專利名稱：一種靶向抗神經膠質瘤蛋白及制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物技術領域，本發(fā)明涉及一種靶向抗神經膠質瘤蛋白(Acp-W2)，同時 還涉及靶向抗神經膠質瘤蛋白(Acp-W2)的制備方法，還涉及基因工程蛋白Acp-W2的用 途，基因工程生產的靶向抗神經膠質瘤蛋白在動物模型水平上能高效抑制神經膠質瘤的 增殖和轉移，具有開發(fā)成抗神經膠質瘤藥物的應用價值。
背景技術：
腦神經膠質瘤是中樞神經系統最常見的腫瘤，其發(fā)生率約占全部顱內腫瘤的40%， 患者平均存活時間為一年。目前所有治療措施(如手術切除、化學治療、放射治療和 免疫治療等)的療效和應用潛力都極為有限。針對這一嚴峻現狀，迫切需要研究和開發(fā) 一種有效的治療神經膠質瘤的藥物。1995年，Ullrich發(fā)現人腦神經膠質瘤細胞表達一種獨特的電壓依賴的氯電流，而 這種電流可以被來源于蝎毒液的氯毒素Chlorotoxin有效抑制，從而有效地降低瘤細胞 增殖速度和腫瘤細胞的轉移。隨后，在動物模型上進一步證實Chlorotoxin可選擇性抑 制神經膠質瘤。因此，篩選神經膠質瘤細胞所特有的氯離子通道的抑制劑可發(fā)展成為抗 神經膠質瘤的選擇性靶向新藥?，F代科學研究表明，蝎毒的成分具有多種生理、藥理活性，對抗腫瘤、治療風濕、 抗癲癇以及心血管疾病有重要治療作用。但是其成分相當復雜，而且成分的結構和物理 化學性質相似，難以分離，許多成分所起的作用甚至相反，而且有效成分往往含量低， 這些無疑都限制了蝎毒的研究和應用。特別是蝎毒氯毒素Chlorotoxin只有36氨基酸 的小肽，東亞鉗蝎蝎毒氯毒素BmKCT也是一個由35氨基酸組成的多肽。因此，氯毒素 在蝎毒中的含量非常低，從蝎毒混合物分離和純化氯毒素的產量低和成本昂貴，這嚴重 限制了蝎毒氯毒素抗神經膠質瘤藥物的研發(fā)工作。盡管采用基因工程技術可以生產大量 的蛋白質，然而蝎毒氯毒素僅由幾十個氨基酸(小余40aa)組成，是一個很小的蛋白 質多肽，如果采用基因工程的辦法生產重組蝎毒氯毒素，那么氯毒素在受體表達菌中易于被蛋白酶降解，而且這么小蛋白的表達量不高和后期純化困難。因此，通過人工改造 蝎毒氯毒素，使氯毒素與其它標簽融合，形成一個較大有生物活性的融合蛋白成為了高 效開發(fā)蝎毒氯毒素靶向抗神經膠質瘤藥物研發(fā)的最佳途徑。發(fā)明內容本發(fā)明的目的是在于提供了一種靶向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白。該蛋白穩(wěn)定性好， 易于保存。本發(fā)明的另一個目的是在于提供了一種耙向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白的制備方 法。該方法簡單易行，操作方便，易于生產，制備的蛋白純度高，產量高。本發(fā)明的再一個目的是在于提供了一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白在 制備治療或預防神經膠質瘤的藥物中的應用。為了實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術措施一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白。通過分子生物學方法，申請人分子 設計了靶向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白。一種分離的蛋白Acp-W2，其序列為SEQIDNO: 1所示的氨基酸序列。申請人發(fā)現Acp-W2蛋白以液態(tài)形式在-20'C下保存6個月以上和 以干粉形式在4'C下保存12個月以上，其生物活性不變。Acp-W2蛋白穩(wěn)定性好，易于 保存。本發(fā)明涉及一種基因工程靶向抗神經膠質瘤蛋白以及生產靶向抗神經膠質瘤蛋白的方法。該基因工程靶向抗神經膠質瘤蛋白的生產方法簡單，后期純化得率高，生物活性好。Acp-W2QGPLGSDDDDKCGPCFTTDANMARKCRECCGGIGKCFGPQCLCR (SEQ ID NO: 1)。