專利名稱：一種促人血小板生成素表達(dá)載體及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬基因工程和轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種促人血小板生成素 的制備方法。具體涉及利用山羊-P酪蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)的促人血小板生成素 (hTP0)基因組DNA和cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建以及由這些載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和轉(zhuǎn)基 因動(dòng)物生產(chǎn)hTP0的方法。
背景技術(shù)：
促血小板生成素(Thrombopoietin, TP0)是一重要的造血因子，其受體 c-mpl主要在巨核細(xì)胞、血小板和造血前體細(xì)胞，因此TP0的主要生物學(xué)功 能是刺激巨核細(xì)胞增殖，分化及血小板成熟，并加速造血前體細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞 周期。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究表明，重組人促血小板生成素(rhTP0)能有效促進(jìn) 血,J、板恢復(fù)，緩解由于放療和化療而引起的血小板減少癥。
hTP0基因組全長(zhǎng)6. 2kb,由六個(gè)外顯子和五個(gè)內(nèi)含予組成，在第一個(gè)外 顯子上游可4企測(cè)到一個(gè)額外的外顯子，命名為exonO(外顯子0)。 Southern 印跡和熒光原位雜交顯示hTP0為單拷貝基因，位于人第3號(hào)染色體 (3q26-27)。 hTP0 cDNA由1774個(gè)核苷酸附加一個(gè)polyA尾組成。起始密碼 子位于核苷酸216-218處，其開;^文閱讀框架由1059個(gè)核苷酸組成，負(fù)責(zé)編碼 353氨基酸的hTP0分子，其中N端前21個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列，人成熟TPO 分子由332個(gè)氨基酸組成，理論分子量為36KD。hTP0基因組序列和cDNA序列已由GeneBank公布，美國(guó)津莫吉尼蒂克斯 公司的專利申請(qǐng)(PCT/US95/14932)中，公開了 TPO的生產(chǎn)中有用的DM構(gòu)建 體以及通過(guò)培養(yǎng)的真核細(xì)胞產(chǎn)生TPO多肽的方法。^f旦尚未見用hTPO基因 (Genomic DNA， cDNA)與山羊-P酪蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建乳腺特異表達(dá)載體的報(bào) 告，也未見用hTPO基因(Genomic DM, cDNA)載體及通過(guò)轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物生 產(chǎn)hTPO的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種促人血小板生成素的制備方法。具體是利用山 羊- p酪蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)的促人血小板生成素(hTPO)基因組DNA、 cDNA和含 有內(nèi)含子V的hTPO cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建以及由所述構(gòu)建載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)生產(chǎn)hTPO的方法。
本發(fā)明將構(gòu)建的山羊_ P酪蛋白啟動(dòng)予指導(dǎo)的促血小板生成素基因表達(dá) 載體應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，使之在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁 中高表達(dá)，為臨床提供有用的藥物蛋白-hTPO。本發(fā)明所提供的hTPO基因 (Genomic DNA， cDNA)以及與山羊-P酪蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建的乳腺特異表達(dá)載 體，為進(jìn)一步研究開發(fā)提供了基礎(chǔ)。
本發(fā)明是通過(guò)下述技術(shù)方案和步驟實(shí)現(xiàn)的。
(一)構(gòu)建山羊-P酪蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)的hTPO表達(dá)載體。
1、通過(guò)下述方法獲得hTPO基因全長(zhǎng)核苷酸序列
以中國(guó)漢族人胎肝基因組DNA為模板，用一對(duì)核苷酸為引物-寡核苷酸 Al: 5， -AGG TACCTGATGACCTGCTGCTGT-3，為正向引物；寡核苷酸A2: 5， -CGGCGCTCC CATTTATTCCTTATAC-3，為反向引物，采用Long-PCR Kit (寶生 物工程公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95。Clmin; (98°C, 20sec; 65°C, lOmin) *30; 72°C， 10min。然后電泳4企測(cè)目的片,殳。2、 擴(kuò)增、轉(zhuǎn)染荻得的hTP0全長(zhǎng)序列
將所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pGEM-T載體(Promega公司)連接， 常規(guī)方法轉(zhuǎn)染大腸桿菌ToplOF，宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒小量擴(kuò)增，堿裂解 法提取質(zhì)粒。取少量提取的質(zhì)粒，用Pstl和BamHI酶切初步鑒定。AB1370 自動(dòng)測(cè)序儀(Perkin-Elemer，公司)測(cè)序，獲得6340bp的hTP0全長(zhǎng)基因，包 括外顯子l一6以及全部的內(nèi)含子。全序列分析表明上述擴(kuò)增的hTPO基因 組序列中，全部編碼序列、全部?jī)?nèi)含子/外顯子剪接識(shí)別序列與已知的hTP0 的基因序列比對(duì)一致；但在349位和1490位發(fā)生G —A和G —T突變；在4940 位、5887位、分別發(fā)生A — G、 T —C、 A —T突變，均位于非編碼區(qū)。
