一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液及其制備方法和應(yīng)用
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種優(yōu)化后的復(fù)性液，該復(fù)性液可以使粗制品半抑制率比原來(lái)提高近一倍，顯著提升了科研單位及生產(chǎn)企業(yè)的重組蛋白制品的制備效率與利潤(rùn)收益，該復(fù)性液的制備方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。通過(guò)對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物使用本發(fā)明的復(fù)性液及變復(fù)性方法進(jìn)行生產(chǎn)，有效解決了TP25包涵體表達(dá)中復(fù)性效率低下問(wèn)題，提高了復(fù)性液中活性蛋白的回收率。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液及其制備方法和 應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液及其 制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 原核表達(dá)是一種常用的異源表達(dá)方式，利用此表達(dá)系統(tǒng)能實(shí)現(xiàn)快速、大量、高效獲 得重組蛋白的目的，而且擁有耗時(shí)短、可控性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，所以很多企業(yè)都選用此表達(dá)系統(tǒng)， 但這種表達(dá)方式在表達(dá)過(guò)程中極易形成包涵體，雖然包涵體預(yù)示著較大的表達(dá)量，但經(jīng)變 復(fù)性后的活性回收率大大降低，影響了生產(chǎn)效率與收益，加大了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本。
[0003] 我國(guó)每年乳腺癌新增病例超二十萬(wàn)，30%為HER2陽(yáng)性，TP25是針對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺 癌的新型靶向抗腫瘤藥物，它是利用現(xiàn)代基因工程技術(shù)手段，通過(guò)原核表達(dá)方式獲得的一 類(lèi)蛋白藥物，然而由于其表達(dá)過(guò)程中極易形成包涵體，活性回收率大大降低，影響了生產(chǎn)效 率與收益，加大了產(chǎn)品的生產(chǎn)成本，因此，尋找一種有效的制備HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物 TP25包涵體的復(fù)性液及復(fù)性方法，使其既能提高蛋白復(fù)性率又能有效降低復(fù)性成本，具有 非常重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的之一是提供了一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的 復(fù)性液。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0006] 一種制備HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物TP25包涵體的復(fù)性液，包括以下組份：100mM Na2HP04 ;l·4mMGSH;lmMEDTA;0·5M精氨酸;0·5M尿素，所述復(fù)性液的pH值為8·5。
[0007] 本發(fā)明的目的之二是提供了上述提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液的制備方 法。本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] 如上所述的一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液的制備方法，包括以下步 驟:精確稱(chēng)取精氨酸、Na2HP0 4和EDTA，加入到15 °C~30 °C的注射用水中攪拌溶解，用冰醋酸 調(diào)ph至8.5，然后加入尿素?cái)嚢枞芙?，?5 °C~30°C注射用水補(bǔ)足余量，常溫下繼續(xù)攪拌30 分鐘，然后預(yù)冷至7~12°C，使用前一小時(shí)在攪拌條件下加入GSH，一直攪拌至使用。
[0009] 本發(fā)明的目的之三是提供了如上所述的一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性 液在HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物TP25包涵體變復(fù)性中的應(yīng)用。
[0010] 作為優(yōu)選，上述應(yīng)用的具體方法步驟為：
[0011] (1)菌種活化和發(fā)酵培養(yǎng):進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)，然后進(jìn)行放大誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，收集 發(fā)酵液中的菌體細(xì)胞，利用超生破碎法獲得表達(dá)出的包涵體；
[0012] (2)包涵體變復(fù)性:使用lys i s buffer對(duì)包涵體進(jìn)行清洗，以10~14ml/mg的比 例向收集到的潔凈包涵體中加入預(yù)冷至2~8°C的變性液進(jìn)行變性，充分?jǐn)嚢韬箅x心收集變 性完全的蛋白溶液，在250~300rpm攪拌速度下，以1:70~1:120倍體積比將變性液逐滴加 入7~12 °C的上述復(fù)性液中，將復(fù)性液在7~12 °C條件下復(fù)性14~18小時(shí)；
