改造谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌精氨酸合成途徑中關鍵酶nagk來提高精氨酸產(chǎn)量的方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及改造谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌精氨酸合成途徑中關鍵酶NAGK來提 高精氨酸產(chǎn)量的方法
【背景技術】
[0002] L-精氨酸是一種含有胍基的堿性氨基酸，在哺乳動物中是半必需或條件性必需氨 基酸。在谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌中，L-精氨酸的生物合成經(jīng)歷了 8個酶的催化過程（見 附圖1)，其中argB基因所編碼的乙酰谷氨酸激酶（N-acetyl-L-glutamatekinase，NAGK) 在此途徑中扮演關鍵酶的角色，即此酶受到終產(chǎn)物精氨酸的反饋抑制，是合成精氨酸的瓶 頸。
[0003] 為解除或減輕精氨酸對關鍵酶的反饋抑制，相關科研工作者通過點突變方法對 argB基因進行改造，以達到在盡量不影響酶活性的基礎上，降低其編碼蛋白對精氨酸的敏 感性。如，Skanyan和Schendzielorz這兩個課題組就分別構建了多個發(fā)生點突變的argB 基因，包括argBE19R、argB_、argB_NargBA49V'M54V、argBG2S7D、argBA49V'M5?等。將這些突變 基因分別克隆到表達載體后轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導表達，純化的蛋白再進行酶活測定和精氨 酸的半抑制率（IC5。）測定，發(fā)現(xiàn)上述突變除argBH26E的酶活性下降較多，導致終產(chǎn)物產(chǎn)量下 降外，其余的突變酶活性都有不同程度的下降但都對產(chǎn)量有貢獻，因為終產(chǎn)物的IC5。得到 了提高，且大部分的IC5。提高了 2-5倍。
[0004] 來源于谷氛酸棒桿菌（Corynebacteriumglutamicum)或純齒棒桿菌 (Corynebacteriumcrenatum)的argB基因全長954bp，翻譯的氨基酸殘基為317個?？梢钥?到上述兩個課題組的argB基因點突變主要位置在NAGK的N端，C端突變位點為268和287。 而本課題組發(fā)現(xiàn)在NAGK的C端311和312位置有兩個連續(xù)的天冬氨酸，這與Niersbach等 報道的大腸桿菌精氨酸合成途徑的負調(diào)控蛋白ArgR也在C端128和129位有兩個連續(xù)的天 冬氨酸是一致的，且Niersbach等報道ArgR的128和129位是結合精氨酸的位點。因此，我 們推測NAGK的C端311和312這兩個連續(xù)的天冬氨酸也是結合精氨酸的關鍵位點。據(jù)此我 們采用點突變的方法構建了突變的argBD311R'D312R(argBM2)基因和argBE19R'H26E'D311R'_(argB M4)基因，分別進行了表達和純化后，測定酶活和IC5。，發(fā)現(xiàn)酶活性均有提高，argBM2的酶 活提高了 19. 5 %且IC5。提高了 1. 3倍，argBM4的酶活提高了 14. 6 %但1C5。提高了 3. 7 倍。綜合比較，我們將argBM4基因替換到突變株鈍齒棒桿菌基因組中，精氨酸產(chǎn)量提高了 26. 2%〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供改造谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌精氨酸合成途徑中關鍵 酶NAGK來提高精氨酸產(chǎn)量的方法，從而提高精氨酸的產(chǎn)量。
[0006] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，降低終產(chǎn)物精氨酸對關鍵酶NAGK的反饋抑制來提高谷氨 酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌精氨酸產(chǎn)量。其實現(xiàn)的技術步驟為，1、點突變argB基因的構建：通 過設計二對引物將上述突變位點分別引入argB基因，設計一對引物在5'端和3'端加上 Hindlll和Xbal限制性內(nèi)切酶位點；分別通過PCR技術獲得原始的argB基因和及argB M2 基因，并利用重疊PCR技術獲得突變的argB M4基因，采用DNA純化試劑盒純化擴增產(chǎn)物， 再通過Hindlll和Xbal雙酶切，將argB基因、argB M2基因和argB M4基因分別克隆至 PXMJ19質(zhì)粒中，并將其分別熱轉(zhuǎn)至大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞；
