具有抗氧化功能的五肽及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】一種具有抗氧化功能的五肽(AWDPE和DWDPK)及其制備方法，屬于抗氧化肽技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以長(zhǎng)白山榛仁為原料，采用酶控制水解技術(shù)制備抗氧化肽并通過(guò)凝膠過(guò)濾層析Sephadex G?25，Sephadex G?15和反相高效液相層析等技術(shù)分離純化，經(jīng)此方法得到的多肽活性及純度較高，雜質(zhì)較少。對(duì)DPPH、羥基自由基、ABTS的清除率及Fe2+螯合率均有較好的效果，存在顯著的清除作用，具備較強(qiáng)的抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有極大的研究?jī)r(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
具有抗氧化功能的五肽及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于抗氧化肽技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗氧化功能的五肽及其制備方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾多研究表明，機(jī)體氧化應(yīng)激損傷能夠引起代謝失調(diào)，從而加速衰老，引發(fā)老年癡 呆、腫瘤及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病。而通過(guò)外界抗氧化物質(zhì)的攝入能夠在一定程度上清除體 內(nèi)自由基，起到延緩衰老，預(yù)防各種疾病的作用。如今大多數(shù)抗氧化劑都是人工合成的，與 其相比，從天然植物中制備抗氧化劑有著易于吸收，安全無(wú)副作用的優(yōu)點(diǎn)。同時(shí)，我國(guó)擁有 極豐富的動(dòng)植物蛋白資源，利用這一優(yōu)勢(shì)，開(kāi)發(fā)天然抗氧化肽具有重要的意義。
[0003] 吉林省長(zhǎng)白山地區(qū)盛產(chǎn)榛子，雖然歷史悠久，但開(kāi)發(fā)利用方面仍處于比較初級(jí)的 階段，加工僅限于制作糕點(diǎn)、飼料以及榨油等。以長(zhǎng)白山榛仁為原料制備抗氧化肽，將對(duì)長(zhǎng) 白山榛子資源的充分利用和榛仁多肽功能性產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供參考。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的之一是提供一種具有抗氧化功能的五肽及其制備方法，以長(zhǎng)白山榛 仁為原料，采用酶控制水解技術(shù)制備抗氧化肽并通過(guò)凝膠過(guò)濾層析Sephadex G-25， Sephadex G-15和反相高效液相層析等技術(shù)分離純化，經(jīng)此方法得到的多肽活性及純度較 高，雜質(zhì)較少。
[0005] 本發(fā)明的目的之二是對(duì)榛仁抗氧化肽進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用高效液相色譜-電噴霧 飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-ESI-TOF MS/MS)技術(shù)并經(jīng)從頭測(cè)序(de novo)方法進(jìn)行質(zhì)譜解 析，鑒定出兩種新的抗氧化肽AWDPE和DWDPK。
[0006] 具有抗氧化功能的五肽及其制備方法，所述抗氧化肽包括兩條肽，分別為AWDPE (八1&-1'印-48口-?1'〇-6111)和0￥0?1((48。-1'印-48。-?1'〇-1^8)，其制備步驟如下：（1)棒仁抗氧 化肽的制備
[0007] 將2~5g榛仁分離蛋白粉（堿溶酸沉法制備，F(xiàn)unctional Properties of the Protein Isolate and Major Fractions of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China，Dan Wu，Wei_hong Min)溶于lOOmL蒸饋水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2 %~5 %的溶液，90~100 °C水浴10~20min使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH至7~10，加入 A1 calase 2.4L，通過(guò)電位滴定儀維持恒定的pH值;酶解結(jié)束后，溶液在90~100 °C下滅酶10 ~20min，冷卻至室溫，用HC1調(diào)節(jié)pH至7 · 0，5000~8000rpm離心10~20min，取上清液，將其 冷凍干燥后得到粗榛仁抗氧化肽，測(cè)定抗氧化活性。
