專利名稱：：一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的法氏囊七肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的法氏囊七肽，及其在免疫中的應(yīng)用(提高動物的免疫能力，能提高疫苗的免疫效果及影響腫瘤細胞的活性)，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：(bursaofFabricus,BF)HieronymusFabricusT1961^f-U現(xiàn)，同時并明確了腔上囊的形態(tài)和位置，由此而命名為bursaofFabricus0法氏囊是禽類特有的體液免疫的中樞淋巴器官，位于泄殖腔背側(cè)，其盲端呈囊狀，朝向軀體前端，頸部以短柄朝向軀體后下方，開口于泄殖腔。早期的研究者觀察到法氏囊隨性成熟而逐漸退化，所以一直認為它是與生殖生理有關(guān)的器官。自1956年，Glick等發(fā)現(xiàn)摘除法氏囊會降低雛雞對沙門氏菌“0”抗原的抗體生成以來，法氏囊被人們確認為禽類特有的中樞淋巴器官，是B細胞的最早發(fā)生場所，B細胞由它遷移到外周淋巴器官定居和繁衍，執(zhí)行免疫功能。1960年，Glick等報道了注射6次丙酮處理9小時法氏囊粗提物的生理鹽水懸液，可以提高摘除法氏囊的雛雞對綿羊紅細胞(SRBC)的抗體水平。Baba等1976年報道用雞法氏囊提取液給切除法氏囊的雛雞注射后，可使這些雞獲得產(chǎn)生IgG的能力并提高抗體水平。1976年，Brand發(fā)現(xiàn)法氏囊提取物能誘導(dǎo)雛雞骨髓細胞表達Th-I抗原，并還存在有促進早期B細胞表達Bu-I抗原的因子，而且囊提取液濃度越低，對誘導(dǎo)B細胞分化的能力就越強。1981年，高舜德等進行了雞胚法氏囊提取液對法氏囊復(fù)生的研究。1982年，Eerola等報道了由體外培養(yǎng)的法氏囊上皮細胞及無血清的培養(yǎng)上清具有促進B淋巴細胞分化的生物學(xué)特性。Audhya等在1986年首次報道了從160g雞的法氏囊中分離到1.3mg囊素(bursin,BS)。經(jīng)質(zhì)譜鑒定分析，認為得到BS是一種三肽排列結(jié)構(gòu)的物質(zhì)，其氨基酸組成順序為Lys-His-Gly-NH2，其中LysHisGlyNH2為10.910.8，并證明它能誘導(dǎo)B細胞前體的分化，且能特異性地提高人DaudiB細胞中cAMP和cGMP的水平，而對T細胞較弱。當(dāng)用濃度為100ug/ml的BS進行刺激時，B淋巴細胞內(nèi)的cAMP和cGMP的水平可達最高值8-15pmol/ml，而對T淋巴細胞則只能使其cGMP水平升高，不能使其cAMP水平升高。這是從法氏囊得到且有關(guān)B細胞發(fā)育的第一個結(jié)構(gòu)明確的活性因子。Pichart等(1973)曾于大鼠肝臟分離出一種增殖因子，具有與BS類似的三肽結(jié)構(gòu)(Gly-His-Lys)。1989年，Viamotes等利用小鼠和兔抗BS多抗進行免疫組化染色，確定BS分布于濾泡的皮髓分界上皮(CME)和髓質(zhì)的樹枝網(wǎng)狀上皮細胞(DREC)以及濾泡間表面上皮(IFSE)基底膜中。秦小強等也認為BS由上述細胞產(chǎn)生。1990年，Audhya等用免疫學(xué)方法檢測證實BS不僅存在于鳥類的BF上皮中，還存在于哺乳動物胎兒骨髓和肝臟內(nèi)膽管上皮細胞中。他們又于1991年報道，從牛骨髓和肝臟分離出的前囊素(probursin)，其氨基酸組成順序為Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Lys-Pro-Arg-Lys-His-Gly-Arg-Arg,其中第9-11個氨基酸恰好是BS。經(jīng)檢測亦具有與BS相同的生物學(xué)特性。BS前體及其水解后的BS的活性肽段除可誘導(dǎo)B細胞的分化外，還可調(diào)節(jié)骨髓的其他功能。