專利名稱：一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽的方法。
背景技術(shù)：
生物活性肽是蛋白質(zhì)中20個(gè)天然氨基酸以不同組成和排列方式構(gòu)成的從二肽到復(fù)雜的線形和環(huán)行結(jié)構(gòu)的不同肽類的總稱，是源于蛋白質(zhì)最復(fù)雜的多功能化合物，具有人體代謝和生理調(diào)節(jié)功能，食用安全性高，是當(dāng)前國(guó)際食品界最熱門的研究課題[1]。隨著生物科學(xué)技術(shù)的發(fā)展以及人們保健意識(shí)的加強(qiáng)，生物活性肽已成為目前制藥和保健品行業(yè)的主要發(fā)展趨勢(shì)。近些年來(lái)抗氧化劑在國(guó)內(nèi)外得到了蓬勃的發(fā)展，用途也越來(lái)越廣泛，不僅用于含脂肪食品的抗氧化防御，而且作為功能因子用于保健食品及化妝品等的開(kāi)發(fā)(夏向東，呂飛杰，臺(tái)建祥.抗氧化劑的功效及抗氧化活性的體外分析評(píng)價(jià)[J].食品科學(xué)，2001， 22(1) :89-93.),但是研究發(fā)現(xiàn)人工合成的抗氧化劑具有許多副作用(劉志先.合理使用食品添加劑[J].飲食與健康，1992，(3) :44-45.),因此食源抗氧化肽的研究成為了各國(guó)的研
究熱點(diǎn)。目前，酶解法是制備生物活性肽的最主要方法，因?yàn)樗膺^(guò)程僅使蛋白肽鍵斷裂產(chǎn)生特定序列的肽段，而氨基酸的結(jié)構(gòu)和構(gòu)型保持不變，不會(huì)產(chǎn)生有毒和有害物質(zhì)，具有安全性高、水解條件溫和、過(guò)程易控制及儀器設(shè)備簡(jiǎn)單等獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)^]，同時(shí)，隨著基因工程技術(shù)的進(jìn)步和發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展，酶解蛋白制備生物活性肽將成為一種主流。目前，工業(yè)化水解蛋白制備生物活性肽的方式幾乎都是間歇式生產(chǎn)，其存在很多不足之處，如酶的一次性使用、各批次產(chǎn)物性能不穩(wěn)定、生產(chǎn)周期長(zhǎng)及勞動(dòng)強(qiáng)度大等， 而酶膜反應(yīng)器的使用則能很好地克服這些不足之處。酶膜反應(yīng)器(Enzymatic Membrane Reactor，簡(jiǎn)稱EMR)是把酶促反應(yīng)與膜的選擇性物質(zhì)傳遞有效地結(jié)合在一起，即采用適當(dāng)孔徑的膜將酶和底物與產(chǎn)物分開(kāi)，并使產(chǎn)物不斷透過(guò)膜的一種反應(yīng)設(shè)備，創(chuàng)造出有利于過(guò)程的熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)，實(shí)現(xiàn)了反應(yīng)與分離的同步進(jìn)行。同傳統(tǒng)的化學(xué)反應(yīng)器或其他酶反應(yīng)器(如間歇反應(yīng)器)等相比，酶膜反應(yīng)器在結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)和操作流程上的優(yōu)點(diǎn)是比較明顯的，如可連續(xù)操作、反應(yīng)-分離相耦合、酶的循環(huán)再生及有效富集產(chǎn)物等(Giorno L， Drioli. Biocatalytic membrane reactors !applications perspectives[J]. Trends in Biotechnology, 2000,18 (8) :339-349.)。隨著基因工程以及材料科學(xué)的發(fā)展，酶的催化性能及膜的性能均得到逐步的改善和提高，再加上高效固定化技術(shù)的開(kāi)發(fā)以及過(guò)程設(shè)計(jì)的不斷優(yōu)化，已使得酶膜反應(yīng)器在生物、醫(yī)藥、化工、環(huán)保、食品工業(yè)等領(lǐng)域得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。但是，由于目前對(duì)酶膜反應(yīng)器特性的認(rèn)識(shí)還不夠全面，其存在很多問(wèn)題還待進(jìn)一步研究和解決。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽的方法。本發(fā)明所提供的制備燕麥抗氧化肽的方法，是在酶膜反應(yīng)器中進(jìn)行制備的，包括下述步驟1)將燕麥麩蛋白溶液加入到所述酶膜反應(yīng)器的酶解罐中，調(diào)節(jié)所述燕麥麩蛋白溶液的PH值為7. 0 7. 5，并加熱至55°C 60°C ；然后再將堿性蛋白酶(Alcalase)加入到所述酶解罐中，使燕麥麩蛋白與堿性蛋白酶在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)2 ^iin ；其中，所述燕麥麩蛋白溶液的質(zhì)量濃度為2. 5% _3%，所加入的堿性蛋白酶與所述燕麥麩蛋白溶液中燕麥麩蛋白的配比為(17000-18000)U/g燕麥麩蛋白；2)關(guān)閉所述酶膜反應(yīng)器中超濾循環(huán)裝置的超濾膜透過(guò)液出口，同時(shí)打開(kāi)蠕動(dòng)泵， 使酶解液以45 50L/h的料液流量常壓循環(huán)2 ^iin ；3)開(kāi)啟所述超濾膜透過(guò)液出口，使酶解液仍以45 50L/h的料液流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的操作壓力為0. 