專利名稱：無抗生素狀態(tài)下產生多肽的表達系統(tǒng)的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種微生物表達系統(tǒng)，其在使用染色體外DNA的基礎上產生多肽，由 此不必使用用于宿主細胞選擇的抗生素標記基因(由所述基因得到的蛋白質使細胞具有 抗生素抗性，所述基因也稱為抗生素抗性基因、抗性基因、抗生素標記或抗生素選擇標記)， 而是使用編碼3-磷酸甘油脫氫酶(也稱為NAD (P) H依賴性二羥丙酮磷酸還原酶、NAD(P)H 依賴性3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫酶(NADP)、3_磷酸甘油合酶、生物合成的3-磷 酸甘油脫氫酶、L-3-磷酸甘油NAD(P)氧化還原酶)的DNA序列，因此所需多肽(例如木聚 糖酶)的產生無需添加抗生素。所述表達系統(tǒng)中不存在抗生素抗性基因。本發(fā)明還涉及一 種編碼具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的DNA序列，以及一種具有3-磷酸甘油脫氫酶 活性的多肽。
背景技術：
現(xiàn)今，所需的大量多肽和酶主要是通過微生物發(fā)酵而獲得。由此使用兩種微生物 i)天然產生相關蛋白質的微生物；和ii)經(jīng)基因修飾的微生物?，F(xiàn)有技術中早已了解修飾 微生物所需的遺傳學方法。其基本原理在于將編碼相關蛋白質的基因插入宿主細胞中，并 由所述宿主細胞進行轉錄，翻譯，可能的翻譯后修飾，并且任選由個別膜分泌到周質或相鄰 培養(yǎng)基中。隨后可從個別細胞或培養(yǎng)上清液中分離出相關多肽。在用于產生多肽的技術方法中，首先研究用于所述產生的微生物合成和任選分 泌蛋白質的天然能力。在發(fā)酵過程中具有成本效益的系統(tǒng)顯示出高產物形成率并且保證 將產生的多肽能夠進行正確折疊、修飾等，因此主要選擇所述系統(tǒng)作為產生多肽的系統(tǒng)。 確定用于此目的的微生物有真核來源的微生物，例如絲狀真菌(曲霉菌(Aspergilla)、 木霉菌(Trichoderma)、青霉菌(Penicillium))和酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、 漢遜酵母(Hansenula)、畢赤酵母(Pichia))，或使用原核生物，例如大腸桿菌(E. coli)、 芽孢桿菌(bacilli)、乳桿菌(Iactobacilli)、葡萄球菌(staphylococci)、鏈霉菌 (streptomycetes)或假單胞菌(pseudomonades)。生物技術方法的收益性無疑取決于所獲得的多肽的產率。這一產率不僅是由所用 的表達系統(tǒng)決定，而且還由所用的制造方法、尤其發(fā)酵參數(shù)和培養(yǎng)基決定。通過優(yōu)化表達系 統(tǒng)和發(fā)酵方法，可明顯增加潛力和可獲得的產率。經(jīng)基因修飾的微生物含有新的遺傳信息，這些信息被整合到基因組中(通常見于 絲狀真菌或酵母)或是整合到例如質粒等染色體外元件(通常用于原核生物或酵母)上。 新的遺傳信息被整合到宿主基因組中的第一構筑體也極為穩(wěn)定，沒有選擇壓力。對于原核 生物，這種方法的缺點在于轉化后，僅一個基因拷貝存在于宿主中，而且整合同一基因的 其它拷貝以便經(jīng)由基因劑量效應增加產物形成率的方法相當復雜。這種方法的解決方案可 見于EP O 284 126 Bi，所述方案通過單獨提供外源基因拷貝，經(jīng)由對宿主細胞至關重要的 內源染色體DNA將所述拷貝整合到所述細胞的基因組中，解決了基因的穩(wěn)定多次整合的問 題。專利申請案DD 277467 Al提供一種產生細胞外酶的方法，所述方法是建立在穩(wěn)定、有
5利地將編碼相關多肽的基因多次整合到細菌染色體中的基礎上。所述整合是通過在同源范 圍內重組而進行。利用質粒將紅霉素(erythromycine)基因插入細胞中，并在成功整合的 情況下使其失活，由此所述質粒上所含的紅霉素基因可用作成功整合事件的對照。申請案WO 96/23073 Al公開一種基于轉座將相關基因的數(shù)個拷貝整合到細菌染 色體中的系統(tǒng)，其特征在于所述載體的標記基因在整合期間或之后缺失，因此，所得菌株 無標記基因。根據(jù)這一文獻，只有在構筑個別細菌菌株的過程中才需要標記。申請案WO 01/90393 Al公開一種增加整合到細菌染色體中的某些基因的拷貝數(shù) 的系統(tǒng)。如果使用染色體外DNA產生經(jīng)基因修飾的微生物，那么應將相關基因轉移到自主 復制元件(例如質粒)中，并使其以游離基因形式保持在宿主有機體中。經(jīng)由每一細胞通常 較多的質粒拷貝所引起的基因劑量效應會有利地影響由相關基因編碼的多肽的產率。不利 之處在于，應在完整的培養(yǎng)時間內保持選擇壓力，以便使染色體外元件在細胞中保持穩(wěn)定。 在將抗生素添加到培養(yǎng)基中時，一般會出現(xiàn)這種情形。由于使微生物對抗生素產生抗性的 基因是位于染色體外元件上，故只有具有這類元件的細胞才可能生長。通過將相關基因定 位于同樣會使宿主對一種或一種以上抗生素產生抗性的質粒上，來使細胞中保持所述基因 的多個拷貝。使用抗生素作為選擇壓力，可以避免由于分離或結構不穩(wěn)定性而引起的質粒 丟失(Bron和Luxen，1985，plasmid 14, 235-244) 以這種方式，還可在細胞中穩(wěn)定保持較 大質粒，并且所述細胞仍保持產生所需多肽的能力。一般說來，染色體外DNA很容易丟失， 尤其是所述有機體的未知DNA更容易丟失。對于天然含有質粒的細菌，應用選擇壓力通常 也是合理的，這是因為天然存在的染色體外元件通常只以低拷貝數(shù)存在；但是，工業(yè)上的高 生產率卻需要高拷貝數(shù)。然而，所述高拷貝數(shù)通常只能通過選擇壓力來保持。近年來，使用抗生素抗性作為選擇標記越來越無法令人滿意。首先，使用抗生素相 當昂貴，尤其當所述抗性是基于降解抗生素的酶時更是如此，以致必須在整個培養(yǎng)期間供 應抗生素。其次，其在世界范圍內的使用還延伸到其它的工程改造和醫(yī)學領域，這使得抗性 基因散布到其它也具致病性的菌株上，從而可能會對疾病控制帶來不利后果?，F(xiàn)有技術中也已開發(fā)出無抗生素選擇的系統(tǒng)。舉例來說，Herrero等人(1990， J. Bacteriol. 172，6557-6567)發(fā)表的文章中描述作為選擇標記的除草劑和重金屬抗性。然 而，與反對使用抗生素的顧慮相同，也反對使用這些化合物。另一種用于使質粒在細胞中保持穩(wěn)定的方法為營養(yǎng)缺陷型菌株(auxotrophic strain)的游離基因補充(印isomal complementation)。在這種情況下，生產菌株的基因 組中編碼基本代謝功能的基因被去除或失活。因此，營養(yǎng)缺陷型宿主菌株只能在另外再產 生代謝功能的情況下生長。如果所述菌株能夠接受所需代謝產物，或可使在宿主基因組上 失活并且編碼基本功能的基因成為可用的游離基因，那么例如可將此代謝物添加到培養(yǎng)基 中。有利的是，這種情形發(fā)生在也攜帶產生多肽的相關基因的質粒上。專利EP O 284 126B1 列出用作營養(yǎng)缺陷型選擇標記的代謝基因leu、hiS、trp等，尤其來自氨基酸合成路徑的基 因。實際上，由于特別是在工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基中，幾乎所有的必需物質(例如氨基酸和 維生素)都是足量可用的，而且個別細胞可通過從培養(yǎng)基中吸收某一代謝物來平衡其所缺 乏的合成這一代謝物的能力，故到目前為止，很難使用所述營養(yǎng)缺陷型作為選擇標記。
