一種靶向fap的抗血管生成肽z?gp?v1及其應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤血管生成作用的靶向FAP的合成肽Z?GP?V1。該肽分子量為：1270.47 Da，序列為Z?GPAAATWLPPR；采用Fmoc固相多肽合成法制備而成，可用于抗腫瘤血管生成制劑中。本發(fā)明通過利用特異性底物二肽Z?GP對V1肽進(jìn)行修飾，獲得了新的合成肽Z?GP?V1，而新的合成肽對于改善V1肽的靶向性，提高其抗腫瘤血管生成作用，及降低其毒副作用等方面都表現(xiàn)出較好的應(yīng)用效果，同時(shí)也為新的抗腫瘤血管生成治療方法提供了新的借鑒和參考。
【專利說明】
一種靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-V1及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于腫瘤治療技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種具有抗腫瘤血管生成作用的靶向FAP的合成肽Z-GP-Vl。
【背景技術(shù)】
[0002]近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率和死亡率逐年上升，現(xiàn)已成為發(fā)達(dá)國家和部分發(fā)展中國家成人死亡的最主要原因，是全球最大的公共問題之一，嚴(yán)重威脅著人們的健康和生命安全。因此，癌癥的治療受到國際社會的普遍關(guān)注和高度重視，而尋找安全有效、不良反應(yīng)較小的抗腫瘤藥物一直是生物醫(yī)學(xué)研究的焦點(diǎn)問題。傳統(tǒng)的臨床治療藥物原則是通過直接殺傷腫瘤細(xì)胞來抑制腫瘤生長的，但是，這些藥物通常對正常細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也易造成人體產(chǎn)生諸如骨髓抑制、免疫功能低下、不規(guī)則出血、惡心嘔吐等副作用，而且隨著藥物使用時(shí)間的延長，腫瘤細(xì)胞易對這些藥物產(chǎn)生抗性。因此，從不同途徑尋找效果好、毒性低、特異性強(qiáng)的抗腫瘤藥物是目前腫瘤治療的主要目標(biāo)，而越來越多的研究者以腫瘤微環(huán)境中的各種基質(zhì)細(xì)胞為靶點(diǎn)來研究癌癥治療，并取得了一定的治療效果，已成為腫瘤治療研究的新熱點(diǎn)。
[0003]以腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞為靶點(diǎn)，通過抑制腫瘤血管生成來抑制腫瘤生長的腫瘤血管阻斷療法受到了人們的廣泛重視。理論而言，腫瘤是血管依賴型的惡性細(xì)胞，其生長、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和預(yù)防均與腫瘤血管生成密切相關(guān)。事實(shí)上，90%的癌癥患者，都是死于血管通道轉(zhuǎn)移，這也是腫瘤血管造成的最大危害。因此，抑制腫瘤新生血管的生長才能從根本上達(dá)到治療腫瘤的目的?，F(xiàn)有的內(nèi)源性血管生成抑制劑多數(shù)是ECM和血液凝滯過程中一些天然組分的片段，但這些片段由于結(jié)構(gòu)較大而不能有效穿透組織，同時(shí)存在在人體內(nèi)易于清除的缺陷，加上藥劑使用量大、應(yīng)用成本高的缺陷，嚴(yán)重限制了內(nèi)源性血管生成抑制劑在臨床中的應(yīng)用。所以，現(xiàn)在許多學(xué)者正致力于研究一些與較大內(nèi)源性蛋白或多肽具有相似作用的小分子多肽藥物。
