專利名稱：一種高溫角質(zhì)酶及其基因序列的制作方法
一種高溫角質(zhì)酶及其基因序列技術(shù)領(lǐng)域一種高溫角質(zhì)酶及其基因序列，本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。具體地說涉及一種編碼嗜熱子囊菌(77zwmo6折必ykyca)高溫角質(zhì)酶的DNA序列及其表達(dá)。
背景技術(shù)：
角質(zhì)酶是一種多功能酶，能水解角質(zhì)多聚物分子以及各種合成聚酯的酯鍵 使其降解為單體和小分子寡聚體，同時(shí)也能水解各種不溶性甘油三酯和水溶性 酯類。角質(zhì)酶作用底物的廣泛性使其在食品、化工、紡織等領(lǐng)域具有良好的應(yīng) 用前景。紡織工業(yè)是我國的傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)和支柱產(chǎn)業(yè)，在國內(nèi)生產(chǎn)總值和外貿(mào)出口總值 中占有重要比例。但我國紡織工業(yè)總體存在產(chǎn)業(yè)集中度不高、工藝技術(shù)裝備落 后和資源利用率低等問題。特別值得注意的是，紡織業(yè)是產(chǎn)生污染非常嚴(yán)重的 工業(yè)，在前處理和后整理過程中，傳統(tǒng)工藝消耗大量的水和化學(xué)品，不僅耗費(fèi) 資源，同時(shí)造成環(huán)境污染并破壞生態(tài)平衡，這對(duì)我國實(shí)施可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略極為 不利。從20世紀(jì)80年代開始，國外掀起了生物酶在紡織品染整加工中應(yīng)用的研 究熱潮。我國近幾年也出臺(tái)一些新政策推動(dòng)"綠色紡織品"和生態(tài)紡織業(yè)的發(fā) 展，而紡織前處理工藝全酶化已成為賣現(xiàn)生態(tài)紡織的重要手段。角質(zhì)酶作為紡織前處理工藝中一種重要的酶制劑，在棉織物前處理過程中 的作用，主要是去除具有疏水性的棉纖維表皮層-角質(zhì)層，以增加棉纖維的潤濕 性。近年來，角質(zhì)酶在合成纖維前處理工藝中的應(yīng)用成為熱門，通過角質(zhì)酶對(duì) PET等合成纖維疏水表面進(jìn)行改性，可以很大程度地提高染整效果。將角質(zhì)酶 用于纖維表面的處理和改性，可取代傳統(tǒng)的堿煮工藝，具有處理?xiàng)l件溫和、對(duì)纖 維損傷小、資源消耗低、對(duì)環(huán)境污染小等諸多優(yōu)點(diǎn)的同時(shí)，還能顯著提高紡織 品加工的品質(zhì)。國外對(duì)角質(zhì)酶的研究已有三十多年歷史。自70年代起，從自然界中篩選到 產(chǎn)角質(zhì)酶菌種(主要為真菌)，進(jìn)行野生酶分離純化和生理生化性質(zhì)研究。90年 代，為深入了解角質(zhì)酶的催化特性、分子機(jī)理，奠定其開發(fā)應(yīng)用的理論基礎(chǔ)， 研究者構(gòu)建了 Fi^7n、m so/am' cDNA文庫，投入大量精力鑒定了該真菌角質(zhì)酶 的編碼基因，并進(jìn)行了克隆表達(dá)。隨后，以實(shí)驗(yàn)室制備的重組酶為研究材料， 廣泛開展了真菌角質(zhì)酶的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)研究。分子水平的理論研究包括晶體結(jié)構(gòu)解析、分子定性、催化機(jī)制等。在應(yīng)用基礎(chǔ)研究方面，研究了酶發(fā)酵提純 技術(shù)以及采用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶功能進(jìn)行修飾，使改造后的酶適應(yīng)不同的工 業(yè)用途。近年來，為開發(fā)角質(zhì)酶的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，研究熱點(diǎn)集中在采用不 同的基因工程宿主細(xì)胞(如釀酒酵母&7cc/z"ram_ycas cereWw'ae、大腸桿菌 五"/jehc&a.co/f和曲霉屬^ype/^7/船sp.)進(jìn)行高效表達(dá)，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，降低 生產(chǎn)成本等方面的研究。國內(nèi)對(duì)角質(zhì)酶的研究較少，只有少數(shù)幾所高校開展了野生菌的篩選和搖瓶 條件的優(yōu)化，沒有工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用的實(shí)例。綜合國內(nèi)外的研究發(fā)現(xiàn)，國外對(duì)角質(zhì)酶的研究主要還是集中在真菌角質(zhì)酶 上，而對(duì)細(xì)菌角質(zhì)酶的報(bào)道很少，其主要原因是國外仍舊側(cè)重于開發(fā)生化性 質(zhì)研究已很深入的真菌角質(zhì)酶，對(duì)細(xì)菌角質(zhì)酶的研究沒有足夠重視；細(xì)菌角質(zhì) 酶編碼基因還沒有被闡明，無法采用基因重組技術(shù)獲得大量產(chǎn)品作為研究材料。 但和真菌角質(zhì)酶相比，細(xì)菌角質(zhì)酶具有比真菌角質(zhì)酶催化效率高、對(duì)環(huán)境適應(yīng) 能力強(qiáng)、以及基因工程表達(dá)技術(shù)等方面優(yōu)勢(shì)，因此，研究細(xì)菌角質(zhì)酶具有極其 重要的價(jià)值。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種高溫角質(zhì)酶，其具有SEQ ID NO: 2所示的氨 基酸序列。