6
工業(yè)上使用的發(fā)酵培養(yǎng)基通常含有為其它過程(通常是發(fā)酵過程)的廢產物的組 分，例如乙醇生產中的谷物殘留物(蒸餾塔余下的谷物)、淀粉生產中的玉米殘留物(玉米 漿粉或玉米漿液)或淀粉生產中的馬鈴薯殘留物(馬鈴薯漿(potato slump))。這些組分 不僅能用作碳源(C)或氮源(N)，而且還通常因其回收過程涉及微生物發(fā)酵而富含例如維 生素或氨基酸。因此，工業(yè)上使用的發(fā)酵培養(yǎng)基相當復雜。因而，即使是使用營養(yǎng)缺陷型菌 株，也很難甚至是不可能在這些培養(yǎng)基中保持選擇壓力。迄今為止，唯一的例外為針對芽孢桿菌和革蘭氏陽性(gram-positive)微生物所 需的必要胸苷和D-丙氨酸的營養(yǎng)缺陷型，所述胸苷和D-丙氨酸只以微量存在，或者根本不 存在于工業(yè)發(fā)酵培養(yǎng)基中，因此須由微生物自身產生。因此，申請案EP 0 251 579 Al提供 使用缺乏對于核苷酸代謝至關重要的胸苷酸合酶基因的菌株作為宿主菌株的解決方案。相 應地，可借助于載體獲得用于此功能的基因(來自大腸桿菌K12的thyA)，從而消除基因缺 陷。專利EP 0 185 512 Bl使用dal缺陷型宿主菌株，通過將dal基因(D，L-丙氨酸消旋 酶)插入質粒中來解決所述問題。申請案WO 2004/078953描述另一種解決這一問題的方法。其公開，分泌過程中所 涉及的必要因子適于選擇。產生蛋白質轉位所涉及的蛋白質的基因提供選擇的基礎，所述 蛋白質為個別基因的必要因子，例如對于芽孢桿菌，蛋白質SecA、SecY, SecE, b_SRP、FtsY 或PrsA。這意味著所述因子的缺乏是致死性的，因此允許重組微生物的類似于抗生素的選 擇?？偠灾?，必須說明的是，盡管有數(shù)年來通過生物技術方法產生多肽的經(jīng)驗， 但迄今為止，尚未提供可能使用相關基因的多個拷貝進行生產，而無需通過昂貴或影響 生態(tài)的物質(例如抗生素)進行選擇的實用系統(tǒng)。歸因于工業(yè)上所用培養(yǎng)基的復雜性 (W02004/078953)，或由于所述系統(tǒng)仍含有抗生素抗性基因，迄今為止，通過營養(yǎng)缺陷型標 記進行選擇的不同方法也都只得到相當貧乏的結果。因為由純組分(純碳源和氮源以及維生素、氨基酸和礦物質)構成的合成培養(yǎng)基 的成本較高，所以不可能使用所述培養(yǎng)基來產生工業(yè)上使用的多肽，例如食品工業(yè)、飼料工 業(yè)或洗滌劑工業(yè)中的酶。

發(fā)明內容
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于產生多肽的表達系統(tǒng)，其中不存在利用昂貴 和/或有污染和/或不健康的物質進行選擇。具體說來，不必通過抗生素抗性進行選擇。本 發(fā)明的表達系統(tǒng)易于應用，且普遍適用于任何靶多肽的表達。此外，本發(fā)明的表達系統(tǒng)適于 在任何宿主細胞中建立。而且，本發(fā)明的表達系統(tǒng)還允許在工業(yè)上常用或具有成本效益的 培養(yǎng)基中進行選擇。所述目的是通過一種用于產生一種或一種以上靶多肽的表達系統(tǒng)來實現(xiàn)，所述表 達系統(tǒng)包含宿主細胞，在所述宿主細胞的基因組中，編碼3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列失 活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主細胞經(jīng)包含編碼所述靶多肽和3-磷酸甘油脫氫酶 的DNA序列的染色體外元件轉化，由此所述宿主細胞基因組與染色體外元件都不攜帶抗生 素抗性基因。意外地發(fā)現(xiàn)，染色體外元件上所提供的3-磷酸甘油脫氫酶基因可用于個別營養(yǎng)
7缺陷型宿主細胞中，從而用于相應宿主細胞的選擇。攜帶3-磷酸甘油脫氫酶基因的染色體 外元件也攜帶將產生相關多肽的基因。因此，3-磷酸甘油脫氫酶基因用作使染色體外元件在營養(yǎng)缺陷型宿主細胞中穩(wěn) 定的選擇標記。所述染色體外元件包含編碼靶多肽和3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列，它 的穩(wěn)定是建立在變?yōu)闋I養(yǎng)缺陷型的宿主細胞的游離基因補充的基礎上。在宿主菌株的基 因組中，編碼3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列或個別基因失活。這一基因編碼酶3-磷酸 甘油脫氫酶(也稱為NAD(P)H依賴性二羥丙酮磷酸還原酶、3-磷酸甘油合酶、生物合成 的 3-磷酸甘油脫氫酶；Morbidoni 等人，1995，J. Bacteriol. 177 (2)，5899-5909 ；EC 編號 1. 1. 1.8,1. 1. 1.94，在本文中還稱為NAD (P) H依賴性3-磷酸甘油脫氫酶、3-磷酸甘油脫氫 酶(NADP)、L-3-磷酸甘油NAD(P)氧化還原酶)。3-磷酸甘油脫氫酶在NAD(P)H的鍵聯(lián) 下，催化二羥丙酮磷酸轉化成順-3-磷酸甘油。順-3-磷酸甘油本身為細胞磷脂合成的起 始物質，且因此為細胞膜合成的主要代謝物。視有機體而定，NAD (P)H依賴性3-磷酸甘油 脫氫酶基因還被稱為 gpsA(也稱為 gol、gly、glyc)、gpd(gpd l/2/3/A/Al/A2/h)或 darl。 一般說來，它是在生理條件下催化合成3-磷酸甘油的酶，并且通常使用NAD(P)H作為輔因 子。使用不同輔因子(例如FAD)的相應酶也是可以想到的。視宿主菌株而定，編碼3-磷 酸甘油脫氫酶的相應基因或3-磷酸甘油脫氫酶基因失活。通過使宿主菌株的基因組中缺失3-磷酸甘油脫氫酶基因，使所述菌株變成3-磷 酸甘油(G3P)營養(yǎng)缺陷型，但如果在培養(yǎng)基中作相應補充(補充G3P或甘油)，或提供相應 的游離基因，那么所述菌株仍可能生長。通過將3-磷酸甘油脫氫酶基因插入也攜帶相關多 肽的DNA序列的質粒中，使所述質粒在營養(yǎng)缺陷型宿主細胞中保持穩(wěn)定。同時，消除通常存 在于質粒上的抗生素抗性基因。此外，也消除任選存在于宿主細胞基因組中的抗生素抗性 基因。