[0008] (2)榛仁抗氧化肽的分離純化
[0009] 將粗榛仁抗氧化肽加入蒸餾水配成溶液，并過(guò)0.22μηι的濾膜;然后通過(guò)Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（1.6cm X 80cm)層析分離，用紫外檢測(cè)儀在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，并用自動(dòng) 部分收集器進(jìn)行收集組分（1.5mL/管），將分離得到的3種組分收集，冷凍干燥，測(cè)定抗氧化 活性;將活性最強(qiáng)組分進(jìn)行Sephadex G-15層析分離，紫外檢測(cè)儀在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，并用 自動(dòng)部分收集器收集(1.5mL/管），將分離得到的2種組分收集，冷凍干燥，測(cè)定抗氧化活性； 將活性最高組分進(jìn)行反相高效液相層析分離，將得到的5種組分收集，冷凍干燥，測(cè)定抗氧 化活性，活性最高的組分即為本發(fā)明所述的具有抗氧化肽功能的五肽AWDPE和DWDPK。
[0010] (3)榛仁抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定
[0011]采用ESI-TOF MS/MS鑒定ACE抑制肽的氨基酸序列，運(yùn)用de novo方法進(jìn)行質(zhì)譜數(shù) 據(jù)解析。結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果即為本發(fā)明所述的具有抗氧化功能的五肽AWDPE和DWDPK。
[0012] 步驟（1)中，利用〇 · 6mol/L NaOH調(diào)pH值7~10和維持恒定的pH值，酶解溫度為40~ 70 °C、酶解時(shí)間為3~7h，加酶量5000~10000U/g榛仁分離蛋白。
[0013] 步驟(2)中所述的Sephadex G-25凝膠層析和Sephadex G-15凝膠層析，上樣濃度 10~50mg/mL，上樣體積1~5mL，洗脫流速0.1~3mL/min，洗脫液為純水。
[0014] 步驟（2)中所述的反相高效液相層析采用C18色譜柱，流動(dòng)相A為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù) 0.1 % TFA的雙蒸水，B為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1 % TFA的乙腈，上樣濃度0.1~5mg/mL，上樣體積10 ~80yL，100 ~60%B 線(xiàn)性洗脫 30 ~60min;流速0.1 ~lmL/min。
[0015] 本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)的有益效果為：
[0016] 本發(fā)明首次公開(kāi)了具有抗氧化功能的五肽及其制備方法，采用堿性蛋白酶 Alcalase 2.4L酶解榛仁分離蛋白進(jìn)行制備并純化鑒定出兩種未報(bào)道的抗氧化肽，對(duì)DPPH、 羥基自由基、ABTS存在顯著的清除作用，對(duì)Fe 2+具有較好的螯合效果，具備較強(qiáng)的抗氧化活 性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有極大的研究?jī)r(jià)值和廣闊的市場(chǎng)前景。
【附圖說(shuō)明】
[0017] 圖1為榛仁抗氧化肽對(duì)ABTS自由基的清除作用曲線(xiàn)圖；由圖1可知，榛仁抗氧化肽 濃度達(dá)到3mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS自由基的清除率就已經(jīng)達(dá)到96.43%，而Vc在0.5mg/mL時(shí)就已經(jīng) 達(dá)到100 %。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，抗氧化肽對(duì)ABTS自由基清除率在3mg/mL以后保持在98 %~ 100%，此時(shí)抗氧化肽和Vc對(duì)ABTS自由基的清除率基本相同，即抗氧化肽對(duì)ABTS自由基的清 除率為Vc的100%。說(shuō)明抗氧化肽對(duì)ABTS自由基有較強(qiáng)的清除作用，具有較強(qiáng)的抗氧化活 性。