[0013] ⑶蛋白精制:根據(jù)工藝要求，進(jìn)行純化工藝，最終獲得目的蛋白制品。
[0014]作為優(yōu)選，步驟(2)中所述變性液與復(fù)性液的體積比為1:120。
[0015] 作為優(yōu)選，步驟（2)中所述變性液包括以下組份:6M Guani dine-Cl，100mM磷緩 (pH=8.0),2mM EDTA,6mM DTT〇
[0016] 作為優(yōu)選，所述步驟(2)中，12000~15000rpm、6~10°C條件下離心15~20分鐘收 集變性完全的蛋白溶液。
[0017] 作為優(yōu)選，所述步驟(2)中，復(fù)性結(jié)束后將復(fù)性液在10000~12000rpm、2°C~8°C條 件下離心30~45分鐘，收集上清液，再進(jìn)行超濾濃縮后便得到復(fù)性后的蛋白溶液。
[0018] 作為優(yōu)選，所述步驟(1)中進(jìn)行放大誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)IPTG使用濃度為O.lmM。
[0019] 本發(fā)明的有益效果為：
[0020] (1)本發(fā)明提供了一種優(yōu)化后的復(fù)性液，該復(fù)性液可以使粗制品半抑制率比原實(shí) 驗(yàn)步驟提高近一倍，顯著提升了科研單位及生產(chǎn)企業(yè)的重組蛋白制品的制備效率與利潤(rùn)收 益。該復(fù)性液的制備方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)的需要。
[0021] (2)通過(guò)對(duì)HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物使用一種優(yōu)選的包涵體復(fù)性液及變復(fù)性方法 進(jìn)行生產(chǎn)，有效解決了 TP25包涵體表達(dá)中復(fù)性效率低下問(wèn)題，提高了復(fù)性液中活性蛋白的 回收率。
[0022] (3)通過(guò)實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析，復(fù)性方法選用滴加稀釋法，使蛋白回收率由74%提高至 89% 〇
[0023] (4)通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)研究得到，制備HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物TP25包涵體的復(fù)性方 法中，在相同表達(dá)時(shí)間前提下，IPTG用量為0.1 mM時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的包涵體量比1.0M時(shí)要大，所 以選定IPTG使用濃度為0.1 mM，這使IPTG使用量縮減為原來(lái)的10%，表達(dá)量比1.0M誘導(dǎo)量提 升21%，縮減成本的前提下帶來(lái)了蛋白表達(dá)量的提高，另外用量的減少也降低了最終產(chǎn)品 IPTG殘留，利于產(chǎn)品質(zhì)量。
【附圖說(shuō)明】
[0024] 圖1:不同處理所得樣品SDS-PAGE圖。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步具體說(shuō)明。
[0026] 實(shí)施例1
[0027] 一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液，包括以下組份：100mM Na2HP〇4; 1.4mM GSH; ImM EDTA; 0.5M精氨酸;0.5M尿素，所述復(fù)性液的pH值為8.5。
[0028]所述的提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液是由以下方法制得的：
[0029]精確稱(chēng)取87.1 克L-精氨酸；35.814克Na2HP〇4; 0.29224克EDTA，用700ml、15°C注射 用水中進(jìn)行攪拌溶解，冰醋酸調(diào)pH至8.5,加入30.03克尿素溶解后用15°C注射用水補(bǔ)至 1000ml，常溫下繼續(xù)攪拌30分鐘，然后預(yù)冷至12°C，使用前一小時(shí)在攪拌條件下加入430毫 克GSH(還原性谷胱甘肽），一直攪拌至使用。
[0030] 實(shí)施例2:使用不同復(fù)性液所得粗制品的半抑制濃度對(duì)比
[0031] 設(shè)置不同配方復(fù)性液組，其緩沖體系都為PH = 9.5的100mM磷酸鹽緩沖液，并測(cè)定 使用對(duì)應(yīng)復(fù)性液所得粗制品半抑制濃度(IC50)，復(fù)性液組成如下所示，所測(cè)IC50結(jié)果如表1 所示。
[0032] Buffer l:lmM GSH&0.4mM GSSG;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.1M精氨 酸；ImM EDTA。
[0033] Buffer2:lmM GSH&0.4mM GSSG;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.3M精氨 酸；ImM EDTA。
[0034] Buffer3:lmM GSH&0.4mM GSSG;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.5M精氨 酸；ImM EDTA。
[0035] Buffer4:1.4mM GSH;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.1M精氨酸；ImM EDTA。
[0036] Buffer5:1.4mM GSH;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.3M精氨酸；ImM EDTA。
