專利名稱：：一種檢測漢坦病毒基因組的rt-pcr法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及到病毒檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測漢坦病毒(HV)基因組的方法，包括設(shè)計了兩對新型漢坦病毒通用引物，研究了實驗條件，建立了病毒基因組的RT-PCR方法，并對不同年代漢坦病毒血清標(biāo)本進行了檢測。
背景技術(shù)：
：病毒性疾病是一類嚴(yán)重威脅人類健康的傳染性疾病，85%以上的傳染性疾病由病毒引起，重要病毒危害到國家安全和社會發(fā)展。漢坦病毒(Hantaviruses,HV)是腎綜合征出血熱(hemorrhagicfeverwithrenalsyndromes,HFRS)和漢坦病毒月巿綜合征(hantaviruspulmonarysyndrome,HPS)的病原體，人可通過氣溶膠吸入、傷口、消化道等途徑感染，被世界衛(wèi)生組織列為可通過氣溶膠傳播的生物武器。HFRS/HPS的主要特征是發(fā)熱、出血腎損害和呼吸衰竭。我國是受漢坦病毒危害最為嚴(yán)重的國家，HFRS患者占世界的90Q/。以上。HFRS是經(jīng)嚙齒類動物傳播的急性自然疫源性疾病。HFRS疫區(qū)已擴大到全國31個省市，同時疫區(qū)類型亦發(fā)生改變，80年代前為漢灘型(HTN型)疫區(qū)，之后又出現(xiàn)漢城型(SEO型)且兩型并存，2003年又報道有普馬拉型(PUU型)出現(xiàn)。HV是分節(jié)段的負(fù)單鏈RNA病毒，由L、M、S三個片段組成，分別編碼RNA聚合酶、外膜糖蛋白(G蛋白，GP1&GP2)和衣殼核蛋白。常規(guī)的診斷檢測方法包括病毒的分離鑒定、ELISA法檢測血清中抗HVIgM、IgG抗體，IFA法檢測病毒抗原和抗體，核酸分子雜交檢測病毒基因組等。但經(jīng)典的分離鑒定法費時，IFA法也不適用于快速的現(xiàn)場檢測，檢測HV抗體僅是一個側(cè)面的間接指標(biāo)，用PCR法檢測組織和細(xì)胞中HVRNA已有報道，并認(rèn)為這一方法直觀優(yōu)越，但陽性率低，檢測保存時間久的血清中病毒RNA的研究也未見報道。為了提高血清中HV的檢出率和準(zhǔn)確性，本發(fā)明設(shè)計了兩對新引物，建立了一種檢測血清中病毒RNA的新方法，用于不同時期血清標(biāo)本的檢測，并得到了優(yōu)勢株病毒基因組。國內(nèi)外尚未見此新型漢坦病毒通用引物的研究報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是在于提供了一種檢測漢坦病毒基因組的方法，涉及到所提供RT-PCR的方法在檢測血清樣本中HV基因組的應(yīng)用。該法直觀優(yōu)越、敏感性好、特異性高，對檢測微量、保存時間久的標(biāo)本中漢坦病毒基因組的效果良好，可用于漢坦病毒感染的實驗室檢測和HRFS/HPS的分子流行病學(xué)調(diào)查。為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案A、設(shè)計兩對新型漢坦病毒通用引物本發(fā)明中所設(shè)計的兩對新型漢坦病毒通用引物，從GenBank中獲得HTV76-118、HTV84Fli、HTVCUMC、HTVHoJo、HTVHV114、HTVLee、HTVNC167、SEOBiken-l、SEOHR80-39、SEOKI-83-262、SEOKI-85-l、SEOKI-88-15、SEOL99、SEOR22、SEOSR-ll共15株漢坦病毒基因編碼氨基酸序列和cDNA序列。將所有氨基酸序列和cDNA序列輸入DNASTARMegAlign軟件用ClustalW程序排列，尋找氨基酸序列及對應(yīng)cDNA序列均保守區(qū)域作為引物設(shè)計區(qū)(見表1)。國內(nèi)外尚未見此新型漢坦病毒通用引物設(shè)計的研究報道。表l漢坦病毒引物設(shè)計引物序列(5'-3')位置極性溫度(°c)長度(bp)p1GATTGAAGATATTGA921-941+p2GTCACCGTTGTATCCCCATTGATTGTG、1142-1162-50.1-50.5242p3TGAGAAATGTGTATG96-116+p4ACATGAACTAGACACTGTTTCAAATGA323-343-49.1-49.9248B、漢坦病毒基因組檢測的方法a、用病毒特異性RNA提取試劑盒(Promega公司病毒基因組RNAKit)提取標(biāo)本血清總RNA;b、核酸分析儀檢測RNA含量，所有標(biāo)本RNAOD260/280^1.9，后取50ngRNA進行RT-PCR反應(yīng)；c、RT-PCR:RT使用HV屬特異性引物Po(5'—ATGCAATATGATGAAAAG-3')，其反應(yīng)條件為37。