抗l-絲氨酸反饋抑制的谷氨酸棒桿菌syps-062的構(gòu)建方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過基因組工程的方法對谷氨酸棒桿菌SYPS-062L-絲氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶3-磷酸甘油酸脫氫酶編碼基因在基因組水平進(jìn)行進(jìn)化，使得重組菌株組成穩(wěn)定表達(dá)抗L-絲氨酸反饋抑制的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體。本發(fā)明的重組谷氨酸棒桿菌SYPS-062△S能夠抗L-絲氨酸的反饋抑制，實(shí)現(xiàn)發(fā)酵過程中高效積累L-絲氨酸。
【專利說明】抗L-絲氨酸反饋抑制的谷氨酸棒桿菌SYPS-062的構(gòu)建方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及抗L-絲氨酸反饋抑制的谷氨酸棒桿菌SYPS-062的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]L-絲氨酸屬于非必需氨基酸，具有重要的生理功能和應(yīng)用價值，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工領(lǐng)域。目前，L-絲氨酸的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、蛋白水解法、酶法轉(zhuǎn)化、微生物前體發(fā)酵和微生物直接發(fā)酵。微生物直接發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸是ー種綠色環(huán)?？沙掷m(xù)的生產(chǎn)方式，但是一直沒有得到突破，使得L-絲氨酸成為瓶頸氨基酸品種而極大地限制其應(yīng)用。究其原因，主要是因?yàn)長-絲氨酸處于整個代謝網(wǎng)絡(luò)的中間位置，主要去向有生成ー碳單元、轉(zhuǎn)化為其他氨基酸如甘氨酸，組氨酸和色氨酸等，另外還能被降解為丙酮酸進(jìn)而進(jìn)入三羧酸循環(huán)，故微生物很難大量積累L-絲氨酸。
[0003]谷氨酸棒桿菌iCorynebacterium glutamicum)是重要的氨基酸生產(chǎn)菌株,廣泛應(yīng)用于發(fā)酵法生產(chǎn)谷氨酸、賴氨酸和甲硫氨酸等氨基酸。谷氨酸棒桿菌L-絲氨酸的生物合成以糖酵解途徑中間產(chǎn)物3-磷酸甘油酸作為起始物質(zhì)，分別通過3-磷酸甘油酸脫氫酶(PGDH)、磷酸絲氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(PSAT)和磷酸絲氨酸磷酸酶(PSP)順序催化的三步反應(yīng)而合成。
[0004]微生物細(xì)胞具有高度的環(huán)境適應(yīng)能力，細(xì)胞各種結(jié)構(gòu)協(xié)調(diào)經(jīng)濟(jì)地運(yùn)行；通常情況下，細(xì)胞只合成本身所需要的中間代謝產(chǎn)物，當(dāng)氨基酸、核酸等物質(zhì)積累后細(xì)胞會進(jìn)行自動反饋調(diào)節(jié)，停止物質(zhì)的過量合成；細(xì)胞主要通過反饋抑制和反饋?zhàn)瓒魜碚{(diào)節(jié)合成途徑相關(guān)酶的酶活性和酶量，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)代謝產(chǎn)物的合成。通常反饋調(diào)節(jié)作用于代謝產(chǎn)物生物合成途徑中催化第一歩合成反應(yīng)的.酶，進(jìn)而使得整個生物合成反應(yīng)終止于起始步驟，從而保證了細(xì)胞對物質(zhì)的經(jīng)濟(jì)性利用。
[0005]谷氨酸棒桿菌L-絲氨酸的生物合成同樣也受到嚴(yán)格的調(diào)控，產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸能夠反饋抑制3-磷酸甘油酸脫氫酶的活性；3_磷酸甘油酸脫氫酶為典型的變構(gòu)調(diào)節(jié)酶，終產(chǎn)物L(fēng)-絲氨酸能夠與其結(jié)合，最終導(dǎo)致酶構(gòu)象發(fā)生改變而使得酶分子催化活性穩(wěn)定處于抑制狀態(tài)。
[0006]不同來源的3-磷酸甘油酸脫氫酶N-端具有很高的同源性，主要由底物結(jié)合域、輔酶結(jié)合域組成，C-端主要為保守性較低的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域。來自大腸桿菌的PGDH研究最為深入，其生物化學(xué)和酶學(xué)性質(zhì)已經(jīng)有較為詳細(xì)的研究，L-絲氨酸是其酶活性的變構(gòu)抑制劑，抑制模型得到很好的研究，其調(diào)節(jié)模型為Kmax型變構(gòu)調(diào)節(jié)。
