專利名稱：一種抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的雞尾酒疫苗及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫學(xué)領(lǐng)域和疫苗研制技術(shù)，具體涉及抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的雞尾酒疫苗及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1.免疫耐受性病毒及其免疫學(xué)基礎(chǔ)免疫耐受性病毒是指可導(dǎo)致機體免疫系統(tǒng)反應(yīng)能力低下的病毒。雖然各個病毒的致病機理不盡相同，但它們都導(dǎo)致以病毒的持續(xù)存在、B細胞和T細胞產(chǎn)生抗體和細胞免疫的能力下降或消失為特征的疾病。在引起肝炎的眾多病毒中，乙肝病毒(HBV)和丙肝病毒(HCV)是最重要的兩個免疫耐受性病毒。
免疫耐受性病毒可有效的逃逸機體免疫，引起免疫耐受，使人體的免疫機制不再對抗原產(chǎn)生免疫應(yīng)答，使病毒在體內(nèi)長期存在。HBV是最典型的免疫耐受性病毒，感病母親所產(chǎn)90％新生兒成為病毒攜帶者，部分成人HBV患者也會形成乙肝的慢性感染。HBV的持續(xù)性感染和抗原的過量表達以及病毒的變異往往導(dǎo)致患者體內(nèi)持續(xù)的病毒復(fù)制、胸腺中病毒特異的與免疫調(diào)節(jié)相關(guān)的Th1類細胞被克隆剔除、外周血和肝臟中與病毒清除和感染細胞裂解相關(guān)的CTL反應(yīng)能力下降、消失或者克隆剔除。HBV的持續(xù)性感染以及與之相關(guān)的肝硬化和肝癌對患者對社會造成了極大的經(jīng)濟和社會壓力。
HBV的主要結(jié)構(gòu)抗原包括表面抗原S，(包括糖基化的大抗原S1S2S，中抗原S2S和小抗原S)和核心蛋白C，此外還有聚合酶P和調(diào)節(jié)蛋白e和x。S和C抗原可以引起中和抗體的產(chǎn)生。核心蛋白C相對保守，它產(chǎn)生的特異的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)對病毒清除具有重要意義。對HBV來說，e抗原的大量表達能夠使得Th1類細胞受到抑制，表面抗原的大量表達使得免疫系統(tǒng)枯竭(exhausted)。
HCV免疫耐受機制與HBV不同，HCV多為低水平感染，不易產(chǎn)生活躍的免疫應(yīng)答，此外HCV基因極易產(chǎn)生變異，造成免疫逃逸，產(chǎn)生持續(xù)性感染和免疫耐受。
HCV多蛋白N末端191個氨基酸為核心蛋白，是病毒核衣殼的主要成分。核心蛋白的N末端富含堿性氨基酸且高度保守。核心蛋白后是病毒的包膜蛋白E1，E2，是高度糖基化的I型跨膜蛋白。在所有HCV蛋白中，E2的保守性最弱，是免疫反應(yīng)的主要目標。大多數(shù)的HCV非結(jié)構(gòu)蛋白(NS2-NS5B)為病毒基因組復(fù)制所必需。HCV是一種高度變異的病毒，這種變異使得HCV在感染者體內(nèi)形成復(fù)雜多樣的HCV準種群，有可能對機體抗病毒免疫應(yīng)答產(chǎn)生影響。免疫逃避株的形成則可能與病毒持續(xù)感染有關(guān)。免疫逃避的兩種可能機制(1)HCV對IFN應(yīng)答的主動拮抗作用，如HCV NS3/4絲氨酸蛋白酶可以阻斷干擾素調(diào)節(jié)因子3的磷酸化和活性；E2和NS5蛋白能夠抑制RNA依賴性蛋白激酶的功能，從而影響IFN的抗病毒效應(yīng)。(2)HCV蛋白上B淋巴細胞或者T淋巴細胞抗原表位在機體免疫力下發(fā)生被動變異，從而逃避適應(yīng)性免疫應(yīng)答的攻擊。
2.免疫缺陷性病毒及其免疫學(xué)基礎(chǔ)免疫缺陷病毒的典型代表是人免疫缺陷病毒(HIV)。HIV通過感染CD4 T細胞，導(dǎo)致CD4+T淋巴細胞數(shù)量不斷下降。另外，HIV感染還引起B(yǎng)-細胞功能失調(diào)和NK細胞的細胞毒功能下降，使具有免疫功能的樹突狀細胞(DC)的數(shù)量在血液中和組織中的分布和數(shù)量改變。HIV感染還可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及胃腸道等器官產(chǎn)生病變。由于免疫功能下降，患者并發(fā)各種癌癥和傳染病的可能性大增，并最終導(dǎo)致獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。
HIV的結(jié)構(gòu)基因包括gag(P55、P17、P24)、Pol和env。Pol基因編碼聚合酶前體蛋白(P34)，經(jīng)切割形成蛋白酶、整合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸酶H，均為病毒增殖所必需。env基因編碼約863個氨基酸的前體蛋白，經(jīng)糖基化形成gp160，gp120和gp41。gp120含有中和抗原決定簇，已證明HIV中和抗原表位在gp120 V3環(huán)上，V3環(huán)區(qū)是囊膜蛋白的重要功能區(qū)，在病毒與細胞融合中起重要作用。gp120與跨膜蛋白gp41以非共價鍵相連。gp41參與靶細胞融合，促使病毒侵染細胞。實驗表明gp41亦有較強抗原性，能誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體反應(yīng)。HIV的調(diào)控基因至少包括Tat、Rev、Nef、Vif、Vpu、Vpr。HIV的免疫治療應(yīng)該建立阻斷病毒持續(xù)侵染CD4+T細胞的機制，抑制感染細胞內(nèi)部HIV的持續(xù)復(fù)制并產(chǎn)生中和抗體和CTL反應(yīng)。
3.免疫耐受性病毒和免疫缺陷性病毒疫苗的研究進展(1)HBV疫苗研究進展HBV的預(yù)防性表面抗原疫苗得到了廣泛的應(yīng)用并在很大程度上降低了HBV的感染，但此種疫苗卻不能治療HBV的慢性感染。傳統(tǒng)治療HBV感染的方法包括α-IFN以及化學(xué)藥物，它們在控制病毒的復(fù)制方面具有重要的作用，但是卻不能有效地清除病毒(Seeger and Mason 2000)。單一策略的DNA疫苗雖然因為能夠誘發(fā)細胞和體液免疫而受到重視，但是DNA疫苗在小動物實驗中的結(jié)果卻不能在大動物身上實現(xiàn)(Payette et al.2006；Zhao et al.2006)。隨著對HBV以及其誘發(fā)疾病研究的深入，已經(jīng)有部分的臨床實驗采用化學(xué)藥物和蛋白疫苗結(jié)合的綜合性療法，雖取得了一定的成果(Yang，Lee et al.2006)，但傳統(tǒng)藥物在克服病毒變異造成的免疫逃逸、降低病毒復(fù)制和恢復(fù)機體的CTL反應(yīng)能力方面還沒有樂觀的報道。至今尚無被批準的HBV治療性疫苗問世。
(2)HCV疫苗研究進展HCV引起的丙型肝炎，其感染的慢性化率高達60-80％，并導(dǎo)致肝硬化和肝癌。HCV主要通過輸血傳染，血液的嚴格檢查可控制HCV新感染的發(fā)生率，根據(jù)上述情況，HCV的疫苗研究主要是針對治療性疫苗的研究。由于HCV基因高度可變，又缺乏合適的細胞培養(yǎng)系統(tǒng)和小動物模型，有效的重組疫苗研發(fā)受到阻礙。盡管如此，基因疫苗，多肽和蛋白質(zhì)疫苗，基于DC細胞的疫苗和類病毒顆粒疫苗等研究都被廣泛關(guān)注(Manns et al.2001)。丙型肝炎的實驗疫苗起步時，不外乎傳統(tǒng)意義上的疫苗策略，即尋找特異的抗原成分，來免疫宿主以期獲得中和性或保護性抗體。在研究中，以重組E1/E2蛋白免疫猩猩能誘導(dǎo)高滴度抗膜蛋白(anti-envelope)抗體產(chǎn)生但只能保護動物免受低價病毒侵害(Foms et al，1998；Zhou et al.2000；Lee et al 1998)?；蛞呙缬?992年首先報道，近來發(fā)展迅速，該技術(shù)將編碼抗原的DNA直接注射到宿主肌肉或皮內(nèi)，能誘導(dǎo)特異性體液免疫以及更廣譜的細胞免疫應(yīng)答，HCV全基因組序列的測序使得HCV基因疫苗的研究逐步深入(Jiao et al.2004)，但重組DNA疫苗的應(yīng)用同樣受到載體特征的限制。HCV疫苗面臨的挑戰(zhàn)，仍然是病毒蛋白的高變性，尤其是包膜蛋白的變異更為主要，而與HCV相關(guān)的LDL蛋白又使得大部分病毒顆粒具有不可中和性，成為疫苗研究的挑戰(zhàn)。由于HCV中和抗體的弱保護活性、病毒的高度變異性以及機體免疫功能的破壞，單一策略的疫苗研究思路在HCV的免疫治療中不能產(chǎn)生重要的治療作用(Inchauspe et al.2003)。HCV臨床研究的現(xiàn)狀迫切需要人們確立一種按照病毒侵染過程和肌體免疫反應(yīng)為特征的綜合性治療策略。
(3)HIV疫苗研究進展自20世紀80年代初發(fā)現(xiàn)艾滋病之后，人們早在1986年即開始嘗試HIV的預(yù)防和治療性疫苗。主要的疫苗策略包括HIV的滅活疫苗、減毒活疫苗，這些通過對病毒的處理而獲得的疫苗雖可持續(xù)產(chǎn)生抗體和CTL免疫反應(yīng)，并可保護試驗成年恒河猴降低SIV感染，但這些猴子最終還是發(fā)展成艾滋病(Baba T W et al.，1999)，因此人們對滅活或減毒活疫苗在人體中的應(yīng)用持保守態(tài)度。對HIV重組亞單位疫苗的研究也沒有獲得可應(yīng)用的成果，如美國首次進入臨床實驗的HIV膜蛋白gp160抗原疫苗，雖然gp120能結(jié)合到CD4細胞上并在一定程度上阻斷HIV的入侵，但由于HIV具有其它途徑與細胞表面的病毒受體結(jié)合，此種亞單位疫苗應(yīng)用人體后既不能誘發(fā)CTL也不能產(chǎn)生中和抗體，在美國和泰國進行的III期臨床實驗已失敗告終(Dennis R B et al.，2004)。HIV病毒樣顆粒疫苗是應(yīng)用部分HIV DNA感染后產(chǎn)生的病毒蛋白組裝成顆粒樣結(jié)構(gòu)的一種疫苗。由于它在靈長類動物中具有很強的免疫原性而受到重視。我國肖瑤等(肖瑤等，2000)研制的Gag和Gag V3基因的病毒樣顆粒在小鼠模型上可誘導(dǎo)體液免疫和一定程度的細胞免疫，但未見在靈長類動物上的實驗結(jié)果。重組DNA疫苗是把HIV外源基因插入活的病毒載體，通過病毒使外源基因在宿主細胞中表達，由此產(chǎn)生更廣的宿主免疫應(yīng)答。這些載體增加了疫苗安全性而不減弱其免疫活性(Bruyn Get al.，2004)。為進一步增加疫苗的安全性，研制減毒痘苗病毒載體已有進展(Qing F，et al.，2005)。DNA疫苗用含HIV基因的質(zhì)粒免疫動物，可誘導(dǎo)特異性抗體產(chǎn)生，同時還觀察到特異性T淋巴細胞的CTL應(yīng)答。質(zhì)粒DNA疫苗在恒河猴能誘導(dǎo)SIV特異性CTL，這種疫苗誘導(dǎo)的免疫能促進第二次CTL應(yīng)答的產(chǎn)生，并能控制隨后的致病性SIV感染后的病毒復(fù)制(Egan M A，et al.，2000)。采用質(zhì)粒DNA免疫原作為HIV候選疫苗的人體早期實驗研究已在進行中。但HIV疫苗的面臨巨大挑戰(zhàn)，迄今全球艾滋病疫苗進行了廣泛的臨床前實驗研究，以及近百次的艾滋病疫苗I期臨床實驗，少數(shù)疫苗已完成或正在進行II期臨床實驗。但目前尚無在臨床實驗中顯示能提供確切保護作用的疫苗，已完成的兩個艾滋病疫苗III期臨床實驗均宣告失敗。
