專利名稱：：在活性位點環(huán)區(qū)具有額外氨基酸殘基的i-s1和i-s2亞族枯草桿菌酶的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及在第95-103位的活性位點環(huán)(b)區(qū)的95位具有至少一個額外氨基酸殘基的新的I-Sl和I-S2亞族枯草桿菌酶(subtilase)。當用于洗滌劑、清潔和洗滌劑組合物中時，這些蛋白酶是有用的，表現(xiàn)出優(yōu)異的或改進的洗滌性能。本發(fā)明還涉及編碼用于所述酶表達的基因，當被插入到合適的宿主細胞或微生物中時表達所述酶。本發(fā)明還涉及用此基因轉化的能夠表達所述酶變體的宿主細胞，以及制備這些新酶的方法。
背景技術：
：在洗滌劑工業(yè)中，酶被用于洗滌制劑已有30多年的歷史。在這些制劑中使用的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶、以及其它的酶，或它們的混合物。商業(yè)上最重要的酶是蛋白酶。大量增加的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質工程變體，例如，DURAZYM(NovoNordiskA/S)，RELASE(NovoNordiskA/s)，MAXAPEM(Gist-BrocadesN.V.),PURAFECf(GenencorInternational,Inc.).而且，許多蛋白酶變體在本領域中已有描述，例如EP130756(GENENTECH)(相應于美國再頒專利34,606(GENENCOR));EP214435(HENKEL);W087/04461(AMGEN);WO87/05050(GENEX);EP260105(GENENCOR);Thomas,Russell和Fersht(1985)々,然318375-376;Thomas,Russell和Fersht(1987)分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)193803-813;Russel和Fersht々>^328496-500(1987);W088/08028(Genex);W088/08033(Amgen);WO95/27049(SOLVAYS.A.);W095/30011(PROCTER&GAMBLE公司)；W095/30010(PROCTER&GAMBLE8公司)；WO95/29979(PROCTER&GAMBLE公司)；US5.543.302(S0LVAYS.A.);EP251446(GENENCOR);WO89/06279(NOVONORDISKA/S);WO91/00345(NOVONORDISKA/S);EP525610Al(SOLVAY);以及WO94/02618(GIST—BROCADESN.V.)。然而，盡管已有大量有用蛋白酶變體的描述，但對于許多工業(yè)應用，仍需求新的改進蛋白酶或蛋白酶變體。因此，本發(fā)明的目的是提供特別是用于洗滌劑工業(yè)的改進蛋白酶或蛋白質工程化蛋白酶變體。發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，其至少一個活性位點環(huán)長于目前已知的活性位點環(huán)的枯草桿菌蛋白酶在洗滌劑組合物中表現(xiàn)出改進的洗滌性能。我們在構建與其親本野生型酶相比在洗滌劑組合物中表現(xiàn)出改進的洗滌性能的枯草桿菌蛋白酶變體，尤其是枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI或Savinase)的變體的過程中對此進行了筌定。這已在我們的早期申請DK1332/97中描述過。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)，在第95-103位的活性位點環(huán)(b)區(qū)的95位(或更確切地在第95-96位之間)具有至少一個額外氨基酸殘基的I-SI(真正的"枯草桿菌蛋白酶")和I-S2(高堿性枯草桿菌蛋白酵)亞族某些枯草桿菌酶或其變體，與目前已知的以及在所述申請中描述的那些相比，顯示出令人吃驚的改進的洗滌能力。根據(jù)本發(fā)明的改進蛋白酶可以通過從自然資源分離獲得，或通過在野生型枯草桿菌蛋白酶的活性位點環(huán)(b)第95和第96位之間導入至少一個額外的氨基酸殘基(一個插入)來獲得(對活性位點環(huán)的定義和位置的編號見下)。盡管此發(fā)現(xiàn)是在枯草桿菌蛋白酶309中獲得的，但我們預測產(chǎn)生或分離同樣有利的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體是可能的。而且可能特異地對自然分離物進行篩選，以鑒定含有比已知野生型枯草桿菌酶例如枯草桿菌蛋白酶309的相應活性位點環(huán)長的活性位點環(huán)(b)的新野生型枯草桿菌酶，這種枯草桿菌酶可被認為在第95-96位之間有一個插入氨基酸殘基，而且與關系最近的已知枯草桿菌蛋白酶例如枯草桿菌蛋白酶309相比，其在洗滌劑中表現(xiàn)出優(yōu)異的洗滌能力。關于比對和編號，參考下圖1，la，2和2a,這些圖顯示了枯草桿菌蛋白酶BPN，(BASBPN)(a)和枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI)(b)之間的比對，以及枯草桿菌蛋白酶BPN，(a)(BASBPN)和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(g)之間的比對。圖1和2中的比對是通過使用GCG軟件包的GAP程序按下文指示的方法確立的，而圖la和2a中的比對與WO91/00345中所顯示的相同。在本專利申請中這些比對被用作殘基編號的參考。7個活性位點環(huán)(a)-(g)(包括所指出的兩個末端氨基酸殘基)在此定義為包括下面所給片段中的氨基酸殘基(a)第33和43位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(b)第95和103位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(c)第125和132氨基酸殘基之間的區(qū)域；(d)第153和173氨基酸殘基之間的區(qū)域；(e)第181和195位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(f)第202和204位氨基酸殘基之間的區(qū)域；(g)第218和219位氨基酸殘基之間的區(qū)域。因此，本發(fā)明的第一個方面涉及在第95-103位的活性位點環(huán)(b)區(qū)的95位具有至少一個額外氨基酸殘基的分離的(即，純度大于10%的)I-Sl和I-S2亞族枯草桿菌酶，由此所述額外氛基酸殘基相應于在第95和96位之間至少一個#^酸殘基的插入。本發(fā)明的第二個方面涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離的DNA序列。本發(fā)明的第三個方面涉及含有編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的分離DNA序列的表達栽體。本發(fā)明的第四個方面涉及用第四方面的表達載體轉化的微生物宿主細胞。本發(fā)明的再一個方面涉及本發(fā)明枯草桿菌蛋白酶的制備。本發(fā)明的酶通?？梢酝ㄟ^如下方式產(chǎn)生培養(yǎng)微生物菌抹，從中分離該酶，并以大體上純的形式回收該酶；或將本發(fā)明第四方面的表達載體插入合適的微生物宿主中，培養(yǎng)該宿主以表達目的枯草桿菌酶，并回收該酶產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。更進一步地，本發(fā)明涉及本發(fā)明的酶在許多工業(yè)相關用途中，尤其是在清潔劑組合物中的應用，以及在含有該突變酶的清潔劑組合物，特別是含有該突變枯草桿菌蛋白酶的洗滌劑組合物中的應用。定義在更為詳細地論述本發(fā)明之前，將首先定義下面的術語和約定。氨基酸命名A=Ala=丙氨酸V二Val二纈氨酸=Leu=亮氨酸I二lie二異亮氨酸P=Pro=脯氨酸F=Phe=苯丙氨酸W=Trp=色氨酸M=Met=甲硫氨酸G=Gly=甘氨酸S=Ser=絲氨酸T=Thr=蘇氨酸C=Cys二半胱氨酸Y=Tyr=酪氨酸N=Asn=天冬酰胺Q=Gin=谷氨酰胺D二Asp=天冬氨酸E=Glu=谷氨酸K=Lys=賴氨酸R二Arg二精氨酸H=His二組氨酸X=Xaa=任意氨基酸核酸命名A=腺噤呤G=鳥噤呤C=胞嘧啶T=胸腺嘧咬(僅在DNA中)U=尿嘧啶(僅在RNA中)變體名稱的命名原則和約定在描述根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生或設想的各種酶變體時，為了便于提及，采用下述命名原則和約定首先通過分離的或親本野生型酶與枯草桿菌蛋白酶BPN，(BASBPN)之間的比對，定義參照框架。為了給變體編號，可以通過9.1版本GCG軟件包的GAP程序利用下述參數(shù)獲得該比對斷缺區(qū)產(chǎn)生罰分(g鄧creationpenalty)=8和斷缺區(qū)延伸罰分(gapextensionpenalty)二8,而所有其它參數(shù)保留其默認值。另一種方法是利用枯草桿菌酶之間的已知公認比對，例如描述于WO91/00345中的比對。在大多數(shù)情況下，這些差異并不是重要的。枯草桿菌蛋白酶BPN，(BASBPN)和枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI)以及和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(BLSCAR)之間的比對，分別顯示在圖1,la,2,和2a中。通過此比對，可以參照BASBPN對許多缺失和插入進行定義.在圖1中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶309在第36、58、158、162、163以及164位具有6個缺失，而在圖la中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶309在第36、56、159、164、165以及166位具有同樣的缺失。在圖2中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg在第58位具有一個缺失，而在圖&中，與BASBPN相比，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg在第56位有一個缺失。