本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，涉及DNAH14基因在腫瘤診治中的應用，具體的涉及DNAH14基因在肺腺癌診治中的應用。

背景技術：

肺癌是呼吸系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，預后差。據(jù)流行病學調(diào)查分析男性肺癌的發(fā)病率較女性高，并與吸煙、地理、環(huán)境和種族等因素有關。在歐洲，北美和澳大利亞等發(fā)達國家因這幾年吸煙率的下降而肺癌發(fā)病率逐年降低，而中國等一些亞洲國家和非洲等國家的肺癌發(fā)病率逐年上升。肺癌的發(fā)病與很多因素有關，研究資料表明肺癌的危險因素包括家族遺傳史、免疫因素、內(nèi)分泌功能失調(diào)等內(nèi)在因素和吸煙、環(huán)境污染、電離輻射、職業(yè)因素等外在因素。

肺癌的組織類型主要分為兩大類，即小細胞肺癌(Small cell lung cancer，SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)，其中NSCLC占多數(shù)，約75％-80％。NSCLC又分為腺癌和鱗狀細胞癌兩種主要亞型。肺腺癌是我國肺癌的主要發(fā)病類型。肺腺癌起源于支氣管粘膜上皮，少數(shù)起源于大支氣管的粘液腺，其發(fā)病年齡較小，而且在不吸煙的女性中多見。腺癌具有高度浸潤和破壞性生長的生物學特征，易侵犯血管和淋巴管壁，出現(xiàn)血行及淋巴轉(zhuǎn)移，且惡性度較高，在臨床上早期一般沒有明顯的癥狀而不易被發(fā)現(xiàn)，當多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已屬于晚期或已有遠處轉(zhuǎn)移。目前，在肺腺癌的治療上早期多選擇手術切除的治療方法，而晚期患者多選擇聯(lián)合化療、放療、生物學治療等綜合治療方法，但其療效仍不佳且后期較易復發(fā)。研究表明影響患者的預后及療效的因素很多，如年齡、腫瘤大小、腫瘤的TNM分期、組織學類型、腫瘤分化程度、脈管浸潤、轉(zhuǎn)移等。

近年，隨著對肺癌發(fā)病分子機制的深入研究，在分子靶向治療上有了初步的效果，但還存在缺乏特異性和低靈敏性，耐藥等一些問題，療效仍然不很滿意，因此，有必要尋找特異性的生物標志物分子，進行個體化靶向治療，以便能降低肺癌的病死率，提高生存率。

技術實現(xiàn)要素：

為了彌補現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的之一是提供一種與肺腺癌發(fā)生發(fā)展相關的特異性分子標志物。

本發(fā)明的目的之二是提供一種診斷肺腺癌的產(chǎn)品和手段，通過檢測分子標志物的表達水平來判斷患者是否患有肺腺癌或者患肺腺癌的風險，具有特異性和敏感性。

本發(fā)明的目的之三，提供一種治療肺腺癌的藥物組合物和手段，通過特異性的下調(diào)分子標志物的表達來治療肺腺癌。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明提供了檢測DNAH14基因表達的試劑在制備診斷早期肺腺癌的產(chǎn)品中的應用。

進一步，所述試劑選自：

特異性識別DNAH14的探針；或

特異性擴增DNAH14的引物；或

特異性結(jié)合DNAH14編碼的蛋白的抗體或配體。

優(yōu)選的，所述特異性擴增DNAH14基因的引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

本發(fā)明提供了一種診斷肺腺癌的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括通過測序技術、核酸雜交技術、核酸擴增技術、免疫測定檢測樣本中DNAH14基因的表達水平。其中，所述產(chǎn)品包括(但不限于)芯片、制劑或試劑盒。

進一步，所述核酸擴增技術選自聚合酶鏈式反應、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應、轉(zhuǎn)錄介導的擴增、連接酶鏈式反應、鏈置換擴增和基于核酸序列的擴增。

本發(fā)明提供了DNAH14基因在制備預防或治療肺腺癌的藥物組合物中的應用。

進一步，所述藥物組合物包括DNAH14的下調(diào)劑。

一方面，所述下調(diào)劑選自：核酸抑制物，蛋白抑制劑，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子，其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)DNAH14基因或其編碼的蛋白的表達或活性。

另一方面，，所述的DNAH14基因或其編碼的蛋白的下調(diào)劑選自：以DNAH14基因或其轉(zhuǎn)錄本為靶序列、且能夠抑制DNAH14基因表達或基因轉(zhuǎn)錄的干擾分子，包括：shRNA(小發(fā)夾RNA)、小干擾RNA(SiRNA)、dsRNA、微小RNA、反義核酸，或能表達或形成所述shRNA、小干擾RNA、dsRNA、微小RNA、反義核酸的構(gòu)建物；或特異性與DNAH14編碼的蛋白結(jié)合的結(jié)合分子(如能夠抑制DNAH1蛋白活性的抗體或配體)。

進一步，所述的下調(diào)劑為siRNA。優(yōu)選的所述siRNA序列如SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9所示。

進一步，所述藥物組合物還包括與所述下調(diào)劑配伍的其他藥類以及藥學上可接受的載體和/或輔料。

本發(fā)明提供了DNAH14基因在篩選預防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)中的應用。

本發(fā)明提供了一種篩選預防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)的方法，所述方法包括：

用候選物質(zhì)處理表達或含有DNAH14基因或其編碼的蛋白的體系；和

檢測所述體系中DNAH14基因或其編碼的蛋白的表達或活性；

其中，若所述候選物質(zhì)可降低DNAH14基因和/或編碼的蛋白的表達或活性，(優(yōu)選顯著降低，如低20％以上，較佳的低50％以上；更佳的低80％以上)，則表明該候選物質(zhì)是預防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。所述體系選自：細胞體系、亞細胞體系、溶液體系、組織體系、器官體系或動物體系。

所述候選物質(zhì)包括(但不限于)：針對DNAH14基因或其編碼的蛋白或其上游或下游基因或蛋白設計的干擾分子、核酸抑制物、結(jié)合分子(如抗體或配體)、小分子化合物等。