06 0. 07MPa,進(jìn)行酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中每隔30min 向所述酶解罐中補(bǔ)加燕麥蛋白溶液和堿性蛋白酶維持反應(yīng)體系體積恒定以及蛋白濃度、酶量恒定，，同時(shí)保持反應(yīng)體系的PH值為7. 0 7. 5、溫度為55°C 60°C，反應(yīng)結(jié)束將收集的超濾膜透過(guò)液干燥，即得到所述燕麥抗氧化肽。為了降低蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程對(duì)酶造成的破壞，步驟幻中所述蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速可選擇 M0-300rpm。同時(shí)，為了減少超濾膜對(duì)酶的吸附，可在使用前，用燕麥麩蛋白溶液對(duì)超濾膜進(jìn)行預(yù)吸附處理。預(yù)吸附處理，即加酶之前關(guān)閉所述酶膜反應(yīng)器中超濾循環(huán)裝置的超濾膜透過(guò)液出口，同時(shí)打開(kāi)蠕動(dòng)泵，使燕麥蛋白溶液以45 50L/h的料液流量常壓循環(huán)2 4min達(dá)到預(yù)吸附處理的目的。上述所用的超濾膜具體可為中空纖維膜，其截留分子量為6000 lOOOODa。步驟3)中所述酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間可為3-6小時(shí)。在反應(yīng)過(guò)程中，當(dāng)超濾膜的膜通量下降至初始膜通量的30%或30%以下時(shí)停止反應(yīng)，利用反沖系統(tǒng)恢復(fù)膜通量繼續(xù)反應(yīng)。步驟幻中反應(yīng)過(guò)程中向所述酶解罐中補(bǔ)加燕麥麩蛋白溶液的量是通過(guò)測(cè)定每小時(shí)收集的超濾液的量來(lái)確定的，補(bǔ)料濃度則是通過(guò)測(cè)定超濾液中的多肽含量確定的，即出多少產(chǎn)物補(bǔ)多少量。本發(fā)明對(duì)堿性蛋白酶酶活定義Ig固體酶粉(或Iml液體酶)在酶最適條件下 (600C、pH值8. 0的條件下)，每分鐘降解酪蛋白釋放1 μ g酪氨酸所需要的酶量為一個(gè)酶活單位U，以U/g(U/ml)表示。本發(fā)明通過(guò)對(duì)AlcalashTrypsin和P印sin酶解燕麥麩蛋白所獲得產(chǎn)物的抗氧化活性和產(chǎn)物得率的研究，確定Alcalase作為酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽的初步用酶，并在Alcalase單酶作用的基礎(chǔ)上研究Alcalase+Trypsin和Alcalase+P印sin耦合酶解燕麥麩蛋白對(duì)產(chǎn)物活性的影響，最終確定在研究酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽工藝的過(guò)程中不考慮分步酶解作用。通過(guò)研究Alcalase在不同酶解體系大小、底物濃度及加酶量條件下對(duì)燕麥麩蛋白酶解速度的影響，可知Alcalase酶解燕麥麩蛋白的速度存在兩個(gè)階段初期高速酶解和后期酶解速度迅速降低；經(jīng)過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度的降低主要是由于底物消耗和酶活損失共同造成的。因此，為了使Alcalase酶解燕麥麩蛋白連續(xù)進(jìn)行，需要在酶解過(guò)程中定期向酶解體系中加入燕麥麩蛋白和Alcalase。通過(guò)研究酶膜反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)酶活的影響，可知酶膜反應(yīng)系統(tǒng)對(duì)Alcalase具有很好的保留效果，其中蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程對(duì)酶造成破壞和超濾膜對(duì)酶的吸附是導(dǎo)致Alcalase酶
4活損失的原因，故在優(yōu)化酶膜反應(yīng)器利用Alcalase酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽的工藝條件時(shí)，可通過(guò)調(diào)節(jié)蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速及超濾膜預(yù)吸附底物等方式來(lái)降低Alcalase酶活的損失。通過(guò)DPS軟件設(shè)計(jì)均勻試驗(yàn)方案和SPSS軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，求得在利用酶膜反應(yīng)器酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽過(guò)程中，酶活保留率和多肽生產(chǎn)效率均取較大值時(shí)各因素的水平條件為底物質(zhì)量濃度(即燕麥麩蛋白溶液濃度)3%、加酶量17000U/g、料液流量45L/h、操作壓力0. 06MPa、溫度60°C、pH值=7 ；經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在該條件下酶膜反應(yīng)器對(duì) Alcalase酶活的保留率達(dá)92. 86%、多肽生產(chǎn)效率為1896. 