3、 獲得hTPO cDNA核苷酸片段
以人胎肝mRNA為才莫板，首先采用RT-PCR Kit (STRATA GENE),進(jìn)行逆轉(zhuǎn) 錄；然后以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用兩對(duì)(B1/B2、 Cl/C2)核苷酸為引 物寡核苷酸Bl: 5， -GCGTCGACAGAATGGAGCTGA - CTGAATT-3，為正向引物， 寡核苷酸B2: 5， -GGCATTGGGATCCTT-GTGAGCTGTGG-3，為反向引物；寡核苷 酸C1: 5， -CAGCTCACAA-GGATCCCAATGCCATCTTC - 3，為正向引物，C2: 5，-CGCAGCTG—ACACGGCAGTGTCTGAGAACCTTA-3，為反向引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 的反應(yīng)條件為85-95°C 3-5min; 48-54°C 3-5min; (85-94。C l-5min; 58 -62°C l-5min; 65-72。C 50 - 90sec) *35; 68-72。C, 5-10tnin。然后電泳 檢測(cè)目的片段，分別獲得450bp和660bp的兩個(gè)TPO cDNA片段。
4、 獲得hTPO cDNA分子全序列
經(jīng)PCR擴(kuò)增的兩個(gè)cDNA片4殳分別用Sal I和BatnHI酶切，測(cè)序質(zhì)粒pBSK 用Sal I單酶切線性化，回收酶切片段，然后將三個(gè)片段用T4連接酶(New England Bio公司)連接，并轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細(xì)菌，質(zhì)粒少量擴(kuò)增，堿裂 解4是取質(zhì)粒，經(jīng)電泳和酶切鑒定，挑選插入hTPO cDNA的重組子，命名為pCTPO。 經(jīng)ABI370測(cè)序后得1062bp的hTPO cDNA全分子核苷酸序列。5、 獲得hTPO基因組中內(nèi)含子V:
以人胎肝基因組DNA為模板，用一對(duì)核苷酸為引物寡核苷酸D1: 5， -ATAAGGCTCCCCACCCGCTTTTAG-3， 為正向引物；寡核苷酸 D2: 5，-CGGCGCTCCCATTTATTCCTTATAC-3，為反向引物，采用Long-PCRKU (寶生物工 程公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95 'C lmin; (98°C, 20sec; 65 °C， 10min) *30; 72°C， 10min。然后電泳檢測(cè)目的片段。將上面獲得的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pGEM-T載體(Promega公司)連接，常規(guī)方法轉(zhuǎn)染大腸桿菌Top IOF，宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒小量擴(kuò)增，堿裂解法提取質(zhì)粒。全序列分析表 明在上述擴(kuò)增的hTP0基因組序列中，全部編碼序列、全部?jī)?nèi)含子/外顯子 剪接識(shí)別序列同已發(fā)表的hTPO的基因序列一致；在5887位、5925位分別發(fā) 生T —C、 A —T的突變。
6、 利用上述所得hTPO基因組DNA、 cDNA、內(nèi)含子V，構(gòu)建hTPO基因表 達(dá)載體
利用pcDNA3. 1 ( + )的pCMV與hTP0基因組DNA、 hTP0 cDNA以及含內(nèi)含 子V的hTP0 cDNA，構(gòu)建表達(dá)載體(1) pcDNA3. 1 (-)的pCMV啟動(dòng)表達(dá)的hTP0 基因組DNA表達(dá)載體；(2) pcDNA3. 1 (-)的pCMV啟動(dòng)表達(dá)的hTP0 cDNA表達(dá)載 體(3)pcDNA3. 1 (-)的pCMV啟動(dòng)表達(dá)的含內(nèi)含子V的hTPO cDNA表達(dá)載體。
7、 利用上述所得hTPO基因組DNA、 cDNA、內(nèi)含子V,與乳腺表達(dá)質(zhì)粒相 結(jié)合，構(gòu)建hTPO基因乳腺表達(dá)載體
利用含有山羊P -酪蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)核苷酸序列SEQ ID No. 3的乳腺 表達(dá)載體，結(jié)合上述hTP0基因組DNA、 cDNA、內(nèi)含子V，構(gòu)建三種人TP0基 因乳腺表達(dá)載體。如由pcDNA3. 1(-)的pCMV和山羊|3-酪蛋白基因5，端6606bp 序列共同啟動(dòng)表達(dá)的hTPO基因組DNA表達(dá)載體、hTPO cDNA表達(dá)載體，以及 含內(nèi)含子V的hTPO cDNA表達(dá)載體等。(二)驗(yàn)證上述hTP0和構(gòu)建的三種載體的有效性及實(shí)用性
1、 驗(yàn)證hTPO基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)
將構(gòu)建的載體采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，進(jìn)行(1)轉(zhuǎn)染非洲綠毛猴腎細(xì)胞C0S-7， (2)孕中期小鼠乳腺上皮細(xì)胞HC-ll。經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，采 用hTPO Kit (R&D)檢觀寸hTPO的含量，證明hTPO得到了表達(dá)。其中由pc醒3. 1 (-) 的pCMV和山羊(3-酪蛋白基因5，端6609bp序列共同啟動(dòng)表達(dá)的含內(nèi)含子V 的hTPO cDNA表達(dá)載體的hTPO表達(dá)量最高。