[0018] 圖2為榛仁抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除作用曲線(xiàn)圖；如圖2所示，當(dāng)Vc濃度為 0. lmg/mL時(shí)，清除率就達(dá)到91.22%。榛仁抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而 升高，并在2mg/mL后逐漸穩(wěn)定，8mg/mL時(shí)達(dá)到100%。
[0019] 圖3為榛仁抗氧化肽對(duì)羥基自由基自由基的清除作用曲線(xiàn)圖；Vc作為一種良好的 抗氧化劑，在〇. 5mg/mL時(shí)清除率就能達(dá)到100%。榛仁抗氧化肽對(duì)羥基自由基的清除作用隨 濃度的增加而顯著提高，當(dāng)濃度為8mg/mL時(shí)，清除率達(dá)到85%以上，并在2411^/11^時(shí)達(dá)到 100%〇
[0020]圖4為榛仁抗氧化肽的還原能力作用曲線(xiàn)圖；有還原能力的樣品能使鐵氰化鉀中 的Fe3+還原成Fe2+(亞鐵氰化鉀），產(chǎn)物與FeCl3進(jìn)一步反應(yīng)生成在700nm處有最大吸光峰的普 魯士藍(lán)(Fe 4[Fe(CN)6]3)，因此測(cè)定700nm處吸光值的高低可以反映樣品還原能力的大小，吸 光值越大，則還原能力越強(qiáng)。試驗(yàn)結(jié)果如3.15圖所示，隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽的還 原能力逐漸增強(qiáng)，10mg/mL時(shí)，A700值為1.055，能夠達(dá)到同濃度下EDTA的38.55%。
[0021]圖5為榛仁抗氧化肽對(duì)亞鐵離子的螯合作用曲線(xiàn)圖；0.5mg/mL EDTA能使Fe2+螯合 率達(dá)到100 %，而濃度為10mg/mL時(shí)抗氧化肽的螯合率為90.25 %，12mg/mL時(shí)達(dá)到99.30 %。 可見(jiàn)榛子抗氧化肽對(duì)Fe2+有較好的螯合能力。
[0022]圖6為實(shí)施例Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析圖譜;通過(guò)Sephadex G-25凝膠色譜 將榛子抗氧化肽分離成A1，A2，A3三個(gè)組分。根據(jù)凝膠層析原理，組分A1應(yīng)該為水解未徹底 的蛋白，分子量大于5000Da，而A2、A3為水解得到的多肽，分子量在5000Da以下。
[0023]圖7為實(shí)施例Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析圖譜；Sephadex G-15葡聚糖凝膠適 用的分子量范圍是1〇〇~1500,可以用于緩沖液的交換、脫鹽和分離分子量接近的小分子。 如圖7所示，組分A3經(jīng)過(guò)G-15分離純化得到B1、B2兩種組分。
[0024] 圖8為實(shí)施例反相高效液相色譜分離圖譜;0~lOmin出現(xiàn)的峰是溶劑峰，通常情況 下，溶劑會(huì)有一定的紫外吸收，形成溶劑峰，一般情況下都會(huì)在10分鐘之前出現(xiàn)，并不影響 純化效果。圖譜出峰主要集中在18~40min區(qū)間內(nèi)，分離主要得到5種組分:C1、C2、C3、C4、 C5〇
[0025] 圖9為兩種抗氧化肽質(zhì)譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0026] 以下結(jié)合實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步解釋本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明作任何限定。（1)榛 仁抗氧化肽的制備
[0027] 將榛仁分離蛋白粉與蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的溶液，90°C下水浴15min，從而 破壞其蛋白結(jié)構(gòu)。冷卻后利用〇. 6mol/L NaOH調(diào)pH值達(dá)到9.5，加入Alcalase2.4L(丹麥諾維 信水解酶），添加量8000U/g分離蛋白粉，保持溫度50 °C并通過(guò)電位滴定儀加入0.6mo 1/L NaOH維持恒定的pH值，酶解5h后溶液在95 °C下滅酶15min，冷卻至室溫，加入HC1調(diào)節(jié)pH至 7.0，5000r/min離心1 Omin，取上清液，將其冷凍干燥后得到粗榛子抗氧化肽。