當(dāng)經(jīng)門脈系統(tǒng)進入肝臟竇狀隙后，亦可調(diào)節(jié)肝細胞和枯氏細胞的功能。1995年，張紅衛(wèi)等從成年牛肝臟中提取到BS類生物活性物質(zhì)。成年牛肝臟已不是B淋巴細胞發(fā)生的器官，卻仍然含有促進淋巴細胞分化的活性分子，說明這種活性因子無種間特異性。湛南輝等(1997)用單抗免疫組化法對BS進行組織定位，發(fā)現(xiàn)BS分布于法氏囊的邊緣上皮、樹突網(wǎng)狀上皮濾泡間上皮、連濾泡上皮、連濾泡支持以及T細胞區(qū)(TDIA)的基底膜上皮等多種細胞上。BS陽性反應(yīng)不僅在BF上，而且在胸腺、脾臟、哈德氏腺、骨髓以及法氏囊；細胞區(qū)亦有特異性陽性反應(yīng)。在研究過程中發(fā)現(xiàn)冰凍切片經(jīng)PBS處理后，陽性反應(yīng)消失，從而表現(xiàn)BS的存在方式可能為非細胞結(jié)合性的。張錦華等在隨后的研究中進一步發(fā)現(xiàn)，能提高法氏囊指數(shù)、能促進體重與法氏囊重的正常生理發(fā)育的活性物質(zhì)更集中于T區(qū)，而不是非T區(qū)。許多學(xué)者對BS促進高水平抗體產(chǎn)生的機理進行了研究。ArmBrand等證實-.提高了血清中第二信使cGMP的含量，增加了cGMP和cAMP的比值，提高了B細胞將DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA的速度，促進了B細胞內(nèi)蛋白質(zhì)(即抗體)的合成，從而提高了血清中特異性抗體水平。Audhya等(1986)證明BS提高了淋巴細胞的轉(zhuǎn)化率，促進了B細胞的分化，而B細胞則是產(chǎn)生抗體的細胞，因而提高了特異性抗體水平。Audhya等的研究結(jié)果表明，在BS誘導(dǎo)淋巴細胞分化過程中，伴有細胞內(nèi)cGMP和cAMP濃度的升高，但這種作用對B淋巴細胞極明顯而對T淋巴細胞較弱。鄭昌學(xué)等用12.5-250ug/ml不同濃度的BS誘導(dǎo)C57純系小鼠脾細胞，可使細胞內(nèi)cAMP濃度明顯升高。姜秀麗在體外實驗中，通過細胞計數(shù)，初步斷定抗體效價的升高與單純的細胞數(shù)量增加沒有直接關(guān)系，從而表明囊素提高雜交瘤細胞抗體的分泌不是通過促進細胞增殖實現(xiàn)的，而可能是誘發(fā)細胞的一系列復(fù)雜的生化變化過程來完成的。目前已知的B細胞信號傳遞途徑包括蛋白酪氨酸磷酸化途經(jīng)，磷脂酰肌醇(PI)途經(jīng)，磷脂酰肌醇-3-激酶(PI-3-K)和磷脂酶C(PKC)途經(jīng)，G蛋白偶聯(lián)的信號傳導(dǎo)途經(jīng)，至于囊素的作用機理如何尚須進一步研究。Guellati等發(fā)現(xiàn)BS對雞腦垂體中腎上腺素皮質(zhì)激素(ACTH)中樞的生理發(fā)育起重要作用當(dāng)胚胎早期(SOhr)雞胚的BF切除后，其ACTH中樞的發(fā)育出現(xiàn)各種異常改變；但若在切除BF后2-5d內(nèi)給雞胚再注射IOOfg-IOOpgBS,則可恢復(fù)ATCH的正常發(fā)育，因此，他們認為BS可能是來自B細胞免疫系統(tǒng)而作用于下丘腦-垂體_腎上腺皮質(zhì)中樞的信號。Youbicier-Simo等報道，BS在雞的松果體生物節(jié)律活性的正常發(fā)育中起重要作用。雞胚胎早期切除BS，其褪黑色素水平及松果體乙酰轉(zhuǎn)氨酶的生物節(jié)奏調(diào)節(jié)幅度均降低50%，但如果給這些雞胚在切除BF后的2-5天內(nèi)注射BS，則可使其恢復(fù)松果體的有關(guān)生物學(xué)功能，而且低濃度(IOOfg)的BS比高濃度的(IOOpg)更有效。張紅衛(wèi)等從已不是淋巴細胞發(fā)生器官的成年牛肝臟中提取到能夠促進淋巴細胞增殖分化的類BS活化因子，說明這種因子可能類似于其它內(nèi)分泌激素，直接釋放到血液中起作用，調(diào)節(jié)肝細胞和Kupffer細胞的生長。