2、 建立hTPO轉(zhuǎn)基因小鼠，在個(gè)體水平驗(yàn)證hTPO在小鼠乳汁中的表達(dá) 通過(guò)顯微注射轉(zhuǎn)基因技術(shù)建立由pcDNA3. 1 (-)的pCMV和山羊0 -酪蛋白
基因5，端6609bp序列共同啟動(dòng)表達(dá)的hTPO基因組DNA表達(dá)載體、hTPOcDNA 表達(dá)載體，以及含內(nèi)含子V的hTPOcDNA表達(dá)載體整合的轉(zhuǎn)基因小鼠。經(jīng)PCR 和Southern. Blot印跡雜交檢測(cè)證實(shí)，轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)有hTPO基因的整合； 采用hTPO Kit(R&D)檢測(cè)鼠奶中hTPO的含量，證明鼠奶中有hTPO的表達(dá)。 其中，由pcDNA3. l(-)的pCMV和山羊p -酪蛋白基因5，端6606bp序列共同 啟動(dòng)表達(dá)的含內(nèi)含子V的hTPO cDNA表達(dá)載體的hTPO表達(dá)量最高達(dá) 122. 8(xg/ml。


圖1是由pcDNA3. 1 (-)的pCMV和山羊|3 -酪蛋白基因5，端6609bp序列 共同啟動(dòng)表達(dá)的hTPO基因組DNA表達(dá)載體的構(gòu)建圖。
圖2是由pcDNA3. 1 (-)的pCMV和山羊^ -酪蛋白基因5，端6609bp序列 共同啟動(dòng)表達(dá)的hTPO cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建圖。
圖3是由pcDM3. l(-)的pCMV和山羊p-酪蛋白基因5，端序列共同啟動(dòng) 表達(dá)的含內(nèi)含子V的人TPO cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建圖。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明所述和以下的實(shí)施例中，所使用的技術(shù)，包括基因測(cè)序、PCR擴(kuò) 增與檢測(cè)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)基因等分子生物學(xué)技術(shù)，以及細(xì)胞培養(yǎng)、 檢測(cè)技術(shù)等，除非特別說(shuō)明的，均為本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員已知的常規(guī)技術(shù)； 所使用的儀器設(shè)備、試劑、質(zhì)粒和載體、細(xì)胞抹等，除非是本說(shuō)明書中特別 注明，均為本領(lǐng)域的研究和技術(shù)人員可以通過(guò)公共途徑獲得的。 本發(fā)明所采用轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物包括所有非人哺乳動(dòng)物。 以下結(jié)合具體的實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的闡述。所述實(shí)施例僅用于 對(duì)本發(fā)明所作的說(shuō)明而不是對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例1: hTPO基因組DNA序列的克隆和測(cè)定1. PCR擴(kuò)增以人胎肝基因組DNA為模板，用一對(duì)核苷酸為引物； 寡核苷酸A1: 5， -AGGTACCTGATGACCTGCTGCTGT-3，為正向引物， 寡核苷酸A2: 5， -CGGCGCTCCCATTTATTCCTTATAC-3'為反向引物。 采用Long-PCR Kit(寶生物工程公司)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件為95°C lmin; (98°C, 20sec; 65°C， 10min)*30; 72°C, 10min。然后電泳才企測(cè)目的片段。2. PCR產(chǎn)物的測(cè)序?qū)⑸鲜鏊@得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別與pGEM-T載體(Promega公司)連接， 常規(guī)方法轉(zhuǎn)染大腸桿菌Top 10F，宿主菌感受態(tài)細(xì)胞，質(zhì)粒小量擴(kuò)增，堿裂 解法提取質(zhì)粒。取小量提取的質(zhì)粒，用PstI和BamHI酶切初步鑒定。AD1370 自動(dòng)測(cè)序儀(Perkin-Elemer公司)測(cè)序，獲得6340bp的hTP0全長(zhǎng)基因， 包括外顯子1-6以及5個(gè)內(nèi)含子的全部序列(見序列表1. SEQ ID No. 1, 其中121-135位是核苷酸引物Al的結(jié)合位點(diǎn)；6326-6350位是核芬酸引物A2的結(jié)合位點(diǎn)；2046位是起始密碼子；5792位是終止密碼子；4891-5127位是內(nèi)含子V;4871位是Pst I的酶切位點(diǎn)；5159位是BamHI的酶切位點(diǎn)。)。實(shí)施例2: hTPO cDNA序列的克隆和測(cè)序1、 RT-PCR以人胎肝mRNA為模板，首先采用RT-PCR Kit (STRATA GENE),進(jìn)行逆 轉(zhuǎn)然后以逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，采用兩對(duì)(B1/B2、 Cl/C2)核苦酸為引物 Bl: 5， -GCGTCGACAGAATGGAGCTGACTGAATT - 3，為正向引物 B2: 5， -GGCATTGGGATCCTTGTGAGCTGTGG-3，為反向引物； Cl: 5， -CAGCTCACAAGGATCCCAATGCCATCTTC - 3，為正向引物， C2: 5， -CGCAGCTGACACGGCAGTGTCTGAGAACCTTA—3，為反向引物，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。