[0028] (2)榛仁抗氧化肽的分離純化
[0029]制備的粗榛仁抗氧化肽，加入蒸餾水配成30mg/mL的溶液，并過(guò)0.22μπι的濾膜。通 過(guò)Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（1.6cm X 80cm)進(jìn)行分離，上樣量2mL，洗脫液為蒸餾水，洗 脫流速0.5mL/min，用紫外檢測(cè)儀在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，并用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集 (1.5!1117管）。分離得到4142 43三個(gè)組分，分別冷凍干燥，測(cè)定抗氧化活性(結(jié)果見(jiàn)表1)，組 分A3具有最強(qiáng)的ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力以及還原能力；而組分A2的還 原力和ABTS自由基以及DPPH自由基的清除能力均不強(qiáng);A1組分總還原能力及DPPH自由基清 除能力最弱均低于未經(jīng)純化的樣品。綜上，選擇組分A3進(jìn)行下一步分離純化。
[0030] 將組分A3，加入蒸餾水配成30mg/mL的溶液，并過(guò)0.22μηι的濾膜。用Sephadex G-15 葡聚糖凝膠柱（1.6cm X 80cm)進(jìn)行分離，上樣量2mL，洗脫液為蒸餾水，洗脫流速0.5mL/min， 用紫外檢測(cè)儀在280nm波長(zhǎng)下檢測(cè)，并用自動(dòng)部分收集器進(jìn)行收集組分(1.5mL/管）。分離得 至|JB1、B2兩種組分，冷凍干燥，測(cè)定抗氧化活性(結(jié)果見(jiàn)表2)，組分B2的抗氧化活性強(qiáng)于B1， 所以收集組分B2,利用高效液相色譜進(jìn)一步分離純化。
[0031] 采用高效液相色譜法，對(duì)組分B2進(jìn)行分離純化。配成lmg/mL的溶液，并過(guò)0.22μπι的 濾膜。色譜條件:儀器：日本島津液相色譜儀;色譜柱:Diamonsi 1 C18(250*4.6，5μπι);流動(dòng) 相(Α:雙蒸水+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸;8:乙腈+質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%三氟乙酸），上樣量2(^1^，洗 脫流速0.5mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220nm，柱溫30 °C。95~70 %B線(xiàn)性洗脫。分離得到5種組分:Cl、 C2、C3、C4、C5,由于反相高效液相色譜分離得到的樣品量較少，所以選用酶標(biāo)儀測(cè)定羥基自 由基、ABTS、還原力三個(gè)指標(biāo)，濃度均為0.5mg/mL。結(jié)果如表3所示，與其他4種組分相比，C2 具有最強(qiáng)的還原力和ABTS自由基清除能力，以及較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，所以C2的抗 氧化活性最強(qiáng)，C4次之，其他組分活性較弱。因此我們選擇對(duì)C2組分進(jìn)行收集和結(jié)構(gòu)鑒定。 [0032] (3)榛仁抗氧化肽的結(jié)構(gòu)鑒定
[0033] 采用Agilent 1200型快速分離液相色譜系統(tǒng)和Agilent 6520Q-T0F質(zhì)譜儀。液相 條件:色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(2. IX 150mm，3.5ym);二元線(xiàn)性梯度洗脫:流動(dòng) 相：（A)0.1 %甲酸水溶液；（B)乙腈；流動(dòng)相梯度：0~30min，5 %-30 ;柱溫35°C，流速 0 · 4mL/min，進(jìn)樣量 5yL〇
[0034] 質(zhì)譜條件:采用電噴霧正離子掃描模式(ESI + );質(zhì)量掃描范圍m/z 100~2000;干 燥氣流速(N2)為9L/min，干燥器溫度300°C，霧化電壓35psig，毛細(xì)管電壓為3.5kV，碎裂電 壓175V，錐孔電壓65V，八級(jí)桿射頻電壓250V，二級(jí)質(zhì)譜碰撞電壓12-15eV。
