專利名稱：源自蜂王漿的抗氧化肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及具有抗氧化作用的肽，具體而言涉及通過將蜂王漿中 含有的蛋白質(zhì)水解所獲得的抗氧化肽。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在，蜂王漿廣泛地應(yīng)用于保健食品、醫(yī)藥品、化妝品等領(lǐng)域， 報告顯示其具有擴張血管、降低血壓、抗菌等各種藥理作用及營養(yǎng)生 理作用。
蜂王漿是由蜜蜂的唾液腺合成、由位于頭部的大顎腺分泌的乳狀 物質(zhì)，是工蜂為了培育蜂王而喂食蜂王幼蟲巢中的幼蜂的物質(zhì)。蜂王 漿均衡地富含蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)， 一生都食用蜂王漿的蜂王的 壽命是工蜂的40倍，并且具有一天產(chǎn)卵2000個的能力。對蜂王漿的 有效成分的研究，一直以10-羥基-2-癸烯酸(fty酸)為代表的脂肪酸、 氨基酸、維生素等低分子化合物為中心而進行。
另一方面，雖然蜂王漿一般含有10%以上的蛋白質(zhì)，但是對與該 蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)、生理作用相關(guān)的研究一直比較落后。并且，制造含
有蜂王漿的化妝品、保健藥水(Ky y夕剤)等時，進行醇提取，蛋白質(zhì)
作為沉淀物被分離，但現(xiàn)階段沒有實現(xiàn)對該蛋白質(zhì)的有效利用。
關(guān)于蜂王漿蛋白質(zhì)的蛋白酶處理物，為人所知的是其具有鈣吸收 促進作用(仲佐輝子、食品i:開発、34, 5(1999))、降低血糖值作用(上..田修一郎、FoodStyle、 21， 6， 5(2002))，并且也有關(guān)于其抗氧化作用
的報道((社)日本全國蜂王槳公平貿(mào)易理事會(全國口一卞々if y —公正
取引協(xié)議會)「口一卞》ifU —(Royal Jelly) K関t3研究」平成13 年度研究報告書)，但其效果不如維生素E。
本發(fā)明的目的在于提供具有強抗氧化作用的天然物質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
針對上述課題，經(jīng)過反復(fù)的研究，結(jié)果本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)通過將蜂王 漿用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶進行酶處理，可以獲得具有和維生素E 同等程度的強抗氧化能力的抗氧化肽。
艮P，本發(fā)明涉及如下所示的發(fā)明
1. 具有以下(1) (3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽 (1 )Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;
(2) Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;
(3) Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
2. 以上述l所述的抗氧化肽作為有效成分的抗氧化劑。
3. 含有上述l所述的抗氧化肽的食品。
4. 具有以下(1) (3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽的制造方
法
(1 )Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu;
(2) Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln;
(3) Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp,
其特征在于，用蛋白酶將源自蜂王漿的蛋白質(zhì)水解。
5. 含有上述l所述的抗氧化肽的化妝品。


圖1:表示通過硫氰酸鐵法進行的抗氧化作用的測定結(jié)果。圖1 中，"none"表示沒有蛋白質(zhì)的對照，"Chymom"表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶處理所獲得的分解物(Chymo級分)，"S.I"表示 表示用胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及小腸酶處理所獲得的分 解物(S.I級分)，"V.E"表示維生素E。
圖2:表示陽離子交換色譜分析法的色譜圖、及各級分的抗氧化 試驗的結(jié)果。
具體實施例方式
本發(fā)明的抗氧化肽具有如下的氨基酸序列。 Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu(以下簡稱為"肽1 ") Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln(以下簡稱為"肽2") Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp(以下簡稱為"肽3")
肽1 肽3是新的肽，其抗氧化作用通過本發(fā)明首次得到明確。