抗生素抗性基因的消除是以本來已知的方式進行，例如對于基因組，利用同源重組 (參看下文)；或對于質粒，借助于適當限制酶進行切除，隨后接合。本發(fā)明表達系統(tǒng)的宿主細胞的基因組中缺失編碼3-磷酸甘油脫氫酶的相應DNA 序列。所述缺失可為完全或部分缺失。在任一種情況下，缺失的存在都必須使3-磷酸甘油 脫氫酶基因失活。宿主菌株中所述基因的失活例如是通過利用失活或(部分)缺失的基因 拷貝進行同源重組而發(fā)生。由于這一重組事件，所述基因的染色體拷貝變得不可操作。此 外，優(yōu)選系統(tǒng)的特征在于染色體上發(fā)生3-磷酸甘油脫氫酶基因失活，以致優(yōu)選在完全喪 失個別染色體基因座中所含的基因或基因片段時，避免失活的染色體基因拷貝與消除失活 的互補載體(curing complementation vector)上的同源區(qū)稍后重組。宿主基因組中互 補載體的重組和整合(由此將以游離形式提供具有基本功能的細胞)將再次消除失活，并 因此抵消使質粒在細胞中保持穩(wěn)定的選擇壓力。由此，欲表達的實際上相關的基因可通過 隨后的細胞分裂而丟失，或僅存在于染色體上的一個或數(shù)個拷貝中。通過失活步驟期間的 廣泛或完全缺失可防止這種情形，這在理論上還可能涉及位于上游或下游的DNA片段。因 此，須考慮到，gpsA基因上游或下游的區(qū)域可能在宿主菌株中具有對所述宿主極為重要的 功能。為了避免染色體外元件所提供的3-磷酸甘油脫氫酶基因與任選存在的染色體 基因之間發(fā)生同源重組，有必要通過個別點突變，以及廣泛或完全地去除宿主基因組上的 3_磷酸甘油脫氫酶基因來使所述基因失活。舉例來說，利用僅包含所述基因的失活部分或
8甚至更佳地僅包含所述基因的側接區(qū)而非所述基因本身的缺失載體(deletion vector), 通過同源重組從宿主基因組中消除所述基因，以致宿主基因組上所述基因的拷貝經(jīng)缺失載 體上存在的截短的拷貝置換，或完全缺失。重要的是，由此沒有抗生素標記基因留下。為了 從宿主中完全消除所述基因，有必要在宿主基因組的上游和下游分離出側接所述基因的區(qū) 域，并將這些無3-磷酸甘油脫氫酶基因本身的側接區(qū)插入缺失載體中。隨后，使側接3-磷 酸甘油脫氫酶基因的各序列之間發(fā)生同源重組，由此將3-磷酸甘油脫氫酶基因從基因組 中完全去除。根據(jù)本發(fā)明，利用攜帶3-磷酸甘油脫氫酶基因以及編碼相關多肽的DNA序列的染 色體外元件，使細胞再次獲得宿主染色體上缺失或失活的3-磷酸甘油脫氫酶基因。不僅個 別宿主細胞中缺失的相同基因，而且編碼NAD (P) H依賴性3-磷酸甘油脫氫酶的相應基因都 可再次為宿主細胞所用。因此，本發(fā)明還涉及一種宿主細胞基因組(其中編碼3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序 列缺失)的互補載體，其包含編碼靶多肽的DNA序列，和包含編碼3-磷酸甘油脫氫酶的DNA 序列的表達盒，由此所述載體不含抗生素抗性基因。因此，所述載體消除編碼3-磷酸甘油 脫氫酶的DNA的失活(“互補載體”)，即，其在染色體外提供編碼3-磷酸甘油脫氫酶的活 性基因拷貝。術語“載體”和“質粒”基本上可以互換使用。其它染色體外元件(例如噬菌 體、噬菌粒(pagmide)或轉座子)也可用作載體。在宿主細胞中保持多個拷貝的質粒優(yōu)選作為載體。如果質粒為成簇建立(例如， 每個細胞10到30個質粒)、優(yōu)選具有多個拷貝(每個細胞超過30個質粒)的質粒，那么這 種情形將是特別有益的。存在的質?？截愒蕉啵蚧騽┝啃a生的所需蛋白質產物 的產率就越高。根據(jù)本發(fā)明，互補載體不含任何抗生素抗性基因。此外，互補載體不僅含有用于產 生多肽的相關序列，而且還含有具有3-磷酸甘油脫氫酶基因的表達盒。由此，優(yōu)選使用編碼3-磷酸甘油脫氫酶并且內源性存在于宿主細胞中的缺失序 列。然而，如果其它有機體(優(yōu)選相關菌株)中編碼具有相同功能的酶的序列能夠消除個 別缺陷，并由此提供在無進一步選擇壓力的情況下保證相關蛋白質的高生產率的系統(tǒng)，那 么也可能使用所述序列。這一染色體外DNA的喪失對于在基本培養(yǎng)基中生長的營養(yǎng)缺陷型 宿主細胞是致死的，以致迫使所述細胞在每次細胞分裂時都將這一染色體外元件傳遞到下 一代。當重組菌株在不提供3-磷酸甘油或甘油的培養(yǎng)基中生長時，本發(fā)明的系統(tǒng)中存在內 源性選擇壓力。無需添加抗生素來避免具有待表達的基因的載體的喪失?？捎糜趯⒕幋a3-磷酸甘油脫氫酶活性或本發(fā)明的開放閱讀框的DNA序列引入宿 主細胞中的表達盒優(yōu)選包含與所述開放閱讀框連接的轉錄起始區(qū)。所述表達盒可包含多個 限制性裂解位點以插入開放閱讀框和/或其它DNA (例如轉錄調控區(qū))。轉錄盒包含(按轉 錄的5’ 一3’方向)轉錄和翻譯起始區(qū)、編碼3-磷酸甘油脫氫酶活性的DNA序列以及在 微生物細胞中具有功能的轉錄和翻譯終止區(qū)。終止區(qū)就轉錄起始區(qū)來說可為原生的；就相 關DNA序列來說也可為原生的；或可源自任何其它來源。術語“開放閱讀框”(ORF)是指在編碼序列的翻譯起始密碼子與終止密碼子之間編 碼的氨基酸序列。術語“起始密碼子”和“終止密碼子”是指編碼序列中的三個相鄰核苷酸 的整體(密碼子)，其指定蛋白質合成(mRNA翻譯)的鏈起始和終止。
9
與核酸有關的“可操作性連接”是指在適合啟動子轉錄起始的位置和方向上成為 同一核酸分子的一部分的化合物。與啟動子可操作性連接的DNA位于啟動子的轉錄起始調 控的下游。編碼序列可在有義或反義方向上與調控序列可操作地連接。對于多肽，可操作 性連接意思指成為同一多肽的一部分(即，經(jīng)由肽鍵)的化合物。根據(jù)本發(fā)明，可使用任何啟動子，只要所述啟動子使本發(fā)明的系統(tǒng)保持穩(wěn)定即可。 在優(yōu)選實施例中，使用弱的組成性啟動子。啟動子通常是指在編碼序列上游(5，)的核苷酸 序列，并且通過識別RNA聚合酶和正確轉錄所需的其它因子來控制編碼序列的表達。本發(fā) 明所用的啟動子可包含最小啟動子(即，來自TATA盒的短DNA序列)，以及指定轉錄起始位 點的其它序列，所述序列與調控元件相連接以便控制表達?？衫帽景l(fā)明的表達系統(tǒng)來產生相關多肽，其產率比在產生的任何時間點都不添 加抗生素并且不存在抗生素標記基因并且蛋白質產物中也不存在抗生素或抗生素抗性基 因的情況下的產率高，甚至至少相同。因此，通過使用本發(fā)明的表達系統(tǒng)，使得所述產物也 可用于不容許或不需要存在完整或部分抗生素標記基因的應用中。本發(fā)明另外涉及所述表達系統(tǒng)的用途，其用于在無抗生素存在的情況下產生靶多 肽。由此，所述表達系統(tǒng)是在無3-磷酸甘油或提供3-磷酸甘油的化合物的培養(yǎng)基中生長。 所述培養(yǎng)基的實例闡述于上文中。表達系統(tǒng)的生長是以本身已知的方式進行。本發(fā)明的表達系統(tǒng)適于任何宿主細胞。本發(fā)明的表達系統(tǒng)一般可用于實際 上所有用于發(fā)酵產生蛋白質的重要的工業(yè)宿主細胞。