這些缺失在圖l，la，2，2a中通過星號(*)標明。在野生型酶中進行的各種修飾通常使用下面三個要素來表示原始氨基酸位置替代氨基酸因此符號G195E是指第195位的甘氨酸被谷氨酸所替代。在原始氨基酸殘基可以是任意氨基酸殘基的情況下，有時可以使用僅指示位置和替代氨基酸的簡寫符號，位置替代氨基酸關于同源枯草桿菌酶中的《f飾，此種符號尤其恰當(見下文)。同樣，當替代氨基酸殘基的身份不重要時，可以使用原始氨基酸位置當原始氨基酸和替代氨基酸均可以包含任意氨基酸時，則僅指明位置，例如170。當原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一種以上但又并非所有氨基酸時，則在括號()中指出選擇的氨基酸，原始氨基酸位置{替代氨基酸二，....，替代的氨基酸^對于具體變體，使用具體的三字母或一字母代碼，包括指示任意氨基酸殘基的代碼Xaa和X。替代谷氨酸在第195位替代甘氨酸命名為Glyl95Glu或G195E或任意氨基酸在第195位替代甘氨酸命名為Glyl95Xaa或G195X或Glyl95或G195因此，絲氨酸在第170位替代任意氨基酸殘基將命名為Xaal70Ser或X170S或170Ser或170S。關于同源枯草桿菌酶中的改變，該符號尤其適合(見下文)。因此170Ser意味著包含例如BASBPN中的Lysl70Ser改變和BLSAVI中的Argl70Ser改變(參見圖1)。對于原始氨基酸和/或替代氨基酸可以包含一種以上但又并非所有氨基酸的改變，甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸或蘇氨酸在第170位替代精氨酸可以通過Argl70{Gly,Ala，Ser,Thr)或R170{G,A，S，T}來表示，以指示變體R170G、R170A、R170S和R170T。缺失第195位甘氨酸的缺失將表示為Glyl95*或G195*相應地，一個以上氨基酸殘基的缺失，例如第195位甘氨酸和196位亮氨酸缺失將表示為Glyl95*+Leul96*或G195*+L196*插入額外氨基酸殘基的插入，例如賴氨酸在G195位之后的插入表示為Glyl95GlyLys或G195GK;或當插入不止一個氨基酸殘基時，例如在G195之后插入一個賴氨酸，丙氨酸和絲氨酸時，il^示為Glyl95GlyLysAlaSer或G195GKAS在這種情況下，通過在插入氨基酸殘基之前的氨基酸殘基位置數(shù)后加上小寫字母來編號該插入的氨基酸殘基。上述例子中的第194-196位序列將因此被表示為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage15</formula>在插入與已有氨基酸殘基相同的氨基酸殘基時，很顯然在命名中產(chǎn)生了簡并性。例如在上述例子的甘氨酸之后插入一個甘氨酸，則表示為G195GG。而對于從194195196BLSAVIA-G-L到194195195a196變體A-G—G-L194194a195196的改變，實際上相同的變化同樣可以表示為A194AG。這些情況對于技術人員來說是顯而易見的，因此表示式G195GG和針對該類型插入的相應表示式旨在包括這種等同簡并表示式。缺口填充當與用于編號的枯草桿菌蛋白酶BPN，序列進行的參照比較中，一個酶中存在缺失時，在該位置的插入例如第36位的天冬氨酸插入表示為承36Asp或舉36D多重修飾含有多重修飾的變體通過加號分開，例如Argl70Tyr+Glyl95Glu或R170Y+G195E表示在第170位和195位用酪氨酸和谷氨酸分別替代精氨酸和甘氨酸的修飾《或例如Tyrl67{Gly，Ala，Ser，Thr}+Argl70{Gly，Ala，Ser，Thr}表示變體Tyrl67Gly+Argl70Gly，Tyrl67Gly+Argl70Ala，Tyrl67Gly+Argl70Ser,Tyrl67Gly+Argl70Thr，Tyrl67Ala+Argl70Gly,Tyrl67Ala+Argl70Ala，Tyrl67Ala+Argl70ser，Tyrl67Ala+Argl70Thr，Tyrl67Ser+Argl70Gly，Tyrl67Ser+Argl70Ala，Tyrl67Ser+Argl70Ser，Tyrl67Ser+Argl70Thr，Tyrl67Thr+Argl70Gly,Tyrl67Thr+Argl70Ala,Tyrl67Thr+Argl70Ser,和Tyrl67Thr+Argl70Thr。當涉及到對具有特定共性的氨基酸殘基例如帶正電荷的殘基(K，R，H)，帶負電荷的殘基(D，E)進行替代、置換、插入或缺失修飾時，或涉及到保守氨基酸修飾例如Tyrl67{Gly,Ala，Ser，Thr}+Argl70(Gly，Ala,Ser,Thr)時，這種命名原則尤其恰當。具體參見"發(fā)明詳述"部分。蛋白酶裂解蛋白質底物中酰胺鍵的酶被歸為蛋白酶，或(可互換使用的)肽酶(參見Walsh，1979，箱^^/^理t/c/eac"o"船cA朋isa^，W.H.FreemanandCompany,SanFrancisco,第3章)氨基酸位置/殘基的編號如沒有另外提及，本文所用的氨基酸編號對應于枯草桿菌酶BPN，(BASBPN)序列的編號。BPN，序列的進一步描述參見圖1和2，或Siezen等，尸ro&277￡>^z^.4(1991)719—737。絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點含有一個必需絲氨酸殘基(White,Handler和Smith,1973"^浙記夢f理r尸r/77Cj(^es0/^/0c力e邁i"str7尸,第五版，McGraw-Hi11BookCompany,NY,第271—272頁)。細菌絲氨酸蛋白酵具有20,000到45,000道爾頓的分子量。其被二異丙基氟磷酸抑制。它們水解簡單末端酯并且在活性上相似于同樣是絲氨酸蛋白酶的真核胰凝乳蛋白酶。更為狹窄的術語，堿性蛋白酶，其包括一個亞族，反映了一些絲氨酸蛋白酶的高最適pH值，從pH9.0到11.0(綜述參見Priest(1977)5a"er/o7of'ca741711-753)?？莶輻U菌酶Siezen等，尸7Y^ej7f/2卵《.4(1991)719—737和Siezen等，資f尸r"w775bie/ce>>6(1997)501-523提議將絲氨酸蛋白酶的一個亞族暫稱為枯草桿菌酶(s^ti7ase)。通過對170多個先前被稱作枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酵的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列同源分析，定義了這些酶?？莶輻U菌蛋白酶以前常常被解釋為由革蘭氏陽性菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人的提議其是枯草桿菌酶的一個亞族。各種各樣的枯草桿菌酶已獲得鑒定，而且許多枯草桿菌酶的氨基酸序列已被測定。對于這些枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更具體描述，參考Siezen等(1997)?？莶輻U菌酶的一個亞族，I-Sl或"真枯草桿菌蛋白酶"，包含"經(jīng)典的"枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168),枯草桿菌蛋白酶BPN，，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE,NOVON0RDISKA/S)，以及枯草桿菌蛋白酶DY(BSSDY)。Siezen等(上文)識別了枯草桿菌酶的另一個亞族，I-S2或高堿性枯草桿菌蛋白酶。I-S2蛋白酶亞族被描述為高堿性枯草桿菌蛋白酶，其包括酶例如枯草桿菌蛋白酶PB92(BMLKP)(MAXACAL，Gist-BrocadesNV)，枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE,NOVONORDISKA/S),枯草桿菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE,NOVONORDISKA/S),以及堿性彈性蛋白酶YaB鵬YAB)。枯草桿菌酶的首字母縮寫列表I-SI枯草桿菌蛋白酶168，BSS168(BSSAS(枯草桿菌蛋白酶amylosacchariticus)，BSAPRJ(枯草桿菌蛋白酶J)，BSAPRN(枯草桿菌蛋白酶NAT),BMSAMP(腸系膜肽酶(Mesentericop印tidase))，枯草桿菌蛋白酶BPN，，BASBPN，枯草桿菌蛋白酶DY，BSSDY，枯草桿菌蛋白酶Carlsberg，BLSCAR(BLKERA(角蛋白酶)，BLSCAl，BLSCA2,BLSCA3),BSSPRC，絲氨酸蛋白酶CBSSPRD，絲氨酸蛋白酶DI-S2枯草桿菌蛋白酶Sendai,BSAPRS枯草桿菌蛋白酶ALP1,BSAPRQ,枯草桿菌蛋白酶147，EsperaseBLS147(BSAPRM(SubtilisinAprM)，BAHIOI)，枯草桿菌蛋白酶309，Savinase,BLS309/BLSAVI(BSKSMK(M-蛋白酶)，BMLKP(枯草桿菌蛋白酶PB92，嗜堿芽胞桿菌(Bacillusalkal叩hilic)堿性蛋白酶)，BLSUBL(枯草桿菌蛋白酶BL)),堿性彈性蛋白酶YaB,BYSYAB，"SAV皿SE⑧"SAVINASE由NOVONORDISKA/S銷售。其是來自遲緩芽孢桿菌(B.Lentus)的枯草桿菌蛋白酶309,而且其僅在一個位置上不同于BAALKP(N87S,參見本文圖SAVINASE具有在圖1中稱為b)的氨基酸序列。親本枯草桿菌酶術語"親本枯草桿菌酶"描述了一種根據(jù)Siezen等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。更詳細的參見剛才上面的"枯草桿菌酶"描述。親本枯草桿菌酶也可以是從自然來源分離的枯草桿菌酶，其中在保留枯草桿菌酶特性的同時，對其進行隨后的修飾?；蛘?，術語"親本枯草桿菌酶"可以被稱為"野生型枯草桿菌酶"?？莶輻U菌酶變體的修飾本文所用術語"修飾"被定義為包括枯草桿菌酶的化學修飾以及編碼枯草桿菌酶的DNA的遺傳操作。修飾可以是在目的氨基酸中或處的氨基酸側鏈置換、氨基酸替代、缺失和/或插入?？莶蒈幘缸凅w在本發(fā)明的上下文中，術語枯草桿菌酶變體和突變的枯草桿菌酶是指由表達突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該生物體來源于含有原始或親本基因并產(chǎn)生相應親本酶的親本生物體，為了產(chǎn)生當在合適宿主中表達時生產(chǎn)所述突變枯草桿菌酶蛋白酶的突變基因，對該親本基因進行了突變。