進一步，所述的方法還包括：對獲得的潛在物質(zhì)進行進一步的細胞實驗和/或動物試驗，以從候選物質(zhì)中進一步選擇和確定對于預防或治療肺腺癌有用的物質(zhì)。

附圖說明

圖1是利用QPCR檢測DNAH14基因在肺腺癌組織中的表達情況圖；

圖2是利用QPCR檢測DNAH14在肺腺癌細胞中的轉(zhuǎn)染情況圖；

圖3是用CCK-8法檢測DNAH14基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋车挠绊憟D；

圖4是用流式細胞儀檢測DNAH14基因?qū)Ψ蜗侔┘毎蛲龅挠绊憟D；

圖5是利用Transwell小室檢測DNAH14對肺腺癌細胞遷移和侵襲的影響圖；其中圖A是DNAH14對肺腺癌細胞遷移的影響圖；圖B是DNAH14對肺腺癌細胞侵襲的影響圖。

具體的實施方式

本發(fā)明經(jīng)過廣泛而深入的研究，通過高通量測序方法，，檢測肺腺癌標本中基因在腫瘤組織和癌旁組織的表達，發(fā)現(xiàn)其中具有明顯表達差異的基因片段，探討其與肺腺癌的發(fā)生之間的關系，從而為肺腺癌的早期檢測及靶向治療尋找更好的途徑和方法。通過篩選，本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了肺腺癌中DNAH14顯著性上調(diào)。實驗證明，siRNA干擾沉默DNAH14，能夠有效地抑制肺腺癌細胞的增殖和侵襲，為肺腺癌的個性化治療提供了新途徑。

分子標志物

“分子標志物”是其在組織或細胞中的表達水平與正?；蚪】导毎蚪M織的表達水平相比發(fā)生改變的任何基因或蛋白。

本領域技術人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的標志物基因的任何特定變體的基因表達進行定量。作為非限制性的實例，標志物基因可具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2指定的核苷酸序列和氨基酸序列。在一些實施方案中，其具有與所列的序列至少85％相同或相似的cDNA序列諸如上述所列的序列至少 90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或至少 99％相同或相似的cDNA序列。

本發(fā)明可以利用本領域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領域技術人員應當理解，測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標志物的表達水平。

DNAH14基因

DNAH14基因位于人1號染色體長臂4區(qū)上，其編碼的蛋白是由幾條重鏈、輕鏈和中間鏈組成的微管相關的動力蛋白復合體。動力蛋白可以分為兩類，即細胞質(zhì)動力蛋白和軸絲動力蛋白，軸絲動力蛋白也被稱為纖毛動力蛋白或鞭毛動力蛋白。本發(fā)明中的DNAH14包括野生型、突變型或其片段。

本領域技術人員將認識到，本發(fā)明的實用性并不局限于對本發(fā)明的靶標基因的任何特定變體的基因表達進行定量。如果當核酸或其片段與其它核酸(或其互補鏈)最佳比對時(具有適當?shù)暮塑账岵迦牖蛉笔?，在至少大約60％的核苷酸堿基、通常至少大約70％、更通常至少大約80％、優(yōu)選至少大約90％、及更優(yōu)選至少大約95-98％核苷酸堿基中存在核苷酸序列相同性，則這兩個序列是“基本同源的”(或者基本相似的)。

或者，當核酸或其片段與另一核酸(或其互補鏈)、一條鏈或其互補序列在選擇性雜交條件下雜交時，則其間存在基本同源或(相同性)。當雜交比特異性整體喪失發(fā)生更具選擇性時，存在雜交選擇性。典型地，當在至少大約14個核苷酸的一段序列存在至少大約55％相同性、優(yōu)選至少大約65％、更優(yōu)選至少大約75％及最優(yōu)選至少大約90％相同性時，發(fā)生選擇性雜交。如本文所述，同源對比的長度可以是較長的序列節(jié)段，在某些實施方案中通常為至少大約20個核苷酸，更通常為至少大約24個核苷酸，典型為至少大約28個核苷酸，更典型為至少大約32個核苷酸，及優(yōu)選至少大約36或更多個核苷酸。

因此，本發(fā)明的多核苷酸與SEQ ID NO.1優(yōu)選具有至少75％、更優(yōu)選至少85％、更優(yōu)選至少90％同源性。更優(yōu)選地，存在至少95％、更優(yōu)選至少98％同源性。

術語“片段”是指多核苷酸的一部分一部分。為生物標志物核苷酸序列的片段的多核苷酸通常包含至少 10、15、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或 1,400個連續(xù)的核苷酸，或最多存在于本文所公開的全長生物標志物多核苷酸中的核苷酸個數(shù)。

在本發(fā)明中，術語“突變型”、“變體”是等同的，旨在表示基本上相似的序列。一般來講，本發(fā)明的特定生物標志物的變體將具有通過序列比對程序測定的與所述生物標志物至少約 40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。

本發(fā)明可以利用本領域內(nèi)已知的任何方法測定基因表達。本領域技術人員應當理解，測定基因表達的手段不是本發(fā)明的重要方面?？梢栽谵D(zhuǎn)錄水平上檢測生物標志物的表達水平。

檢測技術

本發(fā)明的基因使用本領域普通技術人員已知的多種檢測技術進行檢測，這些技術包括但不限于：核酸測序、核酸雜交、核酸擴增技術、免疫檢測技術。

核酸測序技術的示例性非限制性實例包括但不限于鏈終止子(Sanger)測序和染料終止子測序。本領域的普通技術人員將認識到，由于RNA在細胞中不太穩(wěn)定并且在實驗中更易受到核酸酶攻擊，因此在測序前通常將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA。

核酸雜交技術的示例性非限制性實例包括但不限于原位雜交(ISH)、微陣列和Southern或Northern印跡。原位雜交(ISH)是一種使用標記的互補DNA或RNA鏈作為探針以定位組織一部分或切片(原位)或者如果組織足夠小則為整個組織(全組織包埋ISH)中的特異性DNA或RNA序列的雜交。DNA ISH可用于確定染色體的結(jié)構(gòu)。RNA ISH用于測量和定位組織切片或全組織包埋內(nèi)的mRNA和其他轉(zhuǎn)錄本(例如，ncRNA)。通常對樣本細胞和組織進行處理以原位固定靶轉(zhuǎn)錄本，并增加探針的進入。探針在高溫下與靶序列雜交，然后將多余的探針洗掉。分別使用放射自顯影、熒光顯微術或免疫組織化學，對組織中用放射、熒光或抗原標記的堿基標記的探針進行定位和定量。ISH也可使用兩種或更多種通過放射性或其他非放射性標記物標記的探針，以同時檢測兩種或更多種轉(zhuǎn)錄本。