實例為例如葡萄球菌屬、棒桿菌 屬(Corynebacterium)或芽孢桿菌屬的革蘭氏陽性宿主有機體，尤其是種群肉葡萄球 菌(Staphylococcus carnosus)、谷 M 酸棒!f 菌(Corynebacterium glutamicum)、才古草 芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(B. Iicheniformis)、解淀粉芽孢桿菌 (B. amyloliquefaciens)、短小芽孢桿菌(B. brevis)、球形芽孢桿菌(B. globigii)、巨大芽 孢桿菌(B.megaterium)、克勞氏芽孢桿菌(B. clausii)或遲緩芽孢桿菌(B. Ientus)，特別 是菌株地衣芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌的衍生物。優(yōu)選使用芽孢桿菌屬菌株作為宿主細胞。特別優(yōu)選使用解淀粉芽孢桿菌。在解淀 粉芽孢桿菌中，3-磷酸甘油脫氫酶基因是以gpsA形式存在。意外地發(fā)現(xiàn)，與含有抗生素標 記的類似質粒(PUB110衍生物)相比，可在不減少生產質粒的拷貝數(shù)的情況下，在解淀粉芽 孢桿菌中建立本發(fā)明的表達系統(tǒng)。甚至與經(jīng)具有抗生素標記基因的起始質粒(源自PUBllO 的PIK91，參看EP O 585 617 Bi)轉化的宿主菌株(GpsA+)相比，利用由此轉化的解淀粉芽 孢桿菌宿主菌株(GpsA—)獲得較高生產率也是可能的。還發(fā)現(xiàn)，利用側接解淀粉芽孢桿菌的內源性gpsA基因的序列，可很好地從解淀 粉芽孢桿菌的基因組中去除所述gpsA基因。此外，如果由此以游離基因形式提供內源性 gpsA基因，將極為有利。為此，分離出解淀粉芽孢桿菌中的gpsA基因，所述基因迄今仍為 未知的。盡管序列數(shù)據(jù)庫，例如EMBL(歐洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute, EBI)，英國劍橋(Cambridge, Great Britain) ；http//www, ebi. ac. uk)或 GenBank(美國生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)，美國國立衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)，美國馬里蘭州貝塞斯達 (Bethesda, MD, USA) ;http://www. ncbi. nlm. nih. rov/)，都含有 rpsA 基因數(shù)據(jù)，但通過將 本發(fā)明的基因與來自其它有機體的gpsA基因相比較發(fā)現(xiàn)，在DNA水平上，本發(fā)明的基因僅
10與枯草芽孢桿菌的所述基因展現(xiàn)76 %的一致性，或與地衣芽孢桿菌的基因展現(xiàn)71 %的一 致性。酶3-磷酸甘油脫氫酶在桿菌中提供順-3-磷酸甘油(G3P)(細胞膜合成的基本代 謝物)。Morbidoni等人(1995)中描述須極精細地調控枯草芽孢桿菌細胞中G3P的含量，并 且所述細胞中G3P的合成與降解之間的平衡至關重要。由Freese等人進行的實驗(1972， Halverson等人(編)Spores V, 212-221)表明，枯草芽孢桿菌細胞中因缺乏分解代謝的磷 酸甘油脫氫酶(Gof)而導致磷酸甘油積累，致使枯草芽孢桿菌細胞的生長情況不如芽孢形 成受抑制的正常細胞。一般說來，編碼待產生的多肽的相關基因理想地是以可能較高的拷貝數(shù)存在于宿 主細胞中，以便經(jīng)由基因劑量效應增加產率。因此，在優(yōu)選實施例中，使用以多個拷貝存在 于細胞中的質粒，例如PUBllO的衍生物，其在每個細胞中以約50個拷貝存在(Gryczan等 人，1978，J. Bacteriol. 134,318-329)。然而，引入大量待互補的基因gpsA的拷貝可能會破 壞G3P的合成與降解之間敏感的平衡。現(xiàn)已意外地發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的條件下，針對枯草芽孢桿菌所描述的這些問題不 會在解淀粉芽孢桿菌中發(fā)生。由此，在優(yōu)選實施例中，gpsA基因是位于弱啟動子的下游。 Zyprian和Matzura(1986，DNA 5,219-225)報導，在載體pUBllO中，通常存在所述啟動子。 如果使gpsA基因處于這種啟動子的調控下，那么細胞中G3P的合成與降解之間的精密平衡 明顯得到保持，但基因拷貝數(shù)相比未經(jīng)修飾的芽孢桿菌細胞有所增加。由于所述啟動子也 為組成性的，故可在芽孢桿菌細胞周期的任一時間點提供充足的3-磷酸甘油脫氫酶。此 外，如果在復合培養(yǎng)基中生長，所述系統(tǒng)還可在gpsA陰性宿主細胞中穩(wěn)定保持高拷貝數(shù)。 這允許在工業(yè)上常用的培養(yǎng)基中以高濃度產生也由互補載體編碼的相關多肽。如所述，可根據(jù)本發(fā)明使用任何啟動子，只要所述啟動子使本發(fā)明的系統(tǒng)保持穩(wěn) 定即可。特別優(yōu)選弱的組成性啟動子，例如上文關于質粒PUBllO所述的啟動子(Zyprian和 MatZura(1986))。來自枯草芽孢桿菌的ptsH啟動子也為適當?shù)娜醯慕M成性啟動子(StUlke 和 Hillen, 2000，Annu. Rev. Microbiol. 54，849-80)。如上文所述，在本發(fā)明的表達系統(tǒng)中，宿主染色體上的3-磷酸甘油脫氫酶基因失 活。通過提供游離型個別基因來平衡無法合成3-磷酸甘油脫氫酶的能力。很早以前，就 已經(jīng)通過經(jīng)典突變法產生GpsA陰性枯草芽孢桿菌突變體(Mindich，1970，J. Mol. Biol. 49， 415-432)。這些突變?yōu)間psA基因的等位基因(Morbidoni等人，1995)，其可能只是gpsA基 因或其調控中的點突變。這些菌株(和這種方法)不適用于工業(yè)上產生蛋白質，因為其可能會自發(fā)回復突 變成為活性形式，而且所提供的完整游離型gpsA基因與缺陷型染色體基因可能因具有長 同源區(qū)而重組(也參看 Ostroff 等人，1984，Mol. Gen. Genet. 193，299-305)。Khasanov 等 人(1992，Mol. Gen. Genet. 234，494-497)表明在芽孢桿菌屬基因組中70bp的同源區(qū)可能已 發(fā)生同源重組。在所述情況中，宿主細胞可能又變?yōu)樵B(yǎng)型(prototrophic)，并且不再依賴 于具有gpsA基因的質粒。這將使質粒更易于整合或丟失，以致宿主細胞不再產生或僅產生 少量由也存在于所述質粒上的基因構成的相關多肽。