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼本發(fā)明的高溫角質(zhì)酶的DNA分 子，所述的DNA分子具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。 本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供包含本發(fā)明基因的表達(dá)載體。 本發(fā)明的又一個(gè)目的是提供包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。 本發(fā)明的技術(shù)方案 一種高溫角質(zhì)酶，它具有SEQIDNO:2所示的氨基酸 序列。所述的高溫角質(zhì)酶的基因，它具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。 所述的高溫角質(zhì)酶基因的表達(dá)方法由嗜熱子囊菌(r/2^mo^y^a /wm) WSH03-11總DNA獲得高溫角質(zhì)酶基因SEQ ID NO:l，角質(zhì)酶基因以質(zhì)粒 pET20b(+)為表達(dá)載體，以co" BL21 Rosetta (DE3) PlysS為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)高 溫角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)；(1)嗜熱子囊菌7T7^7m^:/Ma/^ca WSH03-11總DNA的提取。 77zemoZ^必/w^a WSH03-11菌株(該菌株巳在化工進(jìn)展2006年第25 巻第5期公開)，在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L， NaC110g/L) 中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于500^L Tris-EDTA(三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，加入15pL溶菌酶，37°C 下保溫30 min，再加入5(iL RNA酶，37。C下保溫30 min,加入30|iL 10%SDS (十二烷基硫酸鈉)和15i^L蛋白酶K， 37。C下保溫60min，加入100|iLNaCl(5M)和80|iLCTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65。C下保溫20 min，用700pL 的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液 用700pL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm離心，上清液用140(VL 體積的冰異戊醇混合，-20'C沉淀30min， 10000rpm離心，沉淀加200(aL70。/o乙 醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即為ryksca WSH03-11 總DNA。(2) 高溫角質(zhì)酶編碼基因的克隆以7T^mo&:/^a/^ca WSH03-11總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引 物，下劃線為酶切位點(diǎn)7VcoI和五coRI， PCR擴(kuò)增高溫角質(zhì)酶基因。引物1: 5, — ggAATACCATATgT￡￡^IggCCAACCCCTACgAgCgCgg — 3 ， 引物2: 5， - CATCTCgAgAg^HCgggAACgggCAggTggAgCg - 3， PCR反應(yīng)在50pL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95 'C變性5min后開始循環(huán)， 然后95 。C變性lmin， 55 。C退火lmin， 72 。C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)后，再于 72 。C延伸10min，擴(kuò)增得到780 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18畫T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨 芐青霉素的LB平板，經(jīng)37'C培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10 h 后提取質(zhì)粒，命名為CUT-pMD18-Tsimple。將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。(3) 高溫角質(zhì)酶基因的改造以CUT-pMD18-T simple為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，設(shè)計(jì)引物 引物3: 5 ， —CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC - 3 ， 引物4: 5 ， —gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg — 3' PCR反應(yīng)在50pL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95 。C變性5min后開始循環(huán)， 然后95 °。變性lmin， 55 。