[0004]成纖維細(xì)胞激活蛋白(fibroblast Activat1n Protein,FAP )是一種膜絲氨酸肽酶，是Π型絲氨酸蛋白酶家族成員之一，具有二肽肽酶及膠原酶活性，可促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移以及微血管的生成，特異性表達(dá)于90%以上的上皮腫瘤的基質(zhì)成纖維細(xì)胞的胞膜和胞漿中，包括結(jié)腸癌，乳腺癌，卵巢癌，膀胱癌，肺癌(原發(fā)的和轉(zhuǎn)移的)，陽性細(xì)胞靠近腫瘤毛細(xì)血管的內(nèi)皮細(xì)胞并圍繞著腫瘤結(jié)節(jié)，但在正常成人的組織、良性和癌前病變的上皮性損傷組織中通常不表達(dá)。FAP的蛋白酶活性可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對細(xì)胞外基質(zhì)的侵襲力，促進(jìn)腫瘤的生長和增殖。研究表明，F(xiàn)AP在瘤形成的整個(gè)過程中均發(fā)揮促進(jìn)作用，還可以有效增強(qiáng)腫瘤新生血管的形成，靶向抑制FAP可以阻止腫瘤的基質(zhì)源性及血管源性供給營養(yǎng)。由于其對腫瘤生長的重要影響作用及特異性表達(dá)于腫瘤基質(zhì)成纖維細(xì)胞中的特點(diǎn)，F(xiàn)AP在腫瘤靶向治療中具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]基于FAP的二肽底物(Z-GP)以及現(xiàn)有NRP-1靶向肽結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上，本發(fā)明設(shè)計(jì)提出了一種新的合成肽物質(zhì)= Z-GP-Vl，從而為腫瘤的預(yù)防和治療提供新的借鑒和參考。
[0006]本發(fā)明所采取的詳細(xì)技術(shù)方案如下。
[0007]—種靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-Vl，該肽由兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域通過丙氨酸柔性連接子連接構(gòu)建而成，具體為由丙氨酸柔性連接子將靶向FAP的二肽底物(Z-GP，N-芐氧羰基甘氨酸脯氨酸)和靶向NRP-1具有抗腫瘤血管生成的多肽片段(VI肽，ATWLPPR)連接起來構(gòu)成；
該肽分子量為:1270.47 Da，序列如SEQ ID N0.1所示，具體為:Z-Gly-Pro-Ala-Ala-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg;即:Z_GPAAATWLPPR或Z-GP-AA-ATWLPPR。
[0008]所述靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-Vl，采用Fmoc固相多肽合成法制備而成；具體過程如下:
(1)選用Wang樹脂與待合成肽C端的第一個(gè)Fmoc-氨基酸羧基以共價(jià)鍵形式連接，再以該氨基酸的N端作為該條多肽合成的起點(diǎn)，并讓其與下一個(gè)氨基酸的羧基端發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，形成肽鍵；
(2)然后，將N端的Fmoc-氨基酸的保護(hù)基進(jìn)行脫保護(hù)，再讓第二個(gè)氨基酸的N端與后面的氨基酸的羧基反應(yīng)，如此不斷重復(fù)這一過程直至多肽合成完畢；
(3)最后將合成的多肽從樹脂上切割下來，經(jīng)過乙醚沉淀與洗滌，得到粗肽；
(4)經(jīng)過脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，即可得到本發(fā)明所述的靶向FAP的抗腫瘤血管生成合成肽Z-GP-Vl，所得合成肽Z-GP-Vl可于-20 V凍存?zhèn)溆谩?br>[0009]所述靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-Vl，用于抗腫瘤血管生成。
