專利名稱：產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌及其構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌及其構(gòu)建和應(yīng)用。所得到的功 能性工程乳酸菌菌株可用于生產(chǎn)類黃酮物質(zhì)，而且該菌株在食品業(yè)具有巨大的潛在市場(chǎng)、 經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。
背景技術(shù)：
類黃酮(Flavonoids)是一組廣泛存在于植物中的多酚類物質(zhì)，屬于次級(jí)代謝產(chǎn) 物，是存在于植物的葉、花、果中的天然色素，因多呈黃色而被稱為類黃酮。類黃酮物質(zhì)由于 其重要的生理功能，尤其是清除自由基及抗癌防癌等作用，而在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域具有廣闊 的應(yīng)用前景。然而，類黃酮在植物中的含量很低，其提取成本高，得率低；利用化學(xué)方法人 工合成的類黃酮是兩種異構(gòu)體的混合物，然而只有(2S)-類黃酮才具有生物活性；通過(guò)植 物細(xì)胞培養(yǎng)或植物基因工程合成類黃酮也受產(chǎn)量低、成本高、不易大規(guī)模培養(yǎng)等限制。近年 來(lái)，利用微生物發(fā)酵的方法合成類黃酮化合物迅速興起。微生物生長(zhǎng)快、易培養(yǎng)，基因工程 技術(shù)的便捷有效等等都是無(wú)與倫比的優(yōu)勢(shì)。在微生物中構(gòu)建類黃酮生物合成途徑并進(jìn)行發(fā) 酵，有望實(shí)現(xiàn)類黃酮的大規(guī)模、工業(yè)化生產(chǎn)。目前構(gòu)建類黃酮生物合成途徑的主要宿主是大 腸桿菌和釀酒酵母，而乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)作為一種生物發(fā)酵細(xì)菌，也是一種 重要的益生菌(Probiotics)，其生物技術(shù)修飾是未來(lái)研究的重點(diǎn)之一，通過(guò)基因工程改造 可以賦予乳酸菌更多的生理功能。將植物類黃酮合成途徑關(guān)鍵基因重組到乳酸菌中，構(gòu)建類黃酮合成的基因工 程乳酸菌，把類黃酮的生理功能特性和乳酸菌的益生功效結(jié)合起來(lái)，促進(jìn)乳酸菌在功 能性食品研究和開發(fā)中的應(yīng)用。植物類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶主要包括苯丙氨酸解氨 酶(Phenylalanine aminolyase, PAL)、4_ 香豆酸-輔酶 A 連接酶(p-coumarinic acid CoA ligase，4CL)、查耳酮合成酶(Chalcone synthetase, CHS)、查耳酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)等，國(guó)外學(xué)者一般將來(lái)源于微生物的PAL和4CL基因，來(lái)源于植物CHS和 CHI基因通過(guò)合適的酶切位點(diǎn)連接成多順反子結(jié)構(gòu)，通過(guò)載體構(gòu)建組裝到大腸桿菌、釀酒酵 母以及委內(nèi)瑞拉鏈霉菌等微生物中。尚未見將完全來(lái)源于植物的類黃酮合成途徑關(guān)鍵酶基 因重組到乳酸菌中的報(bào)道。乳酸菌作為一種重要的益生菌，其基因工程改造可以賦予乳酸 菌更多的生理功能。本發(fā)明所得到的基因工程乳酸菌可以攜帶類黃酮功能因子，其制品復(fù) 合了類黃酮功能因子和乳酸菌本生的益生功效，增強(qiáng)乳酸菌的利用價(jià)值。本發(fā)明的乳酸菌 給食品工業(yè)和乳品工業(yè)提供全新的功能菌株，拓寬功能食品因子的攝取渠道。本產(chǎn)品的主 要受益人群是老人、癌癥易發(fā)人群、高血壓高血脂人群等。產(chǎn)品形式為強(qiáng)化活性菌株、強(qiáng)化 酸乳和發(fā)酵乳制品，以及純化的生物合成大豆異黃酮純品。在食品業(yè)具有巨大的潛在市場(chǎng)、 經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌。所得到的功
4能性工程乳酸菌菌株可用于生產(chǎn)類黃酮物質(zhì)，此外，乳酸菌(Lactic Acid Bacteria)也是 一種重要的益生菌(Probiotics)，通過(guò)基因工程改造的工程乳酸菌具有更多的生理功能。本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供上述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌的構(gòu) 建方法。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供上述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌的應(yīng)用。本發(fā)明所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌，是將來(lái)源于植物的合成類黃 酮相關(guān)酶的編碼基因?qū)氲饺樗峋卸@得的重組菌，所述合成類黃酮相關(guān)酶為苯丙氨酸 轉(zhuǎn)氨酶(Phenylalanine aminolyase, PAL)、4_ 香豆酸輔酶 A 連接酶(p-coumarinic acid CoA ligase，4CL)、查耳酮合成酶(Chalcone synthetase,CHS)和查耳酮異構(gòu)酶(Chalcone isomerase, CHI)。