根據(jù)上述研究結(jié)果以及國內(nèi)外對免疫耐受性和免疫缺陷性病毒疫苗尚未取得突破性進展，并面臨嚴峻的社會需求和技術(shù)性挑戰(zhàn)的現(xiàn)狀，我們及時提出一種新的疫苗研制策略，即雞尾酒式抗免疫耐受和免疫缺陷性病毒研制新策略，其要點是根據(jù)病毒感染的特征和機體的應(yīng)答特征，將多種抗病毒元件結(jié)合在一個疫苗中。構(gòu)建的雞尾酒疫苗經(jīng)證實比單一組份的疫苗有更大的免疫活性，并可在多個層面上抑制病毒的感染、復(fù)制以及造成的免疫損傷。正像艾滋病藥物治療中的雞尾酒用藥方式那樣取得了良好的療效。在本專利所公開的發(fā)明中，我們按照病毒侵染細胞的過程和造成的機體免疫反應(yīng)的特點，設(shè)計了針對病毒不同侵染階段的包含多個抗病毒元件的重組DNA、痘苗病毒和/或腺病毒。由它們的不同組合所構(gòu)建的雞尾酒疫苗可以在病毒入侵的第一階段進行阻斷；針對病毒變異的特征設(shè)計的RNA干擾序列和序列庫可有效抑制病毒核酸復(fù)制和變異的機率；使用熱休克蛋白gp96作為免疫佐劑能增強免疫活性并活化抗病毒的天然免疫和適應(yīng)性免疫能力；從病毒抗原的多個變異序列中的保守序列設(shè)計具有廣泛交叉反應(yīng)活性的重組疫苗；采用重組DNA載體免疫和病毒載體免疫的方式能最有效的發(fā)揮抗病毒免疫作用。這種雞尾酒疫苗具有單一成份的疫苗及其改進型所不具備的整體優(yōu)勢，是一種全新的制備疫苗的策略。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征在于聯(lián)合應(yīng)用包括免疫佐劑如熱休克蛋白gp96或其氨基端片段、抗原抗體中和反應(yīng)、細胞免疫反應(yīng)、抗病毒細胞因子、受體阻斷劑、膜融合抑制物、以及抑制病毒復(fù)制的干擾RNA等策略以研制抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的疫苗?？乖侵覆《窘Y(jié)構(gòu)基因或與佐劑融合的結(jié)構(gòu)基因、病毒的調(diào)節(jié)基因、病毒抗原表位或其多表位融合基因、抗原表位-MHC-I單鏈三聚體(SCT)等。通過聯(lián)合應(yīng)用包括與抑制病毒侵染和復(fù)制相關(guān)的元件、病毒抗原、以及能激活機體天然免疫和適應(yīng)性免疫相關(guān)的元件，達到預(yù)防病毒感染，控制病毒復(fù)制并恢復(fù)機體免疫功能的目的。
在本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了抗免疫耐受病毒和/或囊膜病毒的雞尾酒疫苗，其包括兩種或兩種以上元件以及任選的病毒抗原重組蛋白以及任選的可藥用賦形劑，所述元件以重組DNA和/或重組病毒形式存在，所述元件選自(A)中和抗體、受體阻斷劑、膜融合抑制劑、細胞因子編碼序列，和/或RNA干涉序列；(B)免疫佐劑編碼序列；(C)抗原基因、病毒抗原與免疫佐劑融合基因、病毒抗原表位編碼序列、多表位融合基因和/或病毒抗原表位-MHC-I SCT基因；(D)囊膜病毒融合蛋白的兩個七肽重復(fù)序列HR1(SEQ ID NO17)、HR2(SEQ ID NO16)和/或其聚合物HR212(SEQ ID NO18)的編碼序列。
具體地，所述抗免疫耐受病毒可以選自，但不限于HBV和HCV；所述抗免疫缺陷病毒可以選自，但不限于HIV；所述病毒抗原重組蛋白可以選自，但不限于以下序列表達的蛋白病毒抗原的比對保守序列，主要流行株序列或其部分序列，或病毒抗原與佐劑融合的融合基因序列；所述膜融合抑制劑可以選自，但不限于HIV膜融合的七肽重復(fù)序列HR1、HR2或其聚合物；所述細胞因子可以選自，但不限于，細胞因子IFNα(1和2)或γ，TNF(腫瘤壞死因子)α，IL-2；所述RNA干涉序列可以選自，但不限于病毒編碼序列或非編碼序列；所述免疫佐劑可以是熱休克蛋白gp96或其N端序列；所述抗原基因可以選自，但不限于病毒抗原的比對保守序列，主要流行株序列或其部分序列，或病毒抗原與佐劑融合的融合基因序列；所述病毒抗原表位編碼序列可以選自，但不限于病毒結(jié)構(gòu)基因或調(diào)解基因表位序列；所述多表位融合基因可以選自，但不限于，病毒Th(輔助性T細胞)表位和MHC-I(主要組織相容性抗原I)限制表位與佐劑或/和泛素融合序列；所述病毒抗原表位-MHC-I SCT基因可以選自，但不限于HLA-A2、HLA-A11、HLA-A24、HLA-30與病毒抗原和β2m的融合序列。所述重組DNA可以是重組質(zhì)粒，所述重細病毒可以是重組腺病毒或重組痘苗病毒；所述質(zhì)?？梢允钦婧吮磉_載體。
在本發(fā)明的另一個方面，本發(fā)明還提供了將本發(fā)明的抗免疫耐受病毒和/或囊膜病毒的雞尾酒疫苗用于制備預(yù)防和/或治療由免疫耐受性病毒和免疫缺陷病毒引起的疾病的藥物中的用途。
在本發(fā)明的又一個方面，本發(fā)明提供了用所述藥物治療由免疫耐受性病毒和免疫缺陷病毒引起的疾病的方法。
下面是本發(fā)明的具體實施方案。
1.HBV治療性雞尾酒疫苗本發(fā)明中公開的HBV治療性雞尾酒疫苗是選自以下兩種或兩種以上元件的組合而構(gòu)建的重組DNA、腺病毒和/或痘苗病毒以及它們的組合物(1)有效降低HBV-DNA復(fù)制的干擾RNA(siRNA)和/或IFN(干擾素)α(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？val＝NM_024013.1，序列號NM_024013；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi？db＝protein&val＝11067751，序列號NM_000605)或γ編碼序列；(2)佐劑分子gp96或其氨基端片段的編碼序列；(3)HBV的結(jié)構(gòu)抗原HBsAg、HBcAg或其與佐劑融合的融合基因、HBV的抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。DNA載體、病毒載體具有靈活的插入序列可選擇性和良好的外源基因表達和修飾能力，此外病毒載體上還具有誘發(fā)天然免疫的多種活性元件。用DNA疫苗免疫和病毒疫苗加強的免疫步驟不僅可以有效的實現(xiàn)上述多種元件的表達，免疫所產(chǎn)生的CTL還具有向感染部位遷移的能力。此外用痘苗病毒和腺病毒載體的交叉免疫方式可避免機體對同一種病毒載體再度免疫時所產(chǎn)生的中和作用。
本發(fā)明中HBV的治療性雞尾酒疫苗包括疫苗組合形式一多載體HBV治療性雞尾酒疫苗由重組DNA、痘苗病毒和腺病毒組成的多載體雞尾酒疫苗(

圖1所示)，其中載體一為包含抑制HBV復(fù)制的RNA干擾元件的重組腺病毒或包含多個RNA干擾元件的重組腺病毒庫。載體二為包含HBV結(jié)構(gòu)基因或HBV抗原表位或結(jié)構(gòu)基因以及表位與佐劑的融合基因以及包含表位序列的SCT基因的重組DNA或重組DNA庫。載體三為重組痘苗病毒或重組病毒庫，包含IFN基因、HBV的結(jié)構(gòu)基因或結(jié)構(gòu)基因與佐劑gp96或其N片段融合基因、HBV抗原表位或多表位重組體以及與佐劑gp96或其N片段的融合基因、HBV抗原表位的SCT基因。多載體HBV雞尾酒疫苗還包括重組DNA、痘苗病毒和腺病毒與HBV表面抗原蛋白的彼此分離的組合。
疫苗組合形式二單載體HBV治療性雞尾酒疫苗其特征為包含以下元件的重組痘苗病毒或重組腺病毒或重組痘苗病毒庫或重組腺病毒庫(如圖7所示)IFN基因、HBV的結(jié)構(gòu)基因或結(jié)構(gòu)基因與佐劑gp96或其N片段融合基因、HBV抗原表位或多表位重組體以及與佐劑gp96或其N片段的融合基因、HBV抗原表位的SCT基因、調(diào)解基因和非編碼基因?qū)?yīng)的RNA干涉序列。單載體HBV治療性雞尾酒疫苗還包括由重組病毒或重組病毒庫與HBV表面抗原的彼此分離的組合。
2.HCV治療性雞尾酒疫苗本發(fā)明中公開的HCV治療性雞尾酒疫苗是選自以下兩種或兩種以上元件的組合而構(gòu)建的重組DNA、痘苗病毒和腺病毒以及它們的組合物(1)有效降低HCV復(fù)制的干擾RNA(siRNA)和/或IFNα或γ；(2)佐劑分子gp96或其氨基端片段；(3)HCV的結(jié)構(gòu)抗原衣殼蛋白core(SEQ IDNO58)、E1(SEQ ID NO69)、E2(SEQ ID NO70)編碼序列(http://hcv.lanl.gov/components/hcv-db/combined_search/query_one.comp？se_id＝17434)或其與佐劑融合的融合基因、HCV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。HCV雞尾酒疫苗的組合形式與HBV雞尾酒疫苗相似，分為多載體HCV治療性雞尾酒疫苗和單載體HCV治療性雞尾酒疫苗。
3.HIV-1預(yù)防性雞尾酒疫苗本發(fā)明中公開的HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗是選自以下兩種或兩種以上元件的組合而構(gòu)建的重組DNA、痘苗病毒和腺病毒以及它們的組合物
(1)可阻斷病毒與細胞融合的七肽重復(fù)序列HR212的編碼序列；(2)佐劑分子gp96或其氨基端片段的編碼序列；(3)HIV的結(jié)構(gòu)抗原基因env(SEQ ID NO61)、gag(SEQ ID NO59)、pol(SEQ ID NO60)編碼序列或其與佐劑融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗的組合形式有如下幾種疫苗組合形式一含有分泌表達的HR212元件的多載體HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗其特征為包含分泌型表達特征的HR212的重組DNA、腺病毒和痘病毒。其中HR212的特征為由經(jīng)比對的HIV保守七肽重復(fù)序列、HIV主要流行株系的序列以及序列庫。
疫苗組合形式二多載體HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗由重組DNA、痘苗病毒和腺病毒組成的多載體雞尾酒疫苗，其特征為包含分泌表達的HR212以及HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol或其與佐劑融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征為由經(jīng)比對的HIV保守性七肽重復(fù)序列或HIV主要流行株系HR212序列及其序列庫。
疫苗組合形式三含有分泌表達的HR212元件的單載體HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗其特征為包含分泌型表達特征的HR212的重組DNA(庫)或重組腺病毒(庫)或痘病毒(庫)。其中HR212的特征為由經(jīng)比對的HIV保守性七肽重復(fù)序列、HIV主要流行株系的HR212序列以及序列庫。
疫苗組合形式四單載體HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗由重組DNA或腺病毒或痘苗病毒組成的單載體雞尾酒疫苗，其特征為包含分泌表達的HR212以及HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol或其與佐劑融合的融合的抗原基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征為由經(jīng)比對的HIV一致性七肽重復(fù)序列、HIV主要流行株系的序列以及序列庫。
4.HIV-1治療性雞尾酒疫苗本發(fā)明中公開的HIV治療性雞尾酒疫苗是選自以下兩種或兩種以上元件的組合而構(gòu)建的重組DNA、痘苗病毒和腺病毒以及它們的組合物(1)可阻斷病毒與細胞融合的七肽重復(fù)序列聚合物HR212；(2)可有效抑制HIV復(fù)制的干擾RNA(siRNA)和/或IFNα或γ；(3)佐劑分子gp96或其氨基端片段；(4)HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol或其與佐劑融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。HIV雞尾酒疫苗的組合形式有如下幾種。
疫苗組合形式一多載體HIV治療性雞尾酒疫苗由重組DNA、痘苗病毒和腺病毒組成的多載體雞尾酒疫苗(圖1所示)，其中載體一為腺病毒或腺病毒庫，其特征為包含抑制HIV復(fù)制的有效的RNA干涉元件和/或分泌表達的HR212的。載體二為重組DNA庫，其特征為包含分泌表達的HR212、HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol或其與佐劑融合的融合基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征為由經(jīng)比對的HIV一致性七肽重復(fù)序列、HIV主要流行株系的序列以及序列庫。
疫苗組合形式二單載體HIV治療性雞尾酒疫苗由重組DNA或腺病毒或痘苗病毒組成的單載體雞尾酒疫苗，其特征為包含分泌表達的HR212以及HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol或其與佐劑融合的融合的抗原基因、HIV抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I SCT基因。其中HR212的特征為由經(jīng)比對的HIV保守性七肽重復(fù)序列、HIV主要流行株系的HR212序列以及序列庫。
附圖簡述圖1多載體雞尾酒疫苗的載體和構(gòu)建策略。