[0010]已有研究表明，F(xiàn)AP具有特異性肽鏈內(nèi)切酶活性，能選擇性水解N-末端封閉的甘氨酰脯氨酸二肽序列，如攜帶Z-Gly-Pro(Z-GP) 二肽的底物，因而針對該底物可設(shè)計(jì)針對性藥物以阻斷FAP的作用。而對Vl肽的研究表明，該肽是一種特異性作用于腫瘤血管生成相關(guān)因子受體NRP-1的小分子多肽，通過特異性阻斷在血管形成過程中最為關(guān)鍵的VEGF-A165(血管內(nèi)皮生長因子)與其受體的結(jié)合，進(jìn)而阻斷血管生成。但是無論針對Z-GP所設(shè)計(jì)的治療方式，抑或Vl肽的應(yīng)用，這種單一靶向血管內(nèi)皮細(xì)胞受體的治療方法還存在一定的局限性和缺陷，其主要原因在于，新生血管的形成不僅發(fā)生在腫瘤細(xì)胞周邊，在傷口愈合、子宮內(nèi)膜周期性變化、心肌梗塞后和糖尿病等情況下也會發(fā)生，而當(dāng)VEGF的正常功能受到抑制時(shí)，針對腫瘤治療應(yīng)用的這些藥物將會引起高血壓、蛋白尿、出血、血栓事件、胃腸道穿孔、傷口愈合綜合征等副反應(yīng)的發(fā)生，因而一定程度上限制了這類單一靶向藥物的治療效果，從而影響了這類治療方法的推廣和應(yīng)用。
[0011]本發(fā)明在現(xiàn)有的單一靶向藥物作用基礎(chǔ)上，通過丙氨酸柔性連接子將Z-GP與靶向NRP-1具有抗腫瘤血管生成活性的Vl肽進(jìn)行連接，獲得了一種新的雙靶向的合成肽Z-GP-VI。進(jìn)一步通過體外細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和迀移實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該合成肽的抗血管生成作用。而通過具有豐富血管的小鼠S180移植瘤模型實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該肽對腫瘤的抑制效果明顯，具有抗腫瘤血管生成作用，且無明顯的毒副作用，具有較好的醫(yī)療應(yīng)用前景，同時(shí)也為靶向抗腫瘤血管治療提出了一種新思路。
[0012]總體而言，靶向抗腫瘤血管生成的治療方法，相較于直接以腫瘤組織為靶點(diǎn)的治療方法，具有不易產(chǎn)生耐藥性、特異性強(qiáng)、毒副作用小等諸多優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)由于一個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞會支持50?100個(gè)腫瘤細(xì)胞生長，所以阻斷腫瘤血管后，抑制瘤體效果會成倍放大。本發(fā)明基于抗腫瘤血管生成治療方法的巨大優(yōu)勢，通過利用特異性底物二肽Z-GP對Vl肽進(jìn)行修飾，獲得了新的合成肽Z-GP-Vl，而新的合成肽對于改善Vl肽的靶向性，提高其抗腫瘤血管生成作用，及降低其毒副作用等方面都表現(xiàn)出較好的應(yīng)用效果，同時(shí)也為新的抗腫瘤血管生成治療方法提供了新的借鑒和參考。
【附圖說明】
[0013]圖1為所制備的合成肽Z-GP-Vl的ES1-MS質(zhì)譜分析鑒定結(jié)果；
圖2為合成肽Z-GP-Vl在ΙΟΟμΜ時(shí)，在細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中對于HUVECs迀移的影響；
圖3為合成肽Z-GP-Vl在細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)中對于HUVECs迀移的影響；
圖4為合成肽Z-GP-VI對荷S180的BABL/c小鼠體重變化的影響結(jié)果圖；
圖5為合成肽Z-GP-Vl對荷S180的BABL/c小鼠移植瘤體積變化的影響結(jié)果圖；
圖6為合成肽Z-GP-Vl對荷S180的BABL/c小鼠的移植瘤瘤重的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行詳細(xì)介紹，但在介紹具體實(shí)施例前，首先對本發(fā)明中所用到部分實(shí)驗(yàn)試劑及實(shí)驗(yàn)設(shè)備等情況簡要介紹如下。