所述工程乳酸菌的原始乳酸菌株為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus Iactis subsp. Cremoris)MG1363。所述合成類黃酮相關(guān)酶的編碼基因組成多順反子，四種結(jié)構(gòu)基因的順序?yàn)?PAL-4CL-CHS-CHI。攜帶合成類黃酮相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)載體為pMG26e。所述苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因如SEQ ID No. 1所示；所述4_香豆酸輔酶A連接 酶的編碼基因如SEQ ID No. 2所示；所述查耳酮合成酶的編碼基因如SEQ ID No. 3所示；所 述查耳酮異構(gòu)酶的編碼基因如SEQ ID No. 4所示。所述工程乳酸菌優(yōu)選為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. CremoriS)MG1363-4GS，已于2010年8月17日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心，其菌種保藏編號(hào)為CGMCC No. 4086。其基本形態(tài)為球狀，菌落呈乳白色，表面濕 潤(rùn)。該菌株可利用MRS或M17培養(yǎng)基培養(yǎng)，pH為6. 8-7. 0，生長(zhǎng)溫度為30°C -37°C。上述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌的構(gòu)建方法，以預(yù)處理的大豆幼葉為 材料，通過(guò)RT-PCR方法獲得目標(biāo)基因PAL、4CL、CHS和CHI，再通過(guò)合適的酶切位點(diǎn)將目標(biāo) 基因有序地連接成多順反子結(jié)構(gòu)，整合到乳酸菌表達(dá)載體上，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化方法將重組質(zhì) 粒載體導(dǎo)入到乳酸菌受體細(xì)胞，得到本發(fā)明的工程乳酸菌。具體包括如下操作步驟(1)以紫外線誘導(dǎo)過(guò)的大豆幼葉為原料提取總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn) 錄成cDNA文庫(kù)；(2)根據(jù)GeneBank公布的大豆苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮 合成酶和查耳酮異構(gòu)酶的編碼基因序列分別設(shè)計(jì)特異引物，再以大豆的cDNA文庫(kù)為模板， 采用PCR方法分別擴(kuò)增大豆的苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮合成酶和查 耳酮異構(gòu)酶的編碼基因；(3)用SacI和HindIII雙酶切表達(dá)載體pMG36e，然后將酶切產(chǎn)物與如SEQID No. 5 所示核苷酸序列在T4連接酶的作用下相連接，連接產(chǎn)物稱為表達(dá)載體pMG26e ；SEQ ID No. 5如下，5’和3’端為粘性末端CaatcRatactRCaRRCRRCCRCtctaRaRtcRacRcatRCRRatcctCRaRaCRCRtatcRaRttaRctatRacRtccRCCRRCRaRatctcaRctRCRtacRcctaRRaRctctRCRcattcRaSac I Cla INot I Xba IXho IHind III
5
(4)采用限制性內(nèi)切酶切割表達(dá)載體pMG26e以及步驟(2)擴(kuò)增得到的苯丙氨酸轉(zhuǎn) 氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮合成酶和查耳酮異構(gòu)酶的編碼基因，然后將四種目的 基因插入到表達(dá)載體pMG26e中，從而得到重組載體pMG26e-4GS ；(5)利用電擊轉(zhuǎn)化方法將重組載體pMG26e_4GS導(dǎo)入到受體細(xì)胞乳酸乳球菌乳脂 亞種(Lactococcus lactis subsp. Cremoris)MG1363中，將重組菌置于高滲培養(yǎng)基中復(fù)蘇 培養(yǎng)2h后均勻涂布于紅霉素抗性的MRS平板上，37°C培養(yǎng)2-3天，然后通過(guò)菌落PCR和提 取質(zhì)粒的方法篩選和鑒定重組菌株，從而得到產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌；所 述高滲培養(yǎng)基為含有0. 3M蔗糖和0. I^gCl2的MRS培養(yǎng)基。所述大豆幼葉的預(yù)處理為在紫外照射下間歇生長(zhǎng)一周。步驟(2)中用于擴(kuò)增編碼苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的上下游引物的核苷酸序列分別 如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；用于擴(kuò)增編碼4-香豆酸輔酶A連接酶基因的上下游 引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；用于擴(kuò)增編碼查耳酮合成酶 基因的上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ IDNo. 10和SEQ ID No. 11所示；用于擴(kuò)增編 碼查耳酮異構(gòu)酶基因的上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13所