本發(fā)明的抗氧化肽也可以通過基因重組或化學(xué)合成獲得，并且， 也可以通過使胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶 作用于蜂王漿本身(生蜂王漿、干蜂王漿等)或者源自蜂王漿的蛋白質(zhì)級 分來獲得。并且，只要可以獲得肽1~肽3，也可以使用由胃蛋白酶、 胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、源自豬的小腸酶等水解酶將蜂王漿以外的 蛋白質(zhì)原料水解而得到的物質(zhì)。
作為用于通過蛋白質(zhì)的酶分解制造本發(fā)明的抗氧化肽的酶可以舉 出胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小腸酶等，這些酶是可以將 源自微生物、包括哺乳動物在內(nèi)的動物、植物、酵母、真菌等任意的 生物的肽鍵水解的酶的例子，優(yōu)選胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白 酶、源自豬的小腸酶。例如，通過將源自蜂王槳的蛋白質(zhì)在37'C左右 的溫度下和源自各種生物的胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小 腸酶同時進行約1~約48小時的處理，可以獲得本發(fā)明的任意一種抗氧 化肽。本發(fā)明的肽可以從源自蜂王漿的蛋白質(zhì)的酶分解物中進行分離、 提純后使用，也可以將包括本發(fā)明的抗氧化肽和其他多種肽的蛋白分 解物組合物(根據(jù)需要去除鹽類、糖類或者高分子蛋白質(zhì)等的物質(zhì))作為 抗氧化肽用于食品、化妝品等各種用途。
例如，含有蜂王漿的保健藥水是通過將向蜂王漿添加約70~約
95。/。(v/v)的醇、優(yōu)選乙醇后沉淀的蛋白質(zhì)除去而制造的，該含水醇中不 溶性的源自蜂王漿的蛋白質(zhì)可以作為酶處理的原料蛋白質(zhì)使用。作為 化學(xué)合成法，可以通過肽合成器進行合成，也可以通過固相合成或者 液相合成，階段性地通過肽鍵將氨基酸延長來制造。
本發(fā)明的抗氧化肽基于其抗氧化作用，可以適合添加到由活性氧 引起的各種疾病的預(yù)防及治療用的食品中。本發(fā)明的抗氧化肽具有和 維生素E同等程度的抗氧化能力，通過作為食品每天攝取約lug 約 1000mg，可以預(yù)防或者治療由活性氧引起的各種疾病。作為食品，可 以添加到飲料、保健藥水等液狀食品、膠狀食品(包括營養(yǎng)輔助食品、 下咽困難者用的食品)，也可以作為輔助物、功能性食品等以藥片、顆 粒等固形食品的形式攝取。并且，也可以用于準醫(yī)藥品(口中清涼劑、 護齒、護膚、毛發(fā)用劑、洗浴用劑、爽身粉類("C/u力、粉類)、保健藥水、 健胃清涼劑等)、動物用食品(寵物食品等)、動物用飼料、植物用肥料 等。
本發(fā)明的抗氧化肽通過添加到對氧化不穩(wěn)定的食品中，可以作為 穩(wěn)定劑使用。
并且，本發(fā)明的抗氧化肽也可以添加到化妝品中。作為化妝品， 例如適用于洗劑、化妝水、乳狀液、口紅、霜劑、凝膠、面膜(^y夕)、 粉底霜等主要用于皮膚或粘膜等的物質(zhì)。
以下對本發(fā)明通過實施例進行詳細說明。實施例1
(1) 抗氧化肽級分的調(diào)制
將醇變性蜂王漿蛋白質(zhì)凍干之后，溶解到5倍量的蒸餾水中。通 過進行透析去除低分子的糖、雜質(zhì)，獲得純度更高的醇變性蜂王漿蛋
白質(zhì)。將該蛋白質(zhì)溶液用1N HCl調(diào)整到pH2.8，在最初用1/500重量 比的胃蛋白酶進行處理。將其分解物依次用胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶(i/ 夕'^公司制造)、源自豬的小腸酶進行處理。對于胃蛋白酶、胰蛋白酶、 胰凝乳蛋白酶，添加后在37'C下進行24小時溫育，對于小腸酶，添加 后在37'C下進行1小時溫育。在反應(yīng)停止時，如果是胃蛋白酶，用1N NaOH調(diào)整到pH8.0以使酶失活，如果是胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、小 腸酶時，添加4倍量的99.7%乙醇，以3,000Xg進行20分的離心分離， 去除未反應(yīng)的蛋白質(zhì)及酶。將通過小腸酶處理所獲得的上清液用蒸發(fā) 器進行濃縮干燥固化后，溶解到蒸餾水中，作為醇變性蜂王漿蛋白質(zhì) 的蛋白酶分解物。將這樣所獲得的胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分 解物(Chymo級分)、胃蛋白酶/胰蛋白酶/胰凝乳蛋白酶分解物/小腸酶分 解物(S.I級分)作為樣本使用。肽的濃度測定通過Lowry法進行。標準 蛋白質(zhì)使用牛血清白蛋白。
此外，作為"醇變性蜂王漿蛋白質(zhì)"使用通過將蜂王漿用醇(本實 施例中為70°/。v/v含水乙醇)沉淀處理，將所獲得的蜂王漿蛋白質(zhì)凍干 而得到的物質(zhì)。
(2) 抗氧化作用的測定 (2-l)氧化模型體系
氧化模型體系是將Chen等的方法(14)加以改良后進行的。向管形 瓶中加入5mg亞麻酸、lml的0.2M磷酸鉀緩沖液(K-phosphate buffer)(pH7.0; l%TritonX-100)，作為氧化促進劑添加0.05mM氯化鐵(II) 和蒸餾水，在4(TC下進行4分鐘的超音波處理，做成乳化液。加入樣 本(0.2%)和蒸餾水使最終容量為lml，在40'C的恒溫槽中加熱6b分鐘，并振動。對于加熱前及加熱后的反應(yīng)液的過氧化脂質(zhì)的量盡快地通過 硫氰化鐵法進行測定。對于抗氧化作用的評價，通過對加熱前后的過 氧化脂質(zhì)的增加量的比較來進行。