PCR的反應(yīng)條件為95°C 5min; 54°C 5min; (94°C lmin; 62。Clmin; 72°C 90sec)*35; 72°C, 10min。然后電泳4企測(cè)目的片段，分別獲得450bp 和660bp的兩個(gè)hTPO cDNA片段。2、 hTPO兩個(gè)片段的連接和測(cè)序經(jīng)PCR擴(kuò)增的兩個(gè)cDM片^殳分別用Sail和BamH I酶切，然后用T4連 接酶(NewEnglandBio公司)將兩個(gè)片段插入測(cè)序質(zhì)粒pBSK。經(jīng)AB1370測(cè)序， 發(fā)現(xiàn)缺失15個(gè)堿基對(duì)。為了得到完整的hTPO cDM分子，首先將hTPO分子 克隆于真核表達(dá)載體pcDNA3. 1/zeo(-);其次，根據(jù)已發(fā)表的hTPO cDNA序 列，人工合成包含上述缺失核苷酸序列的DNA片段，利用Pst I和BamHI將 合成的基因插入pCTPOd中，最后利用T7引物和合成的測(cè)序引物完成對(duì)pCTPO中TPO分子的全序列測(cè)定，得到1062bp的hTPO cDNA分子(見序列表2. SEQ ID No. 2,其中1 - 17位是核苷酸引物趴的結(jié)合位點(diǎn)；416 - 441位是核苷酸引物B2的結(jié)合位點(diǎn)；419 - 447位是核苷酸引物Cl的結(jié)合位點(diǎn)；1060 - 1062位是核苷酸引物C2的結(jié)合位點(diǎn)；377位是Pst I的切點(diǎn)；429位是BamHI的切點(diǎn)。)。實(shí)施例3、乳腺特異表達(dá)載體的構(gòu)建1、 由pcDNA3. 1(-)的pCMV和山羊l3 -酪蛋白基因5，端6606bp序列共 同啟動(dòng)表達(dá)的hTPO基因組DNA表達(dá)載體的構(gòu)建hTPO基因組DNA的PCR產(chǎn)物與T載體連接，經(jīng)Sal 1和Sma I (NEB公司) 雙酶切后裝入克隆載體pBSK;再經(jīng)Notl和Kpnl酶切，切下hTPO基因組DNA, 同樣酶切真核基因表達(dá)載體pcDNA3. 1 (-)，電泳回收目的片段，用T4連接酶 (NEB公司)將上述片段依次有順序地裝載到pcDNA3. 1 (-)表達(dá)載體中；最后以 Notl單酶切將山羊P -酪蛋白基因5，端6609bp序列插入到hTPO基因組DNA 的5，端，經(jīng)酶切鑒定挑選方向正確的克隆，并對(duì)克隆子的連接處測(cè)序，結(jié) 果正確(見序列表3. SEQ ID No. 3)。2、 由pcDM3. 1 (-)的pCMV和山羊p -酪蛋白基因5，端6606bp序列共 同啟動(dòng)表達(dá)的hTPO cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建hTPO cDNA的N端和C端PCR產(chǎn)物首先分別與T載體連接，然后以Sail 和SmaI雙酶切，切下兩個(gè)片段，與經(jīng)SalI酶切的克隆載體pBSK連接，測(cè)序 發(fā)現(xiàn)得到的hTPO cDM分子缺失了 15個(gè)核苷酸；以Kpn I和EcoR V將hTPO cDNA分子克隆到真核表達(dá)載體pcDNA3. 1 (-)中；人工合成含缺失片段的核苷 酸分子，以Pstl和BamHI將缺失片段插入到hTP0cDNA中，得到完整的hTPOcDNA分子。最后以Not I單酶切將山羊P -酪蛋白基因5，端序列插入到hTPO cDNA的5，端，經(jīng)酶切鑒定挑選方向正確的克隆，并對(duì)克隆子的連接處測(cè)序， 結(jié)果正確(見序列表3. SEQ ID No. 3)。3、由pcDM3. 1 (-)的pCMV和山羊p -酪蛋白基因5，端序列共同啟動(dòng)表 達(dá)的含內(nèi)含子V的hTPO cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建hTP0內(nèi)含子V的PCR產(chǎn)物首先T載體連接，以Pstl和BamHI將內(nèi)含子 V插入到pc腿3. 1 (-)載體得hTP0 c歸中，得到含內(nèi)含子5的hTP0 cDNA真 核表達(dá)載體；以Not I和Kpn I將大鼠的WAP啟動(dòng)子插入到hTPO cDNA的5， 端；BamHI單酶切以山羊P -酪蛋白基因5，端序列替換大鼠的WAP啟動(dòng)子， 得由pcDNA3. 1(-)的pCMV和山羊P -酪蛋白基因5，端6609bp序列共同啟動(dòng) 表達(dá)的含內(nèi)含子V的hTPO cDNA表達(dá)載體。經(jīng)酶切鑒定挑選方向正確的克隆， 并對(duì)克隆子的連接處測(cè)序，結(jié)果正確。實(shí)施例4: hTPO基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)1、 轉(zhuǎn)染Cos - 7細(xì)胞株按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。 pcDNA3. 1 (-) /hTPO cDNA和pcDNA3. 1 (-) /hTPO cDNA-Intron V質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞是采用DOTAP (DM公司)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法， 轉(zhuǎn)染Cos-7細(xì)胞48小時(shí)，收集細(xì)胞上清液，采用hTPO Kit(R&D)檢測(cè)hTPO 的含量，證明hTPO得到了表達(dá)。2、 轉(zhuǎn)染HC-11細(xì)胞株pcDNA3. 1 (-)/hTPO cDNA和pcDNA3. 1 (-)/hTPO c隨-htron V質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HC-ll細(xì)胞(購(gòu)自瑞士 Friedrich Miescher研究所)是采用DOTAP (DM公司)脂 質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，按照生長(zhǎng)培養(yǎng)期、休克培養(yǎng)期及誘導(dǎo)期培養(yǎng)，三種要求進(jìn)行培 養(yǎng)HC-11細(xì)胞，轉(zhuǎn)染HC-11細(xì)胞48小時(shí)，收集細(xì)胞上清液，采用人TPOKi t (R&D) 檢測(cè)hTPO的含量，證明hTPO得到了表達(dá)。