C反應(yīng)60min，93°C5min終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻3min;PCR使用技術(shù)方案A中設(shè)計的新型HV通用引物(P,/P2，P3/P4)，其反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸5min;d、1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察病毒核酸擴增結(jié)果，在250bp處出現(xiàn)一條特異性核酸帶。為保證各種亞型HVRNA都能有效地逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，本研究選用了HV屬特異性引物Po為共同引物，P卜P2引物的設(shè)計參照相應(yīng)的病毒核酸序列。為了增強引物的屬特異性，申請人在引物Pi的5'端添加了2個堿基。同時考慮到目的基因序列越長，其擴增的敏感性越低，故引物設(shè)計時選擇了擴增200-300bp短片段的引物，以增加HVRNA檢測的陽性率。為了能進一步增加本法檢測HVRNA的敏感性，以用于標(biāo)本年限跨度比較大的血清標(biāo)本的研究，因而高效完整地提取RNA是進行RT-PCR反應(yīng)成功的關(guān)鍵。由于HVRNA極易因為長時間保存而發(fā)生降解，且因HV感染后呈一過性病毒血癥導(dǎo)致血液標(biāo)本中的HVRNA含量少，因此，申請人在提取RNA試劑的選擇上，選用了專門從液體標(biāo)本中提取RNA的總RNA提取試劑盒(Promega公司病毒基因組RNAKit)，該試劑盒基于離子吸附原理可有效地提取液體標(biāo)本中的總RNA，去除DNA和蛋白質(zhì)污染；同時又因具備無需低溫操作、離心時間短等優(yōu)點可盡量減少RNA降解和破壞，得到高品質(zhì)的RNA樣品。另外，申請人選用了針對陳舊性標(biāo)本中RNA含量少，進行逆轉(zhuǎn)錄的Sensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶，該酶能將少于50ng的總RNA高效逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，且具有RNaseH活性，能降解RNA:DNA雜合子中的RNA，為PCR反應(yīng)提供純品的cDNA模板。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點1、本發(fā)明中所設(shè)計的兩對新型HV引物針對HV保守序列設(shè)計，可擴增出各種型別的漢坦病毒，陽性檢出率高，適用于臨床檢測未知型別的HV樣本。2、本發(fā)明中所設(shè)計的兩對新型HV通用引物片段較短，靈敏度高，減少了HV檢測假陰性的可能。3、本發(fā)明中所設(shè)計的HV通用引物P1在其5'端添加了2個堿基，增加了檢測的屬特異性，減少了假陽性的可能。4、本發(fā)明中所確立的HV基因組檢測方法，選用了專門針對微量RNA的RNA提取試劑盒和Sensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶，對年代久遠、保存條件較差的HVRNA有亦有良好的檢測效果，對20多年前收集的血清依然有較高的檢出率，可用于臨床、實驗室檢測以及流行病學(xué)研究。圖1為本發(fā)明檢測HV基因組的特異性對照圖M-DNAMarker;l隱陰性對照；2~4-HV76-118;5—8-HV114;9-CBV3;10-HSV-1;11-ddH20對照。圖2為本發(fā)明檢測HV基因組的敏感性對照圖M-DNAMarker;l-陰性對照；2-HV76-118;3~11國HV76-118RNA自0.72ug開始10倍稀釋后擴增；12-ddH20對照。圖3為本發(fā)明用于HV陳舊性血清和組織標(biāo)本的擴增圖M-DNAMarker;l-陰性對照；2-HV76-118陽性對照；34-HV陽性鼠組織；56HV陽性血清；7-ddH20對照。具體實施例方式實施例1:RT-PCR方法檢測HV陽性模板的基因組RNAA、合成兩對新型漢坦病毒通用引物，交由上海生工公司進行a、HVP1/P2上游引物為GATTGAAGATATTGAGTCACC，下游弓I物為GTTGTATCCCCATTGATTGTG;b、HVP3/P4上游引物為TGAGAAATGTGTATGACATGA，下游引物為ACTAGACACTGTTTCAAATGA。