解淀粉芽孢桿菌中的gpsA基因以及所述基因的上游和下游區(qū)域并未得到描述； 數(shù)據(jù)庫(例如 EMBL, GenBank, SubtiList (Moszer 等人，1995, Microbiology 141,261-268,Moszer,1998, FEBS Lett. 430，28-36 :http//genolist.pasteur. fr. /SubtilList/)))只 提供了有關枯草芽孢桿菌和更遠親微生物的數(shù)據(jù)。解淀粉芽孢桿菌的基因組結構也是未知 的。與gpsA基因直接相鄰位于枯草芽孢桿菌染色體上的基因(即，其表示產生營養(yǎng)缺陷型 宿主所需的側接區(qū))可存在于解淀粉芽孢桿菌基因組中完全不同的位置，或可能甚至完全 缺失。還應考慮到，gpsA基因上游和下游的區(qū)域可在宿主菌株中編碼對所述宿主至關重要 的功能。對于枯草芽孢桿菌，上游和下游具有未知功能的基因都得到描述，而對于解淀粉芽 孢桿菌，并無有關相鄰基因的信息。因此，完整地保持枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌以及 其它桿菌屬中與gpsA基因相鄰的區(qū)域是明智的，以免破壞基因組中其它未知且因此未得 到補充的功能。由此，本發(fā)明迫切需要gpsA基因的完整但也可能精細的缺失，所述缺失不 會引起可能相鄰的基因的任何突變或讀框移位(reading frame shift)。同源區(qū)越長，通過同源重組精細地去除染色體基因或基因片段將越容易獲得成功 (參看Hamilton等人，1989，J. Bacteriol. 171 (9) 4617-4622)。已發(fā)現(xiàn)，在解淀粉芽孢桿菌 中側接gpsA基因的區(qū)域中，上游具有約1.3kbp的區(qū)域與枯草芽孢桿菌中的相應區(qū)域(如 數(shù)據(jù)庫SubtiList中所述)僅展現(xiàn)約84%的序列一致性，并且下游具有約1. 1 kbp的區(qū)域 與枯草芽孢桿菌中的相應區(qū)域僅展現(xiàn)約69%的序列一致性(Moszer等人，1995 ； 1998)。因 此，很難擴增宿主菌株解淀粉芽孢桿菌的染色體DNA上的側接區(qū)域，這尤其是因為構筑缺 失載體還需產生可能較長的同源區(qū)。舉例來說，借助于質粒載體使宿主染色體上的3-磷酸甘油脫氫酶基因缺失，所述 質粒載體具有對溫度敏感或在芽孢桿菌屬中不工作的復制起點，并且已另外插入欲缺失的 基因的可能(側接)的同源DNA區(qū)(缺失載體)。然而，也可以設想例如通過將可移動的遺 傳元件(例如轉座子)整合到欲失活的基因中來實現(xiàn)可逆失活。有關經(jīng)由缺失載體使基因失活的方法描述于Vehmaanper a等人發(fā)表的文章中 (1991，J. Biotechnol. 19,221-240).這種缺失載體的復制起點是以其溫度依賴性為特征。 因此，可能首先在低溫下選擇成功的轉化，隨后通過增加溫度來執(zhí)行選擇壓力以供成功整 合。隨后，利用包含內源性基因拷貝的載體來處理細胞，以致功能性基因拷貝不再存在于染 色體上。細胞中也不保留任何載體序列，即，也不保留抗生素抗性基因。因此，本發(fā)明涉及一種編碼具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的DNA序列，其特 征在于所述DNA序列是選自a)包含SEQ ID NO=I的核苷酸序列的DNA序列；b)包含由 SEQ ID NO 1中的核苷酸1338到2375表示的核苷酸序列的DNA序列；c)由質粒pTPOl編 碼的DNA序列，所述質粒具有圖4的質粒圖并且以寄存編號DSM 18890寄存；d)編碼SEQ ID NO 2的蛋白質序列的DNA序列；e)在嚴格條件下與a)、b)、c)或d)的DNA序列中的一 者雜交的DNA序列；f)因遺傳密碼簡并性而與a)、b)、c)、d)或e)的DNA/核苷酸序列相 關的DNA序列；和g)a)到f)的序列的互補鏈，并且具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽是 選自a)由上述DNA序列的編碼部分編碼的多肽；b)具有SEQ ID NO 2的序列或通過SEQ ID NO 2的序列中一個或一個以上氨基酸的取代、添加和/或缺失而獲得的序列的多肽；c) 具有與SEQ ID NO :2的氨基酸1到345展現(xiàn)至少77% —致性的序列的多肽；d)由在嚴格 條件下與(i)SEQ ID NO 1中的核苷酸1338到2375、(ii) (i)中具有至少100個核苷酸的 部分序列或(iii)⑴或(ii)的互補鏈雜交的核酸序列編碼的多肽；e)具有SEQ ID NO 2 的多肽的變異體，其包含一個或一個以上氨基酸的取代、缺失和/或插入；f)氨基酸序列a)到e)的等位基因變異體。本發(fā)明另外涉及上述DNA序列的用途，其用于產生本發(fā)明的表達系統(tǒng)。意外地發(fā) 現(xiàn)，源自解淀粉芽孢桿菌的編碼具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的DNA序列特別有利于 產生本發(fā)明的表達系統(tǒng)。對于所提出的序列，優(yōu)選通過測定比較中所涉及的兩個具有“相應”對應物 (counterpart)的序列中較短序列的殘基數(shù)來分析序列一致程度。出于本發(fā)明的目的， 優(yōu)選以本身已知的方式，使用常用算法來測定一致性。根據(jù)本發(fā)明，只有編碼成熟蛋白 質或個別成熟蛋白質的氨基酸的核苷酸才用于比較。根據(jù)本發(fā)明，同樣地，優(yōu)選借助于 已知的計算機程序來檢測作為同源序列的一致序列對應物。這類程序的實例為程序 CloneManager Suite，其包含程序部分 Align Plus，并且是由 Scientific&Educational Software (Durham, NC, USA)發(fā)布。由此，根據(jù) FastScan-MaxScore 方法或根據(jù) Neeldeman-Wunsch方法，保持默認值，在選項局部比對(local alignment)下進行如上文 所定義的兩個或兩個以上DNA或氨基酸序列的比較。為了計算一致性，根據(jù)本發(fā)明特別使 用利用函數(shù)"Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequences as DNA bases，，或針對氨基酸禾丨J 用“Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequencesas Amino Acids，，的"Clone Manager 7 Algin Plus 5，，禾呈 序版本。由此，使用從以下來源得到的算法Hirschberg(1975，Commun. Assoc. Comput. Mach. 18,341-343) ；Myers 和 Miller (1988，CABIOS 4,11-17) ；Chao 等人(1992, CABIOS 8， 481-487)。