實(shí)施例5:建立轉(zhuǎn)基因小鼠以QIAquick Kit #是取pcDNA3. 1 (-) /hTPO cDNA和pcDNA3. 1 (-) /hTPO cDNA-Intron V質(zhì)粒，純化定量測(cè)定，供顯微注射。按照常規(guī)程序進(jìn)行轉(zhuǎn)基 因小鼠的制備。經(jīng)PCR和Southern blot印跡雜交檢測(cè)證實(shí)轉(zhuǎn)基因小鼠其體 內(nèi)有hTPO基因的整合，采用hTPO Kit(R&D)檢測(cè)其奶汁中hTPO的表達(dá)量， 最高的達(dá)122. 8)ag/ml。序列表〈110〉上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所〈120〉 一種促人血小板生成素表達(dá)載體及其構(gòu)建方法 〈130〉 P5081014 〈160〉 3<170〉 Patentln version 3.3<210〉 <211〉 <212〉 〈213〉<220> 〈221〉 〈222〉〈220〉 〈221〉 〈222〉16350廳human(1).. (6350)Intron(4891).. (5127)<400〉 1gaggagtgga ccctggtcca ggc鄉(xiāng)ggct cc鄉(xiāng)gaaga gaaggcgtca cttccggggg 60ccttcaccag tgtctggtgg ctcccttctc tgattgggca gaagtggccc aggcaggcgt 120atgacctgct gctgtggagg ggctgtgccc caccgccaca tgtcttccta cccatctgct 180ccccagaggg ctgcctgctg tgcacttggg tcctggagcc cttctccacc cggtgagtgg 240ccagcagggt gtggggttat gtgagggtag a犯ggacagc幼ag卿朋t gggctcccag 300ctgggggagg ggcaggca肪ctggaaccta caggcactga cctttgtcga gaagagtgta 360gccttcccag犯tgggagga gcagggc卿gcaggggtag ggggtggggt gctggtttct 420gagggactga tcacttactt ggtggaatac agcacagccc tggctggccc taaggaaagg 480ggacatgagc ccagggagaa aatamgagag ggagctgcac ttagggctta gcaaacscag 540tagtgagatg gacacagccc caatccccat tcttagctgg tcattcctcg ttagcttaag 600gttctg朋tc tggtgctggg gaagctgggc caggcaagcc agggcgc鄉(xiāng)g卿gggt犯 ,tgggaggagg gcccactcat gttgacagac ctacaggaaa tcccaatatt gaatcaggtg 720caagcctctt tgcacaactt gtgaaaggag gaggaagcca tgtggggggt cctgtggagg 780aaccgg犯gg ggttctgcca鄉(xiāng)gggcagg g鄉(xiāng)caggtg tgagctatg已gac卿tatg 840ttagtgggcg cctaagac犯ggtaagcccc t犯ggtgggc atcacccagc aggtgcccgt 900tcctgggcag ctggtctcag gaaggaagtc ccagaactgt tagcccatct cttggcctca 960gataatggag tatttcagga cttggagtcc agagaaaagc tccagtggct ttatgtgtgg 1020gggtagatag ggaaagaata gaggttaatt tctcccatac cgccttttaa tcctgacctc 1080tagtggtccc agttacagct ttgtgcagtt cccctcccca gccccactcc ccaccgcaga 1140agttacccct caacatattg cgcccgtttg ccagttcctc acccaggccc tgcatcccat 1200tttccactct cttctccagg ctgaagccac aatactttcc ttctctatcc ccatcccaga 1260ttttctctga cctaacaacc aaggttgctc agaatttaag gctaatt犯g atatgtgtgt 1320atacatatca tgtcctgctg ctctcagcag gggtaggtgg caccaaatcc atgtccgstt 1380cactgaggag tcctgac犯a aaggagacac catatgcttt cttgctttct ttctttcttt 1440ctttcctttt ttttttttga gacggagttt cactcttatt gcccaggctg gagtgcaatg 1500gtgcgatctc ggctcaccac aaacctccgc ctcccaggta caagcgattc tcctgtctca 1560gcctcccaag tagcttggat tacaggcatg aaccaccaca ccctgctagt ttttttgtat 1620ttcgtagagc cggggtttca ccatgttagt gaggctggtg gcgaactcct gacctcaggt 1680gatccacccg ccttggactc ccaaagtgct gggattacag gcatgagcca ctgcacccgg 1740cacaccatat gctttcatca caagaaaatg tgagagaatt cagggctttg gcagttccag 1800gctggtcagc atctcaagcc ctccccagca tctgttcacc ctgccaggca gtctcttcct 1860agaaacttgg