B、漢坦病毒基因組檢測的方法1、陽性模板的制備VeroE6細(xì)胞按常規(guī)培養(yǎng)成單層后，分別接種1OOTCID5o的HV76-118和HV114株病毒各lml，吸附2hr將培養(yǎng)液換為含2%胎牛血清的維持液，C02培養(yǎng)箱內(nèi)37。C繼續(xù)培養(yǎng)。14天后刮取少量細(xì)胞，進行HV特異性免疫熒光檢測。收獲感染細(xì)胞，用總RNA提取試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)提取感染細(xì)胞總RNA作為陽性模板。同時設(shè)置陰性對照(正常VeroE6細(xì)胞)。2、RNA的純度和濃度分別測量RNA標(biāo)本在260nm和280nm波長下的光密度值OD260和OD280，通過計算OD260/OD280，確定RNA純度，結(jié)果顯示所有RNA標(biāo)本OD260/OD28021.9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質(zhì)污染；同時讀取并記錄各個RNA樣本濃度，取50ng進行RT-PCR反應(yīng)。3、RT-PCR反應(yīng)取50ng模板RNA，加入200USensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen公司產(chǎn)品)、50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKC1、3mMMgC12、1OmMDTT、10mMdNTPMixlpl、40URNasin和0.4嗎Po引物，無RNase水補足體積至20W。充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液。37°C反應(yīng)lhr，然后93。C5min終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻，一80。C保存待用。取上述反應(yīng)cDNA產(chǎn)物5^1，加入總體積50pl的反應(yīng)體系中，其中含1UTaqDNA聚合酶(Fermentas)、10mMTris-HC1(PH8.8)、50mMKCl、1.5mMMgC12、0.5mMdNTPs和特異性引物(HVPl/P2和HVP3/P4)各lOpmol。充分混勻后，放入PCR擴增儀反應(yīng)。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸5min。整個實驗從RNA提取開始設(shè)置陰性對照和陽性對照。4、瓊脂糖凝膠電泳取5plPCR擴增產(chǎn)物在含5ng/ml溴化乙啶(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，5V/cm,40min后紫外透射反射儀上觀察結(jié)果。6.RT-PCR方法的特異性結(jié)果顯示HTNV76-118株和HV114株病毒核酸擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，在250bp處出現(xiàn)一條特異性核酸帶；而陰性對照擴增產(chǎn)物電泳后未見特異性核酸帶；將HV特異性引物分別用于擴增柯薩奇病毒B組3型(CBV3)和單純皰疹病毒I型(HSV-1)，均未見特異性核酸帶(見圖1所示)。申請人所設(shè)計引物經(jīng)DNASTARPrimerSelect軟件檢測其特異性，結(jié)果顯示上述兩對引物(HVPl/P2和HVP3/P4)對15株HVcDNA序列進行擴增時均只產(chǎn)生一個目的片段產(chǎn)物，無非特異性擴增。7.RT-PCR方法的敏感性將200plHV76-118株病毒培養(yǎng)液中提取的總RNA在核酸分析儀上進行定量為0.72昭，經(jīng)10倍系列稀釋，本法可檢出的最高稀釋度為10—4,即相當(dāng)于72pg核酸中的病毒RNA(見圖2所示)。實施例2:RT-PCR方法檢測陳舊血清標(biāo)本中HVRNA432份1985-1989年、1996-2007年HV血清標(biāo)本RT-PCR檢測。由于血清中病毒核酸水平較低，而RNA又極易降解，通常陳舊性血清中病毒RNA檢出率極低。本研究通過使用HV新型引物(HVP1/P2和HVP3/P4)對每一份提取的核酸標(biāo)本進行分管平行擴增。