作為機體內(nèi)的一種生物活性因子，如同其它已發(fā)現(xiàn)的因子一樣，其作用具有雙向性，即適量時增強免疫效應(yīng)，超量時則起抑制作用。這一點姜秀麗在研究囊素對體外培養(yǎng)雜交瘤細胞抗體分泌的影響時，發(fā)現(xiàn)適當(dāng)濃度的囊素能促進抗體的分泌，而高濃度囊素(lmg/ml)能夠造成雜交瘤細胞凋亡并抑制其抗體分泌。這對以后研究體內(nèi)法氏囊細胞的凋亡及前B淋巴細胞的凋亡有一定的意義，但是這種誘導(dǎo)細胞凋亡的機制還有待于進一步研究。1991年鄭昌學(xué)、高奮標(biāo)用空斑形成細胞(PFC)法為主要測活手段，研究了2_3月齡北京鴨腔上囊中免疫活性因子的本質(zhì)及其在整體水平上的生物學(xué)作用。提取的粗提物分子量小于lOOOODa，它們可顯著提高小鼠脾PFC的數(shù)目及對抗B細胞抑制劑環(huán)磷酰胺(CP)對小鼠的毒理作用，促進B細胞的發(fā)育及正常功能的發(fā)揮，還能明顯增多已脫受體的豬胸腺細胞中E-玫瑰形成細胞(ERFC)的數(shù)目。80°C或蛋白水解酶處理，該提取物的促PFC活性喪失。同年，高奮標(biāo)將此粗提物S印hadexG-15和S印hadexG_10兩步分子篩層析后，得到了部分純化的促PFC活性因子，該因子的分子量小于75KD。用高壓液相色譜(HPLC)進一步分離活性組分，表明活性物質(zhì)帶有較多正電荷，極性較強。因此，可以認為該提取物是BS或其類似物。1992年，Murthy等報道，大劑量的法氏囊提取物在體外可以促進PHA誘導(dǎo)的淋巴細胞的轉(zhuǎn)化，并確信是法氏囊提取物中囊素以外的物質(zhì)在起作用。王興金等(1994)實驗表明法氏囊提取物，提高雞的特異性抗體產(chǎn)生能力和對環(huán)磷酰胺造成的免疫抑制有一定的拮抗作用，這種作用與所用提取液的用量多少有關(guān)。張紅衛(wèi)等(1995)證實法氏囊組織提取物具有抵抗病毒、保護法氏囊正常發(fā)育的作用。1996年孫紅斌和魏財文發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的法氏囊器官和細胞及其上清中的分泌物可加強雞的免疫能力，顯著提高雞外周血中總球蛋白含量和淋巴細胞數(shù)量，促進特異性抗體的產(chǎn)生，增加外周淋巴細胞的；E玫瑰花環(huán)形成率，提高雞對布氏凝集抗原刺激而產(chǎn)生的抗體水平。LowandKinger等研究人員已經(jīng)從胸腺內(nèi)提取到了具有免疫增強作用的多種激素和免疫抑制因子，它們對機體細胞免疫起到平衡和調(diào)節(jié)作用。作為另一中樞免疫器官的BF，是否也具有這種起平衡和調(diào)節(jié)作用的多種因子呢？許多學(xué)者認為BS僅僅是作為其中一個結(jié)構(gòu)明確的因子，可能還含有其它一些活性因子。但單對BS來說，在自然狀態(tài)下，機體內(nèi)最早出現(xiàn)的時間，以及它在體內(nèi)的消長情況，代謝機制，與機體各個系統(tǒng)間的關(guān)系等基礎(chǔ)理論，都需要進一步研究、探討。1995年，張紅衛(wèi)等從成年牛肝臟中提取到BS類生物活性物質(zhì)。Audhya等和Abiko等已證實BS在體外對人類的某些細胞具有增強免疫作用。這表明BS無論是從免疫學(xué)角度還是從生物進化的角度，都不存在種屬差異問題，從而為禽源BS應(yīng)用于哺乳動物和人類奠定了理論基礎(chǔ)。姜秀麗實驗表明高濃度的BS，能導(dǎo)致雜交瘤細胞凋亡。這些結(jié)果為臨床治療免疫缺陷癥和提高患者機體免疫力及抗衰老藥物、抗腫瘤藥物的研制提供理論依據(jù)。胸腺素早已為臨床應(yīng)用，相信隨著對BS的深入研究和嚴格的臨床試驗，不久的將來，它會同胸腺素和干擾素一樣廣泛應(yīng)用于臨床醫(yī)學(xué)。因此法氏囊活性肽具有廣泛的應(yīng)用前景，如免疫調(diào)節(jié)、免疫治療等方面，可應(yīng)用于基礎(chǔ)免疫研究、臨床應(yīng)用研究、營養(yǎng)保健等領(lǐng)域。只有廣泛深入的研究，全面客觀的了解，才能最大限度的開發(fā)利用，使其充分發(fā)揮作用，服務(wù)于生產(chǎn)，造福于人類。