ttaaatgttc actcttcttg ctactttcag gatagattct tcacccttgg 1920cccgcctttg ccccacccta ctctgcccag aagtgcaaga gcctaagccg cctccatggc 1980cccagg犯gg attcagggga gaggccccaa acagggagcc acgccagcca gacaccccgg 2040ccag犯tgga gctgactggt gagaacacac ctgaggggct agggccatat ggaaacatga 2100cagaagggga g卿gaaagg卿cacgctg cagggggcag gaagctgggg gaacccattc 2160tcccaaaaat aaggggtctg aggggtggat tccctgggtt tcaggtctgg gtcctgaatg 2220ggaattcctg gaataccagc tgacaatgat ttcctcctca tctttcaacc tcacctctcc 2280tcatctaaga attgctcctc gtggtcatgc ttctcctaac tgc犯ggcta已cgctgtcca 2340gcccggctcc tcctgcttgt gacctccgag tcctcagtaa actgcttcgt gactcccatg 2400tccttcagag cagactggtg ag犯ctccca acattatccc ctttatccgc gt犯ctggta 2460agacacccat actcccagga agacaccatc acttcctcta actccttgac ccaatgacta 2520ttcttcccat attgtcccca cctactgatc acactctctg acaaggatta 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3420cccaggaggt ggaggttgta gtgagctgsg atcatgccaa tgcactccag cctgggtgac 3480aagagcaaaa ctccgtctca aa犯gaaaaa aaaattctac atgtgt犯at taatgagtaa 3540agtcctattc cagctttcag gccacaatgc cctgcttcca tcatttaagc ctctggccct 3600agcacttcct acga犯agga tctgagagaa ttaaattgcc cccaaactta ccatgt犯ca 3660ttactgaagc tgctattctt aaagctagta attcttgtct gtttgatgtt tagcatcccc 3720attgtggaaa tgctcgtaca gaactctatt ccgagtggac tacacttaaa tatactggcc 3780tgaacaccgg acatccccct gaagacatat gctaatttat taagagggac catattaaac 3840taacatgtgt ctsgaaagca gcagcctgaa cagaaagaga ctagaagcat gttttatggg 3900caatagttta aaaaactaaa atctatcctx aagaacccta gcgtcccttc ttccttcagg 3960actgagtcag gg犯gaaggg cagttcctat gggtcccttc tagtcctttc ttttcatcct 4020tatgatcatt atggtagagt ctcataccta catttagttt atttattatl: attatttgag 4080acggagtctc actctatccc ccaggctgga gtgcagtggc atgarctcaa ctcactgcaa 4140cctcagcctc ccggattcaa gcgattctcc tgcctcagtc tcccaagtag ctgggattac 4200aggtgcccac caccatgccc agctaatttt tgtatttttg gtagagatgg ggtttcacca 4260tgttggccag gctgatcttg aactcctgac ctcaggtgat ccacctgcct cagcctccca 4320aagtgctggg attacaggcg tgagccactg cacccagcct tcattcagtt taaaaatcaa 4380atgatcctaa ggttttgcag cagaaagagt aaatttgcag cactagaacc aagaggtaaa 4440agctgtaaca gggcagattt cagc犯cgta aga犯aaagg agctcttctc actga幼cca 4500agtgt犯gac csggctggac tagaggacac gggagttttt gaagcagagg ctgatgacca 4560gctgtcggga gactgtgaBg gaattcctgc cctgggtggg accttggtcc tgtccagttc 4620tcagcctgta tgattcactc tgctggctac tcctaaggct ccccacccgc ttttagtgtg 4680ccctttgagg cagtgcgctt ctctcttcca tctctttctc aggaggagac caaggcacag 4740gacattctgg gagcagtgac ccttctgctg gagggagtga tggcagcacg gggac犯ctg 4800ggacccactt gcctctcatc cctcctgggg cagctttctg gacaggtccg tctcctcctt 4860ggggccctgc agagcctcct tggaacccag gtaagtcccc agtcaaggga tctgtagaaa 4犯0ctgttctttt ctgactcagt ccccctagaa gacctgaggg aagaagggct cttccaggga 4980gctcaagggc agaagagctg atctactaag agtgctccct gccagccaca atgcctgggt 5040actggcatcc tgtctttcct acttagacaa gggaggcctg agarctggcc ctggtgtttg 5100gcctcaggac catcctctgc cctcagcttc