[0015]生物材料:
S180細(xì)胞(鼠肉瘤細(xì)胞)、HUVECs(人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞)，購買于ATCC(American TypeCulture Collect1n)；
SPF級5?8周齡BALB/c雌鼠(50只)，購買于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心；
實(shí)驗(yàn)試劑:
Fmoc多肽固相合成的Wang樹脂、Fmoc保護(hù)的L型氨基酸，為吉爾生化(上海)有限公司產(chǎn)品;
Fmoc多肽固相合成中的洗滌試劑、1-羥基苯并三唑(HOBt)、N，N-二異丙基碳二亞胺(DIC)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲醇(MeOH)、二氯甲烷(DCM)、茚三酮、六氫吡啶、呢啶、醋酸酐、三氟乙酸(TFA)、乙腈等，自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；
RPM1-1640培養(yǎng)基，為北京Solarb1公司產(chǎn)品；
磷酸鹽緩沖液(PBS)配置相關(guān)試劑，購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；
FBS(胎牛血清)，購自杭州四季青生物有限公司；
實(shí)驗(yàn)設(shè)備:
多肽合成儀，江蘇通州市南興申海玻儀廠；
旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52，上海亞榮生化儀器廠；
RP-HPLC分析儀，日本島津公司；
倒置顯微鏡AE2000，Olympus公司。
[0016]實(shí)施例1
本發(fā)明所提供的合成肽Z-GP-Vl，分子量為:1270.47 Da，具體序列為:Z-Gly-Pro-Ala-Ala-Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg;采用Fmoc固相多肽合成法制備而成，以某次合成0.1843克的合成肽Z-GP-Vl為例，具體制備方法如下所述。
[0017](I)稱取0.3gWang樹脂放入DMF(N，N-二甲基甲酰胺)潤洗過的多肽合成儀中，然后加入4 mLDMF，靜置30min，使樹脂充分溶脹，用真空栗抽去DMF。
[0018](2)第一個(gè)氨基酸的添加:按公式I稱取精氨酸、HoBt及DIC對應(yīng)的量，按公式2稱取DMAP對應(yīng)的量，分別為462.000mg、101.3475mg、94.65yL、9.162mg，先用4 mL DMF溶解精氨酸和HoBt并加入合成儀中，然后直接在合成儀中加入DIC，250C-28°C下攪拌反應(yīng)1min后，再將用ImL DMF溶解的DMAP加入合成儀中，繼續(xù)在此溫度下攪拌反應(yīng)2.5h;
所述公式I為:氨基酸的質(zhì)量=該氨基酸的相對分子質(zhì)量X 2.5(當(dāng)量)X樹脂的質(zhì)量；
所述公式2為:DMAP的質(zhì)量=DMAP的相對分子質(zhì)量X 0.25(當(dāng)量)X樹脂的質(zhì)量。
[0019](3)將步驟(2)中反應(yīng)完畢的樹脂按以下順序及次數(shù)進(jìn)行洗滌，DMF兩次—MeOH三次—DCM三次—DMF兩次，搖床中震蕩洗滌，每次洗滌兩分鐘，洗滌結(jié)束時(shí)用真空栗將液體抽干；
用分光光度計(jì)測定波長為290nm處樹脂和第一個(gè)氨基酸的吸光度0D，根據(jù)公式計(jì)算取代值，加封頭液封頭兩次，每次20min，在搖床中震蕩，然后洗滌，洗滌方法同上，洗滌結(jié)束時(shí)用真空栗將液體抽干然后洗滌；
取代值計(jì)算公示為:取代值=OD八1.65 Χ_§)，_§為樹脂的質(zhì)量。
[0020](4)第二個(gè)氨基酸即脯氨酸的添加:合成時(shí)是從C端到N端方向進(jìn)行，對步驟(2)中第一個(gè)氨基酸添加后樹脂脫保護(hù)兩次；