其中載體I的腺病毒載體攜帶單個或多個RNA干涉元件，也可以是攜帶不同RNA干涉元件的腺病毒庫，其中A、B表示不同的RNA干涉元件，載體I可以單獨或混合的組成多載體疫苗中的一種組分。載體II的DNA載體攜帶病毒的結(jié)構(gòu)抗原基因或由結(jié)構(gòu)抗原與佐劑融合的融合基因或由表位融合構(gòu)建的多表位基因或由單表位構(gòu)建的SCT或其混合物，其中的A代表上述任意元件，載體II可以單獨或混合的組成多載體疫苗中的一種組分。載體III包括細胞因子編碼序列以及任選的載體II基因，其中A、B、C、D分別表示表示載體III所攜帶的不同元件，載體III可以單獨或混合的組成多載體疫苗中的一種組分。多載體HBV治療性雞尾酒疫苗包括任選的單獨包裝的兩種或者三種載體。其中載體I和載體II可以單獨與載體III組合構(gòu)建雙載體雞尾酒疫苗，載體I和載體II也可以與載體III組合構(gòu)建三載體雞尾酒疫苗。
圖2攜帶RAN干涉元件的重組腺病毒載體。
A細胞內(nèi)形成的針對HBV的siRNA的DNA模板根據(jù)HBV的序列設(shè)計出互補的sense和antisense oligos，退火成雙鏈。為方便與SalI/XbaI消化載體pAVU6+27相連，在DNA oligos的5’末端加了SalI，3’端加了XbaI酶切位點，中間灰色部分為轉(zhuǎn)錄后預(yù)期形成的環(huán)結(jié)構(gòu)，為使翻譯有效終止，在末端設(shè)計了終止信號dT(5)。
BNorthern雜交檢測HepG2.2.15細胞中HBV mRNA的水平提取HepG2.2.15細胞的RNA，以HBV DNA為探針進行Northern雜交，并且以GAPDH作為內(nèi)對照。磷屏分析結(jié)果表明，與對照相比，轉(zhuǎn)染了siHBV1(P1)或siHBV2(P2)重組腺病毒的2215細胞中，3.5Kb和2.4Kb/2.1Kb的mRNA水平明顯減少。在對照組中，轉(zhuǎn)染了與HBV基因無關(guān)的重組病毒U6(mock)或siEGFP(E)的細胞中，其mRNA水平與未轉(zhuǎn)染細胞(C)中的mRNA水平相當，表明對照基因siEGFP不會影響HBVmRNA水平，顯示了siRNA作用的特異性。C代表未轉(zhuǎn)染的2215細胞；mock，E，P1，P2分別代表轉(zhuǎn)染了含有U6+27，U6+27-siEGFP，U6+27-siHBV1，U6+27-siHBV2重組腺病毒的2215細胞。
CELISA法檢測2215細胞中HBsAg和HBeAg的表達水平(與對照相比的百分比)取2215細胞的上清，用ELISA檢測試劑盒檢測細胞上清中的HBsAg、HBeAg水平。結(jié)果顯示與對照細胞(C)相比，轉(zhuǎn)染了siHBV1(P1)或siHBV2(P2)重組腺病毒的細胞中HBsAg、HBeAg蛋白水平被明顯抑制。轉(zhuǎn)染了siHBV1重組病毒的細胞，其HBsAg下降了90.6±0.5％(P＝0.00226)，HBeAg下降了88.4±0.9％(P＝0.00011)；轉(zhuǎn)染了siHBV2重組質(zhì)粒的細胞，其HBsAg下降了92.9±0.6％(P＝0.00216)，HBeAg下降了89.7±1.0％(P＝0.0001)，數(shù)據(jù)顯示HBsAg的下降幅度略大于HBeAg。表明此干擾系統(tǒng)對HBV基因抑制的效果很好。C代表未轉(zhuǎn)染的2215細胞；mock，E，P1，P2分別代表轉(zhuǎn)染了含有U6+27，U6+27-siEGFP，U6+27-siHBV1，U6+27-siHBV2重組腺病毒的2215細胞。
DReal time PCR檢測HBV DNA含量取2215細胞的上清，對其中的病毒DNA進行real time PCR分析。為定量HBV DNA的拷貝數(shù)，同時擴增了已知濃度的并且經(jīng)過系列稀釋的topo-HBV質(zhì)粒，制作出標準曲線，依據(jù)標準曲線和測得的HBV DNA的Ct值計算出HBV DNA的拷貝數(shù)。結(jié)果表明，含有siHBV1(P1)和siHBV2(P2)的腺病毒感染的細胞，其上清中的HBV DNA水平與對照(14.48±2.15×104copys/mL)相比分別下降了3.7倍(3.91±0.72×104copys/mL；P＝0.00821)和3.3倍(4.41±0.85×104copys/mL；P＝0.00780)。
圖3攜帶結(jié)構(gòu)抗原的重組DNA載體。
A.融合基因的構(gòu)建與表達。(A)融合基因構(gòu)建示意圖?；蛟趐cDNA3的CMV啟動子下。在融合基因中引入柔性的連接子“GGSGG”保證各基因的正確表達和維持正常功能。N355w代指鼠或人的gp96N端的355個氨基酸。(B)免疫印跡雜交分析。構(gòu)建的克隆經(jīng)磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染293T細胞，兩天后，收集細胞，細胞裂解物經(jīng)免疫沉淀后進行檢測。HBcAg(SEQ ID NO4)，HBsAg(SEQ ID NO5)，N355(SEQ ID NO2，3)，CN355(HBV核心抗原與N355的融合基因)(SEQ ID NO7)，SN355m(HBV的表面抗原S與鼠gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO8)，SN355h(是HBV的表面抗原S與人gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO9)，S2S(SEQ ID NO6)，S2SN355(HBV的表面抗原S2S與gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO10)和N355S2S(HBV的表面抗原S2S與gp96N端N355的融合基因)(SEQ ID NO11)，等基因產(chǎn)物的分子量分別為17kDa，24kDa，45kDa，62kDa，69kDa，69kDa，31kDa，76kDa和76kDa。(a)抗小鼠的核心抗原單抗檢測截短的核心抗原及其與N355的融合產(chǎn)物。(b，c，d)抗小鼠的表面抗原單抗檢測乙肝膜抗原的S和M蛋白及其與N355的融合產(chǎn)物。非糖基化(小帶)和糖基化(大帶)的帶都能夠檢測出來。
B.DNA免BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠后體液免疫反應(yīng)的檢測。共免疫三次，每組5只鼠，每次肌肉注射100μg質(zhì)粒。對于共免疫組，注射前將兩種質(zhì)粒各50μg混合。最后一次免疫后10天眼眶取血，ELISA系列稀釋法測抗體效價。結(jié)果以光吸收平均值(A490nm)±SD表示。(A)BALB/c鼠血清1/1000稀釋后的表面抗體，(B)Anti-HBs in HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠血清1/1000稀釋后的表面抗體，(C)和(D)分別是BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠血清1/10000稀釋后的核心抗體，(E)BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠血清1/100稀釋后N355抗體(IgG)。所有數(shù)據(jù)均為三次不同實驗的一個代表值。
C.ELISPOT檢測HBV特異細胞反應(yīng)。DNA疫苗免疫BALB/c鼠和HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠三次，每組5只鼠，每次肌肉注射100μg質(zhì)粒。對于共免疫組，注射前將兩種質(zhì)粒各50μg混合。最后一次免疫后10天取小鼠脾臟細胞進行分析。HBV特異的IFN-γ和CD8+雙陽性細胞形成的斑點數(shù)以5×105脾臟細胞計算。每組斑點數(shù)(減去沒有多肽刺激的對照斑點)以三個數(shù)的均值±標準方差表示，所有數(shù)據(jù)均為三次不同實驗的一個代表值。(A)表位HBs362-371和Ld28-39用BALB/c鼠分析，表位HBs348-357用于HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠分析。(B)表位HBc87-95用于BALB/c鼠分析，表位HBc18-27用于HLA/A2轉(zhuǎn)基因鼠分析。
圖4攜帶抗原表位-MHC-I的SCT重組DNA載體。
SCT是通過將抗原表位，β2m和MHC-I類分子通過15個氨基酸的GS連接子連接而構(gòu)建的融合基因，其結(jié)構(gòu)如圖A所示。B，SCT可以有效地將抗原表位呈遞在細胞表面。C用SCT重組DAN載體免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以產(chǎn)生特異的CTL，并具有抑制HepG2.2.15細胞中HBV復(fù)制的能力。pcDNA-SCT-C18(SEQ ID NO13)，pcDNA-SCT-C107(SEQID NO14)，pcDNA-SCT-HIV-gag(SEQ ID NO15)圖5攜帶多抗原表位和佐劑分子融合基因的重組DNA載體。由多表位融合而構(gòu)建的融合基因(SEQ ID NO12)的模式6重組痘苗病毒和多載體治療性HBV和HIV疫苗免疫產(chǎn)生的CTL。用實施例一載體2B中的HBV核心抗原-SCT重組DNA和如圖A所示的重組痘苗構(gòu)成的多載體HBV治療性疫苗免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以高效的誘發(fā)HBV核心抗原相關(guān)的CTL水平。用HIV的gag表位具有一致的實驗結(jié)果。圖6A，重組痘苗病毒的構(gòu)建形式之一。圖6B，用含SCT的重組DAN載體和重組痘苗病毒免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以高效產(chǎn)生HBV核心抗原和HIVgag抗原特異的CTL。在本實施例中，載體上的A是γ-IFN，B是S2SN355，C是HLA-A2-SCT-C18。
圖7單載體雞尾酒疫苗。
HBV的單載體雞尾酒疫苗中，載體上的ABC是IFNα及β，S，S2S，S1S2S，C，SCT，gp96，Gp96N-S/C的可任選的組合。D是調(diào)節(jié)基因和非編碼基因特異的RNA干涉序列。單載體雞尾酒疫苗還包括含有不同元件的分別由重組DNA、腺病毒或重組痘苗病毒的同一個載體所形成的單載體的混合。HCV的單載體治療性雞尾酒疫苗是指實施例二1中的單載體治療性雞尾酒疫苗。HIV的單載體雞尾酒疫苗是指實施例三和實施例四種的單載體HIV預(yù)防性和治療性疫苗。其中載體上的ABC是IFNα及γ，core，E1，E2，Gp96，Gp96或其N端-Core/E1/E2的可任選的組合，D是調(diào)節(jié)基因和非編碼基因特異的RNA干涉序列。HIV的單載體雞尾酒疫苗是指實施例三和實施例四種的單載體HIV預(yù)防性和治療性疫苗，其中載體上的ABC是IFNα及γ，gag，pol，env，Gp96，Gp96或其N端-gag/pol/env的可任選的組合，D是調(diào)節(jié)基因和非編碼基因特異的RNA干涉序列。
圖8真核分泌表達的囊膜病毒膜融合抑制基因的構(gòu)建策略。
A帶tPA信號肽的膜融合抑制劑的構(gòu)建策略B帶IgG信號肽的膜融合抑制劑的構(gòu)建策略圖9HBV的RNA干涉序列。
A與HBV X抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。
B與HBV S抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。
C與HBV C抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。
D與HBV P抗原對應(yīng)的干涉RNA序列轉(zhuǎn)化成的插入到pAVU6+27載體上的序列。
實施例下面是本發(fā)明的一些實施例，但是所述實施例僅是舉例說明性的，而對本發(fā)明的范圍不起限定作用。
實施例一HBV的治療性雞尾酒疫苗根據(jù)HBV感染引起的免疫耐受的特點，其治療性雞尾酒疫苗是包含多個元件的單載體疫苗或者多載體組合疫苗。雞尾酒疫苗具有優(yōu)于單個元件所實現(xiàn)的治療目的組合優(yōu)勢。本實施例提供一種多載體雞尾酒疫苗的構(gòu)建和組合方式以及一種單載體雞尾酒疫苗的構(gòu)建方式，但本專利所包含的內(nèi)容不限于本實施例所公開的雞尾酒疫苗的組合方式。