一種基因工程靶向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白的制備方法。它包括下列步驟 A、設計引物設計4條PCR擴增引物進行2輪PCR擴增獲取W2基因，正向引 物為Pl : 5' GCGGATCCGTGCGGTCCGTGCTTCACCACC 3，，弓|物P2 : 5'引物P4: 5 ， CCCAAGCTTCAACGGCACAGGCACTGCGGACC 3'。B、兩輪PCR擴增W2基因第一輪PCR擴增用引物P2和引物P3，第二輪PCR 擴增用引物Pl和引物P4。第一輪PCR反應的試劑如下將5微升的10x聚合酶緩沖 液、4微升的脫氧核糖核苷酸(dNTP)混合物、1微升的引物P2、 1微升的引物P3、 0.25微升的耐熱DNA聚合酶(TaqDNA)和37.75微升的無菌水混合。PCR反應條件 94'C預變性300秒、94'C變性45秒、55'C復性45秒、72'C延伸45秒、72。C最后延伸 200秒，循環(huán)32次。第二輪PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一輪PCR擴增產物 稀釋50倍的模板1微升，其它反應條件不變，獲得特異性的擴增帶(圖l)。C、將PCR擴增W2基因融合到谷胱苷肽轉移酶(GST)的下游，表達和純化Acp-W2蛋白PCR擴增產物凝膠電泳回收后用BamHI和HindIII雙酶切，酶切后的片段插 入經BamHI和HindIII雙酶切的表達載體pGEX-6p-l(購自Pharmacia公司)，構建重組 表達質粒，轉化Rossetta(DE3)(購自Promega)。對轉化的大腸桿菌異丙基-P-D-硫代 半乳糖苷(IPTG，購自華美生物工程公司)誘導培養(yǎng)后，收集菌體，懸浮于緩沖液中(5 0mM Tris-Cl, 1.0mM EDTA， pH8.0),超聲波破菌并離心，所得上清通過GST親和層 析膠后可收集洗脫得到的融合蛋白。收集得到的融合蛋白溶液再經超慮脫鹽和色譜分 離，獲得基因工程Acp-W2蛋白(圖2)，純度達到95% (圖3)。基因工程Acp-W2蛋白作為藥物在治療神經膠質瘤中的用途。它包括下列步驟A、 建立大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物模型收獲C6 (購自上海細胞所) 培養(yǎng)細胞并配成1. 5X 106個/1111濃度的懸液，按0. 2-0. 3ml的體積注射于每只實驗大鼠(150g士10g)右前腋皮下，接種7至10天，即可在右前肢腋下隨手觸摸到腫瘤顆粒。 正常培養(yǎng)7天后，挑選成瘤較好、腫瘤大小適宜的個體作為實驗的模型動物(圖4)。B、 Acp-W2靶向大鼠神經膠質瘤采用氯胺T法將放射性元素'"標記GST蛋白和Acp-W2蛋白。取已通過碘飽和甲狀腺的模型大鼠15只，隨機均分為3組，試驗組注 射1:"I-AcP-W2蛋白，另兩組注射游離的Na1311 (由中國原子能科學研究院同位素)和 '"I-GST蛋白做對照組。注射方式為尾靜脈注射，劑量2(^1 。分別于5min、10min、30min、 60rain、 120min和180min時，采用斷頸法處死實驗動物，分別取血液以及心臟、月巿、肝、腎、胰、胃、大腦、肌肉和腫瘤組織塊作為樣品，以FT-613 (購自北京核儀器廠) 自動計算放免測量儀記錄樣品的脈沖數，記錄時間30秒，換算出單位重量樣品的放射 強度(脈沖數)以及樣本單位放射量權重((某樣品單位重量脈沖數/樣本單位重量脈沖 數總和)X100%)。統計分析發(fā)現，在180分鐘內，荷瘤大鼠腫瘤組織內Acp-W2的 含量隨時間的延長而不斷增加(富集)，而其它非腫瘤組織則不具有這種現象(圖5)， 表明重組Acp-W2蛋白對由C6細胞所誘發(fā)的腫瘤組織有明顯的特異靶向作用。C、 體內抑制大鼠神經膠質瘤增殖大鼠腋下接種C6細胞7天后，挑選已成瘤的 個體12只隨機分為3組，分別對3組動物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理鹽水。 