ctccacaggg caggaccaca gctcacaagg 5160atcccaatgc catcttcctg agtttccaac acctggtccg aggaaaggtg cgtttcctga 5220tgcttgtagg agggtccacc ctctgggtca ggcgggcccc acccaccaca gctgtcccca 5280gcagaacctc tctagtcctc acactgaacg agcttccaaa caggacttct ggattgttgg 5340agacaaactt cactgcctca gccag犯cta ctggctctgg gcttctgaag tggcagcagg 5400gattcagagc caagattcct ggtctgctga accaaacctc caggtccctg gaccaaatcc 5460ccggatacct gaacaggata cacgaactct tgaatggaac tcgtggactc tttcctggac 5520cctcacgcag gaccctagga gccccggaca tttcctcagg aacatcagac acaggctccc 5580tgccacccaa cctccagcct ggatattctc cttccccaac ccatcctcct actggacagt 5640atacgctctt ccctcttcca cccaccttgc ccacccctgt ggtccagctc caccccctgc 5700ttcctgaccc ttctgctcca acgcccaccc ctaccagccc tcttctaaac acatcctaca 5760cccactccca gaatctgtct caggaagggt aaggttctca gacactgccg acatcagcat 5820tgtctcatgt acagctccct tccctgcagg gcgcccctgg gagacaactg gacaagattt 5880cctactttct cctg犯accc犯agccctgg taiaaagggat acacaggact gaaaagggaa 5940tcatttttca ctgtacatta taaaccttca gaagctattt ttttaagcta tcagcaatac 6000tcatcagagc agctagctct ttggtctatt ctacatgctc tttttctgtg ataactctgc gagggag3g已ctaaccttga gtcag犯犯c tcaaggcctt ccaacgcccc catccccttt tattcttaac agatctttac tcttgagaaa ctatacacta gacaa犯ctg agcctgtatattctgcagaa atttgcaact cactgattct 6060aaaggcctgg gctggcctgg cagttgaaca 6120agagaaaggg taatttcctt tgcttcaaat 6180actatcattc tcagtgggac tctgatccca 6240tgaataagct ttctctcaga aatgctgtcc 6300agg犯taaat gggagcgccg 6350〈210〉 2〈211〉 1062〈212〉 DNA〈213〉 human〈220〉<221> gene〈222〉 (1). (1062)〈400〉 2atggagctga ctgaattgct cctcgtggtc atgcttctcc taactgcaag gctaacgctg GOtccagcccgg ctcctcctgc ttgtgacctc cgagtcctca gtaaactgct tcgtgactcc 120catgtccttc acagcagact gagccagtgc ccagaggttc accctttgcc tacacctgtc 180ctgctgcctg ctgtgg已ctt tagcttggga gaatggaaaa cccagatgga ggagaccaag 240gcacaggaca Uctgggagc agtgaccctt ctgctggagg gagtgatggc agcacgggga 300caactgggac ccacttgcct ctcatccctc ctggggcagc tttctggaca ggtccgtctc 360ctccttgggg ccctgcagag cctccttgga acccagcttc ctccacaggg caggaccaca 420gctcacaagg atcccaatgc catct"tcctg agcttccaac acctgctccg aggaaaggtg 480cgtttcctga tgcttgtagg agggtccacc ctctgcgtca ggcgggcccc acccaccaca 540ggattgttgg agacaaactt cactgcctca gccagaacta ctggctctgg gcttctgaag 660tggcagcagg gattcagagc caagattcct ggtctgctga accaaacctc caggtccctg 了之0gaccaaatcc ccggatacct g犯caggata cacg犯ctct tgaatggaac tcgtggactc 780tttcctggac cctcacgcag gaccctagga gcccgggaca tttcctcagg aacatgagac 840acaggctccc tgccacccaa cctccagcct ggatattctc cttccccaac ccatcctcct 900actggacagt atacgctctt ccctcttcca cccaccttgc ccacccctgt ggtccagctc 960caccccctgc ttcctgaccc ttctgctcca acgcccaccc ctaccagccc tcttctaaac 1020acatcctaca cccactccca gaatctgtct caggaagggt aa 1062〈210〉 3 〈211〉 6603 〈212〉 ■ 〈213〉 goat〈400〉 3tagcaggaat cacagcatct acacattttt tcattttgtg acttttcaag tcttcteLgct 60cagtcattct犯atgtgaga tgattttgca accccctgcc tcaggagaca ctggg3犯tt 120tcctgagaca