專利名稱：一種產(chǎn)甘油脫氫酶(gdh)的基因工程菌及其gdh制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)甘油脫氫酶的基因工程菌 及其甘油脫氫酶制備方法，也即一種產(chǎn)GDH的基因工程菌及其GDH制備方法。
背景技術(shù)：
二羥基丙酮，英文名為dihydroxyacetone，簡寫為DHA，是最簡單的酮糖，易溶于 水及乙醇、丙酮、乙醚等有機(jī)溶劑，在pH為6.0時穩(wěn)定。國內(nèi)有關(guān)DHA的報道極少， 在國外DHA已得到廣泛的實際應(yīng)用(1)DHA分子中含有三種官能團(tuán)，化學(xué)性質(zhì)活潑， 廣泛參與諸如聚合、縮合等各種化學(xué)反應(yīng)，是一個重要的化學(xué)合成中間體，也是一個重 要的多功能試劑，如在工業(yè)應(yīng)用上，能最有效地還原丁二烯一苯乙烯復(fù)合物，催化甲醛 到羥醛、羥酮的縮合反應(yīng)。(2)DHA被廣泛應(yīng)用于化妝品中，起保濕及防曬作用在制 革工業(yè)上，DHA被用作皮革制品的保護(hù)劑。(3)DHA是一種重要的醫(yī)藥中間體，目前 已作為醫(yī)藥應(yīng)用在低血糖與糖尿病的治療上，限量口服DHA，跟葡萄糖相比，DHA能
更大幅度地提高呼吸頻率，增大氧氣消耗，有效地防止過量e-羥基丁酸及乙酰乙酸的
形成。(4)DHA可作為一種抗病毒試劑，如在雞蛋胚胎培養(yǎng)中，DHA能殺死51 — 100% 的雞瘟病毒。另外，DHA還有許多其他用途，如作為食品添加劑等還在研究與開發(fā)之 中。
二羥基丙酮(DHA) —般是從低產(chǎn)率的酶催化及通過其他微生物方法得到。自從 1848 1849年Bertran發(fā)現(xiàn)某些微生物能將甘油轉(zhuǎn)化為DHA并鑒定該微生物為醋酸桿菌 后，醋酸桿菌中甘油的代謝途徑及微生物(主要為醋酸桿菌)法生產(chǎn)DHA就開始被研究。 到20世紀(jì)60 70年代，微生物法生產(chǎn)DHA在國外已得到了大規(guī)模的工業(yè)應(yīng)用，微生 物法生產(chǎn)DHA較之化學(xué)法生產(chǎn)有反應(yīng)條件溫和、原料利用率高、產(chǎn)品純度高及工藝簡 單、易于控制等優(yōu)點，從長遠(yuǎn)發(fā)展及環(huán)境保護(hù)角度來看，微生物法也顯得更具有生命力。 而K;7"e"momV^屬兼性厭氧菌，屬于病原菌，但實驗所用菌株較為溫和，在實驗室范圍 內(nèi)未見有其致病的報道，因此是比較適宜的GDH生產(chǎn)菌。
1998年Ahrens在美國《生物工程與工藝》(59巻第5期544-552頁)上發(fā)表，甘油轉(zhuǎn)化 為1,3-PD的厭氧代謝途徑中，甘油沿著氧化和還原兩條平行路徑代謝。在氧化途徑中， 甘油在依賴于NAD+的甘油脫氫酶(glycero1 dehydrogenase,下稱GDH， EC 1丄1.6)的作用 下形成二羥基丙酮(dihydroxyacetone，下稱DHA)，再在二羥基丙酮激酶(dihydroxyacetonekinase ，下稱DHAK ， EC 2.7丄29)的作用下，生成二羥基丙酮磷酸 (digydroxyacetonephosphate，下稱DHAP)，然后進(jìn)入糖酵解途徑，這一代謝過程是以甘 油為底物生長的微生物的共同代謝途徑，為微生物生長提供ATP和NADH。在還原途徑 中，甘油在以維生素Bu為輔酶的甘油脫水酶(glycerol dehydratase,下稱GDHt， EC 4.2丄30) 的作用下生成3-羥基丙醛(3-hydroxypropionaldehyde，下稱3-HPA)，然后在依賴于NADH 的l,3-丙二醇氧化還原酶(l,3-propanedioloxidoreductase，下稱PDOR， EC 1丄1.202)的作 用下形成1,3-PD。還原途徑所需的NADH由氧化途徑提供，整個過程伴隨著輔酶I的再 生。
GDH、 GDHt和PDOR是由Wa操縱子上的不同基因編碼的，已有人利用基因工程技 術(shù)對菌種進(jìn)行改造，Ichinose等將來自于Esc/ m'cWa co// strain JM109基因組DNA中的甘 油脫氫酶在大腸桿菌中表達(dá)，但從成本和生產(chǎn)能力上看都達(dá)不到工業(yè)生產(chǎn)的要求。另外 有Stahl; Peter (Beraried, DE)等申請了從微生物中獲得甘油脫氫酶的專利(《從微生物中 獲得高產(chǎn)、低Km值的甘油脫氫酶》1983年美國專利，218138);有Adachi; Osao (Yamaguchi， JP)等申請了甘油脫氫酶的生產(chǎn)和應(yīng)用的專利(《甘油脫氫酶的生產(chǎn)過程 及其應(yīng)用》，美國專利225328)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供采用基因重組的方法構(gòu)建能生產(chǎn)GDH的工程菌，并提供以較低 成本的發(fā)酵生產(chǎn)GDH的方法。
本發(fā)明所說的產(chǎn)GDH的基因工程菌的制備方法，是將目的基因插入載體pET-32a， 構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建重組菌。再將重組菌培養(yǎng)至OD 為0.4-1.2，通過乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組甘油脫氫酶。