C退火lmin， 72 。C延伸4min，共35個(gè)循環(huán)后，再于 72。C延伸10min，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡.co//JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌體涂 布100 mg/L氨芐青霉素LB平板，挑選單菌落接入100 mg/L氨芐青霉素LB液 體培養(yǎng)基經(jīng)37X:過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定。(4) 高溫角質(zhì)酶基因在表達(dá)載體上的構(gòu)建 用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pelB信號(hào)肽和His-tag標(biāo)記，將pET20b(+)質(zhì)粒和角質(zhì)酶基因進(jìn)行iVco I和五coR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回 收后，再用T4連接酶16"C連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡.0 /^^[109感受態(tài)細(xì)胞， 經(jīng)37"C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨芐青霉素LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后 抽提質(zhì)粒，得到富集的CUT-pET20b(+)質(zhì)粒；(5) 大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌將質(zhì)粒CUT-pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化￡. co// BL21 Rosetta (DE3) PlysS宿主菌， 再在含氨芐青霉素(100mg/L)和氯霉素(50mg/L)的LB平板上經(jīng)37。C培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子(重組菌CUT-pET20b(+)/五co//BL21 Rosetta (DE3) PlysS)在 TB培養(yǎng)基(甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏24 g/L，K2HP04 12.54 g/L， KH2P04 2.31 g/L)中37'C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37'C培養(yǎng)至OD達(dá) 1.5后用終濃度4pMIPTG(異丙基硫代PD半乳糖苷)誘導(dǎo)，降溫至24匸培養(yǎng)， 64h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)69U/mL。(6)重組高溫角質(zhì)酶的純化和特性。將上述角質(zhì)酶發(fā)酵液于4 °C， 10000rpm離心20 min除菌體。上清液中加 入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 。C， 10000 rpm離心20 min，取沉淀物用適量緩 沖液A (20mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉。20mM咪唑，pH7.4)溶解，并在緩沖 液A中透析過夜后，通過0.22pm膜過濾后制成上樣樣品。Ni親和柱用緩沖液A平 衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用緩沖液A 含480mM咪唑 的緩沖液A梯度洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長為280nm，分部收集含角質(zhì)酶 酶活的洗脫液?；盍M分用10000道爾頓膜離心濃縮，得純化角質(zhì)酶酶制品。純 化后角質(zhì)酶達(dá)到電泳純，表觀分子量30000道爾頓。純化過程電泳圖見圖l。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明提供了高溫角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)方法。提取 rferwoZny^a/k ca WSH03-11總DNA，設(shè)計(jì)引物PCR得到編碼高溫角質(zhì)酶的基 因，它具有SEQIDNO: l所示的核苷酸序列，全長783個(gè)核苷酸，編碼261個(gè) 氨基酸。以質(zhì)粒pET20b(+)為表達(dá)載體，以BL21 Rosetta (DE3) PlysS為表 達(dá)宿主，可實(shí)現(xiàn)高溫角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)，重組酶具有角質(zhì)酶活性。該高溫 角質(zhì)酶的最適溫度為60°C，最適pH 8，在6(TC具有很高的穩(wěn)定性，半衰期為 45 h。此酶非常適合紡織工業(yè)應(yīng)用的需要。


圖1重組角質(zhì)酶分離純化SDS-PAGE圖譜1、發(fā)酵上清液；2、通過Ni柱純化后樣品；3、標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量。 圖2高溫角質(zhì)酶最適溫度(對(duì)硝基苯丁酸酯pNPB為底物) 圖3高溫角質(zhì)酶最適pH (對(duì)硝基苯丁酸酯pNPB為底物) pH 6-7，使用磷酸鉀緩沖液；pH 7-9，使用Tris-HCl (三羥甲基氨基甲垸-鹽酸)緩沖液。圖4高溫角質(zhì)酶6(TC穩(wěn)定性研究(對(duì)硝基苯丁酸酯pNPB為底物)具體實(shí)施方式