發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題本研究的目的是，通過超濾分子截流、反相高壓液相色譜(HPLC)柱層析、質(zhì)譜和氨基酸分析等技術(shù)從法氏囊組織液中分離到一個全新的七肽并鑒定，弄清了其氨基酸的結(jié)構(gòu)組成。對法氏囊七肽的在動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)機制進行深入系統(tǒng)研究，從而為法氏囊活性肽的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，并有望推進禽類免疫學(xué)理論的發(fā)展。技術(shù)方案本發(fā)明的一個方面涉及到法氏囊素活性小肽的分離、純化及質(zhì)譜分析。因此，本發(fā)明還涉及包含一種氨基酸序列的基本上純化的肽(見實施例1)。本發(fā)明充分利用現(xiàn)代科技技術(shù)，首先利用超濾濃縮技術(shù)，回收分子量IOOODa以下的有效成分(即粗提物)。超濾濃縮技術(shù)的主要原理是通過微孔濾膜(排阻率為IOOODa)在外來壓力作用下，使小于IOOODa的分子物質(zhì)濾過，而大的物質(zhì)則阻擋在濾膜上。該技術(shù)是新近發(fā)展起來的一種分離、純化技術(shù)，已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)制品、生物制品等下游工程方面。粗提物經(jīng)真空干燥，再次濃縮。然后溶解后，用反向高效液相色譜(RP-HPLC)分離、純化多種法氏囊中的活性成分。收獲的各種組分經(jīng)MODIL-TOF質(zhì)譜分析，測定該法氏囊活性肽的分子量為722.240(m/z)，并獲得完整的氨基酸序列，即EPASGMM。有益效果獲得法氏囊七肽有多種途徑，上述方法僅為其中一種。目前，固相多肽合成技術(shù)十分成熟。眾所周知，化學(xué)合成多肽的方法也常見于免疫學(xué)、生物化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、食品學(xué)、藥物學(xué)等多種領(lǐng)域。化學(xué)合成肽現(xiàn)在可以在程序控制的自動化多肽合成儀上進行，即在一個反應(yīng)容器中進行所有的反應(yīng)，便于自動化操作，加入過量的反應(yīng)物可以獲得高效率的產(chǎn)物，同時產(chǎn)物很容易分離、純化。本發(fā)明中，法氏囊七肽采用該方法由生物公司合成，純度達97%以上。此外，基因工程技術(shù)也日益成熟、完善，是最近二三十發(fā)展起來的最重要的新興技術(shù)之一。目前已有多種基因工程新型藥物(如干擾素等)及疫苗(如亞單位疫苗等)等投放市場，產(chǎn)生了巨大的社會效益和經(jīng)濟效益，同時該技術(shù)也是大量、批量生產(chǎn)多肽的主要技術(shù)之一。通過目的基因重組到表達載體中，并在宿主菌種充分表達，在通過后處理將表達的活性肽分離、純化。本發(fā)明的另一方面涉及到誘導(dǎo)調(diào)節(jié)動物體液免疫力(見實施例2)。利用上述的法氏囊七肽，可驗證該分子對抗體反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用。按動物(小型動物)每只使用活性肽125ug?；钚噪呐cAIV疫苗疫苗混勻后，按正常免疫劑量，腹腔注射免疫動物。其特征在于活性肽在25ug/只時，按疫苗常規(guī)劑量用于動物，活性肽效果會更好，如抗體水平變化顯著，同時調(diào)節(jié)作用明顯。