1.多載體HBV治療性雞尾酒疫苗(圖1)多載體HBV治療性雞尾酒疫苗的組成及應(yīng)用載體1含有RNA干擾序列的重組腺病毒持續(xù)的病毒復(fù)制是免疫耐受性病毒病的一個重要特征，病毒的復(fù)制不僅補充了病毒在宿主內(nèi)的庫容，產(chǎn)生大量的突變體，還造成了免疫系統(tǒng)的枯竭和功能缺陷。因此，免疫耐受性病毒病治療的一個重要的舉措是首先抑制病毒的滴度和復(fù)制水平。對于RNA或者具有RNA中間體的病毒來說，選擇病毒基因組的特定序列，通過合適的載體攜帶的RNA于涉元件可以非常高效特異的抑制病毒的持續(xù)復(fù)制和抗原的持續(xù)表達。在本實施例中，我們以攜帶HBV干擾序列的重組腺病毒降低HBV的復(fù)制水平為例，給出制備具有抑制HBV病毒復(fù)制的RNA干涉疫苗的方法。但本專利所包含的載體一的內(nèi)容不僅限于此公開的序列和載體。
A單個腺病毒載體上針對乙肝病毒單個位點的RNA干擾針對乙肝病毒(HBV)X抗原的mRNA序列，利用Dharmacon公司的網(wǎng)上設(shè)計siRNA序列的軟件，設(shè)計了多個siRNA序列，并將其各自轉(zhuǎn)換成互補的兩條DNA序列(圖2A)，其中為方便與SalI/XbaI消化載體pAVU6+27得到的U6+27啟動子相連，在DNA oligos的5’末端加了SalI，3’端加了XbaI酶切位點。為使翻譯有效終止，還在末端設(shè)計了終止信號dT(5)。于博亞公司合成后，100℃煮沸3分鐘，自動降溫至室溫進行雙鏈退火，克隆到載體pAVU6+27(購自Clontech)中，得到能夠表達針對HBV的siRNA的表達框載體pAVU6+27-siHBV。先行瞬時共轉(zhuǎn)染pUC19-HBV1.3(MBI)質(zhì)粒和pAVU6+27-siHBV質(zhì)粒到HepG2(購自ATCC)細胞中，利用ELISA檢測乙肝相關(guān)S抗原和e抗原的表達，進行初步推斷能有效抑制HBV表達的序列，初步篩選得到2個序列，命名為pAVU6+27-siHBV1(SEQ ID NO20)和pAVU6+27-siHBV2(SEQ IDNO21)(圖2A所示)，進一步將包含有效序列(見圖2A所示)的pAVU6+27-siHBV1和pAVU6+27-siHBV2載體中表達框克隆到腺病毒的pshuttle(購自Stratagene)載體中。方法是將載體pAVU6+27-siHBV中的siRNA的表達盒利用HindIII切下，并行膠回收。將pshuttle載體利用HindIII酶切，并且去磷酸化，與回收的siRNA的表達框連接，得到目的質(zhì)粒pshuttle-U6+27-siHBV1和pshuttle-U6+27-siHBV2。將該目的質(zhì)粒用pmeI線性化，利用乙醇沉淀回收，與pAdEasy-1(購自Stratagene)質(zhì)粒共同電轉(zhuǎn)到感受態(tài)細胞BJ5183(購自Stratagene)中，進行同源重組，得到含有siRNA表達框的重組體。進一步將重組體利用pacI線性化酶切回收后轉(zhuǎn)染病毒包裝細胞系GP-293(購自ATCC)，7-10天后，收集病毒。
將GP-293細胞鋪成單層，按照梯度加入系列稀釋的病毒液，然后用1％半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)培養(yǎng)48小時，計數(shù)形成的嗜斑數(shù)，根據(jù)病毒稀釋比例和嗜斑數(shù)確定重組腺病毒的滴度。按照0.1MOI的感染復(fù)數(shù)感染HepG2.2.15細胞(購自ATCC)(穩(wěn)定表達HBV的各個抗原，并能包裝完整病毒顆粒)，72小時后用ELISA法檢測HBV表面抗原S和e抗原的表達情況，與對照細胞(C)相比，轉(zhuǎn)染了siHBV1(P1)或siHBV2(P2)重組病毒的細胞中S、e抗原的水平被明顯抑制。感染了siHBV1病毒的細胞，其S抗原下降了90.6±0.5％(P＝0.00226)，e抗原下降了88.4±0.9％(P＝0.00011)；感染了siHBV2腺病毒的細胞，其S抗原下降了92.9±0.6％(P＝0.00216)，e抗原下降了89.7±1.0％(P＝0.0001)(圖2B)。Northern雜交結(jié)果顯示，被病毒感染的細胞中，3.5Kb和2.4Kb/2.1Kb的mRNA水平明顯降低(圖2C)。熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，被感染的細胞，其上清中的HBV DNA水平與對照(14.48±2.15×104copys/mL)相比分別下降了3.7倍(3.91+0.72×104copys/mL；P＝0.00821)和3.3倍(4.41±0.85×104copys/mL；P＝0.00780)(圖2D)。這些結(jié)果表明，此腺病毒介導(dǎo)的特異靶向HBV基因的RNAi方法可以有效抑制HepG2.2.15細胞中HBV基因的表達，并最終有效抑制HBV的復(fù)制。
B單個腺病毒載體上針對乙肝病毒多個位點的RNA干擾利用A中的方法，我們篩選到了分別針對HBV的S、X、C或者聚合酶P抗原的siRNA序列，獲得了6個可以有效抑制HBV復(fù)制的pAVU6+27-siHBV重組質(zhì)粒。其中X干擾序列為1.5‘-GAGGACTCTTGGACTCTCA-3’(SEQ IDNO62)；2.5‘-CCGTGTGCACTTCGCTTCACCTCTG-3’(SEQ IDNO63)；其插入到pAVU6+27中的結(jié)構(gòu)如圖9A所示。
S干擾序列1.5‘-CATCACATCAGGATTCCTA-3’(SEQ ID NO64)；2.5‘-CTCAGTTTACTAGTGCCATTTGTTC-3’(SEQ ID NO65)；其插入到pAVU6+27中的結(jié)構(gòu)如圖9B所示。
C干擾序列5‘-CATCACATCAGGATTCCTAAA-3’(SEQ IDNO66)；其插入到pAVU6+27中的結(jié)構(gòu)如圖9C所示。
P聚合酶干擾序列，5‘-AGAAGATCTCAATCTCGGGAATCTC-3′(SEQ ID NO67)。其插入到pAVU6+27中的結(jié)構(gòu)如圖9D所示。
進一步分別將構(gòu)建好的載體中的針對S、X、C或P的siRNA的表達框兩兩組合克隆到pshuttle載體中，即先利用HindIII酶切下pAVU6+27-siHBV中的表達框，膠回收后連到經(jīng)同樣處理的pshuttle中，得到目的克隆pshuttle-siHBV1，進一步將針對另一個抗原的pAVU6+27-siHBV的表達框用ECoRV和stuI切下并回收，用ECoRV酶切pshuttle-siHBV1并且去磷酸化與用ECoRV和stuI切下的siRNA的表達框進行平末端連接，這樣得到了一個pshuttle載體上連接有兩個siRNA的表達框。同樣的方法，將所有得到的針對HBV的siRNA的表達框進行兩兩組合。利用A中所述的腺病毒建立的方法，得到了X，S，P和C的三種兩兩組合的腺病毒顆粒。感染HepG2.2.15后，得到了與以上類似的結(jié)果。進一步將所得到的腺病毒作為一個庫，感染HepG2.2.15細胞后，對HBV的抑制效率要好于用單個腺病毒顆粒的感染。
載體2含有HBV結(jié)構(gòu)抗原、佐劑、佐劑和結(jié)構(gòu)抗原融合基因、表位及多表位融合基因、表位與佐劑融合基因以及表位-MHC-SCT的重組DNA載體
A.含有HBV結(jié)構(gòu)抗原、佐劑、佐劑和結(jié)構(gòu)抗原融合基因的重組DNA載體以HBV的結(jié)構(gòu)蛋白核心抗原HbcAg(C)編碼序列(SEQ ID NO4)，膜抗原的小蛋白HBsAg(S)(SEQ ID NO5)和中蛋白S2S(SEQ ID NO6)、人或小鼠的gp96的N端355個氨基酸(成熟肽，不含信號肽)編碼序列N355h(SEQ ID NO2)以及N355m(SEQ ID NO1)、以及上述結(jié)構(gòu)蛋白和gp96N端構(gòu)建融合基因。構(gòu)建融合基因時，引入連接子“GGSGG”，其編碼序列為“GGT TCC TCT GGA GGT”。融合基因的擴增方法是先分別用兩側(cè)引物與中間引物分別擴增gp96N端以及抗原序列，純化得到的兩端片段；然后混合兩個片段作為模板，用兩側(cè)的引物擴增融合基因。所有擴增引物列入表1中，其中斜體字母為限制性酶切位點，黑體字母為引入的連接子。構(gòu)建的DNA疫苗的示意圖如圖3A所示。
表1 構(gòu)建HBV結(jié)構(gòu)基因以及融合基因疫苗的引物序列


注“N355m”代表鼠源的N355(SEQ ID NO1)，“N355h”代表人源的N355(SEQ IDNO2)。其中(a)為SEQ ID NO24；(b)為SEQ ID NO25；(c)為SEQ ID NO26；(d)為SEQ ID NO27；(e)為SEQ ID NO28；(f)為SEQ ID NO29；(g)為SEQ ID NO30；(h)為SEQ ID NO31；(i)為SEQ ID NO32；(j)為SEQ ID NO33；SEQ ID NO34為ggttcctctggaggtgacgatgaagttgatgt；(k)為SEQ ID NO35；acctccagaggaaccaataacacaagtctccg為SEQ ID NO36；acctccagaggaaccaatgtatacccaaag為SEQ ID NO37；ggttcctctggaggtgatgatgaagtcgac為SEQ ID NO38；(l)為SEQ ID NO39；(m)為SEQ ID NO40；acctccagaggaaccaatgtatacccaaag為SEQ ID NO41；ggttcctctggaggtgatgatgaagtcgac為SEQ ID NO42。
獲得的DNA疫苗分別以肌肉注射的方式免疫BALB/c以及HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠(購自Jackson Lab)，免疫三次，劑量為100μg/鼠，間隔兩周。最后一次免疫的兩周后取鼠的外周血制備血清，檢測HBV中相關(guān)抗原的抗體滴度。取鼠的脾臟細胞，檢測脾臟中產(chǎn)生的HBV抗原特異的CTL產(chǎn)生的水平。實驗結(jié)果表明，DNA疫苗免疫的形式可以產(chǎn)生明顯的抗體和CTL水平，在gp96N端的佐劑作用下，產(chǎn)生Th1類的中和抗體，CTL的水平提高6-8倍。圖3B和圖3C解釋了抗體水平和CTL產(chǎn)生的水平。
B.由抗原表位-MHC-I SCT構(gòu)建的重組DNA通過預(yù)先將表位融合到MHC-I和β2-微球蛋白上構(gòu)建成單分子的SCT可以有效地將病毒抗原相應(yīng)的表位呈遞在細胞表面，非常高效地誘發(fā)病毒抗原相關(guān)的CTL的產(chǎn)生。本實施例中給出HLA-A2限制的HBV核心抗原相關(guān)的兩個表位構(gòu)建的方法和免疫小鼠所產(chǎn)生的CTL的結(jié)果。本專利所包含的內(nèi)容不限于HLA-A2和核心抗原的表位，所獲得的重組DNA載體可以是包含一個表位的單載體，也可以是包含多個表位的多表位重組DNA混合物。
圖4A所示為SCT的模式圖，其中各個基因之間通過15個氨基酸的GS連接子進行連接。SCT的N端是信號肽，其所包含的表位可以通過引物突變的方式引入。構(gòu)建的SCT DNA載體可以有效地將核心抗原表位呈遞在細胞表面(圖4B)。用SCT DNA載體免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠可以產(chǎn)生表位特異的CTL，并能降低HepG2.2.15細胞中HBV表面抗原和核心抗原的表達水平(圖4C)。
采用PCR突變的方式改變HLA-A2所攜帶的抗原表位SCT引物A2-SCT-up1CAGCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAG(SEQ ID NO43)A2-SCT-primer2AATCAGCAAGCTTGGTACCGA(SEQ ID NO44)HBcAg18-27突變引物A2SCT-HBcAg18-27-1(match 1)AACAGAAGGAAAGAAGTCAGAAGGCAAAAAAGCCTCCAGGCCAGAAAG(SEQ ID NO45)A2SCT-HBcAg18-27-2(match 2)TTTTTGCCTTCTGACTTCTTTCCTTCTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA(SEQ ID NO46)HBcAg107-115的突變引物A2SCT-HBcAg107-115-1(match 1)AACAGTTTCTCTTCCAAAAGTAAGACAAGCCTCCAGGCCAGAAAG(SEQ ID NO47)