本發(fā)明另外涉及上述具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的分子中的添加和/或 缺失。因此，可通過在N末端和/或C末端或在分子中添加其它序列，來獲得根據(jù)本發(fā)明修 飾的具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽，以致由此獲得的多肽仍展現(xiàn)3-磷酸甘油脫氫酶 活性，或須能夠與3-磷酸甘油脫氫酶缺陷型菌株互補。由此可產生具有其它有利特性的雜 交分子。根據(jù)本發(fā)明，具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽也可缺失序列部分，同時仍保持 3_磷酸甘油脫氫酶活性。突變、延長和縮短都可根據(jù)所屬領域中本身已知的方法，以本身已 知的方式進行。所屬領域中一般已知所述變異體的產生。舉例來說，可通過DNA突變產生 多肽的氨基酸序列變異體?，F(xiàn)有技術中眾所周知進行誘變和核苷酸序列修飾的方法 (例如參看 Kunkel，1985，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82，488-492 ；Kunkel 等人，1987， MethodsEnzymol. 154,367-382 ；美國專利第 4873192 號，Walker 和 Gaastra(編)，1983， Techniquesin Molecular Biology, Mac Millan Publishing Company, New York)。有關 不影響相關蛋白質的生物活性的適當氨基酸取代的參考文獻可見于Dayhoff等人(1978， Atlas of ProteinSequence and Structure. Natl. Biomed. Res. Found. ,Washington D. C.) 的模型中。優(yōu)選保守性取代，例如將一個氨基酸用另一個具有類似特性的氨基酸置換。這 些置換可主要分為2組(總共4個亞組)，而且各亞組中的置換都稱為保守性置換，其優(yōu)選 不影響蛋白質的活性或折疊。
13
脂肪族無極性GAPILV極性且不帶電荷CSTMNQ極性且?guī)щ姾蒁EKR芳香族HFWY術語“蛋白質”、“肽”和“多肽”基本上可以互換使用。具有3-磷酸甘油脫氫酶活性 的多肽或酶是指催化將二羥丙酮磷酸還原成3-磷酸甘油的偶聯(lián)NAD (P) H的還原反應的酶。 3_磷酸甘油脫氫酶活性可使用本身已知的任何測試方法來確定，所述方法使用一種所述底 物或產物(Morbidoni 等人，1995 ；Bergmeyer, 1970,Methoden der enzymatischenAnalyse. Verlag Chemie，426-227)。本發(fā)明另外涉及編碼具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的DNA序列，其包含 SEQID NO 1的序列的突變、修飾或變異。此外，本發(fā)明還涉及在松弛或嚴格條件下與上述序 列雜交的序列。嚴格條件為在65°C下，在硫酸葡聚糖溶液(GenescreenPlus，DuPont)中雜 交18小時；隨后在65°C下，用6xSSC洗滌過濾器1次，用2xSSC洗滌2次，用2xSSC(0. 1% SDS)洗滌2次，隨后用0. 2xSSC洗滌，各30分鐘(膜轉移和檢測方法，Amersham)。此外，本發(fā)明還涉及因遺傳密碼簡并性而與本發(fā)明的上述序列相關的DNA序列以 及其等位基因變異體。遺傳密碼簡并性可由天然的簡并性或由特別選擇的密碼子的使用引 起。天然存在的等位基因變異體可使用分子生物學中眾所周知的技術來鑒別，所述技術例 如聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、測序技術和雜交技術?？墒褂脤⒃谌魏嗡拗骷毎腥笔У木幋a本發(fā)明多肽的DNA序列，隨后利用同樣攜 帶相關基因的質粒使其再次可用。在使3-磷酸甘油脫氫酶基因缺失/失活后，宿主細胞的 特征是缺乏3-磷酸甘油脫氫酶的基本功能。如本文所述構筑本發(fā)明的營養(yǎng)缺陷型宿主菌株的方式使得可能使用一次產生的 染色體3-磷酸甘油脫氫酶基因失活的營養(yǎng)缺陷型微生物株，從而利用以類似方式構筑的 互補載體不斷地對其進行新的轉化，所述互補載體每次都將提供相同的消除基因缺陷的功 能，但每次也都攜帶用于產生其它相關多肽的不同基因。由此，提供一種極為實用并且通用 的產生系統(tǒng)。所述系統(tǒng)的價值在于能夠在無抗生素選擇壓力的情況下，使產生相關多肽所需 的遺傳元件歷經(jīng)許多代仍然保持穩(wěn)定，并且使其在細胞中保持高拷貝數(shù)。這一元件為攜帶 3_磷酸甘油脫氫酶基因以及欲產生的多肽的基因的質粒。所述選擇壓力的保持對于重組產生菌株的儲存極為有利。然而，所述系統(tǒng)所固有 的穩(wěn)定性足以在產生過程中保持高拷貝數(shù)，因此確保高生產率。由于所述系統(tǒng)所固有的高穩(wěn)定性，其甚至能在不應用選擇壓力(即，即使是在工 業(yè)培養(yǎng)基中生長，所述培養(yǎng)基可能含有痕量甘油)的情況下仍在主要培養(yǎng)物中保持穩(wěn)定， 靶多肽的產率在培養(yǎng)期間不會降低，即，互補載體在細胞中保持穩(wěn)定。特別值得關注的是針對由微生物培養(yǎng)所產生的某些產物的本發(fā)明的表達系統(tǒng)，
所述產物尤其為多肽或蛋白質，例如水解酶或氧化還原酶，特別優(yōu)選α-淀粉酶、β-淀粉
酶、麥芽糖淀粉酶、CGT酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、磷脂酶、磷酸酶、
植酸酶、內切葡聚糖酶(尤其是內切β_1，4-葡聚糖酶、內切β_1，3(4)_葡聚糖酶、內切1，2_β -葡聚糖酶和內切1，3-α -葡聚糖酶)、纖維素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶(尤其是 阿拉伯半乳聚糖-內切1，4- β -半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-內切1，3- β -半乳糖苷 酶)、果膠降解酶(尤其是果膠酶、果膠酯酶、果膠裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖 酶(arabananase)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰 酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸-α -鼠李糖苷酶、果膠裂解酶和α -半乳糖醛酸酶)、甘露聚糖 酶、β -甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、其它木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶 (arabinoxylanase)、蛋白水解酶(例如蛋白酶和肽酶)、脂肪分解酶(例如脂酶、雙半乳糖 苷_ 二甘油_酯酶和角質酶)，和其它酶(例如漆酶和谷氨酰胺轉胺酶)。