1、RNA提取取血清200^1，用總RNA提取試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)，按試劑盒說明提取血清總RNA。2、RNA的純度和濃度測定分別測量RNA標(biāo)本在260nm和280nm波長下的光密度值OD260和OD280,通過計算OD260/OD280，確定RNA純度，結(jié)果顯示所有RNA標(biāo)本OD260/OD28021.9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質(zhì)污染；同時讀取并記錄各個RNA樣本濃度，取50ng進行RT-PCR反應(yīng)。3、RT-PCR反應(yīng)取50ng模板RNA,加入200USensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen公司產(chǎn)品)、50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKC1、3mMMgC12、10mMDTT、10mMdNTPMix1^1、40URNasin禾Q0.4ngPo弓l物，無RNase水補足體積至20^1。充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液。37°C反應(yīng)lhr，然后93°C5min終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻，一80。C保存待用。取上述反應(yīng)cDNA產(chǎn)物5^1，加入總體積50nl的反應(yīng)體系中，其中含1UTaqDNA聚合酶(Fermentas)、10mMTris-HC1(PH8.8)、50mMKCl、1.5mMMgCl2、0.5mMdNTPs和特異性引物(HVP,/P2和HVP3/P4)各lOpmol。充分混勻后，放入PCR擴增儀反應(yīng)。.循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，50°C復(fù)性lmin，72°C延伸lmin，循環(huán)35次，最后72°C延伸5min。整個實驗從RNA提取開始設(shè)置陰性對照和陽性對照。4、瓊脂糖凝膠電泳取5^PCR擴增產(chǎn)物在含5pg/ml溴化乙啶(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，5V/cm,40min后紫外透射反射儀上觀察結(jié)果。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見與相應(yīng)陽性模板一致的擴增條帶(見圖3所示)。5、結(jié)果如表2所示，在432份免疫熒光法檢測陽性標(biāo)本中(免疫熒光檢測均為標(biāo)本收集當(dāng)年完成)，有318份可經(jīng)本法擴增得到特異性PCR產(chǎn)物，檢出率高達73.6%。其中，近10年(1996-2007年)的血清標(biāo)本的檢出率接近80%(79.2%),20年前(1985-1989年)陳舊性標(biāo)本的檢出率仍可高達70.5%以上，可見本法對陳舊性血清標(biāo)本仍有較高檢出率。表2本法用于檢測各年度HFRS患者血清的陽性數(shù)時間(年)免疫熒光法檢測陽性數(shù)(個)本法檢測陽性數(shù)(個)本法檢出率1985-198927819670.5%1996-200715412279.2%Total43231873.6%實施例3:RT-PCR方法用于流行病學(xué)檢測鼠肺組織中HVRNA2002年湖北地區(qū)江夏、南漳、蘄春、新洲四縣野外收集204份鼠組織標(biāo)本RT-PCR檢測。本研究通過使用HV新型引物(HVP1/P2和HVP3/P4)對每一份提取的核酸標(biāo)本進行分管平行擴增，擴增獲得特異性條帶者即為HV感染陽性。1、RNA提取野鼠乙醚麻醉后頸椎脫臼處死，取鼠肺組織約20-30mg，勻漿后用總RNA提取試劑盒(Promega公司產(chǎn)品)，按試劑盒說明提取肺組織總RNA。2、RNA的純度和濃度測定分別測量RNA標(biāo)本在260nm和280nm波長下的光密度值OD260和OD280,通過計算OD260/OD280,確定RNA純度，結(jié)果顯示所有RNA標(biāo)本OD260/OD28021.9，表明RNA純度較高，無DNA和蛋白質(zhì)污染；同時讀取并記錄各個RNA樣本濃度，取50ng進行RT-PCR反應(yīng)。