術語“微陣列”，包括但不限于：DNA微陣列(例如，cDNA微陣列和寡核苷酸微陣列)、蛋白質(zhì)微陣列、組織微陣列、轉(zhuǎn)染或細胞微陣列、化學化合物微陣列和抗體微陣列。通常稱為基因芯片、DNA芯片或生物芯片的DNA微陣列是微觀DNA點的集合，這些點連接到固體表面(例如，玻璃、塑料或硅芯片)上，形成用于對數(shù)千種基因同時進行表達譜分析或表達水平監(jiān)測的陣列。固定的DNA片段稱為探針，其數(shù)千個可用于單個DNA微陣列中。微陣列可用于通過比較疾病和正常細胞中的基因表達而識別疾病基因或轉(zhuǎn)錄本(例如，ncRNA)。微陣列可使用多種技術加以制造，包括但不限于：用細尖針印刷到載玻片上、使用預制的掩模進行光刻、使用動態(tài)微鏡器件進行光刻、噴墨印刷或微電極陣列上的電化學方法。

本發(fā)明可在檢測前或與檢測同時地對核酸(例如，ncRNA)進行擴增。核酸擴增技術的示例性非限制性實例包括但不限于：聚合酶鏈式反應(PCR)、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、轉(zhuǎn)錄介導的擴增(TMA)、連接酶鏈式反應(LCR)、鏈置換擴增(SDA)和基于核酸序列的擴增(NASBA)。本領域的普通技術人員將認識到，某些擴增技術(例如，PCR)需要在擴增前將RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA(例如，RT-PCR)，而其他擴增技術則直接擴增RNA(例如，TMA和NASBA)。

通常稱為PCR的聚合酶鏈式反應使用變性、引物對與相反鏈的退火以及引物延伸的多個循環(huán)，以指數(shù)方式增加靶核酸序列的拷貝數(shù)；TMA的轉(zhuǎn)錄介導的擴增(在基本上恒定的溫度、離子強度和pH的條件下自身催化地合成靶核酸序列的多個拷貝，其中靶序列的多個RNA拷貝自身催化地生成另外的拷貝；LCR的連接酶鏈式反應使用與靶核酸的相鄰區(qū)域雜交的兩組互補DNA寡核苷酸；其他擴增方法包括例如：通常稱為NASBA的基于核酸序列的擴增；使用RNA復制酶(通常稱為Qβ復制酶)擴增探針分子本身的擴增；基于轉(zhuǎn)錄的擴增方法；以及自我維持的序列擴增。

本發(fā)明中非擴增或擴增的核酸可通過任何常規(guī)的手段檢測。

芯片、試劑盒

本發(fā)明提供了檢測中DNAH14基因的表達水平的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括(但不限于)制劑、芯片或試劑盒。其中芯片包括：固相載體；以及有序固定在所述固相載體上的寡核苷酸探針，所述的寡核苷酸探針特異性地對應于DNAH14所示的部分或全部序列。

所述固相載體包括無機載體和有機載體，所述無機載體包括但不限于有硅載體、玻璃載體、陶瓷載體等；所述有機載體包括聚丙烯薄膜、尼龍膜等。

術語“探針”指能與另一分子的特定序列或亞序列或其它部分結(jié)合的分子。除非另有指出，術語“探針”通常指能通過互補堿基配對與另一多核苷酸(往往稱為“靶多核苷酸”)結(jié)合的多核苷酸探針。根據(jù)雜交條件的嚴格性，探針能和與該探針缺乏完全序列互補性的靶多核苷酸結(jié)合。探針可作直接或間接的標記，其范圍包括引物。雜交方式，包括，但不限于：溶液相、固相、混合相或原位雜交測定法。

探針通常被直接標記，例如用同位素、發(fā)色團、發(fā)光團、色原體，或被間接標記，例如用生物素，鏈霉親和素復合物隨后可以與生物素結(jié)合。因此，本發(fā)明測定中所用的可檢測的標記可以是一級標記(其中該標記包含可直接檢測的元件或能產(chǎn)生直接可檢測的元件的元件)或二級標記(其中可檢測的標記與一級標記結(jié)合，例如，免疫標記中常用的)。通常，標記的信號核酸用于檢測雜交?？梢酝ㄟ^常用于檢測雜交多核苷酸存在的數(shù)種方法中的任一種標記互補的核酸或信號核酸。最常用的檢測方法是利用用³H、¹²⁵I、³⁵S、¹⁴C或³²P標記的探針等的放射自顯影法。其它標記包括，例如，能結(jié)合標記抗體的配體、熒光團、化學發(fā)光劑、酶以及能作為標記配體的特異結(jié)合對成員的抗體。

本發(fā)明中的示例性探針包括PCR引物以及基因特異性DNA寡核苷酸探針，例如固定于微陣列基底上的微陣列探針、定量核酸酶保護檢驗探針、與分子條形碼連接的探針、以及固定于珠上的探針。在作為探針使用的多核苷酸的大小優(yōu)選為18個或更多個核苷酸、更優(yōu)選為20個或更多個核苷酸，以及轉(zhuǎn)錄區(qū)域的全長或更少。作為引物使用時，該多核苷酸大小優(yōu)選為18個或更多個核苷酸，以及50個或更少核苷酸。

這些探針具有與靶點基因的特定的堿基序列互補的堿基序列。這里，所謂“互補”，只要是雜交即可，可以不是完全互補。這些多核苷酸通常相對于該特定的堿基序列具有80％以上、優(yōu)選90％以上、更優(yōu)選95％以上、特別優(yōu)選100％的同源性。這些探針可以是DNA，也可以是RNA，另外，可以為在其一部分或全部中核苷酸通過PNA(Polyamide nucleic acid，肽核酸)、LNA(注冊商標，locked nucleic acid，Bridged Nucleic Acid，交聯(lián)化核酸)、ENA(注冊商標，2′-O,4′-C-Ethylene-bridged nucleic acids)、GNA(Glycerol nucleic acid，甘油核酸)、TNA(Threose nucleic acid，蘇糖核酸)等人工核酸置換得到的多核苷酸。