A2SCT-HBcAg107-115-2(match 2)TGTCTTACTTTTGGAAGAGAAACTGTTGGAGGTGGGGGAGGCGGA(SEQ ID NO48)C.由多抗原表位與佐劑融合形成的多表位重組DNA載體在細胞內(nèi)泛素可以促進蛋白降解，提高表位的加工效率，因此可以增強細胞免疫功能。表位可以在機體內(nèi)誘導(dǎo)特異性CTL的產(chǎn)生。我們合成了五個HBV的T細胞表位，分別為HLA-A2限制性的表位C18-27(FLPSDFFPSV)(SEQ ID NO72)、E335-343(WLSLLVPFV)(SEQ IDNO73)和E183-191(FLLTRILTI)(SEQ ID NO74)，HLA-A11限制性的表位C88-96(YVNVNMGLKL)(SEQ ID NO75)，HLA-A24限制性的表位C117-125(EYLVSFGVW)(SEQ ID NO76)，將其串連合成，串連方式如圖5所示。在多表位序列5’端連接破傷風類毒素Th通用輔助表位(QYIKANSKFIGITE)(SEQ ID NO77)，并且與泛素串連在一個閱讀框中，各個表位之間通過連接子AAY連接。設(shè)計的融合基因序列命名為NHTU(SEQ ID NO12)，串連方式如圖5所示。將表達此串連序列的合成DNA連接在pcDNA3.1(購自Invitrogen)真核表達載體中構(gòu)成DNA疫苗。用重組DNA免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠，通過肌肉免疫三次，可以在機體內(nèi)有效產(chǎn)生特異性CTL，從而對機體產(chǎn)生免疫保護效果。
載體3含有HBV結(jié)構(gòu)抗原、佐劑、佐劑和結(jié)構(gòu)抗原融合基因、表位及多表位重組體以及表位-MHC-I SCT、γ-IFN的重組痘苗病毒載體重組痘苗載體可以攜帶多種表達元件，同時痘苗病毒可以高效的誘發(fā)粘膜免疫反應(yīng)，激活天然免疫系統(tǒng)。包含多個元件的重組痘苗病毒可以用于單獨免疫，也可以與腺病毒或/和重組DNA載體一起免疫或分階段免疫。本實施例中提供一種包含多個元件的重組痘苗病毒的構(gòu)建方式，但本專利所包含的內(nèi)容不限于本公開中所包含的元件和元件的組合順序。
以全基因合成的方式按照NCBI(National Center for BiotechnologyInformation，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)所公開的IFN-γ(NM_000619)所示的序列合成IFN-γ的全基因中的127-627位堿基，其中序列的前端加入5’-GCGAAGCTTG-3’序列(SEQ ID NO49)，序列的后端加入3’-ACTCGAGCAT-5’序列(SEQ ID NO50)。合成的基因插入pMD18T載體(購自TAKARA)，進行序列測定。測序正確的基因用HindIII/Xho I進行雙酶切，然后插入同樣酶切的pcDNA3.0載體(購自Invitrogen)中。構(gòu)建IFN-γ的真核表達載體。pcDNA3.0-IFN-γ表達載體經(jīng)過BglII和SmaI的雙酶切和平端化，插入到重組痘苗載體(購自武漢大學(xué))中，構(gòu)建含有IFN-γ的重組痘苗病毒載體。
將本實施例一載體2中的元件進行酶切和平端化，然后連接到重組痘苗載體上，通過酶切和測序的方式確定插入方向。將獲得的重組痘苗載體1μg與野生痘苗病毒天壇株(購自中國CDC)(0.1MOI)在Vero細胞(購自ATCC)中進行同源重組，24小時后通過EGFP的表達或者目的基因的表達篩選重組病毒。重組病毒經(jīng)過六輪的單斑篩選進行純化，純化的病毒在Vero細胞中進行擴增，并用36％的蔗糖墊進行純化。圖6A是包含多個元件的若干重組痘苗病毒載體的一個實例，圖6B是利用含有載體2和載體3的雞尾酒疫苗，取100μg的重組質(zhì)粒pcDNA3.0-SCT-C18肌肉注射免疫轉(zhuǎn)基因鼠，一周后用2×106-8PFU的重組病毒采用肌肉注射的方式進行加強免疫，一周后取小鼠的脾臟細胞檢測小鼠所產(chǎn)生的CTL。
多載體HBV治療性疫苗的比較優(yōu)勢用上述構(gòu)建的重組DNA、腺病毒和痘苗病毒載體疫苗，免疫HBV轉(zhuǎn)基因鼠的流程是首次免疫使用2×106MOI重組腺病毒或重組腺病毒庫RNAi干涉疫苗降低HBV復(fù)制，一個月后用重組DNA疫苗各50μg(pcDNA3.0-SN和pcDNA3.0-CN)肌肉注射免疫轉(zhuǎn)基因鼠，同時輔以20μg的gp96和50μg的重組S蛋白皮下注射免疫轉(zhuǎn)基因鼠，第二次免疫的2周后用2×106MOI的重組痘苗病毒進行加強免疫。實驗結(jié)果表明用重組腺病毒和重組腺病毒庫RNAi疫苗進行初免后轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)HBV滴度降低90％以上，第二次免疫一周后開始出現(xiàn)表面抗原和核心抗原特異的CTL反應(yīng)，并產(chǎn)生保護性的S抗體，HBV的滴度繼續(xù)降低，2周后血清HBV DNA呈現(xiàn)陰性。第三次用重組痘苗病毒(含有γ-IFN、S抗原和C抗原基因)加強免疫后，血清中表面抗原和核心抗原對應(yīng)的抗體水平顯著提高，伴隨著抗原特異CD8+T細胞及γ-IFN的產(chǎn)生和向肝臟內(nèi)部遷移，血清中出現(xiàn)輕度ALT水平提高。治療三個月后，血清HBV DNA陰性，ALT水平正常，肝臟中核心抗原陽性細胞為陰性，cccDNA檢測陰性。HBV轉(zhuǎn)基因鼠經(jīng)雞尾酒疫苗綜合治療后，產(chǎn)生明顯優(yōu)于單組分疫苗的綜合性治療效果。由于佐劑分子的應(yīng)用，產(chǎn)生的抗體和細胞免疫是Th1性的；由于γ-IFN的產(chǎn)生及向肝臟內(nèi)部的遷移，獲得了肝臟細胞非裂解性的HBV清除能力；經(jīng)DNA疫苗和痘苗疫苗的聯(lián)合免疫，體內(nèi)產(chǎn)生顯著的多克隆CTL應(yīng)答，并產(chǎn)生記憶性T細胞克隆，從而進一步清除了肝臟內(nèi)部痕量的感染細胞。由于保護性抗體以及多表位CTL和免疫記憶的產(chǎn)生，HBV轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)部的病毒顆粒得到了有效的清除。
2.單載體HBV治療性雞尾酒疫苗(圖7)本專利申請所包含的HBV治療性雞尾酒疫苗還包括將實施例一中的多載體HBV治療性疫苗對應(yīng)的元件進行組合而構(gòu)建的單載體重組DNA、腺病毒或痘苗病毒載體疫苗。一個具體的實例是如圖7所示的重組痘苗病毒，其中包含降低病毒復(fù)制所需要的RNA干涉元件、γ-IFN、誘發(fā)中和抗體和多克隆CTL的結(jié)構(gòu)抗原基因以及與佐劑融合的結(jié)構(gòu)基因，以及誘發(fā)高效CTL的SCT等。
本專利申請所包含的單載體HBV治療性疫苗還包括由同種載體構(gòu)成的包含不同元件的重組質(zhì)?；蛑亟M病毒的組合。
本專利申請所述的單載體HBV治療性疫苗與多載體HBV治療性疫苗具有一致的抑制病毒復(fù)制和誘發(fā)免疫反應(yīng)的功能。
實施例二HCV的治療性雞尾酒疫苗(圖1)1.HCV的多載體治療性雞尾酒疫苗HCV的多載體治療性疫苗的構(gòu)建策略和方法與HBV的多載體治療性雞尾酒疫苗類似，如圖1所示，其中載體1為含有RNA干涉元件的重組腺病毒或者腺病毒庫。載體2和3中的ABC是指IFN，HCV的結(jié)構(gòu)抗原衣殼蛋白(core)，E1，E2，表位相關(guān)的SCT以及多表位融合基因，gp96編碼序列(SEQ ID NO3)，Gp96N-core/E1/E2融合基因的可任選的組合。
本實施例中簡單的闡述與其中的部分載體相關(guān)的重組體的構(gòu)建策略。
利用與實施例一載體1同樣的方法得到了抑制HCV表達的有效序列5‘-CCCGCTCAATGCCTGGAG-3’(SEQ ID NO68)，轉(zhuǎn)化為插入pAVU6+27載體上的序列，獲得具有抑制HCV復(fù)制的有效序列(SEQ IDNO22)，該序列是針對HCV5‘UTR區(qū)域，利用上述的方法包裝病毒備用。以Huh-mono細胞(購自ATCC)為模型(穩(wěn)定表達I389/hyg-ubi/NS3-3′/5.1 HCV復(fù)制子)，將包裝好的病毒感染該細胞。結(jié)果表明被病毒感染的細胞中HCV的復(fù)制水平下降60％以上，其中的一個重要蛋白HCV-NS5B的表達水平下降了70％以上。
將包含HCV結(jié)構(gòu)基因的重組DNA疫苗以及包含γ-IFN、HCV結(jié)構(gòu)基因以及HCV表位SCT基因的重組痘苗病毒免疫HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠，可產(chǎn)生高效的HCV特異的多克隆CTL反應(yīng)。
2.HCV的單載體治療性雞尾酒疫苗(圖7)本專利申請所包含的HCV治療性雞尾酒疫苗還包括將實施例二1中的多載體HCV治療性疫苗對應(yīng)的元件進行組合而構(gòu)建的單載體重組DNA、腺病毒或痘苗病毒載體疫苗。一個具體的實例是如圖7所示的重組痘苗病毒，其中包含降低病毒復(fù)制所需要的RNA干涉元件和γ-IFN或α-IFN，誘發(fā)中和抗體和多克隆CTL的結(jié)構(gòu)抗原基因以及與佐劑融合的結(jié)構(gòu)基因，以及誘發(fā)高效CTL的SCT等。
本專利所包含的單載體HCV治療性疫苗還包括由同種載體構(gòu)成的包含不同元件的重組質(zhì)?；蛑亟M病毒的組合。
本專利申請所述的單載體HCV治療性疫苗與多載體HCV治療性疫苗具有一致的抑制病毒復(fù)制和誘發(fā)免疫反應(yīng)的功能。
實施例三HIV-I預(yù)防性雞尾酒疫苗本發(fā)明中公開的HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗是選自以下幾個元件的組合而構(gòu)建的DNA、腺病毒或痘苗病毒疫苗(1)可阻斷病毒與細胞融合的七肽重復(fù)序列HR212；(2)gp96或其氨基端片段的佐劑分子；(3)HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag和pol或其與佐劑融合的融合基因和/或HIV的抗原表位、多表位融合基因以及抗原表位-MHC-I構(gòu)建的SCT基因。與實施例一和實施例二相似，本專利公開的HIV-1的預(yù)防性雞尾酒疫苗包括多載體雞尾酒疫苗(圖1)和單載體雞尾酒疫苗(圖7)。多載體雞尾酒疫苗是指圖1中與抑制HIV入侵相關(guān)的載體2和載體3的組合，其中ABC是指IFNα或γ，gag，env，HR212，SCT，gp96，Gp96N-gag/env融合基因的可任選的組合。單載體HIV-1預(yù)防性雞尾酒疫苗是指將上述多載體中相關(guān)的元件進行任選的組合而構(gòu)建的重組DNA、腺病毒或痘苗病毒，其要點是包含抑制膜融合的HR212、中和抗體以及CTL相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因以及結(jié)構(gòu)基因與佐劑的融合基因。其中的單載體預(yù)防性雞尾酒疫苗還包括將包含不同元件的同一載體進行的組合。
本實施例中簡單的闡述與其中的部分載體相關(guān)的重組體的構(gòu)建策略。利用與實施例一同樣的方法，篩選到了抑制HIV的tat基因的siRNA序列(SEQ ID NO23)，轉(zhuǎn)成DNA序列為5‘-AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTT-3’(SEQ ID NO71)，克隆到pshuttle中，在BJ5183感受態(tài)細胞中得到重組腺病毒載體，經(jīng)GP-293包裝好的腺病毒凍存于低溫冰箱備用。以293T細胞為實驗?zāi)Ｐ?，先利用HIVNL4.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，6小時后轉(zhuǎn)染包裝好的腺病毒顆粒，72小時后檢測抑制的效果。Western blotting結(jié)果顯示P24蛋白的表達被抑制掉73％，gag蛋白被抑制掉60％以上，Northern blotting表明HIV-RNA被明顯抑制。說明腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能有效的抑制HIV中重要蛋白的表達，并進一步影響了病毒的復(fù)制。利用同樣的原理構(gòu)建的HIV gag表位相關(guān)的SCT重組DNA和痘苗病毒載體也可以高效的誘發(fā)HIV表位相關(guān)的CTL作用(圖4、6)。
本實施例中所用的HIV-1的膜融合抑制序列是通過構(gòu)建真核分泌表達基因而構(gòu)建的重組DNA、腺病毒和痘苗病毒(圖8)。在一個具體的實例中，我們選擇了真核表達載體pcDNA3.0和pSecTag2B。
