一種卷曲霉素的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于工業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種卷曲霉素的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 結(jié)核病死灰復(fù)燃，正嚴(yán)重威脅人類健康。近年來(lái)，耐多藥結(jié)核(MDR-TB)的出現(xiàn)，以 及結(jié)核分枝桿菌與人類免疫缺陷病毒的聯(lián)合感染導(dǎo)致結(jié)核病再度在全球成流行趨勢(shì)。卷曲 霉素是治療耐多藥結(jié)核分枝桿菌和持留菌感染的一類重要藥物。該藥對(duì)耐藥型結(jié)核桿菌感 染引起的肺結(jié)核療效顯著，毒副作用較其他二線藥物小，是目前較理想的抗結(jié)核菌藥物。
[0003] 卷曲霉素，是由卷曲鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生的環(huán)狀多肽類抗生素，由四個(gè)結(jié)構(gòu)相似的活 性化合物IA、IB、IIA、IIB組成，其中IA和IB的含量占90%以上，是發(fā)揮療效的主要成分。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)生產(chǎn)硫酸卷曲霉素的主要技術(shù)手段如專利CN100471867 C，利用離子交 換樹(shù)脂進(jìn)行吸附、脫鹽、脫色、反復(fù)中和，再經(jīng)濃縮、噴霧干燥而成，過(guò)程復(fù)雜，不利于環(huán)保， 影響收率及產(chǎn)品質(zhì)量。
[0005] 如何能夠提高卷曲霉素產(chǎn)率及質(zhì)量，發(fā)明人做了大量實(shí)驗(yàn)研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種工藝流程短、易操作、產(chǎn)品純度高、有利環(huán)保的卷曲霉素 的制備方法。
[0007] 本發(fā)明提供的一種卷曲霉素的制備方法，包括以下步驟： a、將超順磁性微球加入卷曲霉素發(fā)酵液中，攪拌使之吸附完全，然后分離出超順磁性 微球。
[0008] b、將分離出的超順磁性微球先用水凈化，再用酸性水溶液洗脫，得到卷曲霉素洗 脫液。
[0009] c、將卷曲霉素洗脫液中加入活性炭脫色，過(guò)濾，得到卷曲霉素脫色液。
[001 0] d、卷曲霉素脫色液經(jīng)納濾、噴霧干燥，得到卷曲霉素產(chǎn)品。
[0011]其中步驟(a)所述超順磁性微球的粒徑為10_30μπι，表面的功能基團(tuán)為經(jīng)氫氧化鈉 溶液處理后的鈉型結(jié)構(gòu)。所述超順磁性微球的加入量為每升發(fā)酵液加入30-60克。
[0012]其中步驟(b)所述酸水0.2-0.5mo VL的硫酸水溶液。用量為每克超順磁性微球加 入4_6_升。
[0013] 其中步驟(C)所述活性炭用量為每升洗脫液加入0.5-1.0克，脫色時(shí)間30-40min。
[0014] 步驟(d)所述納濾所用的過(guò)濾膜為截留分子量100_300Da的卷式膜。
[0015]步驟(d)所述噴霧干燥的料液濃度為25-30萬(wàn)yg/mL。
[0016] 超順磁性微球的預(yù)處理及再生，在使用前用2-5倍(v/w)的2m〇L/L的NaOH水溶液， 靜態(tài)浸泡2-4小時(shí)后過(guò)濾，然后用去離子水洗滌至pH值至為7-8，備用。