[0037] Buffer6:1.4mM GSH;2%(v/v)甘油；0.1M尿素；0.1M NaCl;0.5M精氨酸；ImM EDTA。
[0038] Buffer7:1.4mM GSH;0.5M尿素；0.5M精氨酸；ImM EDTA。
[0039] Buffer8:1.4mM GSH;0.5M精氨酸；ImM EDTA。
[0040] 表2.使用不同復(fù)性液所得粗制品半抑制濃度
[0041]
[0042]由表1中數(shù)據(jù)可知，使用Buffer 7復(fù)性液所得粗制品的IC50最低，因此選定其為最 終使用復(fù)性液。選定復(fù)性液組成成分后，進(jìn)行了復(fù)性液PH的確定，選擇8.5與9.5兩組，復(fù)性 液組成如下所示，IC50結(jié)果如表2所示。
[0043] Buffer l(PH=9.5):1.4mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸；0.5M尿素。
[0044] Buffer 2(PH=9.5):1.8mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸。
[0045] Buffer 3(PH=8.5):1.4mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸；0.5M尿素。
[0046] 表3.使用不同pH的復(fù)性液所得粗制品半抑制濃度
[0047]
[0048] 由半抑制濃度可知，當(dāng)復(fù)性液pH為8.5時(shí)，復(fù)性效果更優(yōu)，因此最終確定復(fù)性液配 方為:pH=8.5;100mM Na2HP04;1.4mM GSH;lmM EDTA;0.5M精氨酸；0.5M尿素。
[0049] 優(yōu)化后的復(fù)性液使粗制品半抑制率比原實(shí)驗(yàn)步驟提高40%以上，顯著提升了科研 單位及生產(chǎn)企業(yè)的重組蛋白制品的制備效率與利潤(rùn)收益。
[0050]實(shí)施例3:變復(fù)性方法的確定
[0051 ]分別用透析和稀釋兩種方法進(jìn)行復(fù)性實(shí)驗(yàn)對(duì)比，透析復(fù)性選擇鹽酸胍濃度分別為 4M; 3M; 2M; 1M; 0M五個(gè)濃度，進(jìn)行逐步去除胍鹽透析復(fù)性，結(jié)果如表1所示：
[0052] 表1.不同復(fù)性方法對(duì)比
[0053]
[0054]由表中結(jié)果可知，透析法的蛋白回收率比稀釋法低，且在中間過(guò)程用肉眼可發(fā)現(xiàn) 大量蛋白沉淀，透析操作過(guò)程人為因素影響較大，透析換液繁瑣，對(duì)產(chǎn)業(yè)化有較多不便因 素，因此選用滴加稀釋法復(fù)性，有效提高蛋白回收率至89 %以上。
[0055] 實(shí)施例4
[0056] 一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液在HER2陽(yáng)性乳腺癌靶向藥物TP25包涵 體變復(fù)性中的應(yīng)用，具體方法步驟如下：
[0057] 1.菌種活化。將帶有質(zhì)粒的工程菌株(E.col i BL21)劃線(xiàn)接種與含50ug/ml卡那 霉素選擇性L(fǎng)B平板，恒溫37°C培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落，挑取單菌落與含抗生素液體LB培養(yǎng)基中 進(jìn)行過(guò)夜培養(yǎng)。
[0058] 2.發(fā)酵培養(yǎng)。將培養(yǎng)好的種子以1:80的比例轉(zhuǎn)接，進(jìn)行放大發(fā)酵培養(yǎng)，2.5小時(shí)對(duì) 發(fā)酵液進(jìn)行0D600檢測(cè)，當(dāng)0D值達(dá)到0.6~0.7時(shí)加入IPTG至終濃度0.1 mM，誘導(dǎo)表達(dá)8小時(shí)。
[0059] 3.包涵體制備。將發(fā)酵液轉(zhuǎn)入離心管，10000rpm、2°C ;離心15分鐘收集菌體，并記 錄濕菌體量。以 12ml/mg的比例加入Lys i s buffer I(50mM Tr i s pH8.0,20mM EDTA, lOOmM NaCl，5%tr i ton-X 100)進(jìn)行菌體重懸，然后加入溶菌酶至終濃度180ug/ml，室溫 靜置20分鐘后冰浴超生破碎。將破碎菌體以12000rpm、10°C離心25分鐘收集包涵體并記錄 包涵體濕重，以 12ml/mg的比例分別用Lys i s buffer I與Lys i s buffer I I(50mM Tr i s pH8.0,20mM EDTA，100mM NaCl)清洗包涵體四次，最后 10°C、12000rpm離心 15min收集 包涵體。以 12ml/mg的比例加入2M Guani dine-HCl buffer(50mM NaCl，100mM Tr i s_Cl (pH8.0)，6mM DTT)清洗包涵體兩次，最后用Lys i s buffer I I清洗兩次，得到潔凈的 TP25包涵體。
[0060] 4.包涵體變復(fù)性。將收集到的潔凈TP25包涵體以14ml/mg的比例加入預(yù)冷至2°C的 Denature buffer(6M Guani di ne-Cl，100mM磷緩（pH=8.0)，2mM EDTA，6mM DTT)進(jìn)行包 涵體變性，待全部包涵體溶解后，15000rpm、10 °C離心20分鐘，收集上清即為所得變性液。在 攪拌條件下，將變性液逐滴緩慢加入已準(zhǔn)備好12°C的復(fù)性液中，全部加完后繼續(xù)攪拌30分 鐘，放置12°C條件下靜置14小時(shí)。然后將復(fù)性液在12000rpm、8°C條件下離心30分鐘，收集上 清液，再進(jìn)行超濾濃縮后便得到復(fù)性后TP25蛋白溶液。