所述脫保護(hù)是指在合成儀中加入4 mL脫保護(hù)液(哌啶與DMF的體積比為1: 3)，25°028°C下攪拌反應(yīng)20min，真空栗抽干；
然后洗滌，洗滌方法及步驟同步驟(3 )中洗滌；
然后挑取樹脂茚檢呈藍(lán)色時(shí)，按公式3稱取第二個(gè)氨基酸脯氨酸、HoBt、DIC的量，分別為134.96mg、54.052mg、50.48yL，先用4 mL DMF溶解脯氨酸和HoBt加入合成儀中，然后直接在合成儀中加入DIC，250C-280C下攪拌反應(yīng)2.5h;反應(yīng)結(jié)束后按步驟(3)的方法洗滌樹脂，洗滌結(jié)束后挑取樹脂茚檢呈無色；
所述公式3為:氨基酸的量=該氨基酸的相對分子質(zhì)量(此處為脯氨酸)X 2.5 X樹脂的質(zhì)量(此處為0.3) X取代值(此處為步驟(3)中取代值計(jì)算結(jié)果)。
[0021](5)后續(xù)氨基酸的添加:后續(xù)氨基酸的添加方法同第二個(gè)氨基酸的添加過程，直至加完所有氨基酸;其中茚檢樣品時(shí)，顯色要求有所調(diào)整，茚檢時(shí)，若前一個(gè)氨基酸是脯氨酸、絲氨酸和組氨酸時(shí)則茚檢呈紅棕色。
[0022](6)切割多肽:從樹酯上切割多肽，首先按步驟(4)中的脫保護(hù)方法進(jìn)行兩次;洗滌(同步驟(3));然后進(jìn)行切割；
所述切割為，將切割試劑加入多肽合成儀中，攪拌柱攪拌三小時(shí)，然后將合成儀中的液體抽入球形燒瓶中，并用DCM沖洗3遍；
把球形燒瓶裝在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)I小時(shí)；
在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后加2mLTFA冰切30min ；
在球形燒瓶中加入乙醚再蒸發(fā)5次，最后加入冰乙醚在冰上靜置30min，白色沉淀即為析出的粗肽；
將含粗肽的乙醚溶液2000rpm、離心2min，得粗肽沉淀，把粗肽在37 V烘箱中烘干(烘干約需3h);
需要強(qiáng)調(diào)的是，所述切割試劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，其具體組成配比為:三蒸水0.3mL、苯甲硫醚0.3mL、I，2-二硫醇0.15mL、苯酚0.3mL、三氟乙酸TFA4.95mL。
[0023](7)粗肽純化:利用RP-HPLC純化粗肽，純化體系為:乙腈，1%q，TFA=25%?50%;流速5min/mL，檢測波長是228nm ；
純化后所得精肽即為本發(fā)明所述靶向FAP的合成肽Z-GP-Vl，純度檢測表明，純化后后其純度大于95%，可于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024]對純化后的合成肽Z-GP-Vl進(jìn)行ES1-MS質(zhì)譜鑒定，結(jié)果如圖1。從圖1中可以看出，所制備的合成肽Z-GP-Vl的分子量符合預(yù)期。
[0025]實(shí)施例2
對于實(shí)施例1所制備的合成肽Z-GP-V1，發(fā)明人對其抗腫瘤血管生成作用進(jìn)行了具體的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，相關(guān)實(shí)驗(yàn)簡要介紹如下。
[0026]一、體外抗血管生成作用驗(yàn)證
1、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)
利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，對合成肽Z-GP-Vl對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs )的迀移影響進(jìn)行評價(jià)，相關(guān)實(shí)驗(yàn)過程簡要介紹如下。