因此，在主要用于產生蛋白質的工業(yè)方法中使用本發(fā)明的系統(tǒng)特別重要。如果質 粒是基于可由抗生素產生的選擇壓力，那么通過培養(yǎng)微生物株的細胞來產生蛋白質的方法 一般為現(xiàn)有技術中所知。本發(fā)明另外涉及一種使用本發(fā)明的表達系統(tǒng)來產生相關多肽的方法。以相關蛋白質被分泌到相鄰培養(yǎng)基中為特征的蛋白質產生方法極為重要。由此， 使所得產物的處理明顯減少。然而，在實際產生之后將產生蛋白質的個別細胞溶解，并由此 獲得產物，也是本發(fā)明的一種可能的替代方法。特別有利的一個方面在于，通過始終進行同一類失活和消除，但每次都在消除載 體上提供另一種編碼另一相關多肽的基因，將獲得大量的相關微生物。以這種方式，可將一 次成功開發(fā)出來的系統(tǒng)轉移到無數(shù)的其它制造工藝中。


隨附圖式將較為詳細地說明本發(fā)明。其展示于以下圖1 來自解淀粉芽孢桿菌的gpsA基因和側接區(qū)的DNA序列；SEQ ID NO. 1(斜體字gpsA基因，斜體/粗體推定的RBS，粗體推定的終止子)。圖2 由圖1的gpsA基因編碼的氨基酸序列，SEQ ID NO. 2。圖3 圖1的DNA序列與其它已知的芽孢桿菌屬gpsA區(qū)的比對(解淀粉芽孢桿菌解淀粉芽孢桿菌RH1330 ；枯草芽孢桿菌枯草芽孢桿菌168 ； 地衣芽孢桿菌地衣芽孢桿菌ATCC 14580)。圖4 具有寄存的gpsA基因的pTPOl的質粒圖。圖5 缺失質粒的質粒圖(ALF 解淀粉芽孢桿菌RH 1330的染色體上位于gpsA基因上游的區(qū)域；ARF 解淀 粉芽孢桿菌RH 1330的染色體上位于gpsA基因下游的區(qū)域；ermC :ermC基因編碼腺嘌呤甲 基化酶，從而提供針對紅霉素的抗性)。圖6 :pIK91的質粒圖。圖7: 用于表達多肽的載體ΡΤΡ15的質粒圖。圖4的質粒pTPOl與菌株RH 1626是在2006年12月22日或2006年12月1 8 日寄存于DSMZ(德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH), Mascheroder WeglB,38124 Braunschweig ；http://www, dsmz. 逝)，編號為DSM 18890和DSM 18878。以編號DSM 18878寄存的解淀粉芽孢桿菌RH 1626 為缺失gpsA并且無質粒的受體菌株。寄存物DSM 18890是枯草芽孢桿菌RH 1632，其攜帶質粒pTPOl。
具體實施例方式以下實例將較為詳細地說明本發(fā)明。實例分子生物學工作是根據(jù)例如Sambrook和Russell所著指南(2001，Molecular cloning. Cold Spring Harbour Laboratory Press)中所述白勺標準方法來進 。所用i式齊Ll 盒和酶都是根據(jù)相應制造商的說明書應用。實例1 解淀粉芽孢桿菌中gpsA基因的分離為了分離gpsA 基因，借助于 QIAGEN DNeasy Tissue 試劑盒(Qiagen，Hilden)來 制備解淀粉芽孢桿菌(AB Enzymes GmbH菌株保存中心)的染色體DNA，并在其上經(jīng)由PCR 擴增gpsA基因。由此使用與gpsA基因的上游和下游雜交的引物，以致所述基因完全擴增。 所述引物是源自由實例2a)中的測序所確定的gpsA的側接區(qū)的序列。使用以下引物來進 行擴增SEQ ID N0. 3 AL 1_1198 gctgttaagccgccgagcttcgttg,SEQ ID N0. 4 :AR_180C tBBtcccBtBgcBCCBBgcgcBBBCCBC。利用Sanger 等人(1977，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74，5463-5467)的方法，對含 有1591 bp的DNA片段進行完全測序。所用的測序引物列于表1中。表1 用于對解淀粉芽孢桿菌的gpsA基因進行完全測序的引物
權利要求
一種用于產生一種或一種以上靶多肽的表達系統(tǒng)，其包含宿主細胞，在所述宿主細胞的基因組中，編碼3 磷酸甘油脫氫酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主細胞經(jīng)包含編碼所述靶多肽和3 磷酸甘油脫氫酶的DNA序列的染色體外元件轉化，由此所述宿主細胞基因組與所述染色體外元件都不攜帶抗生素抗性基因。
2.根據(jù)權利要求1所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述染色體外元件為質粒、噬菌體、 噬菌?；蜣D座子。
3.根據(jù)權利要求1或2中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述染色體外元 件包含對應于編碼所述宿主細胞的內源性3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列的DNA序列；編碼 相關3-磷酸甘油脫氫酶或外來3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述編碼3-磷 酸甘油脫氫酶的DNA序列處于弱啟動子的控制下。
5.根據(jù)權利要求4所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述弱啟動子為位于圖7中質粒pUB 110的gpsA基因的下游的啟動子。
6.根據(jù)權利要求4所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述弱啟動子為來自枯草芽孢桿菌 (B. subtilis)的 ptsH 啟動子。
7.根據(jù)權利要求1至6中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述編碼所述內 源性3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列基本上精細缺失，并且不會在相鄰區(qū)域引起突變或讀框 移位。
8.根據(jù)權利要求1至7中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主細胞是 源自革蘭氏陽性(Gram-positive)細菌細胞。
9.根據(jù)權利要求8所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主細胞是源自葡萄球菌屬 (Staphylococcus) lifM (Corynebacterium)或芽孢桿菌屬(Bacillus)的細胞。
10.根據(jù)權利要求9所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主細胞是源自解淀粉芽孢桿 菌(Bacillus amyloliquefaciens)0