用pcDNA3.0(Invitrogen)，pSecTag2B(Invitrogen)兩個真核表達載體，構(gòu)建分別含有tPA和IgG信號肽序列的分泌表達載體。pcDNA3.0-tPA-HR212的構(gòu)建采用搭橋PCR的方式，引物序列分別為Up-tPA-p1GTCTTCGTTTCGCCCAGCTGGATGGAGTGGGACAG(SEQID NO51)Up-tPA-p2GCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCA(SEQID NO52)Up-tPA-p3GATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGC(SEQ ID NO53)Up-tPA-p4CGCAGGATCCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAG(SEQID NO54)Down-HR212-p1CGCGCTCGAGCTACAATAATTCTTGTTCATTC(SEQID NO55)所構(gòu)建的基因結(jié)構(gòu)如圖8A所示。
pSecTag2B-HR212的引物序列如下，所構(gòu)建的基因結(jié)構(gòu)如圖8B所示。
Up-pSec-p1CGCAGGATCCTGGATGGAGTGGGACAGAG(SEQ IDNO56)Down-HR212-p1CTCTGTCCCACTCCATCCAGGATCCTGCG(SEQ IDNO57)將PCR所獲得的基因tPA-HR212(SEQ ID NO19)和pSec-HR212用BamHI/Xho I進行雙酶切，然后連入同樣酶切的真核表達載體中，構(gòu)建分泌表達的真核重組DNA。
將所構(gòu)建的真核分泌表達載體轉(zhuǎn)染293T細胞(購自ATCC)，培養(yǎng)48-72小時后收集上清，并進行濃縮。包裝HIV的假病毒，具體操作方法為轉(zhuǎn)染前24h，消化293T細胞并傳至10cm皿中，濃度為4-5×106/皿。24h后，細胞大約80％鋪滿。用磷酸鈣法將pNL43LucE-R(購自Invitrogen)和pMT3-HXB-2(購自Invitrogen)兩個質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，轉(zhuǎn)染48h后，細胞長滿變圓，離心(3000rpm×10min)收獲含HIV-1假病毒上清液。
進行融合抑制實驗前24小時，消化GHOST-CXCR4(購自ATCC)細胞并傳至24孔板中，細胞濃度為8×104/孔。將真核分泌表達載體表達的上清與病毒按照1∶1混合，然后將混合物接種到GHOST-CXCR4細胞(購自ATCC)中，待病毒吸附細胞2h后，吸棄病毒混合物，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個稀釋度做2個重復(fù)，48-72小時后收獲并裂解細胞，測定細胞上清中螢火蟲熒光酶的活性。實驗結(jié)果如表2所示。
表2HR212抑制HIV侵染靶細胞

陰性GHOST-CXCR4細胞無處理陽性GHOST-CXCR4細胞中接入假病毒對照GHOST-CXCR4細胞中接入假病毒和293細胞上清pcDNA3.0-tPA-HR212GHOST-CXCR4細胞中接入假病毒和轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-TPA-HR212的293細胞上清pSecTag2B-HR212GHOST-CXCR4細胞中接入假病毒和轉(zhuǎn)染pSecTag2B-HR212的293細胞上清與已經(jīng)存在的HIV的小分子化學(xué)藥物雞尾酒疫苗不同，本實施例所公開的內(nèi)容是按照HIV感染特征而設(shè)計的生物雞尾酒疫苗。本實施例所公開的分泌表達的HIV HR212可以有效的抑制包裝的HIV假病毒對靶細胞的侵染，另外，由于真核載體疫苗可以自主在體內(nèi)復(fù)制、表達并正確加工目的蛋白，因此可以有效的降低HIV治療時持續(xù)用藥的特點。與實施例一1B、C的構(gòu)建方式一樣，構(gòu)建的包含HIV結(jié)構(gòu)基因以及包含HIV抗原表位的SCT DNA-痘苗疫苗在HLA-A轉(zhuǎn)基因鼠中可以高效誘發(fā)HIV的多表位CTL應(yīng)答。
實施例四HIV-I治療性雞尾酒疫苗與實施例三類似，HIV-1治療性雞尾酒疫苗也包含多載體治療性雞尾酒疫苗和單載體治療性雞尾酒疫苗。除實施例三所包含的多個元件外，本實施例中還包含能抑制HIV-1復(fù)制的有效的RNA干涉元件及構(gòu)建的重組DNA、腺病毒和痘苗病毒。
本實施例中簡單的闡述與其中的部分載體相關(guān)的重組體的構(gòu)建策略。利用與實施例一同樣的方法，篩選到了抑制HIV的tat基因的siRNA序列(SEQ ID NO23)，轉(zhuǎn)成DNA序列為5‘-AAGTGTTGCTTTCATTGCCAAGTTTGTT-3’，克隆到pshuttle中，在BJ5183感受態(tài)細胞中得到重組腺病毒載體，經(jīng)GP-293包裝好的腺病毒凍存于低溫冰箱備用。以293T細胞為實驗?zāi)Ｐ?，先利用HIVNL4.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，6小時后轉(zhuǎn)染包裝好的腺病毒顆粒，72小時后檢測抑制的效果。Western blotting結(jié)果顯示P24蛋白的表達被抑制掉73％，gag蛋白被抑制掉60％以上，Northern blotting表明HIV-RNA被明顯抑制。說明腺病毒載體介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)能有效的抑制HIV中重要蛋白的表達，并進一步影響了病毒的復(fù)制。與HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗一樣，包含HIV結(jié)構(gòu)抗原、結(jié)構(gòu)抗原與佐劑的融合基因、HIV多表位佐劑融合基因以及HIV表位-SCT的重組DNA-痘苗疫苗在HLA-A2轉(zhuǎn)基因鼠內(nèi)可以高效誘發(fā)多表位CTL作用。
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<221>CDS<222>(1)..(1071)<223>
<400>1atggatgatg aagtcgacgt ggatggcaca gtggaagagg acctgggtaa aagccgagaa 60ggctcaagga cagatgatga agttgtgcag agagaggaag aagctattca gttggatggg 120ttaaacgcat cacagataag agaacttaga gaaaaatctg aaaagttcgc cttccaagct 180gaagtgaaca ggatgatgaa acttatcatc aattctttgt ataaaaataa agagattttc 240ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagaca agataaggct catctcccta 300actgatgaaa atgcactcgc tggaaatgag gagttaacgg tcaagattaa gtgtgacaaa 360gagaaaaacc tgctgcatgt cacagacacg ggtgtaggaa tgactagaga ggagttggtt 420aaaaatctcg gcaccatagc caaatctgga acaagcgagt ttttaaacaa aatgacagaa 480gctcaagaag atggtcagtc aacctctgaa ctgattggcc agtttggtgt cggtttttat 540tctgccttcc ttgtagcaga taaggtcatt gtcacatcga aacacaacaa tgatacccag 600cacatctggg aatcagactc caatgaattc tctgtaattg ctgacccaag aggaaacaca 660ctaggtcgtg gaacaacaat tactcttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720ttggacacaa ttaaaaatct cgtcaggaag tactctcagt tcatcaactt tcccatctac 780gtgtggagta gcaagacaga gactgttgag gagcccttgg aagaagatga agcagcaaaa 840gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aggaagaaga agaaaagaaa 900ccaaaaacta agaaagttga aaaaactgtg tgggattggg aacttatgaa tgatatcaaa 960
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gtgtggagta gcaagacaga gactgttgag gagcccttgg aagaagatga agcagcaaaa 840gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aggaagaaga agaaaagaaa 900ccaaaaacta agaaagttga aaaaactgtg tgggattggg aacttatgaa tgatatcaaa 960ccaatatggc agagaccatc caaagaagta gaagaagacg aatacaaagc tttctacaaa 1020tcattttcaa aggaaagtga tgaccccatg gcttatatcc acttcactgg ttcctctgga 1080ggtcagtgga attccacaac ctttcaccaa actctgcaag atcccagagt gagaggcctg 1140tatttccctg ctggtggctc cagttcagga gcagtaaacc ctgttccgac tactgcctct 1200cccttatcgt caatcttctc gaggattggg gaccctgcgc tgaacatgga gaacatcaca 1260tcaggattcc taggacccct tctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc 1320ctcacaatac cgcagagtct agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggaact 1380accgtgtgtc ttggccaaaa ttcgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcctgt 1440cctccaactt gtcctggtta tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat cttcctcttc 1500atcctgctgc tatgcctcat cttcttgttg gttcttctgg actatcaagg tatgttgccc 1560gtttgtcctc taattccagg atcctcaacc accagcacgg gaccatgccg aacctgcatg 1620actactgctc aaggaacctc tatgtatccc tcctgttgct gtaccaaacc ttcggacgga 1680aattgcacct gtattcccat cccatcatcc tgggctttcg gaaaattcct atgggagtgg 1740gcctcagccc gtttctcctg gctcagttta ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg 1800ctttccccca ctgtttggct ttcagttata tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg 1860tacagcatct tgagtccctt tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac 1920atttaa 1926<210>12<211>1440<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1440)<223>