本發(fā)明的另一方面涉及到增強動物細胞免疫力的調(diào)節(jié)作用(見實施例3)。利用本發(fā)明中的法氏囊七肽與疫苗聯(lián)合作用，即可證明該肽具有調(diào)節(jié)細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)的作用。按動物(小型動物)每只使用活性肽125ug。活性肽與AIV疫苗混勻后，按正常免疫劑量，腹腔注射免疫動物。其特征在于活性肽在5ug/只時，按疫苗常規(guī)劑量用于動物，活性肽效果會更好，如細胞因子產(chǎn)生增加，提高T淋巴細胞的分型，促進脾臟細胞生長活性寸寸。本發(fā)明的另一方面涉及到調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖活性作用(見實施例4)。其應(yīng)用比較廣泛，可延伸到抗感染及抑制腫瘤的生長。本發(fā)明一個可實施的方案是將法氏囊七肽或和其他藥劑聯(lián)合作用于不同的腫瘤細胞，在這種情況下驗證其效果，即屬于本發(fā)明的范疇。將靶細胞分裝到96孔細胞板中，用法氏囊七肽刺激，然后檢測細胞生長情況。其特征在于該活性肽對不同靶細胞具有不同的調(diào)節(jié)作用，同時不向濃度的活性肽對同一靶細胞，具有明顯的濃度依賴性。本發(fā)明的另一方面可能涉及到利用法氏囊七肽治療腫瘤疾病，特別是與機體免疫狀態(tài)密切相關(guān)的腫瘤疾病，為腫瘤疾病的防控提高新的有效分子及創(chuàng)新的方法。本發(fā)明的另一方面可能涉及到法氏囊七肽的實施量可根據(jù)使用目的、使用方法等適當(dāng)選擇，組合物的有效肽的用量可以在較大范圍內(nèi)變化。此外，肽的使用量取決于組合物的使用方法和所用的特別配制劑型。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點及意義如下1、從法氏囊中發(fā)現(xiàn)一種新的七肽，分子量為722.240(m/z)，氨基酸序列為EPASGMM，該七肽是第一次從禽類的中樞體液免疫器官中分離出來，從而說明法氏囊中存在多種活性分子，分子量不同，且可能發(fā)揮的免疫功能也不相同。2、在實驗動物體內(nèi)具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，法氏囊七肽不僅對體液免疫具有誘導(dǎo)效應(yīng)(如調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生和分型)，這與以往報道的法氏囊提取物作用類似，而且對細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)具有強烈的調(diào)節(jié)作用，這在以往的報道中很少提到，從而說明，法氏囊是一個有機組合器官，其中的各種組分相輔相成，諧調(diào)發(fā)揮法氏囊的作用，既有正向調(diào)節(jié)作用的物質(zhì)，也有負向影響的活性分子。本發(fā)明補充了這方面的缺陷，豐富了這方面的內(nèi)容。3、在體外，法氏囊七肽能影響腫瘤細胞的生長情況。腫瘤細胞的增殖是腫瘤疾病發(fā)展、惡化的重要因素，法氏囊七肽具有調(diào)節(jié)腫瘤細胞生長活性的作用，從而為腫瘤疾病的治療和防控提供了新的藥劑和方法，有望在臨床應(yīng)用中發(fā)揮重要作用。本發(fā)明從法氏囊提取物中，分離法氏囊七肽結(jié)構(gòu)簡單，無毒副作用，免疫原性極弱。即可從法氏囊中分離提取，也可化學(xué)合成，成本低，可大量生產(chǎn)。對抗體及其亞型的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，同時可調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生，T淋巴細胞的分型和脾臟細胞的增殖，促進細胞免疫反應(yīng)。