獲得含重組甘油脫氫酶的重組菌后，用溶菌酶、超聲波等生物或物理方法進(jìn)行細(xì)胞 破壁，獲得GDH無細(xì)胞抽提液，再用常規(guī)方法進(jìn)行鎳柱親和層析，純化得到GDH。
本發(fā)明用pET-32a對甘油脫氫酶進(jìn)行表達(dá)，構(gòu)件的重組菌能大量表達(dá)重組甘油脫氫 酶，所得的重組甘油脫氫酶經(jīng)鎳柱一步純化后，酶的比活達(dá)到188U/mg;在經(jīng)脫鹽處理 的酶液于4'C下保存3個月，酶活保存率達(dá)68%。本發(fā)明所構(gòu)建的生產(chǎn)GDH的工程菌能以 較低的成本發(fā)酵生產(chǎn)和純化GDH。


圖1為重組甘油脫氫酶表達(dá)載體構(gòu)建流程圖。
具體實施例方式
實施例一
構(gòu)建生產(chǎn)GDH的重組工程菌用煮沸法從K/efezW/a/ "ewwom'ae DSM 2026菌株上 提取總DNA ， 以5'-CGTCGGATCCTACATGCGCACTTATTTGAG-3'為前引， 5'-AATGCTCGAGCGAATTAACGCGCCAGCCAC-3'為后弓1 ，采用PCR擴(kuò)增得到目的基 因gWA，參照美國Sambrook等編寫的《分子克隆實驗指南》第三版，將目的基因插入 pMD18-T，得到的重組質(zhì)粒pMD- gWA，將重組質(zhì)粒pMD-gWA和pET-32a分別用B"mH I和^oI酶切，按照T4DNALigation(Biolab)的說明書設(shè)計連接體系，并進(jìn)行連接，得 到重組質(zhì)粒pET-32gWA。具體過程如圖1所示。
實施例二
重組工程菌的培養(yǎng)將重組質(zhì)粒pET-32gWA用熱轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入大腸桿菌菌株BL21, 挑選轉(zhuǎn)化子接入5 mL含75 pg/mL氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在37。C搖床中振蕩培養(yǎng)至 對數(shù)期，以1-5%的接種量轉(zhuǎn)接到50mL含有75嗎/mL的安芐青霉素的LB培養(yǎng)基，在 20 0rpm， 30-37"C搖床中振蕩培養(yǎng)0.5-3 h，加入誘導(dǎo)劑乳糖至終濃度為0.5-20 mg/mL，
進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。
實施例三
重組甘油脫氫酶的制備及活性檢測將基因工程菌懸浮于磷酸緩沖液(含二硫蘇糖 醇)，于冰浴中超聲波破碎細(xì)胞；去除不溶性細(xì)胞碎片，得到無細(xì)胞抽提液，按照常規(guī)
方法進(jìn)行鎳柱親和層析，得到重組甘油脫氫酶。
GDH使甘油脫氫生成二羥基丙酮過程中，輔酶I NAD+作為受體獲得氫被還原為 NADH, NADH在340 nm的紫外光下有最大吸收。因此根據(jù)吸光度的增加情況，用初 速度法測定GDH的活力。在250mL搖瓶培養(yǎng)，經(jīng)分離純化后得到的GDH比活為188 U/mg，約是Keiko在五.co/;HB101/pSE420D中表達(dá)的GDH，經(jīng)分離純化后的2.7倍，是陳 宏文由克雷伯肺炎桿菌中分離純化所的GDH的5倍。本研究所獲重組甘油脫氫酶酶活較 穩(wěn)定，其無細(xì)胞抽提液經(jīng)鎳柱純化并進(jìn)行脫鹽處理后，在4"C下保存3個月，酶活保存率 達(dá)68 % 。
權(quán)利要求
1、一種產(chǎn)GDH的基因工程菌的制備方法，是將目的基因插入載體pET-32a，構(gòu)成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建重組菌。再將重組菌培養(yǎng)至OD為0.4-1.2，通過乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組甘油脫氫酶。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述獲得含重組甘油脫氫酶的重組菌后，用溶菌酶、超聲波等生物或物理 方法進(jìn)行細(xì)胞破壁，獲得GDH無細(xì)胞抽提液，再用常規(guī)方法進(jìn)行鎳柱親和層析，純化得 至IJGDH。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，其采用PCR技術(shù)克隆來自克雷伯肺炎桿菌DSM 1115的gldA基因，構(gòu)建含gldA基因的大腸桿菌表達(dá)載體pET-32gldA，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，獲得了能表達(dá)甘油脫氫酶(GDH)的重組基因工程菌株E.coli-pET-gldA；再將重組菌培養(yǎng)至OD0.4-1.2，通過乳糖誘導(dǎo)表達(dá)，獲得重組甘油脫氫酶?？捎糜诿阜ㄉa(chǎn)廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、化妝品和食品添加劑的二羥基丙酮。
文檔編號C12N1/21GK101418274SQ20081008632
公開日2009年4月29日 申請日期2008年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月24日
發(fā)明者張婷婷, 方柏山 申請人:華僑大學(xué)