5mg/ (m2 · h)。同時(shí)，以DPPH清除率為指標(biāo)，利用Design Expert 6. 0. 5設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，求得酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽的最佳工藝條件為底物濃度3%、加酶量 18000U/g、料液流量45L/h、操作壓力0. 07MPa、溫度55°C、pH值=7. 3，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在該條件下產(chǎn)物的DPPH清除率可達(dá)57. 39%，多肽生產(chǎn)效率為1896. 5mg/(m2 · h)。綜上所述，本發(fā)明以燕麥麩蛋白為原料，在最佳工藝條件下利用酶膜反應(yīng)器酶解燕麥蛋白制備燕麥抗氧化肽。所得產(chǎn)物的DPPH清除率可達(dá)57. 39%，多肽生產(chǎn)效率可達(dá) 1896.5!^/0112·!!)。該方法具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為本發(fā)明所用的分體式酶膜反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，1-反應(yīng)罐；2-恒溫水浴加熱套；3-恒溫原料罐；4-堿液罐；5-攪拌器；6-溫度計(jì)；7-pH計(jì)；8-蠕動(dòng)泵；9、 12-壓力表；10-超濾膜；11、13、14_控制閥；15-流量計(jì)；16-產(chǎn)物儲(chǔ)液罐。圖2為不同蛋白酶的水解度與多肽得率之間的關(guān)系。圖3為不同蛋白酶的水解度與產(chǎn)物DPPH清除率之間的關(guān)系。圖4為3種蛋白酶酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽的酶解時(shí)間與產(chǎn)物DPPH清除率之間的關(guān)系。圖5為3種蛋白酶酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽的酶解時(shí)間與多肽得率之間的關(guān)系。圖6為Alcalase+P印sin分步酶解燕麥麩蛋白制備抗氧化肽的酶解時(shí)間與產(chǎn)物 DPPH清除率之間的關(guān)系。圖7為酶解體系大小對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度的影響。圖8為底物濃度對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度的影響。圖9為加酶量對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度的影響。圖10為考察底物消耗和酶活損失對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度影響的流程圖。圖11為考察酶解產(chǎn)物對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度影響的流程圖。圖12為底物消耗及酶活損失對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度的影響圖13為酶解產(chǎn)物對(duì)Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度影響。圖14為酶活保留率和截留液于^Onm處吸光度隨超濾時(shí)間的變化。圖15為酶活泄漏率和透過(guò)液于^Onm處吸光度隨超濾時(shí)間的變化。圖16為酶活損失率隨超濾時(shí)間的變化。
圖17為蠕動(dòng)泵、攪拌器、壓力表及硅膠管對(duì)Alcalase酶活的影響。圖18為超濾膜對(duì)Alcalase酶活的影響。
具體實(shí)施例方式下述實(shí)施例中所述實(shí)驗(yàn)方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；所述試劑和生物材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑獲得。燕麥麩皮(蛋白質(zhì)含量17. 8% )河北省康?？h翔龍食品有限公司；UE0S503中空纖維膜天津膜天膜工程技術(shù)有限公司，截留分子量6000Da ；DPPH =Sigma公司；堿性蛋白酶(Alcalase) :Novozymes公司；胃蛋白酶(P印sin) :Sigma公司；胰蛋白酶CTrypsin) Amresco公司疋olin-酚試劑SIGMA公司；酪蛋白北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；其他試劑均為分析純。燕麥麩蛋白是按照下述方法制備得到的首先，稱取一定量的燕麥麩皮置于反應(yīng)罐中，以料液比1 8(g/ml)加入去離子水，將PH值調(diào)至4. 5，并加入1. 5% (w/w)糖化酶，反應(yīng)罐升溫至55°C，恒溫?cái)嚢杳附?0min ； 接著，將提取液的PH值調(diào)至6，加入(w/w)淀粉酶，反應(yīng)罐升溫至85°C，酶解，直至無(wú)淀粉為止；然后，再將提取液的溫度降至55°C，pH值調(diào)至4. 5，加入(w/w)糖化酶，酶解60min ；最后，將提取液pH值調(diào)至10，在55°C恒溫條件下攪拌浸提90min，離心(4000r/ min)，將上清液pH值調(diào)至燕麥麩蛋白等電點(diǎn)處(pi = 4. 0)，室溫靜置12h，離心(4000r/ min)，將燕麥麩蛋白沉淀物置于真空干燥箱中烘干，粉碎，即得燕麥麩蛋白粉，備用。下述實(shí)施例中利用R)lin_酚法測(cè)酶活力的方法對(duì)蛋白酶活力進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定過(guò)程如下1)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制過(guò)程，見(jiàn)表1所示。表1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