同源枯草桿菌酶序列為了修飾以獲得本發(fā)明枯草桿菌酶變體，對SAVINASE枯草桿菌酶的特異活性位點環(huán)區(qū)和所述環(huán)中的氨基酸插入進行了鑒定。然而，本發(fā)明并不限于這種特殊枯草桿菌酶的修飾，而是擴展到與SAVINASE⑧具有同源一級結構的其它親本(野生型)枯草桿菌酶。兩個氨基酸序列之間的同源性在本發(fā)明中用"一致性"#^:來描迷為了確定兩個枯草桿菌酶的一致性程度，可以應用9.1MGCG軟件包的GAP程序(下文)以及同上的設置^^L除了氨基酸比對外，該程序還輸出兩個序列之間的"一致性百分數(shù)"計算結果?；诖嗣枋?，筌定可以根據(jù)本發(fā)明進行修飾的合適同源枯草桿菌酶和相應的同源活性位點環(huán)區(qū)，對于本領域的技術人員來說是常規(guī)的。洗滌性能在例如洗滌或硬表面清洗過程中，酶催化降解存在于待清潔物品上的各種天然存在底物的能力通常被稱為洗滌能力，洗滌力，去垢力或洗滌性能。在本申請中術語洗滌性能用于包括該性質。分離的DNA序列術語"分離的"，當用于DNA序列分子時，表示該DNA序列已從其天然的遺傳環(huán)境中分離出來，因此不含有其它無關或不需要的編碼序列，而且其形式適用于遺傳工程蛋白質生產(chǎn)系統(tǒng)。該分離的分子是指那些從其自然環(huán)境中分離的分子，包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離DNA分子不含有通常與之相關的其它基因，但可以包括自然存在的5，和3，非翻譯區(qū)例如啟動子和終止子。相關區(qū)域的鑒定對于本領域的普通技術人員來說是容易的(參見例如，Dynan和Tijan，自然316:774-78，1985)。術語"分離的DNA序列"也可以被稱作"克隆的DNA序列"。分離的蛋白質當應用于蛋白時，術語"分離的"是指該蛋白已從其天然環(huán)境中分離出來。在一種優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質相當大程度上不含有其它蛋白，特別是其它同源蛋白質(即"同源雜質"(參見下述))。通過SDS-PAGE檢測，分離的蛋白質具有大于10%的純度，優(yōu)選大于20%的純度，更優(yōu)選大于30%的純度。進一步優(yōu)選提供高純度形式的蛋白質，即通過SDS-PAGE檢測，其純度大于40%，大于60%，大于80%,更優(yōu)選大于95A甚至更優(yōu)選大于99%的蛋白質。術語"分離的蛋白質"也可以被稱為"純化的蛋白質"。同源雜質術語"同源雜質"是指來源于最初從其中獲得本發(fā)明多肽的同源細胞的任何雜質(例如非本發(fā)明多肽的另一種多肽)。獲自與特定微生物來源相連的術語"獲自"，在本文中是指由該特定來源產(chǎn)生的，或由其中插入了該來源基因的細胞產(chǎn)生的多核苷酸和/或多肽。底物與蛋白酶底物相關的術語"底物"，應以其最廣泛形式解釋為包含含有至少一個易受枯草桿菌酶水解的肽鍵的化合物。與蛋白酶酶解反應得到的產(chǎn)物相關的術語"產(chǎn)物"，在本發(fā)明的上下文中應解釋為包括涉及枯草桿菌鰷蛋白酶的水解反應的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以是隨后水解反應中的底物。附圖簡要說明圖1顯示了使用上述GAP程序在枯草桿菌蛋白酶BPN，(a)和Savinase(b)之間進行的比對。圖la顯示了從WO91/00345獲得的枯草桿菌蛋白酶BPN，和Savinase⑧之間的比對。圖2顯示了使用上述GAP程序在枯草桿菌蛋白酶BPN，和枯草桿菌蛋白酵Carlsberg之間進行的比對。圖2a顯示了從W091/00345獲得的枯草桿菌蛋白酶BPN，和枯草桿菌蛋白酶Carlsberg之間的比對。圖3顯示了Savinase的三維結構(蛋白質數(shù)據(jù)庫(PDB)錄入號1SVN)。圖中標明了活性位點環(huán)(b)。發(fā)明詳述在第一個方面，本發(fā)明的枯草桿菌酶涉及在第95到103位的活性位點環(huán)(b)區(qū)中95位具有至少一個額外氨基酸殘基的分離(即純度大于10%的)I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶，由此所述額外g酸殘基相應于在第95-96位之間至少一個氨基酸殘基的插入。換句話說，本發(fā)明枯草桿菌酶的特征在于含有一個多于9個氨基酸殘基的活性位點環(huán)(b)區(qū)，而且其中與親本或已知野生型枯草桿菌酶比較,該額外氨基酸被認為是，或可以被認為是在第95位和96位之間插入的。本發(fā)明第一個方面的枯草桿菌酶可以是從自然環(huán)境鑒定和分離的親本或野生型枯草桿菌酶。這種親本野生型枯草桿菌酶可以通過本領域已知的標準技術來進行特異篩選。進行此篩選的一個優(yōu)選方法是從多種不同微生物，優(yōu)選不同的芽胞桿菌菌抹，特異PCR擴增已知編碼枯草桿菌酶活性位點環(huán)的DNA區(qū)。從其DNA和氨基酸序列同源的意義上而言，枯草桿菌酶是一族保守酶。因此，在活性位點環(huán)兩側構建相對特異的引物是可能的。進行此操作的一個方法是研究不同枯草桿菌酶之間的比對(參見，例如Siezen等.齊^^"存夢6(1997)501-523)。從此常規(guī)工作，本領域技術人員即可構建位于活性位點環(huán)兩側的PCR引物，其中所述活性位點環(huán)相應于I-Sl和I-S2族的任意一個成員例如BLSAVI的第95到103位氨基酸殘基之間的活性位點環(huán)(b)。使用此引物從大量不同微生物優(yōu)選不同芽胞桿菌菌抹擴增DNA,之后對所述擴增PCR片段進行DNA測序，這樣就可能鑒定出產(chǎn)生與例如BLSAVI相比含有更長活性位點區(qū)的這些族枯草桿菌酶的菌抹，其中所述活性位點區(qū)對應于從第95位至103位的活性位點環(huán)區(qū)，而且可以認為在第95-96位之間存在插入。在筌定了目的枯草桿菌酶的菌抹和部分DNA序列之后，完成本發(fā)明枯草桿菌酶的克隆、表達和純化對于本領域技術人員來說是常規(guī)工作。然而，可以認為本發(fā)明的枯草桿菌酶主要是親本枯草桿菌酶的變體。因此，在一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明第一個方面的分離枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是一個與親本酶相比具有更長活性位點環(huán)(b)的構建的變體，其構建方式是在第95和96位氨基^基之間插入至少一個氨基酸。本發(fā)明的枯草桿菌酶在洗滌劑中顯示出優(yōu)異的洗滌性能，而且如果該酶是構建的變體，則與其關系最近的枯草桿菌酶例如枯草桿菌蛋白酶309相比，該酶在洗滌劑中具有改進的洗滌性能。不同的枯草桿菌酶在不同類型的洗滌劑組合物中將顯示出不同的洗滌能力。在大多數(shù)不同類型的洗滌劑組合物中，本發(fā)明的枯草桿菌酶與其最近的相關物相比具有改進的洗滌性能。優(yōu)選地，本發(fā)明的枯草桿菌酶與本文實施例3的洗潦劑組合物(見下文)中的最近相關物相比具有改進的洗滌能力。為了確定所給枯草桿菌酶氨基酸序列(無論所述枯草桿菌酶序列是親本野生型枯草桿菌酶序列還是通過定點誘變之外的任何其它方法產(chǎn)生的枯草桿菌酶變體序列)是否屬于本發(fā)明的范圍，可以使用以下程序i)將所述枯草桿菌酶序列與枯草桿菌蛋白酶BPN'的氨基酸序列進行比對(參見本文的"定義"部分(見上))；ii)基于步驟i)進行的比對，在所述枯草桿菌酶序列中鑒定對應于枯草桿菌酶BPN，活性位點環(huán)(b)區(qū)的活性位點環(huán)(b),其中枯草桿菌酶BPN'的活性位點環(huán)(b)區(qū)包含第95至103位氨基酸殘基(包括兩個末端氨基酸殘基)之間區(qū)域；iii)確定步驟ii)中鑒定的所述枯草桿菌酶序列中的活性位點環(huán)(b)是否長于BLSAVI中的相應活性位點環(huán)，以及所述延長部分是否相應于在第95和96位之間插入了至少一個氨基酸殘基。如果是，則所研究的枯草桿菌酶是本發(fā)明范圍中的枯草桿菌酶。以上步驟i)中進行的比對是按上述方法通過使用GAP程序完成的?；诖嗣枋?，對于本領域技術人員來說，鑒定枯草桿菌酶中的活性位點環(huán)(b)和確定所討論的枯草桿菌酶是否屬于本發(fā)明范圍均是常規(guī)的。如果變體是通過定點誘變構建的，則當然預先知道該枯草桿菌酶變體是否屬于本發(fā)明范圍。本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可通過本領域已知的標準技術來構建，例如通過定點誘變/隨機誘變或通過不同枯草桿菌酶序列的DNA改組來構建。具體參見本文的〃制備枯草桿菌酶變體〃部分以及材料和方法(參見下文)。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及1.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個插入氨基酸殘基選自T、G、A和S;2.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個插入氨基酸殘基選自下列帶電荷氨基酸殘基D、E、H、K和R，更優(yōu)選D、E、K和3.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個插入氨基酸殘基選自下列親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選N、Q、S和T;4.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個插入氨基酸殘基選自下列小的疏水性氨基酸殘基A、G和V;或5.根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中所述至少一個插入氨基酸殘基選自下列大的親水性氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y,F、I、L、M和Y;在再一個實施方案中，本發(fā)明涉及根據(jù)本發(fā)明的分離枯草桿菌酶，其中與BLSAVI中的相應活性位點環(huán)相比，第95和96位之間的所述插入包括至少兩個氨基酸。在其它實施方案中，本發(fā)明涉及含有至少一個選自下組的插入的分離枯草桿菌酶(使用BASBPN的編號方式)X95X{T,G，A，S)X95X{D,E，K,R}X95X饑V，C，N,Q}X95X(F,I，L,M，P，W,Y}或更為具體地對于枯草桿菌蛋白酶309和緊密相關的枯草桿菌酶例如BAALKP、BLSUBL和BSKSMK而言該插入是V95VAV95VTV95VGV95VSV95VDV95VEV95VKV95VRV95VHV95WV95VCV95VNV95VQV95VFV95VIV95VLV95VMV95VPV95WV95VY此外，本發(fā)明還涉及在第95位含有多個插入，或含有以下任意組合的枯草桿菌酶V95VT+Y167A正如本領域所熟知的，所謂一個氨基酸殘基對一個相似氨基酸殘基的保守替代應該對酶的特性僅產(chǎn)生微小的改變。下面表III列出了多組保守氨基酸替代表III保守氨基酸替代共有性質氨基酸堿性(帶正電荷)K=二賴氨酸H::組氨酸酸性(帶負電荷)E:二谷氨酸D:=天冬氨酸極性Q:=谷氨酰胺N=:天冬酰胺疏水性L=:亮氨酸I::異亮氨酸V=:纈氨酸M:=甲硫氨酸芳香族F::笨丙氨酸W=:色氨酸Y=:酪氨酸小分子G=:甘氨酸A=:丙氨酸S:-絲氨酸T=:蘇氨酸基于此原則，含有保守替代例如G97A+A98AS+S99G，G97S+A98AT+S99A的枯草桿菌酶變體應該表現(xiàn)出彼此不會明顯不同的特性?；诖颂幑_的和/或示例的枯草桿菌酶變體，為了獲得顯示出相似改進洗滌能力的其它枯草桿菌酶變體，鑒定這些變體的合適保守修飾對于本領域的技術人員來說是常規(guī)的工作。根據(jù)本發(fā)明，不論為了從自然或人工產(chǎn)生的多樣性中分離本發(fā)明新酶，還是為了從親本枯萃桿菌酶設計和產(chǎn)生變體，本發(fā)明的枯草桿菌酶均屬于I-S1和I-S2亞族，尤其是I-S2亞族。關于來自I-S1亞族的變體，優(yōu)M下組選擇親本枯草桿菌酶BSS168(BSSAS，BSAPRJ，BSAPRN，BMSAMP)，BASBPN，BSSDY，BLSCAR(BLKERA，BLSCA1,BLSCA2，BLSCA3)，BSSPRC和BSSPRD，或者它們的保留了I—Sl26亞族特性的功能性變體。關于來自I-S2亞族的變體,優(yōu)選從下組選擇親本枯草桿菌酶BSAPRQ,BLS147(BSAPRM，BAHIOI)，BLSAVI(BSKSMK,BMLKP，BLSUBL),BYSYAB和BSAPRS,或它們的保留了I-S2亞族特性的功能性變體。所述親本枯草桿菌酶尤其是指BLSAVI(SAVINASENOVONORDISKA/S)，因此本發(fā)明的優(yōu)選枯草桿菌酶變體是5八￥1^5￡@的變體。本發(fā)明還包括所有組合了任意其它氨基酸序列修飾的上述本發(fā)明枯草桿菌酶。特別是包括與本領域已知其它修飾的組合以提供改進的酶性質。本領域描述了許多具有不同改良特性的變體，而且在本文的"發(fā)明背景"部分(參見上文)也提及了許多這樣的枯草桿菌酶。在此公開這些參考文獻作為筌定可以有利地與本發(fā)明枯草桿菌酶變體組合的枯草桿菌酶變體的參考。這些組合包括第222位(提高氧化穩(wěn)定性)，第218位(提高熱穩(wěn)定性)，在穩(wěn)定該酶的Ca-結合位點中例如第76位的替代，以及許多現(xiàn)有技術已知的其它位置。在其它實施方案中，可以有利地將本發(fā)明枯草桿菌酶變體與任意下述位置的一個或更多修飾組合起來27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。特別是下列BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK和BMLKP的變體被i人為適用于進行組合K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、S103A、V104A、V104I、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167、R170、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。而且，包含與上述任意一個或多個修飾組合的如下任意變異S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A,或者這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合的變體表現(xiàn)出改進的特性。更進一步地，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與一個或多個在任何第129、131、133和194位的修飾組合，這些修飾優(yōu)選129K、131H、133P、133D和194P修飾，且最優(yōu)選P129K、P131H、A133P、A133D和A194P修飾。任何這樣的修飾預期可以在本發(fā)明枯草桿菌酶變體的生產(chǎn)中提供更高的該變體表達水平。因此，本發(fā)明的一個更進一步的實施方案涉及根據(jù)本發(fā)明的變體，其中所述修飾選自下組制備枯草桿菌酶變體用以克隆本發(fā)明枯草桿菌酶以及將插入導入基因(例如枯草桿菌酶基因)的方法是本領域所熟知的，參考在"發(fā)明背景"部分引用的文獻。通常，為了獲得本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，可以使用用以克隆基因和將(隨機和/或定點)插入導入所述基因的標準程序。對于適合技術的進一步描述，參見本文實施例(見下文)和(Sambrook等人.(1989)分子克隆實驗室手冊(MolecularCloning:Alaboratorymanual),冷泉港實驗室，冷泉港，NY;Ausubel，F(xiàn).M.等(編)〃現(xiàn)代分子生物學實驗指南(CurrentprotocolsinMolecularBiology)〃.JohnWileyandSons,1995;Harwood，C.R.和Cutting,S.M.(編)"芽胞桿菌的分子生物學方法(MolecularBiologicalMethodsforBacillus)〃.JohnWileyandSons,1990);以及WO96/34946。此外，本發(fā)明的枯草桿菌酶變體可以通過人工產(chǎn)生多樣性的標準技術來構建，例如不同枯草桿菌酶基因的DNA改組(WO95/22625;StemmerWPC,自然(Nature)370:389-91(1994))。例如將實際上已被鑒定與Savinase相比含有更長活性位點環(huán)(b)區(qū)的一個或多個枯草桿菌酶部分序列和編碼Savinase⑧的基因進行DNA改組，在隨后對具有改進洗滌性能的變體進行篩選之后，即可提供根據(jù)本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。表達載體含有編碼本發(fā)明酶的DNA結構的重組表達載體可以是任意可方便地進行重組DNA操作的載體。栽體的選擇通常取決于其將要導入的宿主細胞。因此，該載體可以是自主復制載體，即以染色體外實體形式存在并且其復制獨立于染色體復制的栽體，例如質粒?；蛘?，該栽體可以是當被導入宿主細胞后部分或全部整合到宿主細胞基因組中并且隨其整合的染色體一起復制的栽體。該載體優(yōu)選是表達載體，而直在該表達載體中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地與DNA轉錄所需的其它片段連接。通常，表達載體來源于質?；虿《綝NA，或可以含有二者的元件。術語"可搡作地連接"是指對片段進行排列以使其按預期目的發(fā)揮功能，例如，轉錄在啟動子中起始并沿著編碼酶的DNA序列前進。啟動子可以是在所選宿主細胞中顯示出轉錄活性的任意DNA序列，可以來自編碼與宿主細胞同源或異源的蛋白質的基因。用于細菌宿主細胞的適合啟動子的例子包括嗜熱脂肪芽胞桿菌(^aci2JwsWearotAer咖/J力i7ws)產(chǎn)麥芽糖淀粉酶(maltogenicamylase)基因，地衣芽孢桿菌(5aci77〃sh'c力e/i/araw's)oc-淀粉酶基因，解淀粉芽胞桿菌(Aac/77tfsa/zy^o7勿we/aci朋s)oc-淀粉酶基因，枯草芽孢桿菌(泡cj77"s堿性蛋白酶基因，或短小芽孢桿菌(Aacj77"s/w邁^Zws);f^苷酶基因的啟動子，或入噬菌體Pr或Pl啟動子，或大腸桿菌(E.coli)lac，trp或啟動子。如有必要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列也可以可操作地連接一個合適的終止子。本發(fā)明的重組載體可以進一步含有使得載體能夠在所述宿主細胞中復制的DNA序列。該載體還可以含有一個選擇標記，例如其產(chǎn)物彌補了宿主細胞缺陷的基因，或編碼例如卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等抗生素抗性，或重金屬或除草劑抗性的基因。為了引導本發(fā)明酶進入宿主細胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導序列，前原序列(pr印rosequence)或前序列(presequence)).分泌信號序列在正確閱讀框中與編碼酶的DNA序列連接。分泌信號序列通常位于編碼酶的DNA序列的5，端。分泌信號序列可以是正常與酶聯(lián)系的分泌信號序列，也可以來自編碼另一種分泌蛋白的基因。用于分別地將編碼本發(fā)明酶的DM序列、啟動子和任選的終止子和/或分泌信號序列連接起來，或通過合適的PCR擴增方案裝配這些序列，然后將它們插入含有復制或整合所需信息的適合載體中的方法，是本領域技術人員所熟知的(參見，例如Sambrook等，同上)。宿主細胞被導入宿主細胞的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以與所述宿主同源或異源。如果該DNA序列與宿主細胞同源，即由宿主細胞天然產(chǎn)生，則其典型地是與另一個啟動子序列或，如果適用，與另一個分泌信號序列和/或終止子序列可操作地連接，而不是存在于其天然環(huán)境中。術語"同源的"旨在包括編碼所述宿主生物天然產(chǎn)生的酶的DNA序列。術語"異源的"旨在包括宿主細胞天然并不表達的DNA序列。因此，該DM序列可以來自另一種生物，或其可以是合成序列。本發(fā)明DNA結構或重組載體所導入的宿主細胞可以是能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的任意細胞，包括細菌、酵母、真菌和高等真核生物包括植物的細胞。在培養(yǎng)過程中能夠產(chǎn)生本發(fā)明酶的細菌宿主細胞的例子包括革蘭氏陽性細菌例如芽胞桿菌屬(Bacillus)菌抹如枯草芽孢桿菌(漢地衣芽孢桿菌(及Jj'c力朋ijfor邁is).遲緩芽孢桿菌(丑7朋tws義短芽孢桿菌(A》rer/s)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(及stearo"er邁o/7力"〃;s)、嗜堿芽孢桿菌(及a7Aa7。p力/7tfs),解淀粉芽孢桿菌(及a/Bj^o7勿we/"ac/朋s)、凝結芽孢桿菌(丑coa^/7朋s)、環(huán)狀芽孢桿菌(漢cjfrcw7朋;s乂杣爛芽孢桿菌(及7aw^/s),巨大芽孢桿菌(A/ffe^a^en'm^或蘇云金芽孢桿菌(丑tAtfT277^7'朋sj's)，或鏈霉菌屬(Streptomyces)菌抹，如淺青紫鏈霉菌(5172'nV朋s)或鼠灰鏈霉菌(51邁tfri/〃s)，或革蘭氏陰性細菌例如大腸桿菌(5cAer/cA2'aco//)。細菌的轉化可通過原生質體轉化、電穿孔、接合、或通過使用感受態(tài)細胞，按本來已知的方式進行(參見Sambrook等，見上文)。當在細菌例如大腸桿菌中表達該酶時，該酶可以典型地以不可溶顆粒(稱作包涵體)形式留在細胞質中，或可以被細菌分泌序列引導至周質間隙。在前一種情況中，裂解細胞并回收顆粒，變性，之后通過稀釋變性劑使該酶重新折疊。在后一種情況中，可以通過破碎細胞從周質間隙回收該酶。例如，通過超聲處理或滲壓震擾來釋放周質間隙的內(nèi)容物并回收該酶。當在革蘭氏陽性細菌例如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌抹中表達該酶時，酶可以保留在細胞質中，或可以被細菌分泌序列引導至細胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況中，可以按下文所述方法從培養(yǎng)基中回收該酶。生產(chǎn)枯草桿菌酶的方法