本發(fā)明提供了一種試劑盒，所述試劑盒可用于檢測DNAH14的表達。優(yōu)選的，所述的制劑或試劑盒包括檢測有效量的檢測DNAH14基因的試劑，選自下組的一種或多種物質(zhì)：容器、使用說明書、陽性對照物、陰性對照物、緩沖劑、助劑或溶劑。例如用于混懸或固定細胞的溶液，可檢測的標簽或標記，使核酸易于雜交的溶液，用于裂解細胞的溶液，或用于核酸純化的溶液。

本發(fā)明的試劑盒中還可附有試劑盒的使用說明書，其中記載了如何采用試劑盒進行檢測，和如何利用檢測結(jié)果對腫瘤發(fā)展進行判斷、對治療方案進行選擇。

采用本發(fā)明的試劑盒，可通過選自下組的各種方法(包括但不限于)檢測DNAH14：實時定量反轉(zhuǎn)錄PCR、生物芯片檢測法、DNA印跡法、或RNA印跡法或原位雜交法。本領域普通技術人員可根據(jù)實際條件和需要對檢測方式進行調(diào)整和改變。

下調(diào)劑和藥物組合物

基于本發(fā)明人的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供了一種DNAH14的下調(diào)劑的用途，用于制備抑制肺腺癌的藥物組合物。如本文所用，所述的DNAH14的下調(diào)劑包括但不限于抑制劑、拮抗劑、阻滯劑、阻斷劑、核酸抑制物等。

所述的DNAH14基因或蛋白的下調(diào)劑是指任何可降低DNAH14蛋白的活性、降低DNAH14基因或蛋白的穩(wěn)定性、下調(diào)DNAH14蛋白的表達、減少DNAH14蛋白有效作用時間、或抑制DNAH14基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯的物質(zhì)，這些物質(zhì)均可用于本發(fā)明，作為對于下調(diào)DNAH14有用的物質(zhì)，從而可用于預防或治療肺腺癌。例如，所述的抑制劑是：核酸抑制物，蛋白抑制劑，抗體，配體，蛋白水解酶，蛋白結(jié)合分子，只要其能夠在蛋白或基因水平上下調(diào)DNAH14蛋白或其編碼基因的表達，這些物質(zhì)作為對于下調(diào)DNAH14有用的物質(zhì)，可用于預防或治療肺腺癌。

作為本發(fā)明的一種選擇方式，所述的DNAH14的下調(diào)劑是一種特異性與DNAH14結(jié)合的抗體。所述的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體?？捎肈NAH14蛋白免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等來生產(chǎn)多克隆抗體；多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。與之相似的，表達DNAH14或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產(chǎn)抗體。所述的抗體也可以是單克隆抗體，此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。抗體的“特異性”是指抗體能結(jié)合于DNAH14基因產(chǎn)物或片段。較佳地，指那些能與DNAH14基因產(chǎn)物或片段結(jié)合但不識別和結(jié)合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領域內(nèi)技術人員已知的各種技術進行制備。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)²片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；遺傳工程改造的單鏈Fv分子；或嵌合抗體?？笵NAH14蛋白的抗體可用于免疫組織化學技術中，檢測活檢標本中的DNAH14蛋白含量，還可以作為用于預防肝癌轉(zhuǎn)移和侵襲的特異性治療劑。血樣或尿液中的DNAH14蛋白的直接測定可以作為腫瘤的輔助診斷和愈后的觀察指標，也可作為腫瘤早期診斷的依據(jù)?？贵w可以通過ELISA、Western Blot印跡分析，或者與檢測基團偶聯(lián)，通過化學發(fā)光、同位素示蹤等方法來檢測。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方式，所述DNAH14的下調(diào)劑是一種DNAH14特異性的小干擾RNA分子。如本文所用，所述的“小干擾RNA”是指一種短片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA，這個過程就是RNA干擾(RNA interference)過程。小干擾RNA可以制備成雙鏈核酸的形式，它含有一個正義鏈和一個反義鏈，這兩條鏈僅在雜交的條件下形成雙鏈。一個雙鏈RNA復合物可以由相互分離的正義鏈和反義鏈來制備。因此，舉例來講，互補的正義鏈和反義鏈是化學合成的，其后可通過退火雜交，產(chǎn)生合成的雙鏈RNA復合物。

在篩選有效的siRNA序列時，本發(fā)明人通過大量的比對分析，從而找出最佳的有效片段。本發(fā)明人設計合成了多種siRNA序列，并將它們分別通過轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染肺腺癌細胞系進行驗證，選出干擾效果最佳的siRNA，進一步地在細胞水平實驗，結(jié)果證明對于該siRNA在能有效的抑制細胞中DNAH14基因的表達水平，以及肺腺癌細胞的增殖。

本發(fā)明的核酸抑制物如siRNA可以化學合成，也可以通過一個重組核酸結(jié)構(gòu)里的表達盒轉(zhuǎn)錄成單鏈RNA之后進行制備。siRNA等核酸抑制物，可通過采用適當?shù)霓D(zhuǎn)染試劑被輸送到細胞內(nèi)，或還可采用本領域已知的多種技術被輸送到細胞內(nèi)。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種組合物，它含有有效量的所述的DNAH14的下調(diào)劑，以及藥學上可接受的載體。所述的組合物可用于抑制肺腺癌。任何前述的DNAH14的下調(diào)劑均可用于組合物的制備。

如本文所用，所述“有效量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。所述“藥學上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。該術語指這樣一些藥劑載體：它們本身并不是必要的活性成分，且施用后沒有過分的毒性。合適的載體是本領域普通技術人員所熟知的。在組合物中藥學上可接受的載體可含有液體，如水、鹽水、緩沖液。另外，這些載體中還可能存在輔助性的物質(zhì)，如填充劑、潤滑劑、助流劑、潤濕劑或乳化劑、pH緩沖物質(zhì)等。所述的載體中還可以含有細胞(宿主細胞)轉(zhuǎn)染試劑。