[0017] 本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、采用超順磁性微球，在提取過(guò)程中無(wú)需對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù) 處理及預(yù)熱，既能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)物的簡(jiǎn)便分離，生產(chǎn)周期為由56h縮減為18h，效率提高2/3,廢 液排放減少1/2; 2、超順磁性微球選擇性高，無(wú)需昂貴的提取分離設(shè)備即可得到高純度的 卷曲霉素產(chǎn)品，產(chǎn)品質(zhì)量?jī)?yōu)于藥典標(biāo)準(zhǔn)，收率大于85%，收率較原工藝提高10%;3、整個(gè)提取 過(guò)程未使用有機(jī)溶劑，節(jié)能環(huán)保;4、超順磁性微球具有可回收、反復(fù)利用、再生簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)； 5、本發(fā)明所述方法工藝流程短，克服了卷曲霉素難于純化的缺點(diǎn)，且具有易操作、可控性強(qiáng) 的優(yōu)點(diǎn)，為工業(yè)化生產(chǎn)提供有力的技術(shù)支撐。
【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1卷曲霉素產(chǎn)品高效液相色譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面用具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但并不以任何方式意味著對(duì)本發(fā) 明進(jìn)行限制。下列實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。
[0020] 本發(fā)明所使用的卷曲霉素發(fā)酵液，為華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司生 產(chǎn)。超順磁性微球，蘇州納微生物科技有限公司；噴霧干燥機(jī)(SP-1500)，上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備 有限公司；高效液相色譜儀(SH)-M20A型紫外檢測(cè)器，LC-20AT栗，SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-IOAS柱溫箱，島津公司）;蒸餾水，為本實(shí)驗(yàn)室自制;其他試劑為分析純。
[0021 ]卷曲霉素發(fā)酵液的制備 將卷曲鏈霉菌菌株(編號(hào)NRRL2773)的斜面培養(yǎng)物或孢子液接種于種子培養(yǎng)基，28°C、 220 rpm、培養(yǎng)60h獲得種子液;將種子液接種到發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為10%，培養(yǎng)溫 度29°C、罐壓0.05±0.01 Mpa、通氣比為I: 0.8vvm，400 rpm攪拌，在發(fā)酵培養(yǎng)開(kāi)始40小時(shí) 后每升發(fā)酵液加入1.5g賴氨酸，總發(fā)酵144 h。
[0022] 其中所述的種子培養(yǎng)基按以下方法制得：蔗糖30.0克、酵母粉8.0克、硫酸銨2.0 克、玉米漿5.0克、氯化鈉1.0克、碳酸鈣5.0克，加自來(lái)水定容至1000mL，pH7.0，121°C滅菌 30min〇
[0023] 其中所述的發(fā)酵培養(yǎng)基按以下方法制得:玉米淀粉30.0克、棉籽蛋白粉20.0克、酵 母粉5.0克、硫酸銨2.0克、玉米漿6.0克、磷酸二氫鉀2.0克、氯化鈉2.0克、碳酸鈣5.0克，加 自來(lái)水定容至1000mL，pH7 · 0，121°C滅菌30min。
[0024] 超順磁性微球的預(yù)處理及再生 超順磁性微球的預(yù)處理及再生，在使用前用2-5倍(v/w)的2m〇L/L的NaOH水溶液，靜態(tài) 浸泡2-4小時(shí)后過(guò)濾，然后用去離子水洗滌至pH值至為7-8，備用。
[0025] 實(shí)施例1 300mL發(fā)酵液，發(fā)酵單位11530yg/mL，加入粒徑為ΙΟμπι的超順磁性微球18g，攪拌吸附Ih 后，分離超順磁性微球，用36mL水洗滌分離出的超順磁性微球，然后用108mL 0.2mol/L的硫 酸水溶液洗脫超順磁性微球，收集卷曲霉素洗脫液，洗脫液加入〇. 054克的活性炭脫色，室 溫?cái)嚢?0min后過(guò)濾，濾液再經(jīng)IOODa卷式膜納濾至溶液濃度25萬(wàn)yg/mL，進(jìn)行噴霧干燥，得 到卷曲霉素產(chǎn)品（高效液相色譜圖見(jiàn)圖I )3. Og，含量98.6%，收率85.5%。