[0007]解除L-絲氨酸對3-磷酸甘油酸脫氫酶的反饋抑制是構(gòu)建L-絲氨酸高產(chǎn)菌株以及與L-絲氨酸相關(guān)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的關(guān)鍵技木，已經(jīng)有利用分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行相關(guān)研究以降低L-絲氨酸對3-磷酸甘油酸脫氫酶的敏感性，使得工程菌株L-絲氨酸生物合成途徑通暢以提高L-絲氨酸積累能力，本身作為代謝物積累或者為開發(fā)其他代謝產(chǎn)物提供足夠的結(jié)構(gòu)基團(tuán)，如L-色氨酸。
[0008]申請專利CN200410063527.5描述了大腸桿菌P⑶H的第349位甘氨酸或第372位蘇氨酸的取代，獲得的PGDH突變體對L-絲氨酸的敏感降低，取得較好的效果。申請專利201110389135.8同樣采用定點(diǎn)突變，將第344位組氨酸突變?yōu)楸彼岷偷?46位天冬酰胺突變?yōu)楸彼?，突變體酶活不受L-絲氨酸抑制且酶活能夠較大程度保留。
[0009]P.Peters-Wendisch 等(2002, Appl.Microbiol.Biotechnol.60:437-441)報道了谷氨酸棒桿菌3-磷酸甘油酸脫氫酶C-端缺失能夠在保留一定酶活的基礎(chǔ)上解除其對L-絲氨酸的反饋抑制；在此基礎(chǔ)上，該作者將PGDH突變體利用pZl在谷氨酸棒桿菌中過表達(dá)，重組菌L-絲氨酸的產(chǎn)量幾乎沒有變化(Applied and Environmental Microbiology,2005，71(11): 7139-7144)。
[0010]質(zhì)粒是基因工程的重要工具，通過質(zhì)粒進(jìn)行基因的外源或者同源表達(dá)是改造代謝途徑關(guān)鍵酶的主要手段。利用質(zhì)粒進(jìn)行關(guān)鍵基因的表達(dá)，因?yàn)橘|(zhì)粒能夠較方便地轉(zhuǎn)化入細(xì)胞進(jìn)而進(jìn)行目的基因的高效表達(dá)，故能夠收到一定效果。但是，利用外源質(zhì)粒進(jìn)行基因表達(dá)也會帶來ー些問題，如·質(zhì)粒的不穩(wěn)定性造成工程菌株性能的不穩(wěn)定，例如質(zhì)粒的非均勻分配傳給子代，會形成無質(zhì)粒細(xì)胞，質(zhì)粒本身結(jié)構(gòu)改變會導(dǎo)致目的基因的非正常表達(dá)，此外還有目的基因結(jié)構(gòu)改變會形成能夠抵抗選擇性壓カ的非正常細(xì)胞。
[0011]因此，在細(xì)菌基因組水平進(jìn)行關(guān)鍵酶及其基因表達(dá)調(diào)控序列的進(jìn)化非常有必要，最終構(gòu)建的無質(zhì)粒工程菌能夠高效穩(wěn)定表達(dá)所需的關(guān)鍵酶，克服了外源質(zhì)粒表達(dá)的諸多缺點(diǎn)；基因組進(jìn)化工程必將成為代謝工程的重要技術(shù)手段和廣泛應(yīng)用于エ業(yè)微生物的分子育種研究領(lǐng)域。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的在于通過基因組工程的方法對谷氨酸棒桿菌SYPS-062 L-絲氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶在基因組水平進(jìn)行進(jìn)化，構(gòu)建ー株抗L-絲氨酸反饋抑制的基因工程菌以及應(yīng)用于發(fā)酵法生產(chǎn)L-絲氨酸。
[0013]該目的通過在谷氨酸棒桿菌SYPS-062的基因組水平改造其3-磷酸甘油酸脫氫酶編碼基因sarん僅保留其底物結(jié)合域和輔酶結(jié)合域的編碼序列，另外將起始密碼子進(jìn)行進(jìn)化，最終使得菌株表達(dá)具有抗L-絲氨酸反饋抑制的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體。
[0014]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體，其編碼序列和氨基酸序列見序列I。
[0015]該3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體，其在保持酶活的同時解除對L -絲氨酸的反饋抑制。