本發(fā)明可以采用用本領域熟知的多種方法來將所述的下調(diào)劑或其編碼基因、或其藥物組合物給藥于哺乳動物。包括但不限于：皮下注射、肌肉注射、經(jīng)皮給予、局部給予、植入、緩釋給予等；優(yōu)選的，所述給藥方式是非腸道給予的。

優(yōu)選的，可采用基因治療的手段進行。比如，可直接將DNAH14的下調(diào)劑通過諸如注射等方法給藥于受試者；或者，可通過一定的途徑將攜帶DNAH14的下調(diào)劑的表達單位(比如表達載體或病毒等，或siRNA或shRNA)遞送到靶點上，并使之表達活性的DNAH14下調(diào)劑，具體情況需視所述的下調(diào)劑的類型而定，這些均是本領域技術人員所熟知的。

本發(fā)明的藥物組合物可以進一步包含一種或多種抗癌劑。在具體的實施方案中，藥物組合物包含至少一種抑制DNAH14基因表達的化合物和至少一種化療劑。用于本發(fā)明的方法的化療劑，包括但不限于，DNA-烷化劑，抗腫瘤抗生素劑，抗代謝劑，激素拮抗劑，拓撲異構(gòu)酶抑制劑，蛋白激酶抑制劑，HMG-COA抑制劑，CDK抑制劑，細胞周期蛋白抑制劑，胱天蛋白酶抑制劑，金屬蛋白酶抑制劑，反義核酸，三鏈螺旋DNA，核酸適體，和分子修飾的病毒、細菌和外毒素試劑。

可藥用載體可包括但不限于：病毒、脂質(zhì)體、納米顆?；蚓酆衔锛捌淙我饨M合。相關的遞送載劑可包括但不限于：脂質(zhì)體、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、無機(包括金屬)顆粒、以及細菌或病毒(例如桿狀病毒、腺病毒和逆轉(zhuǎn)錄病毒)、噬菌體、黏粒或質(zhì)粒載體。

本發(fā)明的藥物組合物還可與其他治療肺腺癌的藥物聯(lián)用，其他治療性化合物可以與主要的活性成分同時給藥，甚至在同一組合物中同時給藥。

本發(fā)明的藥物組合物還可以以單獨的組合物或與主要的活性成分不同的劑量形式單獨給予其它治療性化合物。主要成分的部分劑量可以與其它治療性化合物同時給藥，而其它劑量可以單獨給藥。在治療過程中，可以根據(jù)癥狀的嚴重程度、復發(fā)的頻率和治療方案的生理應答，調(diào)整本發(fā)明藥物組合物的劑量。

藥物篩選

本發(fā)明提供了一種篩選預防或治療肺腺癌藥物的方法，即：

在實驗組中，向細胞培養(yǎng)體系中加入待測化合物，并測定DNAH14的表達或活性；在對照組中，向同樣的培養(yǎng)體系中不加入待測化合物，并測定DNAH14的表達或活性；其中，如果實驗組中DNAH14的表達或活性低于對照組，則說明該候選化合物為DNAH14的下調(diào)劑。

在本發(fā)明中，所述的方法還包括：對上面步驟獲得的候選化合物進一步測試其抑制肝癌的效果，若測試化合物對肺腺癌有顯著的抑制效果，則說明該化合物為預防或治療肺腺癌的潛在物質(zhì)。

本發(fā)明中，術語“樣本”包括(但不限于)，可以是血液、組織、尿液、血清、血漿、羊水、腦脊液、胎盤細胞或者組織、內(nèi)皮細胞、白細胞或單核細胞。樣品可以得自患者或?qū)ο笾苯邮褂?，或者進行預處理，如通過過濾、蒸餾、提取、濃縮、離心、失活干擾成分、加入試劑等方式處理，以如本文所述或者本領域已知的一些方式修飾樣品的特性。在本發(fā)明的具體實施例中，所述“樣本”為組織。

下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克?。簩嶒炇沂謨?New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實施例1篩選與肺腺癌相關的基因標志物

1、樣品收集

各收集8例肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織樣本。肺腺癌腫瘤組織標本取材部位為主要腫瘤區(qū)域，位于腫瘤腫塊中外1/3與正常組織交接處，排除腫瘤中心明顯壞死、鈣化部分以及腫瘤外圍正常肺組織；癌旁正常肺組織標本取自腫瘤邊緣5cm以上的部位，肉眼觀察無明顯變化。上述所有標本的取得均通過組織倫理委員會的同意。

2、RNA樣品的制備(利用miRNA kit進行操作)

在研缽中導入液氮，取上述獲得的組織放入研缽中，在液氮中剪碎并研磨成粉末，剪碎后投入液氮中并研磨至粉末狀，隨后轉(zhuǎn)入玻璃勻漿器中；組織勻漿在玻璃勻漿器中加入Trizol試劑，在冰上研磨組織。將勻漿后組織勻漿液轉(zhuǎn)入無RNA酶的EP管中，室溫下靜置5min。按照試劑盒中的說明書提取分離RNA。具體如下：

1)RNA的分離：

在EP管中加入0.2m1氯仿，蓋緊EP管蓋，手動劇烈振蕩15s，使其充分混勻。室溫下孵化5min。然后在4℃下以14000g離心15min。離心后樣品分為三層，RNA存在于上層水相中。

2)RNA沉淀

將分離得的水相取450μl移至新的無RNA酶的EP管中，按照1:1的比例加入450μl異丙醇，上下顛倒混勻后在室溫下孵化10min，4℃14000g離心10min。

3)RNA洗脫

離心后小心移去上清，加入1ml 75％乙醇(滅酶處理，現(xiàn)用現(xiàn)配并在冰上預冷)沖洗RNA，隨后4℃7500g離心5min。

4)RNA再溶解

小心移去洗滌之后的上清，在超凈工作臺中打開EP管管蓋，在室溫下放置RNA樣本5-10min，晾干。加入無RNA酶處理水20-50μl，55-60℃水浴箱中水浴10min。