實(shí)施例1本實(shí)施例說明嗜熱子囊菌TTzermo&y^a/wca WSH03-11總DNA的提取。 T7zemw6^<i"/wca WSH03-11菌株在LB液體培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L ，酵母 膏5g/L， NaC110g/L)中培養(yǎng)2天，10000ipm離心收集菌體，無菌水洗漆，收 集沉淀懸浮于500jiLTris-EDTA (三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸)緩沖液，加入15pL溶菌酶，37'C下保溫30 min，再加入5pLRNA酶，37匸下保溫30min， 加入30^iL10。/。SDS (十二烷基硫酸鈉)和15]iL蛋白酶K， 37。C下保溫60 min， 加入100pLNaCl (5M)和80fiL CTAB (十六烷基三甲基溴化銨)，65。C下保溫 20 min，用700pL的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提， 10000rpm離心，上清液用700pL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm 離心，上清液用1400(iL體積的冰異戊醇混合，-20匸沉淀301^11， 10000rpm離 心，沉淀加200|iL 70%乙醇清洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶 解，即為TTzerwoZj^^/wca WSH03-11總DNA。 實(shí)施例2本實(shí)施例說明高溫角質(zhì)酶編碼基因的克隆程序。以77^mo^y^a/wc"WSH03-11總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引 物，下劃線為酶切位點(diǎn)A^oI和五coRI， PCR擴(kuò)增高溫角質(zhì)酶基因。引物1: 5' — ggAATACCATATgT^AIggCCAACCCCTACgAgCgCgg - 3' 引物2: 5 ， — CATCTCgAgAgMIiegggAACgggCAggTggAgCg — 3 ， PCR反應(yīng)在50(iL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95 "C變性5min后開始循環(huán)， 然后95 。C變性lmin， 55 。C退火lmin， 72 。C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)后，再于 72 "C延伸10min。擴(kuò)增得到780 bp的PCR片段，割膠回收?；厥掌瑪嗯cpMD18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨 芐青霉素的LB平板。經(jīng)37t:培養(yǎng)過夜，平板上長了大約十幾個(gè)菌落，挑四個(gè) 菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10h后提取質(zhì)粒，命名為CUT-pMD18-T simple。 將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果表明插入片段含有一個(gè)長783bp的開放閱讀框 (ORF)，編碼一個(gè)由261個(gè)氨基酸編碼的蛋白質(zhì)。 實(shí)施例3本實(shí)施例說明高溫角質(zhì)酶基因的改造程序。由于在目標(biāo)基因內(nèi)部存在一個(gè)iVco I酶切位點(diǎn)，而基因兩端分別為AAco I和 五coRl位點(diǎn)，所以設(shè)計(jì)引物將7VcoI位點(diǎn)突變?nèi)コ?，以方便下步的克隆表達(dá)。 以連接了角質(zhì)酶基因的CUT-pMD18-T simple為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，設(shè)計(jì)引 物引物3: 5 ， —CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC — 3 ， 弓I物4: 5, -gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg - 3' PCR反應(yīng)在50|iL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95 "C變性5min后開始循環(huán)， 然后95 。C變性lmin， 55 ""C退火lmin， 72。C延伸4min，共35個(gè)循環(huán)后，再于 72。C延伸10min。將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化￡.co//JM109感受態(tài)細(xì)胞。轉(zhuǎn)化后的菌體涂 布100 mg/L氨芐青霉素LB平板，挑選單菌落接入100 mg/L氨節(jié)青霉素LB液 體培養(yǎng)基經(jīng)37t過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果正確，驗(yàn)證了已經(jīng)成功突變?nèi)コ齏coI位點(diǎn)。 實(shí)施例4本實(shí)施例說明高溫角質(zhì)酶基因在表達(dá)載體上的構(gòu)建程序。