一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法。從肝素出發(fā)，制備得到肝素衍生物N-脫硫酸肝素，N-脫硫酸肝素的氨基與葉酸通過(guò)交聯(lián)劑EDC在非均相或均相反應(yīng)中通過(guò)酰胺鍵連接形成肝素葉酸綴合物，通過(guò)透析除去未反應(yīng)的游離葉酸和EDC并將透析后產(chǎn)物凍干得到固體，檢測(cè)其生物學(xué)活性發(fā)現(xiàn)該綴合物具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性。
【專利說(shuō)明】一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，已有研宄證明高度硫酸化的糖胺聚糖肝素具有抗腫瘤活性。事實(shí)上，癌癥患者使用肝素進(jìn)行治療主要是為了治療靜脈血栓，通過(guò)大量的臨床試驗(yàn)觀察到肝素可以延長(zhǎng)惡性腫瘤患者的存活時(shí)間。肝素對(duì)惡性腫瘤的多種作用是基于其對(duì)血管生成因子的抑制作用，例如bFGF ;或通過(guò)抑制肝素酶的活性從而干擾腫瘤轉(zhuǎn)移細(xì)胞侵襲過(guò)程；另外可能肝素本身有阻礙腫瘤生長(zhǎng)或防止癌細(xì)胞生成的活性。此外，一些研宄也證明了肝素具有細(xì)胞毒性。例如，肝素可抑制激活蛋白-1(AP-1)的活性，AP-1是諸多細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途經(jīng)的交匯點(diǎn)，是許多致癌信號(hào)傳導(dǎo)至細(xì)胞核的靶點(diǎn)；肝素還可能與DNA通過(guò)電荷相互作用。
[0003]盡管肝素具有抗腫瘤活性，但是其強(qiáng)大的抗凝血活性使其不能大劑量和長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床治療。另外，由于肝素在體內(nèi)具有多種生物活性，很難確定肝素抗腫瘤活性的原理。已有研宄將低分子量肝素或化學(xué)修飾肝素，如烷基化肝素、肝素與膽酸結(jié)合形成的兩性肝素分子，這些肝素衍生物具有低抗凝血活性可應(yīng)用于抗血管生成和抗腫瘤而不會(huì)引起出血等副作用。
[0004]葉酸受體(FR)是一種膜蛋白，具有高親和力，可將葉酸及葉酸復(fù)合物通過(guò)胞吞作用導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。由于惡性腫瘤細(xì)胞分裂增殖速度較快，需要葉酸量較大，因此在大多數(shù)腫瘤組織如卵巢癌、乳腺癌、鼻咽癌、腎癌和結(jié)腸直腸癌等細(xì)胞表面葉酸受體表達(dá)過(guò)量，葉酸已被應(yīng)用于靶向診斷和治療腫瘤。
[0005]因此，合成肝素與葉酸結(jié)合的綴合物，使肝素可以在腫瘤組織中富集或通過(guò)胞吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)其抗腫瘤活性并與未修飾的肝素進(jìn)行比較，合成的綴合物應(yīng)具有較低的抗凝血活性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案為:旨在合成一種具有低抗凝活性和腫瘤靶向性的肝素衍生物，葉酸與葉酸受體具有高親和力，葉酸通過(guò)γ-羧基與其他大分子化合物連接后，葉酸復(fù)合物仍可通過(guò)葉酸受體經(jīng)過(guò)胞吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，將葉酸的γ -羧基與肝素衍生物N-脫硫酸肝素的氨基通過(guò)酰胺鍵連接制備肝素葉酸綴合物并檢測(cè)其生物活性。
[0008]本發(fā)明提出的一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法的具體操作步驟如下:從肝素出發(fā)，制備得到肝素衍生物N-脫硫酸肝素，N-脫硫酸肝素的氨基與葉酸通過(guò)交聯(lián)劑EDC在非均相或均相反應(yīng)中通過(guò)酰胺鍵連接形成肝素葉酸綴合物，通過(guò)透析除去未反應(yīng)的游離葉酸和EDC并將透析后產(chǎn)物凍干得到固體，通過(guò)紫外光譜掃描和紅外光譜掃描表征綴合物的結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)綴合物的生物活性，確定制備得到的綴合物為具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性。