<400>12atggacgatg aagttgatgt ggatggtaca gtagaagagg atctgggtaa aagtagagaa60ggatcaagga cggatgatga agtagtacag agagaggaag aagctattca gttggatgga 120ttaaatgcat cacaaataag agaacttaga gagaagtcgg aaaagtttgc cttccaagcc 180gaagttaaca gaatgatgaa acttatcatc aattcattgt ataaaaataa agagattttc 240ctgagagaac tgatttcaaa tgcttctgat gctttagata agataaggct aatatcactg 300actgatgaaa atgctctttc tggaaatgag gaactaacag tcaaaattaa gtgtgataag 360gagaagaacc tgctgcatgt cacagacacc ggtgtaggaa tgaccagaga agagttggtt 420
aaaaaccttg gtaccatagc caaatcaggg acaagcgagt ttttaaacaa aatgactgaa 480gcacaggaag atggccagtc aacttctgaa ttgattggcc agtttggtgt cggtttctat 540tccgccttcc ttgtagcaga taaggttatt gtcacttcaa aacacaacaa cgatacccag 600cacatctggg agtctgactc caatgaattt tctgtaattg ctgacccaag aggaaacact 660ctaggacggg gaacgacaat tacccttgtc ttaaaagaag aagcatctga ttaccttgaa 720ttggatacaa ttaaaaatct cgtcaaaaaa tattcacagt tcataaactt tcctatttat 780gtatggagca gcaagactga aactgttgag gagcccatgg aggaagaaga agcagccaaa 840gaagagaaag aagaatctga tgatgaagct gcagtagagg aagaagaaga agaaaagaaa 900ccaaagacta aaaaagttga aaaaactgtc tgggactggg aacttatgaa gcttgctgct 960tactttttgc catctgactt ctttccatcc gtagctgctt actatgtcaa tgttaatatg 1020ggcctaaaat tagctgctta ctggctcagt ttactagtgc catttgttgc tgcttacgaa 1080tatttggtgt cttttggagt gtgggctgct tacttcttgt tgacaagaat cctcacaata 1140gctgcttacg atgctgctta ccagtatata aaagcaaatt ctaaatttat aggtataact 1200gaatctagaa tgcagatctt cgtgaagact ctgactggta agaccatcac cctcgaggtg 1260gagcccagtg acaccatcga gaatgtcaag gcaaagatcc aagataagga aggcattcca 1320ccagatcagc agaggttgat ctttgccgga aaacagctgg aagatggtcg taccctgtct 1380gactacaaca tccagaaaga gtccaccttg cacctggtac tccgtctcag aggtgggtaa 1440<210>13<211>1503<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1503)<223>
<400>13atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgatactct ctctttctgg cctggaggct60tttttgcctt ctgacttctt tccttctgtt ggaggtgggg gaggcggatc aggaggctca 120ggtgggtcag gaggcatcca gcgtactcca aagattcagg tttactcacg tcatccagca 180gagaatggaa agtcaaattt cctgaattgc tatgtgtctg ggtttcatcc atccgacatt 240gaagttgact tactgaagaa tggagagaga attgaaaaag tggagcattc agacttgtct 300ttcagcaagg actggtcttt ctatctcttg tactacactg aattcacccc cactgaaaaa 360gatgagtatg cctgccgtgt gaaccatgtg actttgtcac agcccaagat agttaagtgg 420gatcgagaca tgggaggtgg cggttcgggc ggaggcggct cgggtggcgg cggctctggc 480tctcactcca tgaggtattt cttcacatcc gtgtcccggc ccggccgcgg ggagccccgc 540
ttcatcgcag tgggctacgt ggacgacacg cagttcgtgc ggttcgacag cgacgccgcg 600agccagagga tggagccgcg ggcgccgtgg atagagcagg agggtccgga gtattgggac 660ggggagacac ggaaagtgaa ggcccactca cagactcacc gagtggacct ggggaccctg 720cgcggctact acaaccagag cgaggccggt tctcacaccg tccagaggat gtatggctgc 780gacgtggggt cggactggcg cttcctccgc gggtaccacc agtacgccta cgacggcaag 840gattacatcg ccctgaaaga ggacctgcgc tcttggaccg cggcggacat ggcagctcag 900accaccaagc acaagtggga ggcggcccat gtggcggagc agttgagagc ctacctggag 960ggcacgtgcg tggagtggct ccgcagatac ctggagaacg ggaaggagac gctgcagcgc 1020acggacgccc ccaaaacgca tatgactcac cacgctgtct ctgaccatga agccaccctg 1080aggtgctggg ccctgagctt ctaccctgcg gagatcacac tgacctggca gcgggatggg 1140gaggaccaga cccaggacac ggagctcgtg gagaccaggc ctgcagggga tggaaccttc 1200cagaagtggg cggctgtggt ggtgccttct ggacaggagc agagatacac ctgccatgtg 1260cagcatgagg gtttgcccaa gcccctcacc ctgagatggg agccgtcttc ccagcccacc 1320atccccatcg tgggcatcat tgctggcctg gttctctttg gagctgtgat cactggagct 1380gtggtcgctg ctgtgatgtg gaggaggaag agctcagata gaaaaggagg gagctactct 1440caggctgcaa gcagtgacag tgcccagggc tctgatgtgt ctctcacagc ttgtaaagtg 1500tga1503<210>14<211>1500<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)..(1500)<223>
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cagaggatgg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg gtccggagta ttgggacggg 660gagacacgga aagtgaaggc ccactcacag actcaccgag tggacctggg gaccctgcgc 720ggctactaca accagagcga ggccggttct cacaccgtcc agaggatgta tggctgcgac 780gtggggtcgg actggcgctt cctccgcggg taccaccagt acgcctacga cggcaaggat 840tacatcgccc tgaaagagga cctgcgctct tggaccgcgg cggacatggc agctcagacc 900accaagcaca agtgggaggc ggcccatgtg gcggagcagt tgagagccta cctggagggc 960acgtgcgtgg agtggctccg cagatacctg gagaacggga aggagacgct gcagcgcacg 1020gacgccccca aaacgcatat gactcaccac gctgtctctg accatgaagc caccctgagg 1080tgctgggccc tgagcttcta ccctgcggag atcacactga cctggcagcg ggatggggag 1140gaccagaccc aggacacgga gctcgtggag accaggcctg caggggatgg aaccttccag 1200aagtgggcgg ctgtggtggt gccttctgga caggagcaga gatacacctg ccatgtgcag 1260catgagggtt tgcccaagcc cctcaccctg agatgggagc cgtcttccca gcccaccatc 1320cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctctttggag ctgtgatcac tggagctgtg 1380gtcgctgctg tgatgtggag gaggaagagc tcagatagaa aaggagggag ctactctcag 1440gctgcaagca gtgacagtgc ccagggctct gatgtgtctc tcacagcttg taaagtgtga 1500<210>15<211>1500<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>15atgtctcgct ccgtggcctt agctgtgctc gcgatactct ctctttctgg cctggaggct60agcctgtaca acaccgtcgc gaccctagga ggtgggggag gcggatcagg aggctcaggt 120gggtcaggag gcatccagcg tactccaaag attcaggttt actcacgtca tccagcagag 180aatggaaagt caaatttcct gaattgctat gtgtctgggt ttcatccatc cgacattgaa 240gttgacttac tgaagaatgg agagagaatt gaaaaagtgg agcattcaga cttgtctttc 300agcaaggact ggtctttcta tctcttgtac tacactgaat tcacccccac tgaaaaagat 360gagtatgcct gccgtgtgaa ccatgtgact ttgtcacagc ccaagatagt taagtgggat 420cgagacatgg gaggtggcgg ttcgggcgga ggcggctcgg gtggcggcgg ctctggctct 480cactccatga ggtatttctt cacatccgtg tcccggcccg gccgcgggga gccccgcttc 540atcgcagtgg gctacgtgga cgacacgcag ttcgtgcggt tcgacagcga cgccgcgagc 600cagaggatgg agccgcgggc gccgtggata gagcaggagg gtccggagta ttgggacggg 660