技術領域：
：本發(fā)明提供生產(chǎn)本發(fā)明的分離酶的方法，其中在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)用編碼此酶的DNA序列轉化的合適宿主細胞，并且從培養(yǎng)物中回收產(chǎn)生的酶。當含有編碼此酶的DNA序列的表達載M轉化到異源宿主細胞中時，即可以進行本發(fā)明酶的重組異源產(chǎn)生。因此生產(chǎn)高純度的其特征在于不含有同源雜質的枯草桿菌酶組合物是可能的。在本文中，同源雜質是指來源于最初獲得本發(fā)明酶的同源細胞的任何雜質(例如，除本發(fā)明酶之外的其它多肽)。用于培養(yǎng)轉化宿主細胞的培養(yǎng)基可以是適用于所述宿主細胞生長的任何常規(guī)培養(yǎng)基?？梢詫⒈磉_的枯草桿菌酶方便地分泌至培養(yǎng)基中，并由此通過熟知程序進行回收，這些程序包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細胞，采用鹽例如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基的蛋白質成分，然后進行層析如離子交換層析、親和層析等等。本發(fā)明枯草桿菌酶變體的應用本發(fā)明的枯草桿菌酶蛋白酶變體可以有許多工業(yè)用途，尤其是在洗滌劑工業(yè)中。此外，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明枯草桿菌酶變體的酶組合物。對優(yōu)選的工業(yè)應用以及相應的優(yōu)選酶組合物的總結描述如下。該總結不旨在以任何方式完全列出本發(fā)明枯草桿菌酶變體適合應用。本發(fā)明枯草桿菌酶變體還可以在包括使用蛋白酶，特別是枯草桿菌酶的本領域已知其它工業(yè)應用中使用。含有突變酶的洗滌劑組合物本發(fā)明包括本發(fā)明突變酶在清潔和洗滌劑組合物中的應用以及這些含有該突變枯草桿菌蛋白酶的組合物。這些清潔和洗滌劑組合物在本領域中已有很好的描述，對于適合的清潔和去污組合物的進一步描述，參見wo96/34946,WO97/07202，WO95/30011。此外，下面的實施例闡明了許多本發(fā)明枯草桿菌酶變體在洗滌性能上的改進。洗滌劑組合物本發(fā)明酶可以被加入洗滌劑組合物中并因此成為洗滌劑組合物的一個成分。物，其中包括適用于污染的紡織物預處理的洗衣添加組合物以及加入了織物軟化劑的漂洗組合物，或配制成用于一般家用硬物體表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制成用于手工或M洗碟操作的洗滌劑組合物。在一個具體方面，本發(fā)明提供含有本發(fā)明酶的洗滌添加劑。該洗滌添加劑與所述洗滌劑組合物均可以含有一或多種其它酶例如蛋白酶、脂酶、角質酶(cutinase)、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯聚糖酶(arabanase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶例如漆酶和/或過氧化物酶。通常，所選酶的性質應與所選洗滌劑相適應(即最適pH、與其它的酶和非酶成分的兼容性，等等)，并且該酶應當以有效的量存在。蛋白酶:合適的蛋白酶包括動物，植物或微生物來源的蛋白酶。優(yōu)選徵生物來源的蛋白酶。化學修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內(nèi)。該蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選微生物的堿性蛋白酶，或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的例子是枯草桿菌蛋白酶，尤其是來自芽胞桿菌屬的枯草桿菌蛋白酶，例如枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147以及枯草桿菌蛋白酶168(描述于WO89/06279)。胰蛋白酶樣蛋白酶的例子是胰蛋白酶(例如豬或牛來源的胰蛋白酶)和描述于WO89/06270和WO94/25583中的鐮孢屬(Z^/幼n'咖)蛋白酶。有用蛋白酶的例子是描述于W092/19729、W098/20115、W098/20116和W098/34946中的變體，尤其是在一個或多個下列位置發(fā)生了替換的變體27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、194、206、218、222、224、235和274。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得蛋白酶包括Alcalase、Savinase、Primase,DuralaseTM、Esperase以及Kannase(NovoNordiskA/S)、MaxataseTM、Maxacal、Maxapem、Properase、Purafect、PurafectOxP、FNE和FN3(GenencorInternationalInc.)。脂肪酶:合適的脂肪酶包括細菌或真菌來源的脂肪酶?；瘜W修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內(nèi)。有用的脂肪酶的例子包括來自腐殖霉屬(〃咖icoh)(同義詞7Xer邁o邁yces)的脂肪酶例如EP258068和EP305216中描述的來自#J朋w《i/7osa(T.7朋wg7V30卯W的脂肪酶、或W096/13580中描述的來自〃iflso7朋s的脂肪酶，假單胞菌屬(/^etff/o邁朋as)脂肪酶例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(Aa7ca/>e"es)或類產(chǎn)堿假單胞菌(尸.psei/f/oa化ah^e/7es)(EP218272)、洋蔥假單胞菌(尸-)(EP331376)、司徒茨氏假單胞菌(尸.s^/teeri)(GB1,372,034)、熒光假單胞菌(尸./7uoresc朋s)、假單胞菌屬菌抹SD705(WO95/06720和WO96/27002)、尸.ir/sco/zw'fle/wys(WO96/12012)的脂肪酶，芽胞桿菌屬脂肪酶例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等(1993),BiochemicaetBiophysicaActa,1131,253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP64/744992)或短小芽孢桿菌(及/mw7zas)(W091/16422)的脂肪酶。其它例子包括例如描述于WO92/05249、WO94/01541、EP407225、EP260105、WO95/35381、WO96/00292、WO95/30744、WO94/25578、WO95/14783、WO95/22615、WO97/04079和WO97/07202中的脂肪酶變體。優(yōu)選的商業(yè)上可獲得脂肪酶包括Lipolase頂和LipolaseUltra(NovoNordiskA/S)。淀粉酶合適的(a和/或P)淀粉酶包括細菌或真菌來源的淀粉酶?；瘜W修飾的突變體或蛋白質工程突變體也包括在內(nèi)。淀粉酶包括，例如，從芽胞桿菌屬例如地衣芽孢桿菌的特定菌抹中獲得的a-淀粉酶，更詳細的描述在GB1,296,839中。有用淀粉酶的例子是描述于WO94/02597、W094/18314、WO96/23873和WO97/43424中的變體，尤其是在一個或多個下列位置發(fā)生了替換的變體15、23、105、106、124、128、133、154、156、181、188、190、197、202、208、209、243、264、304、305、391、408和444。商業(yè)上可獲得的淀粉酶是Dura邁ylTM、Termamyl、Fungamyl頂和BAN(NovoNordiskA/s)、Rapidase和Purastar(來自GenencorInterrmtionalInc丄纖維素酶:適合的纖維素酶包括細菌或真菌來源的纖維素酶?；瘜W修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內(nèi)。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐殖霉屬(H咖icola)、鐮孢霉屬(Fusari咖)、梭孢殼屬(Thielavia)、枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶，例如Humicolainsolens,Myceliophthorathermophila和尖錄孢(Fusari咖oxyspor咖)產(chǎn)生的真菌纖維素酶，這些酶公開于US4,435,307、US5，648,263、US5,691,178、US5,776，757和W089/09259。特別合適的纖維素酶是具有護色功能的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的例子是例如描述于EP0495257、EP0531372、W096/11262、WO96/29397、WO98/08940中的纖維素酶。