[0016]一株在基因組水平改造編碼3-磷酸甘油酸脫氫酶編碼基因，將抗L-絲氨酸反饋抑制的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體的編碼基因整合至基因組相應(yīng)位置，其構(gòu)建過程及重組菌的應(yīng)用如下:
(I)基因擴(kuò)增:根據(jù)Genbank中谷氨酸棒桿菌ATCC13032基因組序列信息，設(shè)計(jì)引物以谷氨酸棒桿菌SYPS-062基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增基因上游序列和下游片段；設(shè)計(jì)具有結(jié)構(gòu)性終止翻譯和融合能力雙功能的人工序列，利用該人工序列通過交叉PCR將上下游片段融合，再將該片段連接至PMD19-T，對目的基因序列進(jìn)行測序驗(yàn)證，確證重組克隆質(zhì)粒為 pMD19-T A SerAaes ；
(2)重組整合質(zhì)粒的構(gòu)建:將所述步驟(I)中的重組克隆質(zhì)粒pMD19-TAser≤ues ;進(jìn)行雙酶切處理，將目的片段連接至相同雙酶切處理的質(zhì)粒pK19m0hsac凡轉(zhuǎn)化至 : coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選驗(yàn)證陽性克??；
(3)基因的重組整合:提取步驟(2)構(gòu)建的用于目的基因整合修飾的重組質(zhì)粒pK19mob5a≤ A5≤ues,電激轉(zhuǎn)化至如權(quán)利要求1，4的谷氨酸棒桿菌SYPS-062感受態(tài)細(xì)胞，通過兩次篩選獲得成功重組整合了編碼如權(quán)利要求1，3的ー種3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體編碼基因的重組菌株。
[0017](4)重組菌株的驗(yàn)證:利用引物通過PCR擴(kuò)增驗(yàn)證重組菌株。
[0018](5) 3-磷酸甘油酸脫氫酶及其突變體活性驗(yàn)證:分別將菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062和突變株SYPS-062 A S在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中后期，收集菌體洗滌、破碎菌體和測定粗蛋白酶活，及其在不同L-絲氨酸濃度的體系中3-磷酸甘油酸的相對酶活性。
[0019](6)將谷氨酸棒桿菌SYPS-062重組菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，測定其L-絲氨酸的生產(chǎn)能力。
[0020]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下:
本發(fā)明以L-絲氨酸產(chǎn)生菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062為出發(fā)菌株，選擇催化其生物合成途徑第一步反應(yīng)的3-磷酸甘油酸脫氫酶作為改造対象。采用基因組工程的手段，將關(guān)鍵酶編碼基因在基因組水平改造進(jìn)化，實(shí)現(xiàn)抗L-絲氨酸反饋抑制的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體的組成型穩(wěn)定表達(dá)；采用無質(zhì)粒體系，可以避免質(zhì)粒表達(dá)基因帶來的諸多問題，如質(zhì)粒維持、穩(wěn)定性和分配，以及目的基因過量表達(dá)對菌體帶來的代謝負(fù)擔(dān)；利用該基因固有的轉(zhuǎn)錄表達(dá)調(diào)控系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)對改造基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控，可以省略用于維持重組菌質(zhì)粒的抗生素和誘導(dǎo)基因表達(dá)的化學(xué)誘導(dǎo)劑，減少這些外源添加物質(zhì)對菌體的毒性以及對終產(chǎn)物產(chǎn)品純度影響，尤其是避免抗生素的殘留。
[0021]在L-絲氨酸產(chǎn)生菌株SYPS-062的基因組定向改造3_磷酸甘油酸脫氫酶編碼基因，使得重組菌株能夠組成型穩(wěn)定表達(dá)抗L-絲氨酸反饋抑制的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體，保證在胞內(nèi)高濃度L-絲氨酸的條件下3-磷酸甘油酸脫氫酶也具有較高活性和L-絲氨酸生物合成途徑代謝流通暢，進(jìn)而保證細(xì)胞能夠高效合成目標(biāo)代謝物L(fēng)-絲氨酸。同時，獲得的L-絲氨酸高產(chǎn)菌株也為開發(fā)與L-絲氨酸相關(guān)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)工程菌株奠定物質(zhì)基礎(chǔ)，如L-甘氨酸、L-色氨酸和L-胱氨酸等高產(chǎn)菌株的構(gòu)建。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本發(fā)明中谷氨酸棒桿菌SYPS-062 L-絲氨酸生物合成途徑