[0007] 2、誘導NAGK在大腸桿菌中高效表達：分別將3株不同的陽性菌接到新鮮的LB(含 氯霉素25μgmL4平板上37°C活化12h，再將單菌落接入5mL液體LB(含氯霉素25μg mL3培養(yǎng)基中，37°C180rpm培養(yǎng)12h;按照1%接種量將3株菌分別接入25mLLB(含氯 霉素25ygmL1)培養(yǎng)基中，37°C180rpm培養(yǎng)至0D= 0.5-0.6左右，加入250yL24mg mL1的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（Isopropylβ-D-Thiogalactoside，IPTG)后置于 30°C180rpm誘導表達8h，SDS-PAGE電泳檢測表達情況；
[0008]3、測定NAGK酶活：將細胞超聲破碎離心后獲得的上清作為測定NAGK酶活 反應的粗酶液，酶活反應體積1.5mL，在反應體系中包括400yL40mMN-乙酰-L-谷 氨酸，150yL40mMMgCl2,75yL20mMATPNa2，150yL400mM鹽酸羥氨，500yL200mM Tris-HCl(pH= 8. 0)及適量的粗酶液，其余體積用雙蒸水補齊至1. 5mL，其中ATPNa2最后加 入以啟動酶活反應；在37°C反應lh后加入0.5mL終止液（終止液組成：1000mMHC1，4%三 氯乙酸和5%FeCl3. 6H20)終止反應；最后13000rpm離心lOmin，取上清液測定上其中N-乙 酰-L-谷氨酸氧肟酸在0D540nm處的吸光值。N-乙酰-L-谷氨酸氧肟酸摩爾消光系數(shù)ε =456Lmol1cm1。酶活力單位定義為：一個NAGK酶活力單位（U)為在上述反應條件時， 每分鐘生成1μmol的N-乙酰-L-谷氨酸氧肟酸所需的粗酶液的酶量；
[0009] 4、測定NAGK的IC5。:L-精氨酸對NAGK的抑制實驗中酶活的測定過程與步驟3 一致，只是在NAGK反應體系中再添加了不同濃度的L-精氨酸，分別為0mM、0. 5mM、1.OmM、 1. 5mM、2. 0mM、2. 5mM、3. 0mM、3. 5mM、4. 0mM、4. 5mM、5. 0mM、5. 5mM、6.OmM。通過測定精氨酸不 同添加量的酶活作出NAGK活性隨L-精氨酸濃度變化的曲線，根據(jù)曲線計算出其半抑制率 15(]值，I5(]的定義為：當反應酶液的酶活下降為初始酶活一半時反應液中添加的L-精氨酸 的濃度；
[0010] 5、突變的argB M4基因整合至基因組：綜合比較，將突變的argB M4基因與自殺 載體pK18mobsacB連接后，通過電轉(zhuǎn)法無痕取代鈍齒棒桿菌中來源于大腸桿菌的argB基因 (鈍齒棒桿菌中原始的argB基因已被來源于大腸桿菌的argB基因替換）。篩選的陽性整合 子通過搖瓶發(fā)酵觀察到精氨酸的產(chǎn)量提高了26.2%。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖120g/ L，玉米漿25g/L，硫酸銨45g/L，磷酸二氫鉀(λ05g/L，MgS04·7Η20 (λ5g/L，30g/L CaC03;培 養(yǎng)條件為：30°C，250rpm，發(fā)酵120h。
[0011] 所述來源于谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌的argB基因編碼蛋白NAGK的第311和 312位氨基酸殘基發(fā)生了突變，并聯(lián)合第19和26位氨基酸殘基發(fā)生了突變；突變后酶活得 到了提高，且減輕了精氨酸對其反饋抑制。
[0012] 所述argB M4基因通過無痕取代技術整合至谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌基因組 中。
[0013] 本發(fā)明的技術效果是：本發(fā)明將來源于谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌的精氨酸生物 合成途徑中關鍵酶NAGK編碼基因argB進行點突變，使突變的NAGK對精氨酸的反饋抑制敏 感性降低，提高了酶活和IC5。值；將突變的argB M4置換至基因組中，使得精氨酸的產(chǎn)量得 到了提高。
【附圖說明】
[0014]圖1谷氨酸棒桿菌和鈍齒棒桿菌精氨酸生物合成途徑。
[0015] 圖2為鈍齒棒桿菌argB基因定點突變示意圖。
[0016] 圖3為原始的和點突變argB基因在大腸桿菌中誘導表達的SDS-PAGE圖。
[0017]圖4為L-精氨酸對NAGK、NAGKM2、NAGKM4的反饋抑制曲線。
[0018] 圖5為L-精氨酸的產(chǎn)量和產(chǎn)率。
[0019] 在圖3中，泳道1為E.coliBL21-pXMJ19上清；泳道2和4為E.coli BL21-pXMJ19-argB上清；泳道 3 為Ε·coliBL21-pXMJ19-argBM2 上清；泳道 5