蛋白溶液濃度2^g/W，注射劑量3組均為100W/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共 注射7次。最后一次注射后再將動物詞養(yǎng)5天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前采 用斷頸法處死動物，剝離皮下腫瘤組織并稱量各自瘤重，比較分析兩組間的差異。結果 表明，兩組動物皮下腫瘤平均重量分別為生理鹽水組0.3259土0. 1114g; GST蛋白組 0. 3399±0. 1965g; Acp-W2蛋白組0. 0493 ±0. 0428g。Acp-W2蛋白實際抑瘤率為84. 87%。 統計學分析也顯示兩組間腫瘤均重差異極顯著，顯示Acp-W2蛋白具有很強的抑瘤效果(圖6)。D、 體內抑制大鼠神經膠質瘤轉移大鼠腋下接種C6細胞14天后，挑選已成瘤的 個體15只隨機分為3組，分別對3組動物腹腔注射Acp-蛋白、GST蛋白和生理鹽水。 蛋白溶液濃度2PgA4，注射劑量3組均為10(￥1/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共 注射7次。最后一次注射后再將動物飼養(yǎng)7天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前采 用斷頸法處死動物，觀察各組動物肺部腫瘤轉移情況，比較分析兩組間的差異。結果表 明，Acp-W2蛋白試驗組動物的肺基本上是正常的，而GST蛋白和生理鹽水的試驗動 物的肺出現了腫瘤(圖7)。統計學分析也顯示兩組間腫瘤轉移差異極顯著，顯示Acp-W2 蛋白具有很強的抑制腫瘤轉移的效果(圖7)?？梢?，本發(fā)明具有如下特點(1)基因工程生產Acp-W2蛋白產量高。實驗室小試 生產98%純度以上的Acp-W2蛋白產量達到30mg/L培養(yǎng)物，中試發(fā)酵水平達到400mg/L 培養(yǎng)物；(2) Acp-W2穩(wěn)定性高。Acp-W2是一個由269氨基酸組成的31. 5 KDa大小的蛋 白，具有很高的穩(wěn)定性，不易變質；(3)易于生產。使用親和層析、超慮脫鹽和高效液 相色譜3個純化操作步驟，就可以得到95%以上色譜純的Acp-W2蛋白；(4) Acp-W2藥物效果顯著。動物實驗表明，重組Acp-W2蛋白不僅對神經膠質瘤組織具有特異耙向 性，而且能有效抑制神經膠質瘤惡性增殖和轉移。


圖1重疊PCR方法擴增W2基因示意圖M: DNA Mark Ladder2000; 1:引物P2和P3的擴增帶；2:引物Pl和P4的擴增帶。圖2工程菌BL21(pGEX/Acp-W2)的誘導表達示意圖1:未經誘導轉化pGEX-Acp-W2的全細胞蛋白提取物；2:經IPTG誘導轉化pGEX-pGEX-Acp-W2的全細胞蛋白提取物；3:純化的基因工程Acp-W2蛋白；4:中分 子量蛋白質Mark。圖3基因工程Acp-W2蛋白的HPLC分析圖4建立大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物模型(A):大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物外形照片(接種21天)；(B):對應A圖大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物解剖照片。 圖5 Acp-W2蛋白靶向大鼠神經膠質瘤(A):生理鹽水對照組在大鼠不同組織中的增長速率；(B): '3'1-GST蛋白在大鼠不同組織中的增長速率；(C): ,-Acp-W2蛋白在大鼠不同組織中的增長速率。圖6 Acp-W2蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤增殖(A):生理鹽水、GST蛋白和Acp-W2蛋白處理組大鼠神經膠質瘤解剖結果；(B): 生理鹽水、GST蛋白和Acp-W2蛋白處理組大鼠神經膠質瘤重量及其抑瘤率；(C): 生理鹽水、GST蛋白和Acp-W2蛋白處理組大鼠神經膠質瘤重量的柱形圖。 圖7 Acp-W2蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤轉移(A):生理鹽水和Acp-W2蛋白處理組大鼠肺的腫瘤轉移情況統計；(B):典型的 生理鹽水和Acp-W2蛋白處理組大鼠肺解剖照片(a: —只具有+ + +腫瘤嚴重程度的生理鹽水對照組大鼠肺；b: —只沒有發(fā)生病變的Acp-W2蛋白組大鼠肺)。