tttttgattc caaaagctgt gcagttggtg cttctaccat cttcgtggta 180gaggtcaagg atgctgctaa acattctaca acacattsag aiaaaccccca caacaasgaa 240ttcttccgcc犯aaatatca ataatatgaa ggttgaaaaa tactggtcta gcatgtaigta 300tgtgctcaat agc犯ggaga g犯犯ga3ag ccttcctcac tgatt犯tgc aaag犯atag 犯0aggaeia已caa tagaatggga aagactagag agctcttcaa gcaaattaga gatatcaagg 420gaacatttca cgcaeLeigatg ggcacaataa aggELcagaaa ttttatggag gagttgctga 480tgg卿ggg3 ggCCtggCgt gCtgCg3ttC 3tggggtCgC認(rèn)g3gtCgg 3C3認(rèn)Ctga 歸gcgactgaat tg犯ctga8C tg犯ctggac aaagcag犯g atatt犯gBa gaggtggt犯 600gaatacacag aagaacaata taaaaaagst cttcatgacc cagataacca cgatga^tgtg 660atcactcacc tagagccaga caccctggaa 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1、一種促人血小板生成素hTPO表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體包括含有內(nèi)含子V的hTPO cDNA，并且利用山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)所述含有內(nèi)含子V的hTPO cDNA的表達(dá)。
2、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述內(nèi)含子V具有SEQ ID N0: 1所示第4891 _ 5127位的核苷酸序列。
3、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述hTPO cDNA具有 SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
4、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述山羊(3-酪蛋白啟 動(dòng)子具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
5、 如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體還包括 CMV啟動(dòng)子。
6、 一種如權(quán)利要求1所述載體的構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟A、 PCR擴(kuò)增hTPO cDNA片段，并將hTP0內(nèi)含子V片段插入hTPO cDM 中，構(gòu)建成含內(nèi)含子V的hTPO cDNA真核表達(dá)載體；B、 將山羊p-酪蛋白啟動(dòng)子插入hTPO cDNA的5，端，構(gòu)建成由CMV啟 動(dòng)子、山羊P -酪蛋白啟動(dòng)子共同啟動(dòng)的含有內(nèi)含子V的hTPO cDNA的表達(dá)載 體。
7、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟A的hTPO cDNA片 段具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列。
8、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟A的hTPO內(nèi)含子 V片段具有SEQ ID NO: 1所示第4891 - 5127位的核苷酸序列。
9、 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟B的山羊I3-酪蛋 白啟動(dòng)子具有SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明屬基因工程和轉(zhuǎn)基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及建立人促血小板生成素基因與山羊β-酪蛋白基因啟動(dòng)子的乳腺特異表達(dá)載體的方法。構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)染于COS-7和HC-11細(xì)胞，在真核細(xì)胞水平驗(yàn)證hTPO有表達(dá)。將構(gòu)建的山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子指導(dǎo)的促血小板生成素基因表達(dá)載體應(yīng)用于制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物乳腺生物反應(yīng)器，在轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物的乳汁中高表達(dá)，為臨床提供了有用的藥物蛋白-hTPO。本發(fā)明所提供的hTPO基因以及與山羊β-酪蛋白啟動(dòng)子構(gòu)建的乳腺特異表達(dá)載體，為進(jìn)一步研究開發(fā)提供了基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12N15/12GK101250553SQ20081008647
公開日2008年8月27日 申請(qǐng)日期2002年7月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月13日
發(fā)明者寧云山, 曾溢滔, 王小寧, 黃淑幀 申請(qǐng)人:上海醫(yī)學(xué)遺傳研究所;中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);上海滔滔轉(zhuǎn)基因工程股份有限公司