[0035] 肽段序列解析運(yùn)用Peaks 7.5軟件（Bioinformatics Solutions Inc)。所鑒定出 榛仁抗氧化肽的結(jié)構(gòu)分別是AWDPE和DWDPK，它們的分子量分別是616.25和659.29Da。
[0036] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)先實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，在不脫離本發(fā)明原理的前提下， 兩種抗氧化肽的氨基酸序列其他排列組合方式及對(duì)多肽做出的若干改進(jìn)和修飾，也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0037]表1 :G_25分離得到的各組分抗氧化指標(biāo)比活
[0038]
[0039] 表2 :G_15分離得到的各組分抗氧化指標(biāo)比活
[0040]
[0041 ]表3:反相高效液相分離得到的各組分抗氧化指標(biāo)比活
[0042]
【主權(quán)項(xiàng)】
1 · 一種具有抗氧化功能的五肽，其特征在于：同時(shí)包括AWDPE(Ala-Trp-Asp-Pro-Glu) 和 DWDPK( Asp-Trp-Asp-Pro-Lys)兩種五肽。2. 權(quán)利要求1所述的一種具有抗氧化功能的五肽的制備方法，其步驟如下： (1) 榛仁抗氧化肽的制備 將2~5g榛仁分離蛋白粉溶于100mL蒸餾水配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%~5%的溶液，90~100 °C水浴10~20min使蛋白變性，冷卻后調(diào)節(jié)pH至7~10,加入Alcalase2.4L，維持恒定的pH 值；酶解結(jié)束后，溶液在90~100°C下滅酶10~20min，冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH至7.0,5000~ 8000rpm離心10~20min，上清液冷凍干燥后得到粗榛仁抗氧化肽； (2) 榛仁抗氧化肽的分離純化 將粗榛仁抗氧化肽加入蒸餾水配成溶液，并過(guò)〇. 22μηι的濾膜;然后通過(guò)Sephadex G-25 葡聚糖凝膠柱層析分離，將分離得到的組分收集，冷凍干燥;將活性最強(qiáng)組分進(jìn)行Sephadex G-15層析分離，將分離得到的組分收集，冷凍干燥;將活性最高組分進(jìn)行反相高效液相層析 分離，將分離得到的組分收集，冷凍干燥，活性最高的組分即為具有抗氧化肽功能的五肽 AWDPE和DWDPK。3. 如權(quán)利要求2所述的一種具有抗氧化功能的五肽的制備方法，其特征在于:步驟（1) 中，是利用〇.6mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH值至7~10和維持恒定的pH值。4. 如權(quán)利要求2所述的一種具有抗氧化功能的五肽的制備方法，其特征在于:酶解溫度 為40~70°C、酶解時(shí)間為3~7h，加酶量5000~10000U/g榛仁分離蛋白粉。5. 如權(quán)利要求2所述的一種具有抗氧化功能的五肽的制備方法，其特征在于:步驟(2) 中所述的Sephadex G-25凝膠層析和Sephadex G-15凝膠層析，上樣濃度10~50mg/mL，上樣 體積1~5mL，洗脫流速0.1~3mL/min，洗脫液為純水。6. 如權(quán)利要求2所述的一種具有抗氧化功能的五肽的制備方法，其特征在于:步驟(2) 中所述的反相高效液相層析采用C18色譜柱，流動(dòng)相A為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%TFA的雙蒸水，B 為含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇.l%TFA的乙腈，上樣濃度0.1~5mg/mL，上樣體積10~80yL，100~60%B 線(xiàn)性洗脫30~60min;流速0.1~lmL/min。
【文檔編號(hào)】C07K7/06GK106008670SQ201610517727
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年7月4日
【發(fā)明人】閔偉紅, 劉春雷, 李鴻梅, 方麗, 王輯
【申請(qǐng)人】吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)