[0061] 5.蛋白精制。利用陰離子交換層析技術(shù)進(jìn)行初步純化，最終獲得純度為92%的 TP25蛋白，蛋白回收率達(dá)85%以上。
[0062]實(shí)施例5: IPTG誘導(dǎo)濃度的優(yōu)化
[0063] 分別選取IPTG終濃度為0.1;0.4;0.7;1.011^，以及發(fā)酵時(shí)間為1 ;2;3;4;5;6;7小時(shí) 做正交處理試驗(yàn)，破壁后收集包涵體，將各不同處理樣品等量上樣進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)表達(dá) 量。1到4號(hào)分別為IPTG 0.1;0.4;0.7;1.OmM誘導(dǎo)一小時(shí)的電泳結(jié)果，隨后四個(gè)為兩小時(shí)，以 次類(lèi)推，結(jié)果如圖1所示。
[0064]
[0065]
[0066]結(jié)果顯示前三小時(shí)蛋白整體表達(dá)水平較低，從四小時(shí)后開(kāi)始積累，且各不同濃度 差異不明顯，因此直接選用〇. 1與1. OmM進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，表達(dá)情況如表4所示：
[0067] 表4.不同IPTG用量所得包涵體量
[0068]
[0069]注:上表中數(shù)據(jù)為每400ml發(fā)酵液收集包涵體變性后總蛋白量。
[0070]由上表可知，在相同表達(dá)時(shí)間前提下，IPTG(誘導(dǎo)劑）用量為O.lmM時(shí)誘導(dǎo)表達(dá)的包 涵體量比1.0M時(shí)要大，所以選定IPTG使用濃度為O.lmM，這使IPTG使用量縮減為原來(lái)的 10%，表達(dá)量比1.0M誘導(dǎo)量提升21%，縮減成本的前提下帶來(lái)了蛋白表達(dá)量的提高，另外用 量的減少也降低了最終產(chǎn)品IPTG殘留，利于產(chǎn)品質(zhì)量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液，其特征在于包括以下組份：l〇〇mM Na2HP04;1.4mMGSH ;lmMEDTA;0.5M精氨酸;0.5M尿素，所述復(fù)性液的pH值為8.5。2. 如權(quán)利要求1所述的一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液的制備方法，其特征 在于包括以下步驟:精確稱(chēng)取精氨酸、Na2HP〇4和EDTA，加入到15 °〇30 °C的注射用水中攪拌 溶解，用冰醋酸調(diào)ph至8.5,然后加入尿素?cái)嚢枞芙?，?5t>3(TC注射用水補(bǔ)足余量，常溫 下繼續(xù)攪拌30分鐘，然后預(yù)冷至7~12°C，使用前一小時(shí)在攪拌條件下加入GSH，一直攪拌至 使用。3. 如權(quán)利要求1所述的一種提高原核包涵體表達(dá)復(fù)性率的復(fù)性液在HER2陽(yáng)性乳腺癌靶 向藥物TP25包涵體變復(fù)性中的應(yīng)用。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，具體方法步驟為： 菌種活化和發(fā)酵培養(yǎng):進(jìn)行菌種活化培養(yǎng)，然后進(jìn)行放大誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)，收集發(fā)酵液中 的菌體細(xì)胞，利用超生破碎法獲得表達(dá)出的包涵體； 包涵體變復(fù)性:使用lysis buffer對(duì)包涵體進(jìn)行清洗，以10~14ml/mg的比例向收集到 的潔凈包涵體中加入預(yù)冷至2~8°C的變性液進(jìn)行變性，充分?jǐn)嚢韬箅x心收集變性完全的蛋 白溶液，在250~300rpm攪拌速度下，以1:70~1:120倍體積比將變性液逐滴加入7~12°C的上 述復(fù)性液中，將復(fù)性液在7~12°C條件下復(fù)性14~18小時(shí)； 蛋白精制:根據(jù)工藝要求，進(jìn)行純化工藝，最終獲得目的蛋白制品。5. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于步驟(2)中所述變性液與復(fù)性液的體積比為1: 120〇6. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中所述變性液包括以下組份:6M Guanidine-Cl, 100 mM 磷緩（pH= 8.0)，2mM EDTA, 6mM DTT〇7. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中，12000~15000rpm、6~10°C條件 下離心15~20分鐘收集變性完全的蛋白溶液。8. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟(2)中，復(fù)性結(jié)束后將復(fù)性液在10000 ~12000rpm、2°08°C條件下離心30~45分鐘，收集上清液，再進(jìn)行超濾濃縮后便得到復(fù)性后 的蛋白溶液。9. 如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述步驟（1)中進(jìn)行放大誘導(dǎo)發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)IPTG 使用濃度為O.lmM。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK106008668SQ201610498793
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年6月29日
【發(fā)明人】曹強(qiáng)庚, 龐廣禮, 彭延杰, 林童俊, 李鋒, 梁邦領(lǐng)
【申請(qǐng)人】山東省生物制品研究所