圖2目的基因的擴(kuò)增:泳道I和6:DL-2 000 DNA Marker ;泳道2:serA上游片段；泳道3 -.serA下游片段；泳道4 -.serA缺失591 bp片段A SerAues ;泳道5 -.serA未缺失原始序列。
[0023]圖3重組克隆質(zhì)粒和重組整合質(zhì)粒的驗(yàn)證:A，泳道1:DL_2 000 DNA Marker ;泳道2重組克隆質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子提取質(zhì)粒用5 I和"i/?d III雙酶切后的產(chǎn)物；B，泳道1:DL-5000 DNA Marker ;泳道2:重組整合質(zhì)粒陽性轉(zhuǎn)化子提取的質(zhì)粒用5?/ I和沿'/?d III雙酶切后的產(chǎn)物。[0024]圖4重組菌株的驗(yàn)證:泳道M:DL_2 000 DNA Marker ;泳道1:出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062基因組作為模板PCR驗(yàn)證基因型；泳道2:重組菌谷氨酸棒桿菌SYPS-062 A S基因組擴(kuò)增serA片段
圖5 L-絲氨酸對3-磷酸甘油酸脫氫酶及其突變體的反饋抑制:()出發(fā)菌株3-磷酸甘油酸脫氫酶在不同濃度L-絲氨酸條件下相對酶活；(□)重組工程菌株3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體在不同濃度L-絲氨酸條件下相對酶活。
【具體實(shí)施方式】
[0025]以下結(jié)合具體實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)ー步說明。應(yīng)指出，以下實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0026]實(shí)施例1:人工雙功能序列的設(shè)計(jì)
以谷氨酸棒桿菌SYPS-062 serA基因的終止序列為模板，優(yōu)化其堿基得到用于融合PCR的人工連接序列，其原始序列和結(jié)果如下:
原始序列:5’ -TAATTAGAGATCCAITTGCTTGAAC-3’
修改序列:5’ -TAATTAGAAAITCAITTGTTAGAAC-3’
實(shí)施例2:重組克隆質(zhì)粒和整合質(zhì)粒的構(gòu)建
以谷氨酸棒桿菌SYPS-062基因組DNA為模板，設(shè)計(jì)如下引物分別擴(kuò)增目的基因:
用于擴(kuò)增上游片段的引物:
serA-\:5’ -CATAAGCTTTGTTTGCTCAGCGTCTTG-3’ (其中 AAGCTT 為 HinA III酶切位點(diǎn))
serA-2:5’-GTTCTAACAAATGAATTTCTAATTAAGCCAGATCCATCCACACAG-3’
用于擴(kuò)增下游片段的引物:
serA-3:5’-GAAATTCATTTGTTAGAACCGCCTTCCCATCTTTGA-3’
serA-A:5’ -TCTGTCGACGTAMGTGCATGAMCTC-3’ (其中 GTCGAC 為 Sal I 酶切位點(diǎn))
分別用引物Serj-1和Serjj擴(kuò)增上游片段，以引物Serjj和擴(kuò)增下游片段，分別用瓊脂糖凝膠電泳純化上下游片段，見圖2，長度分別為561bp和591bp ;分別以上游片段和下游片段作為模板，以引物和進(jìn)行交叉PCR擴(kuò)增上下游融合片段，利用瓊脂糖凝膠電泳純化PCR產(chǎn)物，結(jié)果見圖2。
[0027]將目的片段連接至克隆載體pMD19_T simple vector轉(zhuǎn)化至萬.JM109感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒，Sall和"ifldIII酶切鑒定，見圖3-A，即為陽性重組克隆質(zhì)粒PMDW-TA1Serんes;利用限制性內(nèi)切酶I和"i/?d III酶切重組克隆質(zhì)粒pMD19-T A,將回收片段與用相同處理的pK19mohsaci?混合，T4 DNA Iigase過夜處理。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至: cWi JM109。挑取單菌落培養(yǎng)提取質(zhì)粒，fe/I和沿/?dill酶切鑒定，見圖3-B,該轉(zhuǎn)化子含有重組敲除質(zhì)粒pK19mohsaci? A serj—。