此外，還以劑量依賴性方式調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長，是一種多功能的免疫調(diào)節(jié)因子，具有廣泛的應(yīng)用前景，如免疫調(diào)節(jié)、免疫治療等方面，可應(yīng)用于基礎(chǔ)免疫研究、臨床應(yīng)用研究、營養(yǎng)保健等領(lǐng)域。四圖1法氏囊七肽的分離和純化。反向高效液相色譜圖中，箭頭所指，BSP的洗脫峰23.89min。圖2:MALDI-T0F-MS分析。圖3=HI抗體的測定。與AIV免疫組比較，差異顯著P<0.05；差異極顯著P<0.01。圖46=AIV抗體亞型測定。與AIV免疫組比較，差異顯著P<0.05；差異極顯著P<0.01。其中圖4為抗體IgG亞型分析圖；圖5為抗體IgGl亞型分析圖；圖6為抗體IgG2a亞型分析圖。圖79細胞免疫反應(yīng)測定。與AIV免疫組比較，差異顯著P<0.05；差異極顯著P<0.01。其中圖7為細胞因子分析圖；圖8為T淋巴細胞亞型分析圖；圖9為脾臟淋巴細胞增殖分析圖。圖10法氏囊七肽影響腫瘤細胞增殖活性測定。與空白對照組比較，差異顯著P<0.05；差異極顯著P<0.01。五具體實施例方式實施1、法氏囊素七肽的分離與鑒定一種法氏囊七肽的提取方法，包括以下操作步驟取健康46周齡雞的法氏囊(AA肉雞，上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院附屬養(yǎng)殖場)2000克，用3000ml生理鹽水碾碎、混勻，反復(fù)凍融三次。于4°C，14000g離心60分鐘，上清轉(zhuǎn)入另一個管中，再次離心一次。然后經(jīng)IOOODa超濾膜，超濾，并凍干濾液。凍干樣品用B液(2%乙腈，0.065%三氟乙酸)稀釋，12000g離心10分鐘，然后用0.22um濾膜過濾。取濾液經(jīng)反向高效液相純化分析，收獲滯留時間為23.98分鐘的活性峰(見圖1)。收獲的洗脫液經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，分子量為722.240，氨基酸序列EPAGSMM(見圖2)，這是第一次從法氏囊中分離發(fā)現(xiàn)。采用固相化學(xué)合成方法，合成氨基酸結(jié)構(gòu)相同的七肽，純度在97%以上。2、動物免疫及體液免疫反應(yīng)天然的法氏囊提取物能促進B細胞的增殖、分化，從而導(dǎo)致抗體的產(chǎn)生。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人以4-6周齡BALB/c小鼠(購自揚州大學(xué)試驗動物中心)為動物模型，以禽流感滅活疫苗(H9N2亞型F株，購自南京梅里亞動物保健有限公司)與不同濃度的法氏囊七肽聯(lián)合免疫三次，分別在三次免疫后14天，采血，分離血清，檢測HI抗體水平和抗體亞型IgGl和IgG2α的變化情況，分析法氏囊七肽對體液免疫的調(diào)節(jié)功能(見表1)。通過該實驗可以發(fā)現(xiàn)法氏囊七肽能明顯調(diào)節(jié)體液免疫功能，且與劑量密切相關(guān)，并且具有平衡Thl和Th2型免疫反應(yīng)的功能。DHI抗體水平，采用血凝抑制試驗方法檢測，具體操作方法為確定4倍抗原于V微量血凝反應(yīng)板的每孔中滴加PBS25ul，共滴四排。吸取病毒抗原(H9N2亞型F株，購自中國獸醫(yī)藥品檢查所菌種保藏室)滴加于第一列孔，每孔25ul，然后由左至右順序倍比稀釋至第11列孔，再從第11列孔各吸取25ul棄之。然后于每孔中再加入PBS25ul。在于每孔中加入雞紅細胞懸液25ul。置微型振蕩器上振蕩混勻，室溫(約20°C)靜置40分鐘，或4°C60分鐘，應(yīng)在對照孔的RBC顯著呈鈕扣狀時判定結(jié)果。表1免疫程序<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>以紅細胞完全凝集(++++)的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價，表示一個HA單位(HAU)。