[0026] 實(shí)施例2 IL發(fā)酵液，發(fā)酵單位11583yg/mL，加入粒徑為20μηι的超順磁性微球50g，攪拌吸附1.5h 后，分離超順磁性微球，用IOOmL水洗滌分離出的超順磁性微球，然后用200mL 0.3mol/L的 硫酸水溶液洗脫超順磁性微球，收集卷曲霉素洗脫液，洗脫液加入ο. 16克的活性炭，室溫?cái)?拌40min后過(guò)濾，濾液再經(jīng)200Da卷式膜納濾至溶液濃度28萬(wàn)yg/mL，進(jìn)行噴霧干燥，得到卷 曲霉素產(chǎn)品I 〇. I g，含量98.9%，收率86.2%。
[0027] 實(shí)施例3 3L發(fā)酵液，發(fā)酵單位11516yg/mL，加入粒徑30μηι的超順磁性微球90g，攪拌吸附2h后，分 離超順磁性微球，用180mL水洗滌分離出的超順磁性微球，然后用450mL 0.5mol/L的硫酸水 溶液洗脫超順磁性微球，收集卷曲霉素洗脫液，洗脫液加入0.45克的活性炭，攪拌35min后 過(guò)濾，濾液再經(jīng)300Da卷式膜納濾至溶液濃度30萬(wàn)yg/mL，進(jìn)行噴霧干燥，得到卷曲霉素產(chǎn)品 30 · 3g，含量 98 · 7%，收率 86 · 6%。
[0028] 對(duì)比例1 300mL發(fā)酵液，發(fā)酵單位11530μ8/ιΛ，加入300mL水稀釋后，用草酸調(diào)PH=3.0，然后加入 3〇g珍珠巖助濾劑，攪拌30min后過(guò)濾，濾液用2mol/L的NaOH溶液調(diào)PH=7.0,然后導(dǎo)入IOOmL 徑高比為1:10的離子交換樹(shù)脂D1161進(jìn)行吸附，吸附完畢，飽和樹(shù)脂用300mL去離子水凈化 后，用300mL的lmol/L的硫酸水溶液洗脫，洗脫液導(dǎo)入30mL徑高比為1:5離子交換樹(shù)脂I X 16 脫鹽，脫鹽液中加入適量離子交換樹(shù)脂33 Γ1311，攪拌將洗脫液中和至PH=6.0,中和液導(dǎo)入 50mL徑高比為1:10的離子交換樹(shù)脂122^ 1脫色，脫色完畢，飽和樹(shù)脂分別用150mL0.5、1.0、 1.5mol/L的硫酸水溶液梯度洗脫，洗脫液中加入適量離子交換樹(shù)脂331 411,攪拌將洗脫液中 和至PH=7.0,即得到精制液，精制液濃縮至25萬(wàn)yg/mL，進(jìn)行噴霧干燥，得到卷曲霉素產(chǎn)品 2 · 8g，含量 95 · 6%，收率 77 · 4%。
[0029] 對(duì)比例2 IL發(fā)酵液，發(fā)酵單位11583此/11^，加入IL水稀釋后，用草酸調(diào)PH=3.5，然后加入160g助 濾劑攪拌30min后過(guò)濾，濾液用2mol/L的NaOH溶液調(diào)PH=7.5，然后導(dǎo)入300mL徑高比為1:10 的離子交換樹(shù)脂Dlie^ la進(jìn)行吸附，吸附完畢，飽和樹(shù)脂用1000 mL去離子水凈化后，用700mL 的2mol/L硫酸水溶液洗脫，洗脫液導(dǎo)入IOOmL徑高比為1:10離子交換樹(shù)脂I X 16脫鹽，脫鹽 液中加入適量離子交換樹(shù)脂33廠'攪拌將洗脫液中和至PH=7.0,中和液導(dǎo)入150mL徑高比 為1:10的離子交換樹(shù)脂122_h脫色，脫色完畢，飽和樹(shù)脂用分別用450mL0.5、1.0、1.5mol/U9 硫酸水溶液梯度洗脫，洗脫液中加入適量離子交換樹(shù)脂331 411，攪拌將洗脫液中和至PH= 6.5，即得到精制液，精制液濃縮至30萬(wàn)yg/mL，進(jìn)行噴霧干燥，得到卷曲霉素產(chǎn)品9.2g，含量 96.2%，收率 76.4%。