權(quán)利要求
1.一種制備燕麥抗氧化肽的方法，是在酶膜反應(yīng)器中進(jìn)行制備的，包括下述步驟1) 將燕麥麩蛋白溶液加入到所述酶膜反應(yīng)器的酶解罐中，調(diào)節(jié)所述燕麥麩蛋白溶液的PH值為7. 0 7. 5，并加熱至55°C 60°C ；然后再將堿性蛋白酶加入到所述酶解罐中，使燕麥麩蛋白與堿性蛋白酶在攪拌狀態(tài)下反應(yīng)2 ^iin ；其中，所述燕麥麩蛋白溶液的質(zhì)量濃度為2. 5% _3%，所加入的堿性蛋白酶與所述燕麥麩蛋白溶液中燕麥麩蛋白的配比為 (17000-18000) U/g 燕麥麩蛋白；2)關(guān)閉所述酶膜反應(yīng)器中超濾循環(huán)裝置的超濾膜透過(guò)液出口，同時(shí)打開(kāi)蠕動(dòng)泵，使酶解液以45 50L/h的料液流量常壓循環(huán)2 ^iin ；3)開(kāi)啟所述超濾膜透過(guò)液出口，酶解液仍以45 50L/h的料液流量循環(huán)，調(diào)節(jié)超濾膜的操作壓力為0. 06 0. 07MPa，進(jìn)行酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)，反應(yīng)過(guò)程中每隔一定時(shí)間向所述酶解罐中補(bǔ)加燕麥蛋白溶液和堿性蛋白酶維持反應(yīng)體系體積恒定以及蛋白濃度、酶量恒定，同時(shí)保持反應(yīng)體系的PH值為7. 0 7. 5、溫度為55°C 60°C，反應(yīng)結(jié)束將收集的超濾膜透過(guò)液干燥，即得到所述燕麥抗氧化肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟幻中所述蠕動(dòng)泵的轉(zhuǎn)速為 240-300rpmo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于步驟幻中超濾循環(huán)裝置的超濾膜在使用前用燕麥麩蛋白溶液進(jìn)行預(yù)吸附處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于步驟幻中超濾循環(huán)裝置的超濾膜為中空纖維膜，其截留分子量為6000 lOOOODa。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于步驟3)中所述酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為3-6小時(shí)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟幻中每隔一定時(shí)間的時(shí)間間隔為30分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于步驟1)中所述燕麥麩蛋白溶液的質(zhì)量濃度為3%，所加入的堿性蛋白酶與所述燕麥麩蛋白溶液中燕麥麩蛋白的配比為18000U/g KiSe ；步驟幻中所述酶解液以45L/h的料液流量循環(huán)，超濾膜的操作壓力為 0. 07MPa，所述酶解-膜分離耦聯(lián)反應(yīng)的反應(yīng)體系的pH值為7. 3、溫度為55°C。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種制備燕麥抗氧化肽的方法。通過(guò)考察不同蛋白酶酶解燕麥麩蛋白所得產(chǎn)物的抗氧化活性和產(chǎn)物得率，確定Alcalase作為制備用酶；并通過(guò)考察Alcalase對(duì)燕麥麩蛋白的酶解速度，可知Alcalase酶解燕麥麩蛋白速度的降低主要是由于底物消耗和酶活損失共同造成的。同時(shí)，通過(guò)研究酶膜反應(yīng)器系統(tǒng)對(duì)酶活的影響，可知酶膜反應(yīng)器系統(tǒng)對(duì)Alcalase具有很好的保留效果，其中蠕動(dòng)泵運(yùn)轉(zhuǎn)過(guò)程對(duì)酶造成的破壞和超濾膜對(duì)酶的吸附是導(dǎo)致Alcalase酶活損失的主要原因。通過(guò)利用DesignExpert 6.0.5設(shè)計(jì)四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，求得酶膜反應(yīng)器制備燕麥抗氧化肽的最佳工藝條件為底物濃度3％、加酶量3.2％、料液流量45L/h、操作壓力0.07MPa、溫度55℃、pH值＝7.3，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，在該條件下產(chǎn)物的DPPH清除率可達(dá)57.39％。
文檔編號(hào)C07K1/34GK102212600SQ20111011251
公開(kāi)日2011年10月12日 申請(qǐng)日期2011年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月29日
發(fā)明者任清, 張曉平, 郭項(xiàng)雨 申請(qǐng)人:北京工商大學(xué)