具體實施方式
實施例l:分子設計W2基因基于已報道的蝎毒氯毒素BmKCT(AF135821)的氨基酸序列，利用常規(guī)方法推斷編 碼蛋白質的核苷酸序列，同時考慮大腸桿菌密碼子偏好性。在此基礎上，分別設計引物 進行 PCR擴增獲取目的基因 W2 。 正向引物為 Pl : 5' GCGGATCCGTGCGGTCCGTGCTTCACCACC 3'， 弓l物 P2: 5'引物P4: 5， CCCAAGCTTCAACGGCACAGGCACTGCGGACC 3，。第一輪PCR擴增用 引物P2和引物P3，第二輪PCR擴增用引物P1和引物P4。第一輪PCR反應的試劑如 下將5微升的10xT叫聚合酶緩沖液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、 1 微升的引物P3、 0.25微升的TaqDNA聚合酶和37.75微升的無菌水混合。PCR反應條 件94。C預變性300秒、94。C變性45秒、55。C復性45秒、72。C延伸45秒、72t:最后 延伸200秒，循環(huán)32次。第二輪PCR中使用引物P1和引物P4，加入第一輪PCR擴 增產物稀釋50倍的模板1微升，其它反應條件不變。實施例2: Acp-W2蛋白重組表達載體的構建 A: W2和pGEX-6p-l的雙酶切與連接將實施例l中所得PCR產物經過酚:氯仿異戊醇(25: 24: l)抽提，無水乙醇(2.5 倍體積)沉淀后用5(^1滅菌水溶解沉淀。用限制性內切酶BamHI和HindIII (Takara 公司產品)對回收的PCR產物和表達載體pGEX-6p-l質粒進行酶切。酶切反應 BamHI(14U4U)和HindlII(20U/Vl)各1^1， 10倍緩沖液2.5^1,， PCR產物或pGEX-6p-l質 粒50-100ng，加無菌水至總體積為25^1。 37。C水浴5小時，酶切產物經酚氯仿異戊 醇抽提，無水乙醇(2.5倍體積)沉淀后用TJ)NA連接酶(Takara公司產品)將PCR產 物與表達載體pGEX-6p-l連接。連接反應T4DNA連接酶(1U/(xl) 1W， PCR產物與 表達載體pGEX-6p-l的摩爾比為3: 1，并且DNA總量為0.1嗎，5倍連接酶反應緩沖 液4pl，加無菌水至總體積為20)lU， 16'C放置24小時。B:大腸桿菌DH5a和Rossetta(DE3)感受態(tài)細胞的制備DH5(x (購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，DH5a為普通菌株)感受態(tài)細胞的制備在劃線平板上挑取DH5a單菌落，接種于5mlLB培養(yǎng)液，37°C， 250rpm搖床中培養(yǎng)過 夜；以lX量轉接于5ml LB培養(yǎng)基中，生長至OD6oo到0.4 0.6，取菌液lml于預冷 的1.5mlEppendorf管中，冰浴5 10分鐘，4。C 12,000rpm離心20 30秒，收集菌體， 倒置1分鐘，再冰浴10分鐘；沉淀重懸于lml預冷的0.1M CaCl2中，冰浴20 40分 鐘，4°C 12,000rpm離心20 30秒，收集菌體，將菌體重懸于預冷的CaCl2中， 冰浴2 7小時，4'C冰箱保存，如放置在-70。C則可保存6個月。Rossetta(DE3)感受態(tài)細胞的制備同于DH5a感受態(tài)細胞的制備。C:連接產物的轉化和陽性克隆的鑒定將實施例2A步驟中的20nl連接反應液加到IOOW的DH5a感受態(tài)細胞，混勻，冰 浴30分鐘，42。C水浴90秒(不能搖動)，再冰浴2分鐘；加等體積2XLB培養(yǎng)液，37 r搖床(120rpm)溫育l小時；搖勻菌液，取200^1涂布于LB/AP+瓊脂平板上，待菌 液吸干后倒置于37。