[0027](I)將HUVECs以I X 15個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于24孔板中，待細(xì)胞鋪板率達(dá)到90%以上后，用200yL槍頭輕輕地沿著標(biāo)記進(jìn)行劃痕；
(2 )隨后，用PBS將劃去的細(xì)胞清洗干凈，將合成肽Z-GP-Vl分別以不同濃度(ΙΟΟμΜ、25μΜ、5μΜ)加入每個(gè)復(fù)孔中，每個(gè)濃度為一個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組3個(gè)復(fù)孔，同時(shí)，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)基為陰性對照組、Vl肽為陽性對照組、Z-GP為無關(guān)肽對照組；
所述Vl肽、Z-GP 二肽參考現(xiàn)有技術(shù)制備而成，使用前均由RPMI 1640無血清培養(yǎng)基溶解稀釋至200μΜ;
(3)在37 0C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24小時(shí)，期間每隔12小時(shí)在倒置顯微鏡下以40X的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照記錄，并按照下述公式計(jì)算各個(gè)時(shí)間段的劃痕愈合程度并繪制柱狀圖；
計(jì)算公式:[1-(12小時(shí)一24小時(shí)的相對區(qū)域/0小時(shí)的相對區(qū)域)]X 100%。
[0028]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，本發(fā)明中的合成肽Z-GP-Vl有抑制HUVECs迀移的作用，在24小時(shí)時(shí)，陰性對照組的“傷口”愈合程度是ΙΟΟμΜ合成肽Z-GP-Vl實(shí)驗(yàn)組的1.4倍，具有顯著差異(**ρ〈0.01)，這一結(jié)果說明實(shí)驗(yàn)組HUVECs的迀移速度慢于陰性對照組，即，合成肽Z-GP-Vl對于HUVECs的迀移有較好的抑制效果。但就單獨(dú)的Z-GP處理組而言，其“傷口”愈合程度幾乎和陰性對照組相同，說明Z-GP本身對于HUVECs的迀移并沒有明顯的影響作用。而就Vl肽與合成肽Z-GP-Vl組對比結(jié)果可以看出，隨著時(shí)間的延長，合成肽Z-GP-Vl組的愈合程度要優(yōu)于Vl肽組，但始終具有抑制HUVECs迀移的效果，表明合成肽Z-GP-Vl對于HUVECs迀移的副作用相對較小，但依舊保持了 Vl本身抑制HUVECs迀移的能力。
[0029]2、細(xì)胞迀移實(shí)驗(yàn)
為進(jìn)一步驗(yàn)證合成肽Z-GP-Vl對于HUVECs迀移的抑制作用，發(fā)明人進(jìn)一步進(jìn)行了Transwe 11小室實(shí)驗(yàn)(BD公司，8.Ομπι)，實(shí)驗(yàn)過程簡介如下。
[0030](I)HUVECs依次先后經(jīng)過無血清RPMI 1640培養(yǎng)基饑餓處理12小時(shí)，不同藥物濃度(100、25、5μΜ)的合成肽Z-GP-Vl處理12小時(shí)，同時(shí)以無血清培養(yǎng)基為陰性對照組、以Vl肽為陽性對照組、以Z-GP為無關(guān)肽對照組，處理12小時(shí)后，收集細(xì)胞并用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行重懸。
[0031]所述Vl肽、Z-GP二肽參考現(xiàn)有技術(shù)制備而成，使用前均由RPMI 1640無血清培養(yǎng)基溶解稀釋至200μΜ;
(2)以1.5\105個(gè)/1^的細(xì)胞密度接種于1'瓜118￥611上室中，每孔20(^1^，下室加入75(^1^含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基，37°C、5%C02的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12小時(shí)；