[0028]實(shí)施例3:重組菌SYPS-062 33a A SerAues的構(gòu)建及驗(yàn)證
將pK19mohsaci? A SerAues電擊轉(zhuǎn)化至谷氨酸棒桿菌SYPS-062 33a感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行兩次重組和篩選，長出的單菌落包括回復(fù)野生型和目的片段缺失型，分別挑取單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證基因表型，結(jié)果見圖4，目的重組工程菌株P(guān)CR結(jié)果為圖4泳道2。
[0029]實(shí)施例4:3_磷酸甘油酸脫氫酶及其突變體表達(dá)及酶活測定
分別將菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062和突變株SYPS-062 A S在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)中后期，收集菌體按照如下方法洗滌、破碎菌體和測定粗蛋白酶活。
[0030]在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌體至對數(shù)生長中后期，收集菌體離心去上清,沉淀菌體用40mM磷酸鉀緩沖液pH7.5，1.0mM DTT洗滌二次，4°C超聲破碎菌體，12 000 rpm離心40 min獲得上清即為全細(xì)胞粗酶液。
[0031]酶活測定體系如下:
2ml反應(yīng)體系中含有:40mM磷酸鉀緩沖液pH7.5，1.0mM DTT, 0.25mM NADH，5mM a -酮戊ニ酸，200iU粗蛋白液，反應(yīng)溫度為37°C。測定反應(yīng)體系在340nm紫外吸收，隨著反應(yīng)進(jìn)行NADH消耗，反應(yīng)體系340nm紫外吸收將降低用以檢測底物的減少。
[0032]用Brandford法測定蛋白濃度。
[0033]酶活定義:在37°C反應(yīng)條件下,酶分鐘減少lnmol NADH所需酶量。
[0034]L-絲氨酸對3-磷酸甘油酸脫氫酶及其突變體酶活的影響
在3-磷酸甘油酸脫氫酶酶活性測定反應(yīng)體系中加入2 M的L-絲氨酸母液，反應(yīng)體系中L-絲氨酸的終濃度分別為· OmM，10 mM,20 mM,40 mM,60 mM,80mM,100 mM，150 mM，分別加入相同體積的粗蛋白液200 yl，以未加入L-絲氨酸的體系所測得的3-磷酸甘油酸脫氫酶酶活性為100%，計(jì)算不同L-絲氨酸濃度反應(yīng)體系中3-磷酸甘油酸脫氫酶的相對酶活性，結(jié)果見圖5，重組菌谷氨酸棒桿菌SYPS-062 A S能夠組成型表達(dá)抗L-絲氨酸反饋抑制的3-磷酸甘油酸脫氫酶。
[0035]實(shí)施例5:重組菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062 A S用于發(fā)酵生產(chǎn)L-絲氨酸
利用接種環(huán)將出發(fā)菌株和重組工程菌劃線于種子培養(yǎng)基固體平板中，將平板置于30°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至長出單菌落，接種環(huán)分別劃取一環(huán)菌體接種至20ml種子培養(yǎng)基中，300C，120rpm培養(yǎng)至對數(shù)生長中期，按照5%的接種比接種至25ml搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，120rpm 發(fā)酵 96h。
[0036]發(fā)酵結(jié)束，利用HPLC檢測發(fā)酵液中L-絲氨酸的含量，發(fā)酵液樣品處理及HPLC的條件如下:
將發(fā)酵液用ddH20稀釋至合適濃度，以異硫氰酸苯酯(PITC)作為衍生劑將氨基酸衍生化，產(chǎn)物苯氨基酸硫甲酰衍生物(PTC-AA)在254nm有穩(wěn)定的強(qiáng)紫外吸收，高效液相色譜儀為 DIONEX Ultimate 3000 series HPLC system,米用 Venusil-AA 氨基酸分析專用柱(4.6X250 mm, 5 Mm)，在紫外下檢測衍生物。
[0037]流動相A相:92.6 mMこ酸鈉，用冰醋酸將pH調(diào)節(jié)到6.50±0.05 ;流動相B相:80%こ腈，流速1.0 ml/min,柱溫:40°C,紫外檢測器波長254 nm。梯度洗脫程序?yàn)?0?4 min, 100% A ;4?16 min, 97 % A;16?17 min, 89 %;17?32 min, 79 % A ;32?34 min, 66 % A ;34?38min，0 % A ；38.01，100 % A。