C培養(yǎng)12 16小時，觀察結果。加氨芐青霉素瓊脂平板(LB/AP+)上挑取單菌落10個，于50(^1含氨節(jié)的LB液 體培養(yǎng)基中37'C振搖4小時，取2pl菌液作為模板，以實施例1中的正反向引物P1、 P2、 P3、 P4進行PCR。 PCR篩選的陽性克隆子進一步使用限制性酶切反應鑒定。兩者 都為陽性結果的克隆子送上海三博公司進行測序分析。測序引物是針對pGEX-6p-l質 粒的通用測序引物pGEX5 ，primer 。實施例3:重組Acp-W2基因工程菌的制備將實施例2C步驟中測序正確的陽性克隆子按照堿裂解法提取重組表達質粒 pGEX-Acp-W2 (方法見《分子克隆》第二版)。按照實施例2C步驟中的轉化方法將提取 的pGEX-Acp-W2質粒轉入實施例2B步驟制備的大腸桿菌感受態(tài)Rossetta(DE3)細胞中。 平板為LB/AP+瓊脂平板。挑取單克隆子獲得基因工程菌Rossetta(DE3) (pGEX-Acp-W2)。實施例4:重組Acp-W2蛋白的表達和純化在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中以1:100的比例接種克隆子(重組大腸桿菌Ro ssetta (DE3) /pGEX-Acp-W2)， 37。C培養(yǎng)至OD柳)二O. 8時加入IPTG(終濃度為0. lmM) 對培養(yǎng)物進行誘導，然后將培養(yǎng)物在28'C培養(yǎng)4小時以進行目的基因的表達。濃縮誘 導后的培養(yǎng)物50倍，超聲波破細胞(80HZ，30秒/次，至培養(yǎng)物變清亮為止)，12000rpm離心15分鐘，所得上清加入到GST親和層析膠中充分混合后26。C作用1小時使Acp-W 2蛋白與GST親和層析膠充分結合。用含50mM的EDTA(乙二胺四乙酸)的Tris-Cl (三羥 甲基氨基甲垸鹽酸)緩沖溶液(l. OmM， p朋.O)反復沖洗GST親和層析膠去除雜蛋白。然后 用lOmM的GSH (還原型谷胱甘肽)溶液按照50ml/L培養(yǎng)物洗脫Acp_W2蛋白。洗脫的A cp-W2蛋白通過50ml的lOKDa超慮管(Millipore, Centricon, USA)離心濃縮脫鹽， 離心速度為3500rpm/min，溫度為4°C。然后濃縮脫鹽的Acp_W2蛋白進行HPLC (美國 安吉倫公司產品)純化。HPLC (高效液相色譜)的參數設置為分離柱子C18 (EliteH PLC, China, 10X250咖，5nm)，流速5ml/min，液相為含有0. 1%的三氟乙酸TFA的乙 腈(CH3CN: 10% to 80%)洗脫液，紫外檢測設置在280nm處。手工收集Acp-Wl蛋白峰， 并且冷凍干燥(一40。C)。通過Tris-Tricine緩沖液的十二垸基磺酸鈉聚丙烯酰氨凝膠 電泳(SDS-PAGE)檢測收集液中的重組Acp-W2蛋白，并用Bradford方法測定含量。 高效液相色譜鑒定蛋白純度達到95%。實施例5:大鼠神經膠質瘤C6細胞皮下移植瘤動物模型的建立收獲C6培養(yǎng)細胞并配成1. 5X 1(f個/ml濃度的懸液，按0. 2-0. 3ml的體積注射于 每只實驗SD大鼠(150g土10g，購自湖北省試驗動物中心)右前腋皮下，接種7至10 天，即可在右前肢腋下隨手觸摸到腫瘤顆粒。正常培養(yǎng)7天后，挑選成瘤較好、腫瘤大 小適宜的個體作為實驗的模型動物。實施例6: Acp-W2靶向大鼠C6細胞皮下移植瘤采用氯胺T法將方文身寸性元素1311標記GST蛋白和Acp-W2蛋白。取已通過碘飽和甲狀腺的模型大鼠15只，隨機均分為3組，試驗組注射'3'I-Acp-W2蛋白，另兩組注射 游離的Na1:ilI和13'I-GST蛋白做對照組。注射方式為尾靜脈注射，劑量20nl。分別于 5min、 10min、 30min、 60min、 120min和180min時，采用斷頸法處死實驗動物，分別 取血液以及心臟、肺、肝、腎、胰、胃、大腦、肌肉和腫瘤組織塊作為樣品，以FT-613 自動計算放免測量儀記錄樣品的脈沖數，記錄時間30秒，換算出單位重量樣品的放射 強度(脈沖數)以及樣本單位放射量權重((某樣品單位重量脈沖數/樣本單位重量脈沖 數總和)X100%)。