7J\ ο步驟(4)中編碼合成類黃酮相關(guān)酶的四種目的基因插入到表達(dá)載體pMG26e上的 具體方法如下(a)用BamHI和XhoI雙酶切重組載體pMD19_CHS和pMD19_CHI，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩 選和酶切鑒定得到重組載體pMD 19-CHS-CHI ；用BamHI和NotI雙酶切重組載體pMD19_PAL 和pMD19-4CL，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定得到重組載體pMD19-PAL-4CL ；(b)用XbaI和XhoI雙酶切重組載體pMD19-CHS_CHI和表達(dá)載體pMG26e，經(jīng)連接、 轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定得到重組載體pMG26e-CHS-CHI ；(c)用 ClaI 和 NotI 雙酶切重組載體pMD19_PAL_4CL和重組載體 pMG26e-CHS_CHI， 經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定得到重組載體pMG26e-4GS。上述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌在生產(chǎn)類黃酮上的應(yīng)用。該重組菌能 夠以苯丙氨酸、酪氨酸等為底物發(fā)酵合成柚皮素、甘草素、松屬素等類黃酮物質(zhì)。具體發(fā)酵 方法為將工程乳酸菌按Iwt %的接種量接種于50mlMRS液體培養(yǎng)基(含5 μ g/ml紅霉素) 中，然后向培養(yǎng)基中添加苯丙氨酸和/或酪氨酸，使其終濃度為500mg/L，37°C生長(zhǎng)48h， 離心取培養(yǎng)基上清，以等體積乙酸乙酯萃取，取有機(jī)相，以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥，殘留物溶解于 2. Oml無(wú)水甲醇，所得到的即為類黃酮粗品溶液。柚皮素、甘草素和松屬素的結(jié)構(gòu)如下柚皮素(Naringenin)的化學(xué)名稱為4'，5，7_三羥基黃酮；英文名4 ‘，5， 7-Trihydroxyflavanone,別名4, 5, 7-TrihydroxyfIavone ；Naringenin ；分子式C15H1205, 分子量272. 25 ；CAS號(hào):480_41_1，其結(jié)構(gòu)式為
權(quán)利要求
產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌，是將來(lái)源于植物的合成類黃酮相關(guān)酶的編碼基因?qū)氲饺樗峋卸@得的重組菌，所述合成類黃酮相關(guān)酶為苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、4 香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮合成酶和查耳酮異構(gòu)酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌，其特征在于，所述工 程乳酸菌的原始乳酸菌株為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. Cremoris) MG1363。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述重組植物類黃酮合成酶編碼基因的工程乳酸菌，其特征在于， 所述合成類黃酮相關(guān)酶的編碼基因組成多順反子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌，其特征在于，攜帶合 成類黃酮相關(guān)酶編碼基因的表達(dá)載體為pMG26e。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌，其特征在于，所述苯 丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的編碼基因如SEQ ID No. 1所示；所述4-香豆酸輔酶A連接酶的編碼基因如 SEQ ID No. 2所示；所述查耳酮合成酶的編碼基因如SEQ IDNo. 3所示；所述查耳酮異構(gòu)酶 的編碼基因如SEQ ID No. 4所示。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌，其特征在于，所述工 程乳酸菌為乳酸乳球菌乳脂亞種(Lactococcus lactis subsp. Cremoris)MG1363-4GS，其 保藏編號(hào)為CGMCC No. 4086。
7.權(quán)利要求1所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌的構(gòu)建方法，其特征在于， 包括如下操作步驟(1)以紫外線誘導(dǎo)過(guò)的大豆幼芽為原料提取總RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶將其反轉(zhuǎn)錄成 cDNA文庫(kù)；(2)根據(jù)GeneBank公布的大豆苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮合成 酶和查耳酮異構(gòu)酶的編碼基因序列分別設(shè)計(jì)特異引物，再以大豆的cDNA文庫(kù)為模板，采用 PCR方法分別擴(kuò)增大豆的苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮合成酶和查耳酮 異構(gòu)酶的編碼基因；(3)用SacI和HindIII雙酶切表達(dá)載體pMG36e，然后將酶切產(chǎn)物與如SEQIDNo. 