每次四排重復(fù)，以幾何均值表示結(jié)果。計算出含4個血凝單位的抗原濃度，按如下公式進行計算抗原應(yīng)稀釋倍數(shù)=血凝滴度/4HI梯度的測定于微量血凝反應(yīng)板111孔中加入25ulPBS，第12孔加入50ulPBS。吸被檢血清25ul于第1孔中，混勻后吸于第2孔，依次倍比稀釋至第10孔，最后棄去25ul。1_11孔均加入含4個HAU的病毒抗原液，室溫下靜置不少于30分鐘，4°C不少于60分鐘。然后滴加25ull%紅細胞懸液與各孔中，振蕩混合后，室溫下靜置40min，或4°C60分鐘，應(yīng)在對照孔的RBC顯著呈鈕扣狀時判定結(jié)果。結(jié)果判定完全抑制4HAU抗原的最高血清稀釋倍數(shù)為HI效價。陰性對照血清效價不高于21og2，和陽性對照血清效價應(yīng)在已知效價的一個稀釋度以內(nèi)，結(jié)果有效。HI效價小于或等于log23判定HI試驗陰性；HI效價等于log24為陽性。結(jié)果表明法氏囊七肽(BSP)具有調(diào)節(jié)血清抗體水平的能力，且調(diào)節(jié)能力與濃度有關(guān)(見附圖3)。2)抗體亞型檢測，采用間接ELISA方法，具體操作方法為分別于免疫后14天、28天和42天，采血分離血清檢測特異的亞型抗體。將102_5EID5tlAil滅活A(yù)IV抗原包被板條，IOOul/孔，4°C作用過夜，或37°C作用2小時，洗滌三次，然后BSA封閉37°C作用2個小時，或4°C作用過夜。然后加入血清，分別按110-1IO5四個梯度，37°C作用2個小時，然后分別加入11000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG和12000稀釋的羊抗鼠IgGlandIgG2a，37°C作用2個小時，充分洗滌后，加入TMB底物顯色液，37°C作用1015min，然后加入2MH2SO4終止，450nm讀值，分析結(jié)果。結(jié)果表明法氏囊七肽(BSP)能明顯調(diào)節(jié)抗體亞型的水平(見附圖4，5，6)。在抗體分型中，可以發(fā)現(xiàn)，BSP誘導(dǎo)的抗體亞型以IgGl為主，同時也誘導(dǎo)IgG2α亞型。因為IgGl和IgG2a是IgG的主要亞型，它們是由不同類型的免疫反應(yīng)產(chǎn)生的。IgGl抗體由Th2型免疫反應(yīng)產(chǎn)生，IgG2a抗體由Thl型免疫反應(yīng)產(chǎn)生。因此，BSP能明顯誘導(dǎo)Thl/Th2型免疫反應(yīng)。3、細胞免疫試驗1)細胞免疫反應(yīng)檢測細胞免疫的表現(xiàn)形式有多種，其中細胞因子在免疫反應(yīng)中起重要作用，可以調(diào)節(jié)多種反應(yīng)。脾細胞增殖和T細胞亞型等也是細胞免疫反應(yīng)的常用指標(biāo)。2)細胞因子檢測我們采用ELISA方法，用試劑盒(RD，USA)檢測血清中IL-4和IFN-γ的含量。在第三次免疫后1周，采血分離血清。按說明書操作。結(jié)果表明，BSP能促進細胞的分泌，特別是0.05mg/只時，量均明顯高于疫苗對照組。如附圖7，法氏囊七肽不僅能提高代表Thl類型免疫反應(yīng)得細胞因子IFN-γ的水平，同時能顯著提高代表Th2類型的細胞因子IL-4的水平。3)T細胞分型檢測采用三色法檢測T細胞亞型。在第三次免疫后1周，處死小鼠，無菌分離脾臟淋巴細胞，分裝到96孔細胞板上(105cells/well)。用三個劑量的BSP刺激4872小時后，收獲細胞。加入PE、FITC和PE-Cy5標(biāo)記的CD3、CD4和CD8單抗(eBioscience,USA)室溫作用30m分鐘，洗滌一次，然后用新生牛血清(杭州四季青，中國)的PBS懸浮細胞，在流氏分析儀(BD，LSR)上分析細胞亞型。結(jié)果表明，BSP能明顯刺激T細胞的分化，且在0.05mg/只時，效果最為明顯，見附圖8。