統計分析發(fā)現，在180分鐘內，荷瘤大鼠腫瘤組織內""I-Acp-W2的 含量隨時間的延長而不斷增加(富集)，而其它非腫瘤組織則不具有這種現象，表明重組Acp-W2蛋白對由C6細胞所誘發(fā)的腫瘤組織有明顯的特異靶向作用。實施例7: Acp-W2蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤增殖大鼠腋下接種C6細胞7天后，挑選已成瘤的個體12只隨機分為3組，分別對3 組動物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理鹽水。蛋白溶液濃度2吆A4，注射劑量 3組均為100W/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再將動 物飼養(yǎng)5天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前采用斷頸法處死動物，剝離皮下腫瘤 組織并稱量各自瘤重，比較分析兩組間的差異。結果表明，兩組動物皮下腫瘤平均重量 分別為生理鹽水組O. 3259±0. 1114g; GST蛋白組O. 3399±0. 1965g; Acp-W2蛋白組 0.0493 ±0. 0428g。 Acp-W2蛋白實際抑瘤率為84. 87%。統計學分析也顯示兩組間腫瘤 均重差異極顯著，顯示Acp-W2蛋白具有很強的抑瘤效果。實施例8: Acp-W2蛋白體內抑制大鼠神經膠質瘤轉移大鼠腋下接種C6細胞14天后，挑選已成瘤的個體15只隨機分為3組，分別對3 組動物腹腔注射Acp-W2蛋白、GST蛋白和生理鹽水。蛋白溶液濃度2l^gAtl，注射劑量 3組均為100W/只大鼠，頻率為每2天注射一次，共注射7次。最后一次注射后再將動 物飼養(yǎng)7天，觀察腫瘤生長情況，解剖摘取腫瘤前采用斷頸法處死動物，觀察各組動物 肺部腫瘤轉移情況，比較分析兩組間的差異。結果表明，Acp-W2蛋白試驗組動物的肺 基本上是正常的，而GST蛋白和生理鹽水的試驗動物的肺出現了腫瘤，。統計學分析也 顯示兩組間腫瘤轉移差異極顯著，顯示Acp-W2蛋白具有很強的抑制腫瘤轉移的效果。SEQUENCE LISTING〈110〉武漢大學<120〉 一種靶向抗神經膠質瘤蛋白及制備方法和用途<130> —種靶向抗神經膠質瘤蛋白及制備方法和用途〈160〉 1〈170〉 Patentln version 3.1〈210〉 1〈211> 269〈212〉 PRT 〈213〉人工合成<400> 1Met Ser Pro lie Leu Gly Tyr Trp Lys lie Lys Gly Leu Val Gin Pro15 10 15Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu20 25 30Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu35 40 45Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr lie Asp Gly Asp Val Lys50 55 60Leu Thr Gin Ser Met Ala lie lie Arg Tyr lie Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu lie Ser Met Leu Glu85 90 95Gly Ala Val Leu Asp lie Arg Tyr Gly Val Ser Arg lie Ala Tyr Ser100 105 110Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu115 120 125Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn130 