3、RT-PCR反應(yīng)取50ng模板RNA，加入200USensiscript逆轉(zhuǎn)錄酶(Qiagen公司產(chǎn)品)、50mMTris-HCl(pH8.3)、75mMKC1、3mMMgC12、lOmMDTT、10mMdNTPMixlnl、40URNasin和0.4嗎P。引物，無RNase水補足體積至20^1。充分混勻，短暫離心收集反應(yīng)液。37°C反應(yīng)lhr，然后93°C5min終止反應(yīng)，迅速置冰上冷卻，一8(TC保存待用。取上述反應(yīng)cDNA產(chǎn)物5|il，加入總體積50^1的反應(yīng)體系中，其中含1UTaqDNA聚合酶(Fermentas)、10mMTris-HC1(PH8.8)、50mMKC1、1.5mMMgCl2、0.5mMdNTPs和特異性引物(HVPi/P2和HVP3/P4)各lOpmol。充分混勻后，放入PCR擴增儀反應(yīng)。循環(huán)反應(yīng)參數(shù)為94°C預(yù)變性3min，94°C變性1min，50DC復(fù)性lmin，72°C延伸lmin,循環(huán)35次，最后72°C延伸5min。整個實驗從RNA提取開始設(shè)置陰性對照和陽性對照。4、瓊脂糖凝膠電泳取5plPCR擴增產(chǎn)物在含5嗎/ml溴化乙啶(EB)的1.5%瓊脂糖凝膠上電泳，5V/cm，40min后紫外透射反射儀上觀察結(jié)果。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可見與相應(yīng)陽性模板一致的擴增條帶(見圖3所示)。5、結(jié)果如表3所示，在204份鼠肺組織標(biāo)本中，33份經(jīng)本法擴增得到特異性PCR產(chǎn)物(見表3)。可見，湖北各地區(qū)野鼠帶毒率高。HV通過咬傷或螨、虱等媒介均可感染人，農(nóng)民和野外工作者戶外勞動時需注意安全防護。本法可作為HV流行病學(xué)調(diào)査的有力工具。表3本法用于流行病學(xué)檢測鼠肺組織HV陽性標(biāo)本數(shù)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>權(quán)利要求1.一種檢測漢坦病毒株基因組的方法，其步驟是A、設(shè)計兩對漢坦病毒通用引物a、HVP1/P2上游引物為GATTGAAGATATTGAGTCACC，下游引物為GTTGTATCCCCATTGATTGTG；b、HVP3/P4上游引物為TGAGAAATGTGTATGACATGA，下游引物為ACTAGACACTGTTTCAAATGA；B、漢坦病毒檢測的方法a、用病毒特異性RNA提取試劑盒提取標(biāo)本血清總RNA；b、核酸分析儀檢測RNA含量，所有標(biāo)本RNAOD260/280≥1.9，后取50ngRNA進行RT-PCR反應(yīng)；c、RT-PCRRT使用HV屬特異性引物P05’-ATGCAATATGATGAAAAG-3’，其反應(yīng)條件為37℃反應(yīng)60min，93℃5min終止反應(yīng)，置冰上冷卻3min；PCR使用HV通用引物P1/P2，P3/P4，其反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3min，94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，循環(huán)35次，最后72℃延伸5min；d、1.5％瓊脂糖凝膠電泳觀察病毒核酸擴增結(jié)果，在250bp處出現(xiàn)一條特異性核酸帶。全文摘要本發(fā)明公開了一種檢測漢坦病毒株基因組的方法，其步驟是A、設(shè)計兩對漢坦病毒通用引物；B、漢坦病毒檢測的方法a.用病毒特異性RNA提取試劑盒提取標(biāo)本血清總RNA；b.核酸分析儀檢測RNA含量，取RNA進行RT-PCR反應(yīng)；c.RT-PCRRT使用HV屬特異性引物P₀，PCR使用HV通用引物P₁/P₂，P₃/P₄；d.瓊脂糖凝膠電泳觀察病毒核酸擴增結(jié)果，出現(xiàn)—特異性核酸帶。本發(fā)明直觀優(yōu)越，敏感性好，效果良好，近10年血清的檢出率為79.2％，20年前血清的檢出率仍可高達70.5％，適用于漢坦病毒感染的實驗室檢測和分子流行病學(xué)調(diào)查。文檔編號C12Q1/70GK101294226SQ20081004735公開日2008年10月29日申請日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2008年4月17日發(fā)明者萍付,婧劉,晴李,楊占秋,紅肖,文陳申請人:武漢大學(xué)