5)RNA樣品的質(zhì)量分析

分光光度計檢測：

NanoDrop1000分光光度計檢測RNA樣品，RNA-seq測序的樣品要求：OD260/OD280為1.8-2.2。

瓊脂糖凝膠電泳檢測：

將上述提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，Agilent Technologies 2100Bioanalyzer檢測RNA樣品質(zhì)量，觀察28S rRNA和18S rRNA主帶明顯、無降解、RNA完整性指數(shù)合格、濃度達到要求，可以用于芯片的基因表達譜及篩選實驗。

3、逆轉(zhuǎn)錄和標記

用Low RNA Input Linear Amplification Kit將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時用Cy3分別標記實驗組和對照組。

4、雜交

基因芯片采用Aglient公司的人全基因組表達譜芯片。按芯片使用說明書的步驟進行。

5、數(shù)據(jù)分析

利用Agilent GeneSpring軟件對芯片結(jié)果進行分析，篩選表達量具有顯著性差異(標準為該基因在癌與癌旁的表達量相差2倍以上，而且p<0.05)的基因。

6、結(jié)果

結(jié)果顯示，DNAH14在肺腺癌組織中的表達量顯著高于癌旁組織中的表達量。

實施例2 QPCR測序驗證DNAH14基因的差異表達

1、對DNAH14基因差異表達進行大樣本QPCR驗證。按照實施例1中的樣本收集方式選擇肺腺癌癌旁組織和肺腺癌組織各50例。

2、RNA提取步驟如實施例1所述。

3、逆轉(zhuǎn)錄

1)反應體系：

RNA模板 1μl，隨機引物1μl，雙蒸水加至12μl，混勻，低轉(zhuǎn)速離心，65℃5min，然后放在冰上冷卻。

繼續(xù)在12μl反應液中加入下列成分：

5×反應緩沖液4μl，RNA酶抑制劑(20U/μl)1μl，10mM dNTP混合液 2μl，AMV反轉(zhuǎn)錄酶(200U/μl)1μl；充分混勻并進行離心處理；

2)逆轉(zhuǎn)錄反應條件

25℃5min，42℃60min，70℃5min。

3)聚合酶鏈反應

引物設計：

根據(jù)Genebank中DNAH14基因和GAPDH基因的編碼序列設計QPCR擴增引物，由博邁德生物公司合成。具體引物序列如下：

DNAH14基因：

正向引物為5’-AAGTATAATTCAACAACATA-3’(SEQ ID NO.3)；

反向引物為5’-TTCTTATCACATCATCAT-3’(SEQ ID NO.4)。

GAPDH基因：

正向引物為5’-AATCCCATCACCATCTTCCAG-3’(SEQ ID NO.5)；

反向引物為5’-GAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3’(SEQ ID NO.6)。

配制PCR反應體系：

2×qPCR混合液 12.5μl，基因引物2.0μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.5μl，ddH₂O 8.0μl。

PCR反應條件：95℃10min，(95℃15s，60℃60s)×40個循環(huán)，60℃5min延伸反應。75℃至95℃，每20s升溫1℃，繪制溶解曲線。以SYBR Green作為熒光標記物，在Light Cycler熒光定量PCR儀上進行PCR反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，ΔΔCT法進行相對定量。

5、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，癌與癌旁組織的配對比較采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖1所示，與肺腺癌癌旁組織相比，DNAH14在肺腺癌組織中表達上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，同芯片檢測結(jié)果一致。

實施例3 DNAH14基因的沉默

1、細胞培養(yǎng)

人肺腺癌細胞株A549，以含10％胎牛血清和1％P/S的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃、5％CO₂、相對濕度為90％的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2-3天換液1次，使用0.25％含EDTA的胰蛋白酶常規(guī)消化傳代。

將培養(yǎng)瓶中的細胞用胰酶進行消化并接種在6孔板中，保證細胞數(shù)為2-8×10⁵個/孔，加入細胞培養(yǎng)基。過夜，第二天觀察細胞密度，細胞密度為70％以上可進行轉(zhuǎn)染。

2、siRNA的設計

陰性對照siRNA序列(siRNA-NC)：

正義鏈為5’-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3’(SEQ ID NO.7)

反義鏈為5’-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3’(SEQ ID NO.8)

siRNA-1：

正義鏈為5’-UCAUAUCUUAAAAGUCUUGGU-3’(SEQ ID NO.9)

反義鏈為5’-CAAGACUUUUAAGAUAUGAAG-3’(SEQ ID NO.10)

siRNA-2：

正義鏈為5’-UCAUAUGGAUUGUAAAGGGAU-3’(SEQ ID NO.11)

反義鏈為5’-CCCUUUACAAUCCAUAUGAUC-3’(SEQ ID NO.12)

siRNA-3：

正義鏈為5’-UCUACUUCCUUUACACUACCA-3’(SEQ ID NO.13)

反義鏈為5’-GUAGUGUAAAGGAAGUAGAAC-3’(SEQ ID NO.14)

3、轉(zhuǎn)染

將實驗分為三組：對照組(A549)、陰性對照組(siRNA-NC)和實驗組(siRNA-1、siRNA-2、siRNA-3)，其中陰性對照組siRNA與DNAH14基因的序列無同源性，濃度為20nM/孔，同時分別進行轉(zhuǎn)染。

4、QPCR檢測DNAH14基因的轉(zhuǎn)錄水平

4.1細胞總RNA的提取

1)將6孔板中的細胞培養(yǎng)液倒掉，用PBS沖洗兩次，各孔加入1ml Trizol試劑，室溫放置5min。

2)加入0.2m1氯仿，劇烈震蕩15s，4℃，12000g離心15min。

3)水相轉(zhuǎn)移到新管中，加入4.5m1異丙醇，室溫放置10min；4℃，10000g離心10min。

4)倒掉液體，用l ml的75％乙醇洗EP管壁。4℃，7500g，離心5min。

5)倒掉清洗后的75％乙醇，室溫晾置5-10min。

6)加入25μl無RNA酶的DEPC水，-70℃保存。

4.2逆轉(zhuǎn)錄 步驟同實施例2。

4.3 QPCR擴增 步驟同實施例2。

5、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，DNAH14基因?qū)嶒灲M與對照組之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