135 140Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu165 170 175Val Cys Phe Lys Lys Arg lie Glu Ala lie Pro Gin lie Asp Lys Tyr180 185 190Leu Lys Ser Ser Lys Tyr lie Ala Trp Pro Leu Gin Gly Trp Gin Ala195 200 205Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu210 215 220Phe Gin Gly Pro Leu Gly Ser Asp Asp Asp Asp Lys Cys Gly Pro Cys 225 230 235 240Phe Thr Thr Asp Ala Asn Met Ala Arg Lys Cys Arg Glu Cys Cys Gly245 250 255Gly lie Gly Lys Cys Phe Gly Pro Gin Cys Leu Cys Arg 260 26權利要求
1. 一種分離的多肽，其序列為SEQ ID NO1所示的氨基酸序列。
2、 一種制備權利要求l所述的一種基因工程耙向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白的方法， 其步驟是A、 設計引物設計4條PCR擴增引物進行2輪PCR擴增獲取W2基因，正向引 物 PI : 5' GCGGATCCGTGCGGTCCGTGCTTCACCACC 3',弓|物P2 : 5'物P4: 5 ， CCCAAGCTTCAACGGCACAGGCACTGCGGACC 3';B、 兩輪PCR擴增W2基因第一輪PCR擴增用引物P2和引物P3，第二輪PCR 擴增用引物Pl和引物P4，第一輪PCR反應的試劑如下將5微升的10xTaq聚合酶緩 沖液、4微升的dNTP混合物、1微升的引物P2、 1微升的引物P3、 0.25微升的TaqDNA 聚合酶和37.75微升的無菌水混合，PCR反應條件94'C預變性300秒、94'C變性45 秒、55'C復性45秒、72。C延伸45秒、72。C最后延伸200秒，循環(huán)32次，第二輪PCR 中使用引物P1和引物P4，加入第一輪PCR擴增產物稀釋50倍的模板1微升，其它反 應條件不變，獲得擴增帶；C、 Acp-W2蛋白的表達和純化PCR擴增產物凝膠電泳回收后用^wz別和 //雙酶切，酶切后的片段插入經和殆>7必//雙酶切的表達載體pGEX-6p-l，構建 重組表達質粒，轉化大腸桿菌Rossetta(DE3)，對轉化的大腸桿菌異丙基-P-D-硫代半 乳糖苷誘導培養(yǎng)后，收集菌體，懸浮于緩沖液中，超聲波破菌并離心，所得上清通過G ST親和層析膠后收集洗脫液得到融合蛋白，再經超慮脫鹽和色譜分離，獲得基因工程 Acp-W2蛋白。
3、 權利要求1所述的一種靶向抗神經膠質瘤Acp-W2蛋白在制備治療或預防神經 膠質瘤的藥物中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種靶向抗神經膠質瘤蛋白及制備方法和應用，本發(fā)明分離了一種蛋白質，其序列為SEQ ID NO1所示的氨基酸序列?；蚬こ趟婕暗囊?，將蝎毒氯毒素的核苷酸序列插入表達載體中pGEX-6p-1，構成重組表達質粒；重組質粒轉化大腸桿菌Rossetta(DE3)，然后細胞裂解經親和層析、超慮脫鹽和色譜純化得到Acp-W2蛋白。Acp-W2蛋白對神經膠質瘤有特異靶向作用，且能有效抑制大鼠神經膠質瘤的增殖，具有靶向抗神經膠質瘤的作用。Acp-W2蛋白在制備治療或預防神經膠質瘤藥物中的應用。本發(fā)明方法簡單易行，操作方便，產量高，生物活性好。
文檔編號C12N15/12GK101270158SQ20081004755
公開日2008年9月24日 申請日期2008年4月30日 優(yōu)先權日2008年4月30日
發(fā)明者吳英亮, 孫正博, 曹志賤, 李文鑫, 范少忠, 蔣達和 申請人:武漢大學