用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pelB信號(hào)肽和His-tag標(biāo)記。 將pET20b(+)質(zhì)粒和角質(zhì)酶基因進(jìn)行Wco I和￡coR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回 收后，再用T4連接酶16T:連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.o /!'JM109感受態(tài)細(xì)胞， 經(jīng)37X:培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100 mg/L氨芐青霉素LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后 抽提質(zhì)粒，得到富集的CUT-pET20b(+)質(zhì)粒。實(shí)施例5本實(shí)施例說明大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌的程序。 將質(zhì)粒CUT-pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化co/z' BL21 Rosetta (DE3) PlysS宿主菌， 再在含氨芐青霉素(100mg/L)和氯霉素(50mg/L)的LB平板上經(jīng)37。C培養(yǎng) 過夜，挑選轉(zhuǎn)化子(重組菌CUT-pET20b(+)/五.co/z'BL21 Rosetta (DE3) PlysS )在 TB培養(yǎng)基(甘油5 g/L，蛋白胨12 g/L，酵母膏24 g/L，K2HP04 12.54 g/L， KH2P04 2.31 g/L)中37"C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37"C培養(yǎng)至OD達(dá) 1.5后用終濃度4^MIPTG(異丙基硫代(3D半乳糖苷)誘導(dǎo)，降溫至24。C培養(yǎng)， 64h時(shí)產(chǎn)酶達(dá)69U/mL。 實(shí)施例6本實(shí)施例說明重組高溫角質(zhì)酶的純化和特性。將上述角質(zhì)酶發(fā)酵液于4 。C， 10000 rpm離心20 min除菌體。上清液中加 入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 °C， 10000 rpm離心20 min，取沉淀物用適量緩 沖液A (20 mM磷酸鈉，0.5M氯化鈉。20mM咪唑，pH7.4)溶解，并在緩沖 液A中透析過夜后，通過0.22pm膜過濾后制成上樣樣品。Ni親和柱用緩沖液A平 衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用緩沖液A 含480mM咪唑 的緩沖液A梯度洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長為280nm，分部收集含角質(zhì)酶 酶活的洗脫液?；盍M分用10000道爾頓膜離心濃縮，得純化角質(zhì)酶酶制品。純 化后角質(zhì)酶達(dá)到電泳純，表觀分子量30000道爾頓。純化過程電泳圖見圖l。將重組酶進(jìn)行底物水解試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)重組酶可水解角質(zhì)、甘油三酯和可溶性 酯，結(jié)果表明角質(zhì)酶基因?qū)崿F(xiàn)高效表達(dá)。以可溶性酯對(duì)硝基苯丁酸酯(pNPB)為底物時(shí)，高溫角質(zhì)酶的最適溫度為 60°C (圖2)，最適pH8 (圖3)，在6(TC具有很高的穩(wěn)定性，半衰期為45 h (圖 4)。序列表SEQ ID NO: 1gccaacccctacgagcgcggCCCC￡L￡lCCCgaccgacgccctgctcgaagcccgcagcggc60cccttctccgtgagtga卿acgggcctcccgcttxggtgctgacggtttcggcggcggc120accatctactacccgcgggag犯ca^c3cctacggtgccgtggcgatctcccccggctac180accggcacccaggcctctgtcgcctggctgggcgagcgcatcgcctcccacggcttcgtc240gtcatcaccatcgscacc3acaccaccctcg織agccggacagccgggcccgccagctc300aacgccgcgctggactacatgatc^cgacgcctcgtccgcggtgcgcagccggatcgac360agcagccgactggcggtcatgggCCELCtCC"鵬cggcggcggcaccctgcgtctggcc420tcccagcgtcccgacctgaaggccgccatcccgctcaccccgtggcacctc犯c犯g犯c480tggeigcagtgtgcgggttcccaccctcatcatcggtgctgacctggacaccatcgctccg540gtcctcacccSLCgCCCggCCcttctacaacagcctcccgacctcgatcagcaaggccteic600ctggagctggacggcgc犯cccacttcgccccgaacatxccc犯ca^gatcatcggcaag660tacagcgtcgcctggctcaagcggttcgtcgacaacgacacccgctacacccagttcctc720tgccccggacCgCgCgELCggactcttcggcgaggtcg犯gagtaccgctccacctgcccc780ttctag786SEQ ID NO: 2Ala Asn Pro Tyr Glu Arg Gly Pro Asn Phe Thr Asp Ala Leu Leu5 10 15Glu Ala Arg Ser Gly Pro Phe Ser Val Ser Glu Glu Arg Ala Ser20 25 30Arg Phe Gly Ala Asp Gly Phe Gly Gly Gly Thr lie Tyr Tyr Pro35 40 45Arg Glu Asn Asn Thy Tyr Gly Ala Via Ala lie Ser Pro Gly Tyr50 55 60Thr Gly Thr Gin Ala Ser Val Ala Trp Leu Gly Glu Arg leu Ala65 70 75Ser His Gly Phe Val Val lie Thr Asn Asp Thr lie Thr Thr LeuAsp Gin Pro Asp Ser Arg Ala Arg Gin Leu Asn Ala Ala Leu Asp80859095100105Tyr Met lie Asn Ser Ser Arg Leu Thr Leu Arg Leu Pro Leu Thr Pro Val Pro Thr Leu Val Ala Thr His lie Ser Lys Ala Pro Asn lie Pro Leu Lys Arg Phe Cys Pro Gly Pro Arg Ser Thr CysAsp110Ala125Ala140Trp155lie170Ala185Tyr200Asn215Val230Arg245Pro.260AlaValSerHislieArgLeuLysAspAspPhe 261Ser Ser Met Gly Gin Arg Leu Asn Gly Ala Pro Phe Glu Leu lie lie Asn Asp Gly LeuAla His Pro Lys Asp Tyr Asp Gly Thr PheVal 115 Ser 130 Asp 145 Asn 160 Leu 175 Asn 190 Gly 205 Lys 220 Arg 235 Gly 250Arg Met Leu Trp Asp Ser Ala Tyr Tyr GluSer Gly Lys Ser Thr Leu Thr Ser Thr ValArg GlylieGlyAla AlaSer Vallie AlaPro ThrHis PheVal AlaGin PheGlu GluAsp 120 Gly 135 lie 150 Arg 165 Pro 180 Ser 195 Ala 210 Trp 225 Leu 240 Tyr 25權(quán)利要求
1. 一種高溫角質(zhì)酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2、 一種編碼權(quán)利要求l所述的高溫角質(zhì)酶的基因，它具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。
3、 一種如權(quán)利要求2所述的高溫角質(zhì)酶基因的表達(dá)方法，其特征是由嗜熱 子囊菌(77zemo&:/^a /附ca) WSH03-11總DNA獲得高溫角質(zhì)酶基因SEQ ID NO:l ，角質(zhì)酶基因以質(zhì)粒pET20b(+)為表達(dá)載體，以五.co/f BL21 Rosetta (DE3) PlysS為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)高溫角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)；(1) 嗜熱子囊菌77^mo^/^a/Msca WSH03-11總DNA的提取 77zermo^y^a/^ca WSH03-11菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天，10000rpm離心收集菌體，無菌水洗滌，收集沉淀懸浮于500(iL Tris-EDTA緩沖液，加入 15pL溶菌酶，37。C下保溫30 min,再加入5^L RNA酶，37。C下保溫30 min， 加入3(VL 10%十二烷基硫酸鈉和15(iL蛋白酶K， 37X:下保溫60 min，加入 1 OOjxL 5M的NaCl和80pL十六烷基三甲基溴化銨，65 。C下保溫20 min，用700pL 的酚氯仿異戊醇體積比25 : 24 : 1混合溶劑抽提，10000rpm離心，上清液 用700(iL的氯仿異戊醇體積比24 : 1抽提，10000rpm離心，上清液用1400^L 的冰異戊醇混合，-20°。沉淀301^11， 10000rpm離心，沉淀加200|aL 70%乙醇清 洗，10000rpm離心，沉淀用Tris-EDTA緩沖液溶解，即為7T^rmo&y^a/^ca WSH03-11總DNA;(2) 高溫角質(zhì)酶編碼基因的克隆以TT^mo&yWa/z^ca WSH03-11總DNA為模版，以下列核苷酸序列作為引 物，下劃線為酶切位點(diǎn)臉oI和五coRI， PCR擴(kuò)增高溫角質(zhì)酶基因；引物1: 5 ， — ggAATACCATATgT^IggCCAACCCCTACgAgCgCgg — 3 ， 引物2: 5 ， - CATCTCgAgAgMEiegggAACgggCAggTggAgCg - 3 ， PCR反應(yīng)在50pL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95 "C變性5min后開始循環(huán)， 然后95 。C變性lmin， 55 'C退火lmin， 72 。C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)后，再于 72 。