4)脾細胞增殖試驗在2ndboost免疫后1周，處死小鼠，無菌分離小鼠脾臟淋巴細胞，分裝到96孔細胞板上(IO5個細胞/孔)。用三個劑量的BSP刺激4872小時后，加入100μg/孔MTT(Sigma,USA)，作用4小時，棄去上清，加入DMSO(Sigma，USA)IOOul/孔，0D570nm讀值，分析結(jié)果。結(jié)果，BSP能增加脾臟淋巴細胞的活性，在0.05mg/只時，達到最高值，見附圖9。4、腫瘤細胞活性的影響將長成單層的Hela細胞(購自中國科學(xué)院細胞庫，編號TCHul87)，用胰酶消化，同時將長成單層的SP2/0細胞(購自中國科學(xué)院細胞庫，編號TCM18)從瓶壁反復(fù)吹打下來，分別分裝到96孔細胞板上。用10%血清的生長液培養(yǎng)。2小時后，以四個劑量0.2μg/ml、1μg/ml、5yg/ml禾口25μg/mlBSP加入到細胞中，作用4872小時。然后加入100μM/well的MTT于各孔中，37°C作用4個小時。棄去上清，加入DMSOIOOul/孔，于570nm讀值，分析結(jié)果。結(jié)果表明，BSP對Hela和SP2/0細胞的活性具有調(diào)節(jié)作用，且在高劑量時，細胞活性受到抑制；見附圖10，從而說明法氏囊七肽能調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長，且不同的腫瘤細胞，且調(diào)節(jié)能力與劑量的關(guān)系不同?？偟内厔菔牵诘蛣┝繒r，BSP能促進腫瘤細胞的生長。然而隨著劑量的增殖，腫瘤細胞的活性逐漸降低，即BSP抑制了腫瘤細胞的增殖。據(jù)此，結(jié)果表明，BSP雖然來源于禽法氏囊組織中，但可能也是腫瘤細胞的一種效應(yīng)因子，在不同的情況下，可能發(fā)揮不同的作用。權(quán)利要求一種法氏囊七肽，由七個氨基酸組成，其序列為EPASGMM，分子量為722.240，在體內(nèi)外均具有免疫調(diào)節(jié)作用。2.權(quán)利要求1中所述法氏囊七肽的制備工藝，其特征在于，取健康青年雞的法氏囊組織，于質(zhì)量比0.85%的生理鹽水中碾碎，反復(fù)凍融三次，并在0-10°C下14000g離心60分鐘，采用截流分子量為lOOODa的超濾膜過濾，真空冷凍干燥，得法氏囊活性肽粉劑，凍干粉溶解，經(jīng)0.22ym濾膜過濾，進行高效反向液相，在220nm波長，收集23.89min峰值的洗脫液，然后進行M0DLID-T0F質(zhì)譜分析，即得法氏囊七肽。全文摘要本發(fā)明涉及一種具有免疫調(diào)節(jié)作用的法氏囊七肽，及其在免疫中的應(yīng)用(提高動物的免疫能力，能提高疫苗的免疫效果及影響腫瘤細胞的活性)，屬于免疫學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明分離到一種七肽，分子量為722.240，氨基酸序列為EPASGMM，結(jié)構(gòu)簡單，無毒副作用，免疫原性極弱。既可從法氏囊中分離提取，也可化學(xué)合成，成本低，可大量生產(chǎn)。法氏囊七肽對抗體及其亞型的產(chǎn)生具有誘導(dǎo)作用，同時可調(diào)節(jié)細胞因子的產(chǎn)生，T淋巴細胞的分型和脾臟細胞的增殖，促進細胞免疫反應(yīng)。是一種對功能的免疫調(diào)節(jié)因子，具有廣泛的應(yīng)用前景，如免疫調(diào)節(jié)、免疫治療等方面，可應(yīng)用于基礎(chǔ)免疫研究、臨床應(yīng)用研究等領(lǐng)域。文檔編號C07K1/20GK101830968SQ201010156269公開日2010年9月15日申請日期2010年4月23日優(yōu)先權(quán)日2010年4月23日發(fā)明者馮秀麗,周斌,曹瑞兵,王芳權(quán),茅翔,陳溥言,魏建超申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)