[0030] 對(duì)比例3 3L發(fā)酵液，發(fā)酵單位11516μ8/ιΛ，加入3L水稀釋后，用草酸調(diào)PH=3.2，然后加入600g助 濾劑攪拌30min后過(guò)濾，濾液用2mol/L的NaOH溶液調(diào)PH=8.0，然后導(dǎo)入IL徑高比為1:10的離 子交換樹(shù)脂Dl 16^進(jìn)行吸附，吸附完畢，飽和樹(shù)脂用3L去離子水凈化后，用2.5L的1.5mol/L 硫酸水溶液洗脫，洗脫液導(dǎo)入300mL徑高比為1:10離子交換樹(shù)脂I X 16脫鹽，脫鹽液中加入 適量離子交換樹(shù)脂33廠'攪拌將洗脫液中和至PH=6.5,中和液導(dǎo)入500mL徑高比為1:10的 離子交換樹(shù)脂1224脫色，脫色完畢，飽和樹(shù)脂用分別用1500mL 0.5、1.0、1.5mol/L的硫酸水 溶液梯度洗脫，洗脫液中加入適量離子交換樹(shù)脂33Γ1311，攪拌將洗脫液中和至PH=7.0，即得 到精制液，精制液濃縮至30萬(wàn)yg/mL，進(jìn)行噴霧干燥，得到卷曲霉素產(chǎn)品27.7g，含量95.8%， 收率76.8%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種卷曲霉素的制備方法，包括下述步驟： a、 將超順磁性微球加入卷曲霉素發(fā)酵液中，攪拌使之吸附完全，然后分離出超順磁性 微球； b、 將分離出的超順磁性微球先用水凈化，再用酸性水溶液洗脫，得到卷曲霉素洗脫液； c、 將卷曲霉素洗脫液中加入活性炭脫色，過(guò)濾，得到卷曲霉素脫色液； d、 卷曲霉素脫色液經(jīng)納濾、噴霧干燥，得到卷曲霉素產(chǎn)品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(a)所述超順磁性微球的粒徑為10-30μπι， 表面的功能基團(tuán)為經(jīng)氫氧化鈉溶液處理后的鈉型結(jié)構(gòu)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(a)所述超順磁性微球的加入量為每升發(fā) 酵液加入30-60克。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(b)所述酸水為0.2-0.5mol/L的硫酸水溶 液。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(b)所述酸水用量為每克超順磁性微球加 入4_6_升。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟（c)所述活性炭用量為每升洗脫液加入 0.5-1.0 克。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(d)所述納濾所用的過(guò)濾膜為截留分子量 100-300Da的卷式膜。8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其中步驟(d)所述噴霧干燥的料液濃度為25-30萬(wàn)μ g/mL〇
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種卷曲霉素的制備方法，該方法包括以下步驟：將超順磁性微球加入卷曲霉素發(fā)酵液進(jìn)行吸附、洗脫、脫色、噴霧干燥等，得到卷曲霉素產(chǎn)品。本發(fā)明在提取過(guò)程中無(wú)需對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理及預(yù)熱，無(wú)需昂貴的提取分離設(shè)備，生產(chǎn)周期縮短2/3，污染減少1/2，收率提高10%，為工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。
【IPC分類】C07K1/14, C07K7/56
【公開(kāi)號(hào)】CN105504023
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610097986
【發(fā)明人】高任龍, 王海燕, 張雪霞, 任風(fēng)芝, 耿文飛, 段寶玲
【申請(qǐng)人】華北制藥集團(tuán)新藥研究開(kāi)發(fā)有限責(zé)任公司
【公開(kāi)日】2016年4月20日
【申請(qǐng)日】2016年2月23日