(3)培養(yǎng)結(jié)束后，將舊的培養(yǎng)基吸出，用I3BS清洗2遍；
(4)用3.8%的多聚甲醛固定細(xì)胞20min;固定結(jié)束后用I3BS清洗2遍；
(5)用0.2%的結(jié)晶紫染色15min;染色結(jié)束后再用PBS清洗5遍；
(6)清洗干凈后，向每孔加入適量的超純水，放到倒置顯微鏡下以40X的放大倍數(shù)進(jìn)行觀察拍照計(jì)數(shù)并繪制柱狀圖。
[0032]實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，合成肽Z-GP-Vl有抑制HUVECs迀移的作用，陰性對照組的迀移細(xì)胞數(shù)是ΙΟΟμΜ濃度合成肽Z-GP-Vl組迀移的HUVECs的細(xì)胞數(shù)的3.3倍，具有極其顯著差異(***P〈0.001)，這一結(jié)果表明合成肽Z-GP-Vl處理后的HUVECs的迀移速度減慢。而就單獨(dú)的Z-GP處理組而言，其細(xì)胞迀移的數(shù)目和陰性對照組相比幾乎達(dá)到一致，再次說明Z-GP本身對HUVECs的迀移能力沒有明顯的影響。就Vl肽組與合成肽Z-GP-Vl組的對比可以看出，不同濃度下，合成肽Z-GP-Vl組與Vl組均具有抑制HUVECs迀移作用，這兩組迀移的細(xì)胞數(shù)量明顯低于陰性對照組，再次說明Z-GP-Vl保持了 Vl的抑制內(nèi)皮細(xì)胞迀移的能力。
[0033]基于現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，發(fā)明人認(rèn)為，與Z-GP所連接的序列可在Z-GP作為FAP的底物基礎(chǔ)上，實(shí)現(xiàn)初步定位功能，而由于FAP存在于腫瘤基質(zhì)中，因而與Z-GP所連接的序列亦可初步定位于腫瘤基質(zhì)中。結(jié)合上述體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，與Z-GP所連接的肽序列(即本發(fā)明所提供的合成肽Z-GP-V1)相較于初始的Vl肽，其仍然保留較好的多肽活性，仍然具有較好的抗腫瘤作用;或者說，Z-GP 二肽底物本身并沒有影響Vl肽的抗血管生成作用。而鑒于初始Vl肽作用時(shí)所缺乏的靶向性，本發(fā)明所提供的合成肽Z-GP-Vl，能夠更好地作用于目標(biāo)靶位(血管內(nèi)皮細(xì)胞)，對于更好地抑制內(nèi)皮細(xì)胞迀移，發(fā)揮抗腫瘤血管生成作用具有較好的改進(jìn)效果，同時(shí)鑒于更低的毒副作用效果，使得本發(fā)明所提供的合成肽Z-GP-Vl具有較好的推廣應(yīng)用意義。
[0034]二、合成肽Z-GP-V1的抗腫瘤活性的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證
為進(jìn)一步檢驗(yàn)合成肽Z-GP-Vl的抗腫瘤活性，以實(shí)施例1制備的合成肽Z-GP-Vl進(jìn)一步進(jìn)行抗腫瘤相關(guān)實(shí)驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)情況介紹如下。
[0035]抑瘤率實(shí)驗(yàn)具體實(shí)驗(yàn)過程如下:
(I)于每只小鼠的右前肢腋下荷I X 17個(gè)瘤細(xì)胞，待小鼠的瘤體積達(dá)到50?10mm3時(shí)按瘤體積隨機(jī)分組，分為7組，分別為Z-GP-Vl高劑量組(0.6μΜ)、Z-GP-V1低劑量組(0.2μΜ)、V1高劑量組(0.6μΜ)、ν?低劑量組(0.2yM)、Z-GP高劑量組(0.6yM)、Z-GP低劑量組(0.2μΜ)、和生理鹽水組(陰性對照組)，每組5只；
使用時(shí)，合成肽Z-GP-Vl (VI肽或Z-GP)直接溶于生理鹽水配成相應(yīng)濃度，按lmL/Kg注射用量注射；