C延伸10min，擴(kuò)增得到780 bp的PCR片段，割膠回收，回收片斷與pMD18-T simple載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布含100 mg/L氨 芐青霉素的LB平板，經(jīng)37i:培養(yǎng)過夜，挑選菌落，接入LB液體培養(yǎng)基，10 h 后提取質(zhì)粒，命名為CUT-pMD18-Tsimple,將此質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定；(3) 高溫角質(zhì)酶基因的改造以CUT-pMD18-T simple為模板進(jìn)行定點(diǎn)突變PCR，設(shè)計(jì)引物 引物3: 5 ， 一CATgggCCACTCAATgggCggCggCggC - 3, 弓I物4: 5 ， 一gCCgCCgCCgCCCATTgAgTggCCCATg _ 3'PCR反應(yīng)在50|iL體系中進(jìn)行，反應(yīng)條件為在95 t:變性5min后開始循環(huán)， 然后95 。C變性lmin， 55'C退火lmin， 72 。C延伸4min，共35個(gè)循環(huán)后，再于 72'C延伸10min，將PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co//JM109感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化后的菌體涂 布100 mg/L氨芐青霉素LB平板，挑選單菌落接入100 mg/L氨芐青霉素LB液 體培養(yǎng)基經(jīng)37"C過夜培養(yǎng)，抽提質(zhì)粒，將突變后的質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定；(4) 高溫角質(zhì)酶基因在表達(dá)載體上的構(gòu)建 用于構(gòu)建表達(dá)載體的質(zhì)粒是pET20b(+)，帶有pe舊信號(hào)肽和His-tag標(biāo)記，將pET20b(+)質(zhì)粒和角質(zhì)酶基因進(jìn)行iVco I和￡coR I雙酶切，酶切產(chǎn)物割膠回 收后，再用T4連接酶16i:連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化五.co"'JM109感受態(tài)細(xì)胞， 經(jīng)37匸培養(yǎng)過夜，挑選轉(zhuǎn)化子于100mg/L氨節(jié)青霉素LB進(jìn)行液體培養(yǎng)，然后 抽提質(zhì)粒，得到富集的CUT-pET20b(+)質(zhì)粒；(5) 大腸桿菌宿主轉(zhuǎn)化和篩選重組菌將質(zhì)粒CUT-pET20b(+)熱擊轉(zhuǎn)化co/z' BL21 Rosetta (DE3) PlysS宿主菌， 再在含100 mg/L氨芐青霉素和50 mg/L氯霉素的LB平板上經(jīng)37匸培養(yǎng)過夜， 挑選重組菌CUT-pET20b(+)/￡. co/z' BL21 Rosetta (DE3) PlysS轉(zhuǎn)化子在TB培養(yǎng)基 中37'C液體培養(yǎng)過夜，后接入TB發(fā)酵液體培養(yǎng)基37。C培養(yǎng)至OD達(dá)1.5后用 終濃度4 ^M異丙基硫代p D半乳糖苷誘導(dǎo)，降溫至24X:培養(yǎng)，64h時(shí)產(chǎn)酶達(dá) 69U/mL;(6) 重組高溫角質(zhì)酶的純化和特性將上述角質(zhì)酶發(fā)酵液于4 °C、 10000 rpm離心20 min除菌體；上清液中加 入70%固體硫酸銨鹽析過夜，4 'C、 10000 rpm離心20 min，取沉淀物用適量 含20mM磷酸鈉、0.5M氯化鈉、20mM咪唑、pH 7.4的緩沖液A溶解，并在 緩沖液A中透析過夜后，通過0.22pm膜過濾后制成上樣樣品；Ni親和柱用緩 沖液A平衡后，將上樣樣品吸入Ni柱，使之完全吸附后，分別用緩沖液A 含 480mM咪唑的緩沖液A梯度洗脫，流速lmL/min，檢測(cè)波長為280 nm，分部 收集含角質(zhì)酶酶活的洗脫液；活力組分用10000道爾頓膜離心濃縮，得純化角 質(zhì)酶酶制品。
全文摘要
一種高溫角質(zhì)酶及其基因序列，本發(fā)明屬于酶基因工程和酶工程領(lǐng)域。本發(fā)明由嗜熱子囊菌(Thermobifida fusca)WSH03-11總DNA獲得高溫角質(zhì)酶基因SEQ ID NO1，角質(zhì)酶基因以質(zhì)粒pET20b(+)為表達(dá)載體，以E.coli BL21 Rosetta(DE3)PlysS為表達(dá)宿主，實(shí)現(xiàn)高溫角質(zhì)酶基因的高效表達(dá)；該角質(zhì)酶基因全長783個(gè)核苷酸，編碼261個(gè)氨基酸，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)角質(zhì)酶。重組酶具有角質(zhì)酶活性。該高溫角質(zhì)酶的最適溫度為60℃，最適pH 8，在60℃具有很高的熱穩(wěn)定性，半衰期為45h。此酶非常適合紡織工業(yè)應(yīng)用的需要。
文檔編號(hào)C12N15/55GK101250509SQ20081002012
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2008年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月28日
發(fā)明者敬 吳, 堅(jiān) 陳, 晟 陳 申請(qǐng)人:江南大學(xué)