(2-2)硫氰酸鐵法
根據(jù)大澤等的方法(23)進行。向0.05ml的反應(yīng)液中加入99.5%的 乙醇2.25ml、30。/。硫氰酸銨水溶液0.05ml、0.1ml的IN HC1以及O.lml 的0.02MFeCl2/3.5°/。HCl，進行充分攪拌后，測定500nm下的吸光度。 測定時使用Jasco、 V-530UV分光光度計。S.I級分、Chymo級分、維 生素E(VE)及無蛋白質(zhì)對照(none)的比較結(jié)果如圖l所示。另外，各肽 以0.2%的濃度添加。這是因為一般情況下食品添加物的使用濃度是 0.1%左右，所以使用與該濃度相近的值?？梢钥闯觯琒.I樣本顯示出和 a -生育酚(維生素E)同等的抗氧化作用。
(3)抗氧化肽的分離、鑒定 (3-l)陽離子交換色譜分析法
S,I級分溶解到0.05M的乙酸銨緩沖液(pH6.0)中，并使其吸附到用 該緩沖液平衡化的AG50WX2(H +型,50-100目，BioRad)柱上。將非吸附 物質(zhì)用同樣的緩沖液清洗后，將吸附的級分用0.2M的NH4OH洗脫。 將洗脫的吸附級分凍干，獲得堿性肽級分。陽離子交換色譜分析法的 色譜圖、以及各級分的抗氧化試驗結(jié)果如圖2所示。圖2中具有最高 抗氧化活性的級分V進一步用HPLC提純。
(3-2)HPLC
為了分離級分V中存在的抗氧化肽，進行使用反相柱的高效液體 色譜分析法(HPLC)。其中柱使用ODS柱(Pegasil-3000DS，Senshu Scientific Co.)，洗脫時使用從0.1%TFA水溶液到含有0.085%TFA的 60%乙腈溶液的60分鐘的濃度梯度法(l。/。/min)。脈的洗脫位置用220nm 下的吸光度進行了確認。并且，再次進行HPLC時，使用從含有0.1 %TFA 的20%乙腈溶液到含有0.085%TFA的40°/。乙腈溶液的40分鐘的濃度梯度法(0.5。/。/min)。對于通過用反相柱的HPLC分離的抗氧化肽的氨基 酸序列，使用蛋白質(zhì)定序儀(:/口亍^ y乂一夕工:/f"一) G-1005A(匕 工一^、夕卜'八。、乂力一 k社)進行分析。其結(jié)果是獲得了肽l(序列號1)、
肽2(序列號2)、肽3(序列號3)。這些肽的質(zhì)譜分析的結(jié)果如下表l所 示。
表1
肽化學(xué)式質(zhì)譜[1^1+11]+計算值實測值
Tyr-Tyr-Ser-Pro-LeuC32H42N509642.3642.2
Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-'Asp-GlnC45H6。N10Oi6997.4997.4
Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp994.5994.5
表1的質(zhì)譜分析的結(jié)果和蛋白質(zhì)定序儀的結(jié)果一致，因而鑒定了 本發(fā)明的肽的序列。
制劑例l:化妝水
配合以下各成份，按照通常的方法調(diào)制成化妝水。
乙醇 5重量％
甘油 4重量％
BG(l,3-丁二醇) 4重量％
實施例1所獲得的蜂王漿蛋白質(zhì)酶分解物 0.5重量％
擰檬酸 適量
檸檬酸鈉 適量
凈化水 殘余
制劑例2:保健藥水
配合以下各成份，按照通常的方法調(diào)制成保健藥水。
水 88重量°/。
葡萄糖 10重量％
抗壞血酸鈉 4重量％實施例1所獲得的蜂王漿蛋白質(zhì)酶分解物 1重量％
檸檬酸 適量
EDTA2Na 0.5重量％
制劑例3:健康食品(片劑)
配合以下各成份，按照通常的方法調(diào)制成片劑。
淀粉 15重量％
乳糖 25重量％
羥丙基纖維素 4重量％
硬脂酸鎂 1重量％
蟲膠(〉工，y夕) 5重量％
砂糖 45重量％
實施例1所獲得的蜂王漿蛋白質(zhì)酶分解物 5重量％
根據(jù)本發(fā)明，可以獲得源自天然物質(zhì)的、安全性高的抗氧化肽， 并可廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.具有以下氨基酸序列的抗氧化肽Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln。
2. 以權(quán)利要求1所述的抗氧化肽作為有效成分的抗氧化劑。
3. 含有權(quán)利要求l所述的抗氧化肽的食品。
4. 具有以下氨基酸序列的抗氧化肽的制造方法 Asn-Tyr隱Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Ghi，其特征在于，用蛋白酶將源自蜂王漿的蛋白質(zhì)水解。
5. 含有權(quán)利要求l所述的抗氧化肽的化妝品。
全文摘要
本發(fā)明提供具有以下(1)～(3)的任意一種氨基酸序列的抗氧化肽(1)Tyr-Tyr-Ser-Pro-Leu；(2)Asn-Tyr-Pro-Phe-Asp-Val-Asp-Gln；(3)Ser-Leu-Pro-Ile-Leu-His-Glu-Trp。
文檔編號A23L1/30GK101284867SQ20081008526
公開日2008年10月15日 申請日期2005年2月16日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月16日
發(fā)明者雜賀愛, 田邊創(chuàng)一, 西村敏英 申請人:株式會社山田養(yǎng)蜂場