[0009]本發(fā)明的獨(dú)到之處有兩點(diǎn):首先，肝素衍生物N-脫硫酸肝素分子上的氨基與葉酸的γ -羧基形成穩(wěn)定的酰胺鍵，將二者連接起來(lái)，之所以不采取將葉酸的羧基直接與肝素鏈上的羥基進(jìn)行酯化連接，原因在于酰胺鍵比酯鍵更穩(wěn)定，可以避免在體內(nèi)循環(huán)過(guò)程中，酯鍵水解使葉酸分子脫落下來(lái)，導(dǎo)致靶向功能消失。其次，肝素分子中的N位硫酸基是抗凝活性所需的，在肝素分子的N位進(jìn)行連接有望得到具有低抗凝活性的肝素葉酸綴合物。

【具體實(shí)施方式】
[0010]以下利用實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明，但不能認(rèn)為是限定發(fā)明的范圍。
[0011]實(shí)施例一:Ν-脫硫酸肝素的制備
[0012]精密稱取500mg肝素鈉完全溶解于3mL去離子水中，加入50mL無(wú)水DMSO后，攪拌條件下55°C恒溫水浴2h后加入同體積去離子水結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用IM NaOH調(diào)pH至8?9，用冷的無(wú)水乙酸鈉飽和的無(wú)水乙醇沉淀肝素衍生物，4°C沉淀過(guò)夜，離心收集沉淀，冰無(wú)水乙酸鈉飽和的無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次，適量去離子水溶解沉淀，使用截留分子量為3500的透析膜在去離子水中透析3d，然后凍干得白色絮狀固體。
[0013]實(shí)施例二:葉酸活性酯的制備
[0014]精密稱取40mg葉酸放入錐形瓶中，加入1mL DMS0，攪拌下加入20 μ L EDC，攪拌條件下25°C恒溫水浴lh，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，即得紅棕色的葉酸活性酯的DMSO溶液。
[0015]實(shí)施例三:肝素葉酸綴合物的合成
[0016]精密稱取10mg N-脫硫酸肝素，均相反應(yīng)，即懸浮于1mL DMSO中，磁力攪拌下將葉酸活性酯的DMSO溶液緩慢滴加至N-脫硫酸肝素溶液中，攪拌條件下30°C恒溫水浴16h，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行；精密稱取10mg N-脫硫酸肝素，非均相反應(yīng)，即完全溶解于1mLpH為4.7 (或pH為5.6)的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，將葉酸活性酯溶液緩慢滴加至N-脫硫酸肝素溶液中，邊滴加邊攪拌，攪拌條件下30°C恒溫水浴16h，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析膜在蒸餾水中透析ld，除去DMS0，取出淡黃色微濁液體，高速離心30min除去不溶于水的葉酸分子，繼續(xù)用蒸餾水透析4d，取出透析袋中淡黃色透明液體凍干得淡黃色絮狀固體產(chǎn)物，即肝素葉酸綴合物。非均相反應(yīng)，pH4.7為最佳反應(yīng)條件，得肝素葉酸綴合物最佳偶聯(lián)比為3.01。紅外光譜顯示HOOcnr1處吸收峰為酰胺鍵的-C0-(C = O)振動(dòng)引起，154001^1處吸收峰可能是由新生成的酰胺鍵的N-H變形振動(dòng)引起。
[0017]實(shí)施例四:肝素葉酸綴合物生物活性檢測(cè)
[0018]根據(jù)《美國(guó)藥典》的羊血漿法測(cè)肝素葉酸綴合物的抗凝血活性并與原料肝素鈉的抗凝血活性進(jìn)行比較，未修飾肝素效價(jià)約為160U/mg，肝素葉酸綴合物效價(jià)約為17.02U/mg，肝素葉酸綴合物的抗凝血活性為未修飾肝素抗凝血活性的10.6%。乳腺癌MCF-7細(xì)胞是一種細(xì)胞膜表面葉酸受體過(guò)量表達(dá)的細(xì)胞系，選擇此細(xì)胞為模型考察發(fā)現(xiàn)肝素葉酸綴合物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向識(shí)別能力和一定的抗腫瘤活性。
