,12,13，15，17,19，21,23或25之一所述的氨基酸序列的核苷酸序列或其互補形式；(ii)SEQIDNO:1，3，5，7,14，16，18，20，22或24之一所述的核苷酸序列或SEQIDNO:9的編碼區(qū)或其互補形式；(iii)具有與(i)或(ii)至少大約60%的相似性的核苷酸序列；和(iv)能在低等嚴格條件下與(i)，(ii)和/或(m)雜交的核苷酸序列.全文摘要本發(fā)明一般涉及編碼類黃酮途徑中代謝酶，更具體地，類黃酮3′-羥化酶(下文稱為“F3′H”)或其衍生物的基因序列及它們在植物和其它生物中控制色素形成的用途。文檔編號C12N15/63GK101381736SQ200810087649公開日2009年3月11日申請日期1997年2月28日優(yōu)先權日1996年3月1日發(fā)明者F·布魯里拉,M·Z·米查爾,T·A·霍爾頓申請人:國際花卉開發(fā)有限公司