6、結(jié)果

結(jié)果如圖2顯示，與非轉(zhuǎn)染組與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，實驗組中的DNAH14的表達水平顯著降低，而轉(zhuǎn)染siRNA-3的沉默效果最好，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

實施例4 DNAH14基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋车挠绊?/p>

采用CCK-8實驗檢測DNAH14基因?qū)Ψ蜗侔┘毎鲋衬芰τ绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染步驟同實施例3，轉(zhuǎn)染后6h換液，放置細胞培養(yǎng)箱過夜。

2、第二天將細胞取出，顯微鏡下觀察細胞生長情況，1ml/孔加入含EDTA的胰酶，進行細胞消化，待消化完成后去除胰酶，加入細胞培養(yǎng)基混勻使細胞懸浮，然后進行細胞計數(shù)。

3、將細胞懸液濃度稀釋為15000個/ml，之后往96孔板中進行接種，每孔加入細胞懸液200μl，細胞控制在3000個左右，接種8個復孔。設置siRNA-3實驗組和siRNA-NC對照組。共鋪4塊96孔板分別用于24h、48h、72h、96h 4個檢測時間點。

4、24h后，將第一塊96孔板取出，每孔中加入10μl的CCK-8檢測液，將96孔板繼續(xù)放入細胞培養(yǎng)箱中孵育4h左右，用酶標儀檢測各孔在450nm波長處的吸光度值并記錄數(shù)據(jù)。

5、在48h、72h、96h后分別重復步驟4中的操作，最后統(tǒng)計出各時間點的吸光度值，作出生長曲線圖。

6、統(tǒng)計學分析

實驗都是按照重復3次來完成的，采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析，兩者之間的差異采用t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

7、結(jié)果

結(jié)果如圖3所示，與對照相比，實驗組在轉(zhuǎn)染siRNA-3后，細胞的增殖明顯受到了抑制，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)說明DNAH14具有促進細胞增殖的作用。

實施例5 DNAH14基因?qū)Ψ蜗侔┘毎蛲龅挠绊?/p>

使用流式細胞儀檢測DNAH14基因?qū)毎蛲龅挠绊憽?/p>

1、細胞培養(yǎng) 步驟同實施例3。

2、細胞轉(zhuǎn)染 步驟同實施例3。

3、步驟

1)將3m1 10×上樣緩沖液用27m1蒸餾水稀釋。

2)收集細胞樣本并用預冷的PBS清洗。

3)將細胞加入lml 1×上樣緩沖液，300g離心10min，吸出緩沖液。

4)再次加入lml 1×上樣緩沖液，將細胞懸液中細胞濃度調(diào)整為1×10⁶個/ml。

5)將細胞懸液取出100μl，加入EP管中。

6)將5μl的Annexin V FITC加入EP管中，混勻EP管中的液體，在室溫下避光孵育10min。

7)向EP管中加入5μl PI染液，在室溫下避光5min。

8)在EP管中加入500μl的PBS溶液，輕輕混勻，1h內(nèi)上流式細胞儀進行檢測。

3、統(tǒng)計學方法

實驗都是按照重復3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是以平均值±標準差的方式來表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用的t檢驗，認為當P<0.05時具有統(tǒng)計學意義。

4、結(jié)果：

結(jié)果如圖4所示，實驗組與對照組相比，細胞凋亡率升高，但是差異不大，該結(jié)果說明，DNAH14與肺腺癌細胞凋亡率相關性不高。

實施例6細胞遷移及侵襲實驗

1、Transwell小室制備

無菌條件下Matrigel冰浴融化，用PBS進行20倍稀釋，以50μl/孔的體積鋪在Transwell小室的聚碳酸酯膜上。37℃放置4h，待Matrigel膠聚合成凝膠后取出，輕輕吸出上層析出液。每孔中加入50μl的含BSA的無血清培養(yǎng)液對基底膜進行水化處理，37℃放置30min。

2、配置細胞懸液

細胞撤血清饑餓處理12-24h，對細胞進行消化處理，終止消化后進行離心，去除上層培養(yǎng)液。用PBS對沉淀細胞進行清洗，加入含有BSA的無血清培養(yǎng)基對其進行重懸。調(diào)整細胞的密度至5×l0⁵個/ml。

3、細胞接種

取細胞懸液200μl(遷移實驗為100μl，侵襲實驗為200μl)加入到Transwell小室中。在24孔板下室加入500μl含F(xiàn)BS的1640培養(yǎng)基。把細胞放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。

4、染色

細胞在培養(yǎng)結(jié)束后使用DAPI染色。把小室細胞先用PBS漂洗2遍，放入DAPI工作液中室溫染色5-20min。用PBS漂洗2遍，放入熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)。

5、結(jié)果

結(jié)果如圖5所示，在肺腺癌細胞轉(zhuǎn)染干擾RNA之后，與對照組相比，實驗組的遷移及侵襲能力均有明顯下降，結(jié)果說明DNAH14能夠促進肺腺癌的遷移及侵襲。

上述實施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核心思想。應當指出，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾也將落入本發(fā)明權利要求的保護范圍內(nèi)。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京泱深生物信息技術有限公司