5所 示核苷酸序列在T4連接酶的作用下相連接，連接產(chǎn)物稱為表達(dá)載體pMG26e ；(4)采用限制性內(nèi)切酶切割表達(dá)載體pMG26e以及步驟(2)擴(kuò)增得到的苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨 酶、4-香豆酸輔酶A連接酶、查耳酮合成酶和查耳酮異構(gòu)酶的編碼基因，然后將四種目的基 因插入到表達(dá)載體pMG26e中，從而得到重組載體pMG26e-4GS ；(5)利用電擊轉(zhuǎn)化方法將重組載體pMG26e-4GS導(dǎo)入到受體細(xì)胞乳酸乳球菌乳脂亞種 (Lactococcus lactis subsp. Cremoris)MG1363中，將重組菌置于高滲培養(yǎng)基中復(fù)蘇培養(yǎng) 2h后均勻涂布于紅霉素抗性的MRS平板上，37°C培養(yǎng)2-3天，然后通過(guò)菌落PCR和提取質(zhì)粒 的方法篩選和鑒定重組菌株，從而得到產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌；所述高滲 培養(yǎng)基為含有0. 3M蔗糖和0. I^gCl2的MRS培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌的構(gòu)建方法，其特征在 于，步驟(2)中用于擴(kuò)增編碼苯丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因的上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 6和SEQ ID No. 7所示；用于擴(kuò)增編碼4-香豆酸輔酶A連接酶基因的上下游引物的 核苷酸序列分別如SEQ ID No. 8和SEQ ID No. 9所示；用于擴(kuò)增編碼查耳酮合成酶基因的上下游引物的核苷酸序列分別如SEQID No. 10和SEQ ID No. 11所示；用于擴(kuò)增編碼查耳酮 異構(gòu)酶基因的上下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID No. 12和SEQ ID No. 13所示。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌的構(gòu)建方法，其特征在 于，步驟(4)中編碼合成類黃酮相關(guān)酶的四種目的基因插入到表達(dá)載體pMG26e上的具體方 法如下(a)用BamHI和XhoI雙酶切重組載體pMD19_CHS和pMD19_CHI，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選和 酶切鑒定得到重組載體PMD19-CHS-CHI ；用BamHI和NotI雙酶切重組載體pMD19_PAL和 PMD19-4CL，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定得到重組載體pMD19-PAL-4CL ；(b)用XbaI和XhoI雙酶切重組載體pMD19-CHS-CHI和表達(dá)載體pMG26e，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、 篩選和酶切鑒定得到重組載體pMG26e-CHS-CHI ；(c)用ClaI和NotI雙酶切重組載體pMD19-PAL-4CL和重組載體pMG26e-CHS_CHI，經(jīng) 連接、轉(zhuǎn)化、篩選和酶切鑒定得到重組載體pMG26e-4GS。
10.權(quán)利要求1-6任一所述產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌在生產(chǎn)類黃酮中的 應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于基因工程改造乳酸菌領(lǐng)域的產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的工程乳酸菌及其構(gòu)建和應(yīng)用。該工程乳酸菌是將完全來(lái)自于我國(guó)本土栽培大豆(Glycine max(L.)Merr.)的類黃酮合成途徑相關(guān)酶基因PAL、4CL、CHS和CHI連接成多順反子結(jié)構(gòu)PAL-4CL-CHS-CHI，構(gòu)建到經(jīng)改造的乳酸菌表達(dá)載體pMG26e上，形成重組載體pMG26e-4GS，再將pMG26e-4GS電擊轉(zhuǎn)化到乳酸菌中，得到產(chǎn)植物類黃酮合成相關(guān)酶的基因工程乳酸菌。該重組菌保藏號(hào)為CGMCC No.4086，較原始乳酸菌具有更加豐富的生理功能，可直接應(yīng)用于食品領(lǐng)域，本發(fā)明所得到的重組菌株經(jīng)發(fā)酵，類黃酮產(chǎn)量在mg/l水平，高于同類重組大腸桿菌和重組酵母菌發(fā)酵的水平。
文檔編號(hào)C12N15/63GK101948794SQ20101027299
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月6日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月6日
發(fā)明者盧曉明, 左芳雷, 李平蘭, 趙建云, 鄭超, 郝彥玲, 陳尚武, 馬會(huì)勤 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)