其它例子是描述于WO94/07998、EP0531315、US5，457，046、US5,686，593、US5，763,254、WO95/24471、WO98/12307和PCT/DK98/00299中的纖維素酶變體。商業(yè)上可獲得的纖維素酶包括Celluzyme和Carezyme(NovoNordiskA/S)，Clazinase和PuradaxHATM(GenencorInternationalInc.),以及KAC—500(B)(Kao公司)。過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括植物，細菌或真菌來源的過氧化物酶/氧化酶?；瘜W修飾突變體或蛋白質工程突變體也包括在內(nèi)。有用的過氧化物酶的例子包括WO93/24618、WO95/10602和W098/15257中所描述的，來自鬼傘菌屬(O^r/z^s)的過氧化物酶例如來自(61d7erews)的過氧化物酶，及其變體。商業(yè)上可獲得的過氧化物酶包括Guardzyme頂(NovoNordiskA/S)?？梢酝ㄟ^加入含有一或多種酶的分開的添加劑，或通過加入含有所有這些酶的組合添加劑，將這些洗滌劑酶包含在洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑即分開的添加劑或組合添加劑，可以配制成例如顆粒、液體或漿液等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制品是顆粒，尤其是非起塵(non-dusting)顆粒，液體，尤其是穩(wěn)定的'液體，或漿液。非起塵顆?？梢园蠢鏤S4,106,991和4,661,452中所公開的方法生產(chǎn)，并且可以任選地通過本領域已知方法進行包被。蠟樣包被材料的例子是平均分子量為1000到20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)品(聚乙二醇，PEG);具有16到50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化壬基酚(ethoxylatednonylphenol);其中具有15到80個環(huán)氧乙烷單位并且醇含有12到20個碳原子的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的單、二和三甘油酯。適于通過流化床技術應用的薄膜形成包被材料見GB1483591。液體酶制品可以根據(jù)已有技術通過例如加入多元醇(例如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸來穩(wěn)定?？梢愿鶕?jù)EP238,216中公開的方法制備受保護的酶。本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便形式例如條形、片劑、粉劑、顆粒、糊劑或液體。液體洗滌劑可以是水性的，典型地含有高達70%的水和0-30%的有機溶劑，或是非水性的。該洗滌劑組合物含有一或多種表面活性劑，該表面活性劑可以是非離子包括半極性，和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑。這些表面活性劑典型地按重量計以0.1%到60%的水平存在。當包括在內(nèi)時，洗滌劑通常含有大約1%到大約4096的陰離子表面活性劑，例如直鏈烷基苯磺酸鹽、a-烯基磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯)、醇乙氧基硫酸鹽、仲烷基磺酸鹽、ot-磺基脂肪酸甲基酯，烷基-或烯基丁二酸或肥皂。當包括在內(nèi)時，洗滌劑通常含有大約0.2%到大約40%的非離子表面活性劑例如脂肪醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多葡糖苷、烷基二甲胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇胺、聚羥基烷基脂肪酸酰胺或氨基葡糖("葡糖酰胺")的N-酰基N-烷基衍生物。該洗滌劑可以含有0-65%的洗滌助劑或絡合劑例如沸石，二磷酸鹽，三磷酸鹽，膦酸酯，碳酸鹽，檸檬酸鹽，次氮基三乙酸，乙二胺四乙酸，二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基丁二酸、可溶性硅酸鹽或分層的珪酸鹽(例如來自Hoechst的SKS-6)。該洗滌劑可以包含一或多種聚合物。例子有羧甲基纖維素，聚(乙烯基吡咯烷酮)，聚(乙二醇)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡啶-N-氧化物)，聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯例如聚丙烯酸酯，馬來酸/丙烯酸共聚物和十二烷基異丁烯酸/丙烯酸共聚物。該洗滌劑可以含有漂白體系，該漂白體系可以包括&02來源物質例如過硼酸鹽或過碳酸鹽，這些物質又可以與形成過酸的漂白活化劑例如四乙酰乙二胺或壬酰羥笨磺酸鹽結合?；蛘?，該漂白體系可以含有例如酰胺、酰亞胺或砜類的過氧酸.本發(fā)明洗滌劑組合物中的酶可以通過使用常規(guī)穩(wěn)定劑來穩(wěn)定，例如多元醇例如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物例如芳香族硼酸酯、或笨基硼酸衍生物如4-甲?；炕鹚?，并且該組合物可以按例如WO92/19709和WO92/19708所述的方法配制。該洗滌劑還可以含有其它常規(guī)去污成分，例如織物調(diào)理劑，其包括粘土、發(fā)泡增效劑、泡沫抑制劑、抗腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污垢再沉積劑、染料、殺菌劑、光漂白劑、增溶劑、晦暗抑制劑或香料。目前我們正在考慮，在該洗滌劑組合物中加入任何酵，尤其是本發(fā)明的酶，加入量為每升洗滌液中加入相當于0.01-lOOmg的酶蛋白，優(yōu)選每升洗滌液中加入0.05-5mg的酶蛋白，尤其是每升洗滌液中加入0.l-lmg另外可以將本發(fā)明的酶加入WO97/07202中所公開的洗滌劑制品中，其中WO97/07202在此以參考文獻方式并入。在皮革工業(yè)中的應用本發(fā)明的枯草桿菌酶可以被應用于皮革工業(yè)，尤其是用于皮革脫毛.在所述應用中，優(yōu)選在另外含有其它蛋白酶的酶組合物中使用本發(fā)明枯草桿菌酶變體。對于其它適合的蛋白酶的更具體描述，參見有關用于洗滌劑組合物的合適酶的部分(見上文)。羊毛工業(yè)中的應用本發(fā)明的酶可以被應用于羊毛工業(yè)，尤其是用于含羊毛衣物的清洗中。在所述應用中，優(yōu)選在進一步含有其它蛋白酶的酶組合物中使用本發(fā)明枯草桿菌酶變體。對于其它適合的蛋白酶的更具體描述，參見有關用于洗滌劑組合物的合適酶的部分(見上文)。在下述實施例中對本發(fā)明進行了更為詳細的描述，這些實施例并不旨在以任何方式對本發(fā)明要求的范圍進行限制。材料和方法菌抹枯草芽孢桿菌DN1885(Diderichsen等，1990)。遲緩芽孢桿菌309和147是保藏在NCIB且編號為NCIB10309和10147的遲緩芽胞桿菌的特定菌抹，其描述于美國專利3,723,250,該文獻以參考文獻方式并入本文。大腸桿菌MC1000(M.J.Casadaban和SN.Cohen(1980);分子生物學雜志(J.Mol.Biol.)138179-207)通過常規(guī)方法被制備成r-、m+，其也描述于美國專利申請039，298.中。質粒pJS3:大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體，含有編碼枯草桿菌酶309的合成基因(由JacobSchi^dt等人描述于"蛋白質和肽通訊"(Protein肌dpeptideletters)3:39-44(1996)中)》pSX222:枯草芽孢桿菌表達載體(描述于WO96/34946中)。普通分子生物學方法除非另有說明，DNA操作和轉化采用分子生物學的標準方法來進行(Sambrook等(1989)分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel,F.M.等(編)〃現(xiàn)代分子生物學實驗指南〃.JohnWileyandSons,1995;Harwood,C.R.和Cutting,S.M.(編)"芽胞桿菌的分子生物學方法〃.JohnWileyandSons,1990).DNA操作用的酶依據(jù)供應商的說明書進行使用，DNA搡作用的酶除非另有說明，所有DNA處理用的酶例如限制性核酸內(nèi)切酶，連接酶等均從NewEnglandBiolabs公司獲得。蛋白水解活性在本發(fā)明的上下文中，蛋白水解活性以KiloNOVO蛋白酶單位(KNPU)表示。該活性的測定是相對于酶標準(SAVINASE)進行的，并且以標準條件下蛋白水解酵對二甲基酪蛋白的消化為基礎，所述標準條件是50X:、pH8.3、反應時間9分鐘、測量時間3min。文件AF220/1可從NovoNordiskA/S，丹麥索取獲得，此文件以參考文獻方式并入本文。GU是甘氨酸單位，定義為在標準條件下，40X:孵育15分鐘時，以N-乙酰酪蛋白作為底物產(chǎn)生相當于l,ole甘氨酸的順2基團量的蛋白水解酶活性。酶活性也可以采用PNA實驗，根據(jù)與可溶性底物琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酕-苯丙氨酰-對硝基酚的反應來測定，該方法描述于美國石油化T.M.，Goodlander，B.D.，Garrison,P.H.和Smith,LA.，(1988)。發(fā)酵用于生產(chǎn)枯草桿菌酶的發(fā)酵在含有100mlBPX培養(yǎng)基的500ml帶擋板的錐形瓶中于30"C在旋轉搖床(300r,p.m)上進行5天。因此為了制備例如2升細菌培養(yǎng)液，20個錐形瓶同時進行發(fā)酵。培養(yǎng)基BPX培養(yǎng)基成分(每升)馬鈴薯淀粉100g碾碎的大麥50g大豆粉20gNa2HP04x12H209gPluronic0-1g酪蛋白酸鈉10g該培養(yǎng)基中的淀粉用a-淀粉酶液化，并且該培養(yǎng)基通過120"C加熱45分鐘進行滅菌'滅菌后通過加入NaHC03至0.1M將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到9。實施例1酶變體的構建和表達定點誘變在活性位點環(huán)(b)中第95到96位之間含有特定插入的本發(fā)明枯草桿菌酶309定向位點變體可以通過DNA片段的傳統(tǒng)克隆方法制備(Sambrook等.