【權(quán)利要求】
1.一種具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性的肝素葉酸綴合物的制備方法，從肝素出發(fā)，制備得到肝素衍生物N-脫硫酸肝素，N-脫硫酸肝素的氨基與葉酸通過(guò)交聯(lián)劑EDC在非均相或均相反應(yīng)中通過(guò)酰胺鍵連接形成肝素葉酸綴合物，通過(guò)透析除去未反應(yīng)的游離葉酸和EDC并將透析后產(chǎn)物凍干得到固體，通過(guò)紫外光譜掃描和紅外光譜掃描表征綴合物的結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)綴合物的生物活性，確定制備得到的綴合物為具有低抗凝血活性和腫瘤靶向性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:精密稱取500mg肝素鈉完全溶解于3mL去離子水中，加入50mL無(wú)水DMSO后，攪拌條件下55°C恒溫水浴2h后加入同體積去離子水結(jié)束反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用IM NaOH調(diào)pH至8?9，用冷的無(wú)水乙酸鈉飽和的無(wú)水乙醇沉淀肝素衍生物，4°C沉淀過(guò)夜，離心收集沉淀，冰無(wú)水乙酸鈉飽和的無(wú)水乙醇洗滌沉淀兩次，適量去離子水溶解沉淀，使用截留分子量為3500的透析膜在去離子水中透析3d，然后凍干得白色絮狀固體。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:精密稱取40mg葉酸放入錐形瓶中，加入1mL 01^0，攪拌下加入2(^1^ EDC，攪拌條件下25°C恒溫水浴lh，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行，即得紅棕色的葉酸活性酯的DMSO溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:精密稱取10mgN-脫硫酸肝素，均相反應(yīng)，即懸浮于1mL DMSO中，磁力攪拌下將葉酸活性酯的DMSO溶液緩慢滴加至N-脫硫酸肝素溶液中，攪拌條件下30°C恒溫水浴16h，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行；精密稱取10mg N-脫硫酸肝素，非均相反應(yīng)，即完全溶解于1mL pH為4.7 (或pH為5.6)的醋酸-醋酸鈉緩沖液中，將葉酸活性酯溶液緩慢滴加至N-脫硫酸肝素溶液中，邊滴加邊攪拌，攪拌條件下30°C恒溫水浴16h，反應(yīng)在避光條件下進(jìn)行。
5.根據(jù)權(quán)利要求1和4所述的方法，其特征在于:非均相反應(yīng)，pH4.7為最佳反應(yīng)條件，得肝素葉酸綴合物最佳偶聯(lián)比為3.01。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:反應(yīng)結(jié)束后用截留分子量為3500的透析膜在蒸餾水中透析1山除去DMS0，取出淡黃色微濁液體，高速離心30min除去不溶于水的葉酸分子，繼續(xù)用蒸餾水透析4d，取出透析袋中淡黃色透明液體凍干得淡黃色絮狀固體產(chǎn)物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:肝素葉酸綴合物抗凝血活性為未修飾肝素抗凝血活性的10.6%，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有靶向識(shí)別能力和一定的抗腫瘤活性。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104491873SQ201410751272
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】滕麗萍, 付海田, 王敏, 陳敬華 申請(qǐng)人:江南大學(xué)