[0038]其中種子培養(yǎng)基為:
蛋白胨 1.0%，葡萄糖 2.0%，酵母粉 0.5%，牛肉膏 1.0%，NaCl 0.3%, pH 7.0-7.2,121°C高溫滅菌IOmin ;固體培養(yǎng)基加入瓊脂2.0%。
[0039]氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品和樣品衍生化步驟:
(1)準(zhǔn)確量取氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液及樣品200yl，分別置于1.5ml離心管中；
(2)每管中準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)液20；
(3)分別向每個離心管中加入三こ胺こ腈溶液100yl，異硫氰酸苯酯こ腈溶液100 ill，混勻，室溫放置反應(yīng)Ih ；
(4)加入正己烷400yl，劇烈震蕩后放置IOmin ；
(5)取下層PTC-AA溶液，用0.45 iim針式過濾器過濾；
(6)取濾過清液lOOiil，加入400iilddH20稀釋，搖勻，進(jìn)樣20iU 樣品衍生化反應(yīng)中所需的溶液如下:
三こ胺こ腈:三こ胺1.4ml+こ腈8.6ml，混勻；_20°C保存。
[0040]異硫氰酸苯酯こ腈溶液:PITC 25 iU，加入こ腈2ml，混勻。(密閉，4°C放置保質(zhì)期為7天)
正亮氨酸內(nèi)標(biāo)液:秤取正亮氨酸10mg，加入0.1 M鹽酸溶液IOml使其溶解，混勻，4°C保存。
[0041]搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基為:
蔗糖 10.0%, (NH4)2SO4 3.0%, CaCO3 6.0%, K2HPO4 0.3%, MgSO4 ? 7H20 0.05%, FeSO4 ? 7H20
0.002%,MnSO 4 *H20 0.002%,生物素 50 u g/L，硫胺素 450 u g/L, pH 7.0，115°C滅菌 7 min ；重組菌谷氨酸棒桿菌SYPS-062 A S發(fā)酵96h L-絲氨酸產(chǎn)量為26g/L，較出發(fā)菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062提高近2.4倍。
【權(quán)利要求】
1.ー種3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體，其保留谷氨酸棒桿菌SYPS-062野生型3-磷酸甘油酸脫氫酶的底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和輔酶結(jié)合域。
2.如權(quán)利要求1的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體，其特征在于:其能夠抗L-絲氨酸的反饋抑制，其編碼基因和氨基酸序列見序列I。
3.如權(quán)利要求1的谷氨酸棒桿菌SYPS-062野生型3-磷酸甘油酸脫氫酶，其特征在于:L-絲氨酸對其有反饋抑制作用，其編碼基因序列和氨基酸序列見序列2。
4.如權(quán)利要求1的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體和野生型PGDH，其特征在于:與谷氨酸棒桿菌ATCC13032的PGDH氨基酸序列(見序列3)不同之處為43位丙氨酸被蘇氨酸代替。
5.一段人工設(shè)計(jì)序列(見序列4)用于構(gòu)建3-磷酸甘油酸脫氫酶編碼序列非必須序列精確無痕刪除，其特征在干:具有結(jié)構(gòu)性終止翻譯的發(fā)夾結(jié)構(gòu)和較好的融合能力可用于融合 PCR。
6.ー種在谷氨酸棒桿菌SYPS-062基因組整合如權(quán)利要求1所述的3-磷酸甘油酸脫氫酶突變體編碼基因，構(gòu)建ー株重組菌株谷氨酸棒桿菌SYPS-062 A S，其特征在于:發(fā)酵96h發(fā)酵液中L-絲氨酸的含量為2`廣26 g/L。
【文檔編號】C12N15/53GK103436504SQ201310389798
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年9月2日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月2日
【發(fā)明者】許正宏, 史勁松, 羅玉常, 竇文芳, 張曉梅, 陸震鳴, 許鴻瑜, 李會, 李恒, 耿燕, 張旦旦, 蔣敏, 趙芹芹, 錢建瑛 申請人:江南大學(xué)