需要注意的是，將合成肽Z-GP-Vl (VI肽或Z-GP)溶于生理鹽水后，需過濾除菌，為使用方便期間，可過濾除菌后分裝后_20°C保存?zhèn)溆茫?br> (2)尾靜脈給藥的方式注射，共給藥12天;各組每天上午給藥;實(shí)驗(yàn)期間小鼠自由進(jìn)食和飲水；
(3)實(shí)驗(yàn)期間每日測量小鼠體重并記錄，繪制曲線，以評價(jià)合成肽Z-GP-Vl的毒副作用；同時(shí)每日測量腫瘤的長(a)短(b)徑，并按公式(計(jì)算公示為:V=l/2 X (a Xb2))計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線;給藥結(jié)束的第二天將小鼠脫頸處死取出腫瘤并稱重。
[0036]小鼠體重變化曲線如圖4所示，小鼠腫瘤體積變化曲線如圖5所示，小鼠瘤重情況如圖6所示。
[0037]從圖4中可以看出，合成肽Z-GP-VI給藥組的小鼠的體重變化均在正常范圍內(nèi)，表明該合成肽沒有明顯的毒副作用。而從圖5和圖6我們可知，合成肽Z-GP-Vl給藥組的瘤體積和瘤重比陰性對照即生理鹽水組要小，具有差異(*P〈0.05)，且高濃度顯示出了較好的抑制效果，同時(shí)Z-GP組未顯示出明顯的抑瘤活性，說明靶向FAP的合成肽Z-GP-Vl具有一定的抗腫瘤作用。
[0038]進(jìn)一步而言，就Vl肽與合成肽Z-GP-Vl組對比而言，雖然Vl肽處理組的抗腫瘤效果優(yōu)于Z-GP-Vl，但由于Vl肽并沒有靶向腫瘤的功能基序，從圖4的小鼠體重變化中可以看出其仍然具有一定的毒副作用(隨著時(shí)間的延長，小鼠體重增加的并不明顯)，而Z-GP-Vl實(shí)驗(yàn)組具有一定的抗腫瘤效果，且沒有明顯的毒副作用。
[0039]自1986年發(fā)現(xiàn)FAP以來，對于該蛋白的定位、表達(dá)和功能做了大量研究工作，初步研究認(rèn)為，F(xiàn)AP在腫瘤的侵潤和轉(zhuǎn)移中扮演了重要的角色，其與90%的上皮細(xì)胞癌有關(guān)系，但在正常成人的組織、良性和癌前病變的上皮性損傷組織中通常不表達(dá)該蛋白，因此FAP可以作為腫瘤體內(nèi)免疫診治中較有前途的革G分子。
[0040]本發(fā)明通過丙氨酸柔性連接子將FAP的二肽底物與靶向NRP-1具有抗血管生成作用的Vl肽相耦聯(lián)，使這條設(shè)計(jì)的合成肽Z-GP-Vl具有雙靶向的功能，利用Z-GP與FAP的高親和性以及FAP在腫瘤基質(zhì)部位的高表達(dá)特性，減少和降低了本身NRP-1選擇性多肽Vl的非特異性所造成的毒副作用，同時(shí)較好地保留了新的合成肽中Vl肽部分的抗腫瘤血管生成作用效果。通過上述一系列體內(nèi)、體外的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明所提供的合成肽Z-GP-Vl在應(yīng)用于抗血管腫瘤生成時(shí)，沒有明顯的副作用，加上其制備方法較為成熟和完善，因而具有較好地醫(yī)療應(yīng)用前景。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-V1，其特征在于，該肽分子量為:1270.47 Da，序 列如 SEQ ID N0.1 所不，具體序列為:Z-Gly-Pr〇-Ala-Ala-Ala-Thr-Trp-Leu-P;r〇-P;r〇-Arg;即:Z-GPAAATWLPPR。2.權(quán)利要求1所述靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-V1的制備方法，其特征在于，采用Fmoc 固相多肽合成法制備而成。3.權(quán)利要求1所述靶向FAP的抗血管生成肽Z-GP-V1在制備抗腫瘤血管生成制劑中的應(yīng)用。
【文檔編號】C07K1/20GK106046121SQ201610441253
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月20日
【發(fā)明人】陳鯉翔, 王雅娟, 王婷, 陳思偉, 安秀麗, 祁元明, 高艷鋒, 李國棟
【申請人】鄭州大學(xué)