11.根據(jù)權利要求10所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主細胞為以寄存編號 DSM18878寄存的解淀粉芽孢桿菌RH 1626。
12.根據(jù)權利要求1至7中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述宿主細胞 是源自革蘭氏陰性細菌細胞。
13.根據(jù)權利要求1至12中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)，其特征在于，所述靶肽是選 自水解酶、果膠降解酶、蛋白水解酶或脂肪分解酶。
14.一種與宿主細胞基因組互補的載體，在所述宿主細胞基因組中，編碼3-磷酸甘油 脫氫酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，所述載體包含編碼所述靶多肽的DNA序列， 以及編碼所述3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列，由此所述載體不含抗生素抗性基因。
15.根據(jù)權利要求14所述的載體，其特征在于，所述編碼所述3-磷酸甘油脫氫酶的 DNA序列對應于編碼所述宿主細胞中待互補的基因組的內源性3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序 列。
16.一種宿主細胞，其特征在于，基因組中缺失編碼3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列，并 且所述宿主細胞經(jīng)根據(jù)權利要求14或15中任一權利要求所述的載體轉化。
17.一種在無抗生素情況下產生靶多肽的方法，其特征在于，根據(jù)權利要求1至12中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)或根據(jù)權利要求16所述的宿主細胞是在表達所述靶多肽的條 件下生長，并分離出由此所表達的靶多肽。
18.根據(jù)權利要求1至13中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)或根據(jù)權利要求16所述的 宿主細胞的用途，其用于在無抗生素情況下產生靶蛋白。
19.一種編碼具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的DNA序列，其特征在于，所述DNA序 列是選自a)包含SEQID NO 1的核苷酸序列的DNA序列，b)包含由SEQID NO 1中的核苷酸1338到2375表示的核苷酸序列的DNA序列，c)由質粒pTPOl編碼的DNA序列，所述質粒pTPOl具有圖4的質粒圖并且是以寄存編 號DSM 18890寄存，d)編碼SEQID NO 2的蛋白質序列的DNA序列，e)在嚴格條件下與a)、b)、c)或d)的DNA序列中的一者雜交的DNA序列，f)因遺傳密碼簡并性而與a)、b)、c)、d)或e)的DNA/核苷酸序列相關的DNA序列，和g)a)到f)的序列的互補鏈。
20.根據(jù)權利要求19所述的DNA序列，其特征在于，所述序列是源自芽孢桿菌。
21.根據(jù)權利要求20所述的DNA序列，其特征在于，所述序列是源自解淀粉芽孢桿菌。
22.一種核酸序列，其包含一個根據(jù)權利要求19至21中任一權利要求所述的序列的類 似物，其特征在于，所述序列編碼具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽，以及a)與一個所述序列展現(xiàn)至少77%的一致性，或b)在嚴格條件下與一個所述序列雜交，或c)為一個所述序列的等位基因變異體，或d)為a)到c)的序列中的一者的互補鏈，由此，所述序列可通過SEQ ID NO :1的DNA序列中一個或一個以上核酸的取代、缺失、 插入、添加或突變而獲得。
23.一種具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽，其是選自a)由根據(jù)權利要求19至22中任一權利要求所述的DNA序列的編碼片段編碼的多肽，b)具有SEQID NO 2的序列或可通過所述SEQ ID NO 2的序列中一個或一個以上氨 基酸的取代、添加和/或缺失而獲得的序列的多肽，c)具有與SEQID NO 2中的氨基酸1到345展現(xiàn)至少77% —致性的序列的多肽，d)由在嚴格條件下與以下序列雜交的核酸序列編碼的多肽(i)SEQID NO 1 中的核苷酸 1338 到 2375，(ii)(i)中具有至少100個核苷酸的一部分序列，或(iii)⑴或( )的互補鏈，e)具有SEQID NO :2的多肽的變異體，其包含一個或一個以上氨基酸的取代、缺失和/ 或插入，f)所述氨基酸序列a)到e)的等位基因變異體。
24.根據(jù)權利要求23所述的多肽，其特征在于，所述多肽是源自解淀粉芽孢桿菌。
25.—種表達構筑體，其包含(i)根據(jù)權利要求19至22中任一權利要求所述的核苷酸序列，或編碼根據(jù)權利要求23或24中任一權利要求所述的多肽的核苷酸序列，所述序列與以下序列(ii)可操作性連 接，( ) 一個或一個以上控制適當宿主細胞中具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的表達 的序列。
26.根據(jù)權利要求25所述的表達構筑體，其特征在于，所述控制所述3-磷酸甘油脫氫 酶基因的表達的序列為組成性啟動子。
27.根據(jù)權利要求25或26所述的表達構筑體，其特征在于，所述控制所述3-磷酸甘油 脫氫酶的表達的序列為弱啟動子。
28.一種宿主細胞，其包含根據(jù)權利要求25所述的表達構筑體。
29.—種產生具有3-磷酸甘油脫氫酶活性的多肽的方法，其特征在于，使根據(jù)權利要 求27所述的宿主細胞在適于表達所述多肽的條件下生長，并且隨后回收所述多肽。
30.一種根據(jù)權利要求19至22中任一權利要求所述的DNA序列的用途，其用于產生根 據(jù)權利要求1至13中任一權利要求所述的表達系統(tǒng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用于產生一種或一種以上靶多肽的表達系統(tǒng)，其包含宿主細胞，在所述宿主細胞的基因組中，編碼3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主細胞經(jīng)包含編碼所述靶多肽和3-磷酸甘油脫氫酶的DNA序列的染色體外元件轉化，由此所述宿主細胞基因組與所述染色體外元件都不攜帶抗生素抗性基因。
文檔編號C12N15/75GK101952439SQ200880014749
公開日2011年1月19日 申請日期2008年3月12日 優(yōu)先權日2007年5月4日
發(fā)明者啼娜·普勞斯, 布如諾·文因特, 斯愛琳·卡多特, 璐斯·史維爾德福哲 申請人:Ab多酶兩合公司