<120> DNAH14基因在腫瘤診治中的應用

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人源

<400> 1

atggagacgt ttatacccat tgatttgaca actgaaaatc aagagatgga caaggaggaa 60

accaagacaa aaccaagact tttaagatat gaagagaaaa aatatgaaga tgtgaaacca 120

ttagagactc aaccagctga aatagcagaa aaggaaacat tggaatataa aacagttaga 180

acattctctg aatctttgaa gtcagagaaa acagaagatt accttagaga aagtataatt 240

caacaacata tggtttctcc agagccagct tcccttaagg agaaagggaa gtcaaggaga 300

aaaaaggatc aaactcatgc ttgtccaaat gttaggaaag ccaggcctgt gtcctatgat 360

agaacagaac caaaagatga tgatgtgata agaaatatta ttaggctacg agaaaagctt 420

ggttggcaaa ctatattacc gcagcacagt ttgaaatacg gaagctccaa aattgcaatt 480

cagaagatta ctttaaagaa acctttggaa gatgatggag aatttgttta ttgccttcct 540

cggaaaagtc ctaaatccct ttacaatcca tatgatcttc aggtagtatc ggctcatact 600

gctaaacatt gcaaagaatt ttgggttatt actgcttcat ttatctcaaa ggttattaat 660

atagttggta gtgtaaagga agtagaactc atacctactt tggaatggct atcagaaaga 720

agacattact atttattacg gcaattcaag atattttctg atttccgaat gaataaagca 780

tttgttacct ggaaattgaa tgttaaaaga attaagacag agaagagcag gtcatttttg 840

taccaccatc tttttttggc tgatgacttg tttcaaacct gtttggttta tataagagga 900

ctttgtgaag atgcaattaa tctcaaaaat tataatgacc atgaaaataa tctatctgcc 960

atatgccttg taaagctgga tagttctcga acatattctc tagatgaatt ttgtgaagag 1020

cagttacagc aagctaccca ggcattgaaa caacttgagg acatcaggaa taaagcaatt 1080

tcagagatga aaagtacttt tctaaaggtt gcagaaaaga atgaaatcaa agagtatttt 1140

gagtcaaaac tctctgaaga tgacacaaca catttcaagc tgcctaaata tagacgttta 1200

ttagaaacat ttttcaagtt tgtaatgctg gttgactaca tatttcagga actcattcgt 1260

caacttatga acactgcagt cacactactt ttggaattat ttaatggttc tgctggaatg 1320

ccattttcag tggaaaaaaa gaatgaaaat cttatcaggt aa 1362

<210> 2

<211> 453

<212> PRT

<213> 人源

<400> 2

Met Glu Thr Phe Ile Pro Ile Asp Leu Thr Thr Glu Asn Gln Glu Met

1 5 10 15

Asp Lys Glu Glu Thr Lys Thr Lys Pro Arg Leu Leu Arg Tyr Glu Glu

20 25 30

Lys Lys Tyr Glu Asp Val Lys Pro Leu Glu Thr Gln Pro Ala Glu Ile

35 40 45

Ala Glu Lys Glu Thr Leu Glu Tyr Lys Thr Val Arg Thr Phe Ser Glu

50 55 60

Ser Leu Lys Ser Glu Lys Thr Glu Asp Tyr Leu Arg Glu Ser Ile Ile

65 70 75 80

Gln Gln His Met Val Ser Pro Glu Pro Ala Ser Leu Lys Glu Lys Gly

85 90 95

Lys Ser Arg Arg Lys Lys Asp Gln Thr His Ala Cys Pro Asn Val Arg

100 105 110

Lys Ala Arg Pro Val Ser Tyr Asp Arg Thr Glu Pro Lys Asp Asp Asp

115 120 125

Val Ile Arg Asn Ile Ile Arg Leu Arg Glu Lys Leu Gly Trp Gln Thr

130 135 140

Ile Leu Pro Gln His Ser Leu Lys Tyr Gly Ser Ser Lys Ile Ala Ile

145 150 155 160

Gln Lys Ile Thr Leu Lys Lys Pro Leu Glu Asp Asp Gly Glu Phe Val

165 170 175

Tyr Cys Leu Pro Arg Lys Ser Pro Lys Ser Leu Tyr Asn Pro Tyr Asp

180 185 190

Leu Gln Val Val Ser Ala His Thr Ala Lys His Cys Lys Glu Phe Trp

195 200 205

Val Ile Thr Ala Ser Phe Ile Ser Lys Val Ile Asn Ile Val Gly Ser

210 215 220

Val Lys Glu Val Glu Leu Ile Pro Thr Leu Glu Trp Leu Ser Glu Arg

225 230 235 240

Arg His Tyr Tyr Leu Leu Arg Gln Phe Lys Ile Phe Ser Asp Phe Arg

245 250 255

Met Asn Lys Ala Phe Val Thr Trp Lys Leu Asn Val Lys Arg Ile Lys

260 265 270

Thr Glu Lys Ser Arg Ser Phe Leu Tyr His His Leu Phe Leu Ala Asp

275 280 285

Asp Leu Phe Gln Thr Cys Leu Val Tyr Ile Arg Gly Leu Cys Glu Asp

290 295 300

Ala Ile Asn Leu Lys Asn Tyr Asn Asp His Glu Asn Asn Leu Ser Ala

305 310 315 320

Ile Cys Leu Val Lys Leu Asp Ser Ser Arg Thr Tyr Ser Leu Asp Glu

325 330 335

Phe Cys Glu Glu Gln Leu Gln Gln Ala Thr Gln Ala Leu Lys Gln Leu

340 345 350

Glu Asp Ile Arg Asn Lys Ala Ile Ser Glu Met Lys Ser Thr Phe Leu

355 360 365

Lys Val Ala Glu Lys Asn Glu Ile Lys Glu Tyr Phe Glu Ser Lys Leu

370 375 380

Ser Glu Asp Asp Thr Thr His Phe Lys Leu Pro Lys Tyr Arg Arg Leu

385 390 395 400

Leu Glu Thr Phe Phe Lys Phe Val Met Leu Val Asp Tyr Ile Phe Gln

405 410 415

Glu Leu Ile Arg Gln Leu Met Asn Thr Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

420 425 430

Leu Phe Asn Gly Ser Ala Gly Met Pro Phe Ser Val Glu Lys Lys Asn

435 440 445

Glu Asn Leu Ile Arg

450

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

aagtataatt caacaacata 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttcttatcac atcatcat 18

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aatcccatca ccatcttcca g 21

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagccccagc cttctccat 19

<210> 7

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 7

uucuccgaac gugucacgu 19

<210> 8

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 8

acgugacacg uucggagaa 19

<210> 9

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 9

ucauaucuua aaagucuugg u 21

<210> 10

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 10

caagacuuuu aagauaugaa g 21

<210> 11

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 11

ucauauggau uguaaaggga u 21

<210> 12

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 12

cccuuuacaa uccauaugau c 21

<210> 13

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 13

ucuacuuccu uuacacuacc a 21

<210> 14

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 14

guaguguaaa ggaaguagaa c 21