，分子克隆，實驗室手冊，第二版.，冷泉港，1989),其中所述DNA片段是通過含有目的插入片段之寡核普酸的PCR擴增所產(chǎn)生的(見下文)。模板質粒DNA是pJS3，或其含有枯草桿菌酶309變體的類似物。通過寡核苷酸指導的誘變導入插入物以構建V95VX插入變異(X二第95和96位之間插入的任意氨基酸殘基)，產(chǎn)生V95VX枯草桿菌酶309變體。將該枯草桿菌酶309變體轉化到大腸桿菌中。通過限制性核酸內(nèi)切酶消化、DM片段的純化、連接以及枯草芽孢桿菌的轉化，將從這些大腸桿菌轉化體的過夜培養(yǎng)物中純化的DNA轉化到枯草芽孢桿菌中。枯草芽孢桿菌的轉化按Dubnau等，1971,分子生物學雜志.56，第209-221頁所述的方法進行。用于在確定區(qū)域插入隨機插入物的定域隨機誘變用于進行定域隨機誘變的整個策略是合成一個對應于插入位點兩側DNA序列的誘變引物(寡核苷酸)，其由定義該插入片段的DNA堿基對分隔開。隨后，所獲的誘變引物與合適的反向引物一起用于PCR反應。純化產(chǎn)生的PCR片段并在第二次PCR反應中延伸該片段，之后用核酸內(nèi)切酶進行消化并將所獲片段克隆至大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體中(見下文)?；蛘撸缬斜匾?，將產(chǎn)生的PCR片段作為引物和第二個合適的反向引物一起進行第二次PCR反應，使得該誘變區(qū)可以被消化并克隆至穿梭載體中。PCR反應在常規(guī)的條件下進行。通過此策略，在SAVINASE中構建了定域隨機文庫，其中插入片段被導入到活性位點環(huán)區(qū)的第95和96位之間。通過請變引物引入突變(見下文)，以致可以提供所有20種氨基酸(N二25%的A，T，C，和G;而S=50%C和G)。使用如下引物PCR擴增產(chǎn)生一段PCR片段5，CTAMTATTCGTGGTGGCGC3，(有義)和5，GACTTTAACAGCGTATAGCTCAGC3，(反義)，然后將一段重疊序列與該PCR片段組合并通過另一輪PCR，使上文誘變引物產(chǎn)生的PCR片段向Savinase的N端延伸。將延伸的DNA片段克隆到修飾質粒pJS3(見上文)的HindIII和MluI位點，并對十個隨機選擇的大腸桿菌菌落測序以證實所設計的突變。誘變引物(5，GCTGAGCTATACGCTGTTAAAGTCNNSCTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTC3，(正義))與位于pJS3的MluI位點下游的合適反向反義引物(例如5，-CCCTTTAACCGCACAGCGTTT-3，(反義)一起用于PCR反應，質粒pJS3作為模板。通過使用限制酶HindIII和Mlul將該獲得的PCR產(chǎn)物克隆到pJS3穿梭載體中。通過熟知技術將該隨機文庫轉化到大腸桿菌中。制備的文庫含有大約100，000個獨立克隆/文庫。對隨機選擇的IO個菌落進行測序以證實所設計的突變。為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，用含有本發(fā)明變體的枯草芽孢桿菌pJS3表達質粒轉化感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌抹，并按上述方法在含有10pg/ml氯霉素(CAM)的培養(yǎng)基中進行發(fā)酵。實施例2酶變體的純化本方法涉及用于在芽孢桿菌宿主細胞中生產(chǎn)本發(fā)明枯草桿菌酶的2升級發(fā)酵的純化。大約1.6升的發(fā)酵培養(yǎng)液在1升的離心杯中5000rp姐離心35分鐘。上清液用109b醋酸調(diào)節(jié)pH至6.5并用SeitzSupraS100過濾板過濾。濾出液使用配有AmiconS1Y10UF柱體的AmiconCH2AUF裝置濃縮到大約400ml。離心和過濾UF濃縮液，之后室溫下在pH7的桿菌肽(Bacitracin)親和柱上進行吸附。使用含有25%2-丙醇、1M氯化鈉和0.01二甲基戊二酸、0.1M硼酸和0.002M氯化鈣(調(diào)節(jié)pH至7)的緩沖液，室溫下從該桿菌肽柱中洗脫該蛋白酶。將來自桿菌肽純化步驟的具有蛋白酵活性的組分合并，并施加至經(jīng)如下緩沖液平衡的750mlSephadexG25柱中(5cm直徑)，該緩沖液含有O.Ol二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣，調(diào)節(jié)pH至6.5。合并來自S印hadexG25柱的具有蛋白水解活性的組分，并施加至經(jīng)如下緩沖液平衡的150mlCMS印haroseCL6B陽離子交換柱中(5cm直徑)，該緩沖液含有0.01二甲基戊二酸、0.2M硼酸和0.002M氯化鈣，調(diào)節(jié)pH至6.5。使用具有0-0.1M氯化鈉線性梯度的2升相同緩沖液(對于枯草桿菌蛋白酶147為0-0.2M氯化鈉)洗脫該蛋白酶。在最后的純化步驟中，合并含有蛋白酶的來自CMS印harose柱的組分，并在配有GR81PP膜的Amicon超濾小室(來自DanishSugarFactories公司)中濃縮。通過使用實施例1中的構建和發(fā)酵技術，以及上述的分離操作，我們生產(chǎn)和分離了下列枯草桿菌蛋白酶309變體V95VTV95VSV95VDV95VEV95VPV95VGV95VHV95VIV95VT+Y167A這些變體在初步測試中顯示出比Savinase更好的洗滌性能。實施例3含有酶變體的洗滌劑組合物的洗滌性能下面的實施例提供了在所顯示條件下進行的許多洗滌測試的結果。頁小型洗滌(MINIWASH)洗滌條件<table>tableseeoriginaldocumentpage43</column></row><table>洗滌劑所用洗滌劑分別從丹麥(OMO，目錄ED-9745105)和美國(Wisk，目錄ED-9711893)的超市獲得。使用前，通過微波處理使洗滌劑中的所有酶失活。布樣所用布樣是從EMPATestmaterialen,Movenstrasse12，CH-9015St.Gall,瑞士獲得的EMPA116和EMPA117。反射率測試材料的反射率(R)測量是使用MacbethColorEye7000光度計在460nm下進行的。該測量依據(jù)廠商說明書M行。評價對枯草桿菌酶洗滌性能的評價由所研究的枯草桿菌酶的改進因子或性能因子決定。改進因子，IF刑量/反應，定義為當枯草桿菌酶濃度趨于零時，含有所研究枯草桿菌酶的洗滌劑的洗滌性能曲線和含有參照枯草桿菌酶的相同洗滌劑的洗滌性能曲線的斜率的比值。IF劑量/反應=a/a參照洗滌性能根據(jù)通過式I計算a'ARmax'c"、，R-R0+^-^-(工)'其中R是以反射率單位表示的洗滌性能；R。是擬合曲線與y-軸的截距(空白)；a是當c-0時擬合曲線的斜率；c是酶的濃度；ARmax是當c—時的理論最大洗滌效果。性能因子P是通過式II計算的R變體—R空白'PRsavinaseR空白(II)其中R變體是用10nM變體洗滌的測試材料的反射率；Rsavinase是用10nMSavinase洗滌的測試材料的反射率；R空白是未用酶洗滌的測試材料的反射率，US(洗滌劑USWisk,布樣EMPA117)<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>因此，觀察到本發(fā)明的枯草桿菌酶與5&7111&86@相比顯示出改進的洗滌能力。序列表<110>NovoNordiskA/S在活性位點環(huán)區(qū)具有額外氨基酸殘基的I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酷<130>5792.204<140><141><160>2<170>PatentlnVer.2,1<210>1<211>275<212>PRT<213>地農(nóng)芽孢桿菌(BacillusLicheniformis)<400>1AlaGinThrValProTyrGlylieProLeulieLysAlaAspLysVal151015GinAlaGinGlyPheLysGlyAlaAsnValLysValAlaValLeuAsp202530ThrGlylieGinAlaSerHisProAspLeuAsnValValGlyGlyAla354045SerPheValAlaGlyGluTyrAsnThrAspGlyAsnGlyHisGly505560ThrHisValAlaGlyThrValAlaAlaLeuAspAsnThrThrGlyVal65707580LeuGlyValAlaProSerValSerLeuTyrAlaValLysValXaaLeu859095AsnSerSerGlySerGlyThrTyrSerGlylieValSerGlylieGlu100105110TrpAlaThrThrAsnGlyMetAspVallieAsnMetSerLeuGlyGly115120125ProSerGlySerThrAlaMetLysGinAlaValAspAsnAlaTyrAla130135140ArgGlyValValValValAlaAlaAlaGlyAsnSerGlySerSerGly14515015S160AsnThrAsnThrlieGlyTyrProAlaLysTyrAspSerVallieAla165170175ValGlyAlaValAspSerAsnSerAsnArgAlaSerPheSerSerVal180185190GlyAlaGluLeuGluValMetAlaProGlyAlaGlyValTyrSerThr1195200205TyrProThrSerThrTyrAlaThrLeuAsnGlyThrSerMetAlaSer210215220ProHisValAlaGlyAlaAlaAlaLeulieLeuSerLysHisProAsn225230235240LeviSerAlaSerGinValArgAsnArgLeuSerSerThrAlaThrTyr245250255LeuGlySerSerPheTyrTyrGlyLysGlyLeulieAsnValGluAla260265270AJLaAlaGin275<210>2<211>270<212>PRT<213>達緩芽孢桿菌<400>2AlaGinSerValProTrpGlylieSerArgValGinAlaProAlaAla51015HisAsnArgGlyLeuThrGlySerGlyValLysValAlaValLeuAsp202530ThrGlylieSerThrHisProAspLeuAsnlieArgGlyGlyAlaSer354045PheValProGlyGluProSerThrGinAspGlyAsn<3lyHisGlyThr505560HisValAlaGlyThrlieAlaAlaLeuAsnAsnSerlieGlyValLeu65707580GlyValAlaProSei:AlaGluLeuTyrAlaValLysValXaaLeuGly859095AlaSerGlySerGlySerValSerSerlieAlaGinGlyLeuGluTrp100105110AlaGlyAsnAsnGlyMetHisValAlaAsnLeuSerLeuGlySerPro115120125SerProSerAlaThrLeuGluGinAlaValAsnSerAlaThrSerArg130135140GlyValLeuValValAlaAlaSerGlyAsnSerGlyAlaGlySerlie145150155160SerTyrProAlaArgTyrAlaAsnAlaMetAlaValGlyAlaThrAsp165170175GinAsnAsnAsnArgAlaSerPheSerGinTyrGlyAlaGlyLeuAsp180185190lieValAlaProGlyValAsnValGinSerThrTyrProGlySerThr195200205TyrAlaSerLeuAsnGlyThrSerMetAlaThrProHisValAlaGly210215220AlaAlaAlaLeuValLysGinLysAsnProSerTrpSerAsnValGin22S230235240lieArgAsnHisLeuLysAsnThrAlaThrSerLeuGlySerThrAsn245250255LeuTyrGlySerGlyLeuValAsnAlaGluAlaAlaThrArg260265270權利要求1.I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶，其在第95-103位的活性位點環(huán)(b)區(qū)中的95位具有至少一個額外的氨基酸殘基，由此所述額外氨基酸殘基相應于在第95和96位之間至少一個氨基酸殘基的插入。2.權利要求1的分離的枯草桿菌酶，其中所述枯草桿菌酶是在前體枯草桿菌酶的第95和96位之間具有至少一個插入的氨基酸的構建的變體。3.權利要求1或2的分離的枯草桿菌酶，其選自X95X(A，T，G，S}，X95X(D,E,K，R}，X95X{H，V，C，N，Qh和X95X(F，I，L，M,P，W，Y}。4.權利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個額外或插入的氨基酸殘基選自T,G，A和S。5.權利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個額外或插入的氨基酸殘基選自帶電荷的氨基酸殘基D、E、H、K和R更優(yōu)逸D、E、K和R。6.權利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個額外或插入的氨基酸殘基選自親水性氨基酸殘基C、N、Q、S和T，更優(yōu)選N、Q、S和T。7.權利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個額外或插入的氨基酸殘基選自小的疏水性分子氨基酸殘基A、G和V。8.權利要求3的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個額外或插入的氨基酸殘基選自大的疏水性分子氨基酸殘基F、I、L、M、P、W和Y，更優(yōu)選F、I、L、M和Y。9.根據(jù)前述權利要求之任意一項的分離的枯草桿菌酶，其中所述至少一個額外或插入的氨基酸殘基包含在活性位點環(huán)(b)中的一個以上的額外或插入氨基酸殘基。10.前述權利要求之任意一項的枯草桿菌酶變體，其中所述第95和96位之間的插入與在任意其它位置的一個或多個進一步《務飾相結合。11.權利要求15的枯草桿菌酶變體，其中所述進一步修飾位于以下的一個或多個位置27、36、57、76、87、97、101、104、120、123、167、170、206、218、222、224、235和274。12.前述權利要求之任意一項的枯草桿菌酶變體，其中所述#"飾與下列一個或多個位置的《務飾相結合129、131、133和194。13.前述權利要求之任意一項的枯草桿菌酶，其中該枯草桿菌酶，或如果該枯草桿菌酶是變體，則親本枯草桿菌酶，屬于I-S1亞族。14.權利要求13的枯草桿菌酶，其中該親本枯草桿菌酶選自ABSS168、BASBPN、BSSDY和BLSCAR,或它們的保留了I-S1亞族特性的功能性變體。15.根據(jù)權利要求l-14之任意一項的枯草桿菌酶，其中該枯草桿菌酶，或如果該枯草桿菌酶是變體，則親本枯草桿菌酶，屬于I-S2亞族。16.權利要求15的枯草桿菌酶，其中該親本枯草桿菌酶選自BLS147、BLS309、BAPB92、TVTHER和BYSYAB，或它們的保留了I-S2亞族特性的功能性變體。17.權利要求3、15或16的分離的枯草桿菌酶，其選自V95VA，V95VT，V95VG,V95VS，V95VD，V95VE，V95VK,V95VR，V95VH，V95W,V95VC，V95VN，V95VQ，V95VF，V95VI，V95VL,V95VM,V95VP,V95W，和V95VY。18.權利要求15-17之任意一項的枯草桿菌酶變體，其中所述進一步修飾選自K27R、*36D、S57P、N76D、S87N、G97N、S101G、V104A、V104N、V104Y、H120D、N123S、Y167X、R170X、Q206E、N218S、M222S、M222A、T224S、K235L和T274A。19.權利要求15-17之任意一項的枯草桿菌酶變體，其中所迷進一步修飾選自S101G+V104N、S87N+S101G+V104N、K27R+V104Y+N123S+T274A、N76D+S103A+V104I或N76D+V104A，或這些突變(V104N、S101G、K27R、V104Y、N123S、T274A、N76D、V104A)的其它組合，其與權利要求1-14之任意一項中提及的任意一個或多個替代、缺失和/或插入相組合。20.權利要求15-17之任意一項的枯草桿菌酶變體，其中所述進一步修飾還選自P129K、P131H、A133P、A133D和A194P。21.根據(jù)前述權利要求之任意一項的變體，其含有選自以下組的修飾V95VT+Y167A。22.屬于I-S1亞族的具有下列氨基酸序列的枯草桿菌酶1<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table>或具有包含第95a位氨基酸殘基并顯示與上述序列相比有大于70%、75%、80%、85%、90%或95%—致性的氨基酸序列的同源枯草桿菌酶。23.屬于1-S2亞族的具有下列氨基酸序列的枯草桿菌酶1102030.A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-405060丄-D-T-G-I-*-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-*-S-T-Q-D-.708090.G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-1-G-V-L-G-V-A-P-S-A-E-L-.95a110120Y-A-V-K-V-X-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-，130140150.V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-.160170180.A-A-S-G-N-S-G-A-*-G-S-I-S-*-*-*-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-.190200210.D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L醫(yī)D-I-V-A_P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-，.-220230240G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-.250260270.W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-.275.E-A-A-T-R或具有包含第95a位氨基酸殘基并顯示與上述序列相比有大于70%、75%、80%、85%、90%或95%—致性的氨基酸序列的同源枯草桿菌酶.24.權利要求22或23的枯草桿菌酶變體，其中第95a位的X選自T、A、G、S和P。25.編碼權利要求1-24之任意一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的分離的DNA序列。26.含有權利要求25的分離DNA序列的表達載體。27.轉化了權利要求26的表達載體的微生物宿主細胞。28.權利要求27的微生物宿主，其是細菌，優(yōu)選芽孢桿菌屬細菌，特別是遲緩芽孢桿菌。29.權利要求27的微生物宿主，其是真菌或酵母，優(yōu)選絲狀真菌，特別是曲霉屬。30.制備權利要求1-24之任意一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的方法，其中在利于所述變體表達和分泌的條件下培養(yǎng)權利要求27-29之任意一項的宿主，并回收該變體。31.含有權利要求1-24之任意一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體的組合物。32.根據(jù)權利要求31的組合物，其還含有纖維素酶、脂肪酶、角質酶、氧化還原酶、別的蛋白酶、或淀粉酶。33.根據(jù)權利要求31或32的組合物，其中該組合物是洗滌劑組合物。34.根據(jù)權利要求1-24之任意一項的枯草桿菌酶或枯草桿菌酶變體或者根據(jù)權利要求31或32的酶組合物在洗衣和/或洗碟洗滌劑中的應用。全文摘要本發(fā)明涉及在第95-103位的活性位點(b)環(huán)內(nèi)的95位含有額外氨基酸殘基的I-S1和I-S2亞族枯草桿菌酶。與其親本酶相比，枯草桿菌酶變體在洗滌劑中顯示改良的洗滌性能。文檔編號C12N15/09GK101294152SQ200810087660公開日2008年10月29日申請日期1999年12月20日優(yōu)先權日1998年12月18日發(fā)明者C·安德森,F·米凱爾森,K·安德森維爾博,M·諾里加德-馬德森,P·漢森坎普申請人:諾沃奇梅茲有限公司