gagacacgga aagtgaaggc ccactcacag actcaccgag tggacctggg gaccctgcgc 720ggctactaca accagagcga ggccggttct cacaccgtcc agaggatgta tggctgcgac 780gtggggtcgg actggcgctt cctccgcggg taccaccagt acgcctacga cggcaaggat 840tacatcgccc tgaaagagga cctgcgctct tggaccgcgg cggacatggc agctcagacc 900accaagcaca agtgggaggc ggcccatgtg gcggagcagt tgagagccta cctggagggc 960acgtgcgtgg agtggctccg cagatacctg gagaacggga aggagacgct gcagcgcacg 1020gacgccccca aaacgcatat gactcaccac gctgtctctg accatgaagc caccctgagg 1080tgctgggccc tgagcttcta ccctgcggag atcacactga cctggcagcg ggatggggag 1140gaccagaccc aggacacgga gctcgtggag accaggcctg caggggatgg aaccttccag 1200aagtgggcgg ctgtggtggt gccttctgga caggagcaga gatacacctg ccatgtgcag 1260catgagggtt tgcccaagcc cctcaccctg agatgggagc cgtcttccca gcccaccatc 1320cccatcgtgg gcatcattgc tggcctggtt ctctttggag ctgtgatcac tggagctgtg 1380gtcgctgctg tgatgtggag gaggaagagc tcagatagaa aaggagggag ctactctcag 1440gctgcaagca gtgacagtgc ccagggctct gatgtgtctc tcacagcttg taaagtgtga 1500<210>16<211>102<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<220>
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<221>misc_feature<222>(1)..(56)<223>
<400>20tcgagaggac tcttggactc tcattcaaga gatgagagtc caagagtcct cttttt 56<210>21<211>68<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(68)<223>
<400>21tcgaccgtgt gcacttcgct tcacctctgt tcaagagaca gaggtgaagc gaagtgcaca 60cggttttt68<210>22<211>56<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(56)<223>
<400>22tcgacccgct caatgcctgg agattcaaga gatctccagg cattgagcgg gttttt 56
<210>23<211>74<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(74)<223>
<400>23tcgaaagtgt tgctttcatt gccaagtttg ttttcaagag aaacaaactt ggcaatgaaa 60gcaacacttt tttt74<210>24<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>24gcggatccat ggagaacatc acatcaggat 30<210>25<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>25gcgctcgagt taaatgtata cccaaagac29<210>26<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>26gcggatccat ggacattgac ccgtataaag 30<210>27<211>30<212>DNA<213>人工序列
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<212>DNA<213>人工序列<400>54cgcaggatcc gccaccatgg atgcaatgaa gagag 35<210>55<211>32<212>DNA<213>人工序列<400>55cgcgctcgag ctacaataat tcttgttcat tc32<210>56<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>56cgcaggatcc tggatggagt gggacagag29<210>57<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>57ctctgtccca ctccatccag gatcctgcg29<210>58<211>3027<212>DNA<213>丙肝病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(3027)<223>
<400>58atgagcacaa atcctaaacc tcaaagaaaa accaaacgta acaccaaccg ccgcccacag 60
gacgtcaagt tcccgggcgg tggtcagatc gttggtggag tttacctgtt gccgcgcagg 120ggccccaggt tgggtgtgcg cgcgactagg aagacttccg agcggtcgca acctcgtgga 180aggcgacaac ctatccccaa ggctcgccgg cccgagggca gggcctgggc tcagcccggg 240tacccttggc ccctctatgg caatgagggc ttggggtggg caggatggct cctgtcaccc 300cgtggctctc ggcctagttg gggccccaca gacccccggc gtaggtcgcg taatttgggt 360aaggtcatcg ataccctcac atgcggcttc gccgacctca tggggtacat tccgcttgtc 420ggcgcccccc tagggggcgc tgccagggcc ctggcgcatg gcgtccgggt tctggaggac 480ggcgtgaact atgcaacagg gaatttgccc ggttgctctt tctctatctt cctcttggct 540ttgctgtctt gtctgaccat cccagcttcc gcttatgaag tgcgcaacgt gtccggggtg 600taccatgtca cgaacgactg ctccaactca agtattgtgt atgaggcagc ggacatgatc 660atgcacaccc ccgggtgcgt accctgcgtc cgggaggcca actcctcccg ctgctgggta 720gcgctcactc ccacgctcgc ggccaggaac agcagcgtcc ccactacgac aatacgacgc 780cacgtcgatt tgctcgttgg ggcagctgct ctctgctccg ccatgtacgt gggagatctc 840tgcggatctg ttttcctcat ctcccagctg ttcaccttct cacctcgcca gtatgagacg 900gtacaagact gcaattgctc actctatccc ggccacgtat caggtcaccg catggcttgg 960gatatgatga tgaactggtc acctacaaca gccctggtgg tatcgcagtt gctccggatc 1020ccacaagccg tcgtggacat ggtggcgggg gcccactggg gagtcctagc gggccttgcc 1080tactattcca tggtggggaa ctgggctaag gttctgattg tgatgctact ctttgccggc 1140gtcgacgggg ctacctacac gtcagggggg acggtaggcc ggaccaccag aggccttacg 1200tccttctttg cacctggccc gtctcagaag atccaactta tcaacaccaa cggcagctgg 1260cacatcaata ggactgccct gaattgcaat gactccctcc acaccgggtt ccttgctgcg 1320ctgttctaca cgcacaagtt caactcgtcc ggatgctcgg agcgtatggc cagctgccgc 1380cccattgaca agttcgccca ggggtggggt cccatcactc atggtgtgcc tgacgacccg 1440gaccagaggc cctactgttg gcactacgcg cctcggccgt gcggtatcgt acccgcgtcg 1500caggtgtgtg gtccagtgta ttgcttcacc ccgagccctg tcgtggtggg gacgaccgat 1560cgttccggcg cccccacgta cacctggggg gagaatgaga cggacgtgct actccttaac 1620aacacgcgac cgccgcaagg caactggttc ggttgcacat gggtgaacag caccgggttc 1680accaaaacgt gcgggggccc cccatgcaac attggagggg tcggcaacaa caccttgacc 1740tgccccacgg actgcttccg gaagcacccc gaggccactt acaccaaatg cggctcgggg 1800ccatggttga cacccaggtg catggttgac tacccataca gactctggca ctacccttgc 1860actgtcaatt ttaccatctt caaggtcagg atgtatgtag ggggtgtgga gcacaggctc 1920gacgccgcgt gcaattggac ccgaggagag cgttgcaatg tggaggacag ggatagatca 1980gagcttagcc cactgctact gtccacaaca gagtggcagg tactgccctg ttctttcacc 2040accctaccgg ctctgtccac tggtttgatc cacctccacc agaacatcgt ggacgtgcaa 2100tacctgtacg gtgtggggtc agtggttgtc tccgttgtaa tcagatggga gtatgtcgtg 2160ctgctcttcc ttctcctggc ggacgcacgc gtctgcgcct gcttgtggat gatgctgctg 2220gtagcccagg ctgaggccgc cttagagaac ttggtggtcc tcaatgcggc atctgtagcc 2280ggagcgcatg gcattctctc cttccttgtg ttcttctgtg ctgcctggta catcaagggc 2340
aagctggtcc ctggggcggc atatgccttc tatggcgtat ggccgctgct cctgctcctg 2400ctggcgttac caccacgagc atacgccatg gaccgggaga tggctgcatc atgcggaggc 2460gcggttttcg taggtctggc actcttgacc ttgtcaccac actataaagt gttcctcgcc 2520aggctcatat ggtggttgca ataccttatc accagggccg aggcgctgct gcaagtgtgg 2580atcccccctc tcaacgttcg ggggggccgc gatgccatca tcctcctcac gtgcgcggtc 2640catccagagc taatctttga catcaccaaa atcttgctcg ccatatttgg tccgctcatg 2700gtgctccagg ctggcttaac cagagtgccg tacttcgtgc gcgctcaggg gctcatccgt 2760gtgtgcatgt tggtgcggaa ggtcgctggg ggtcactacg tccagatggc tctcatgagg 2820ctcgccgcac tgacgggcac gtacgtttac gaccatctca ctccgctgcg gggctgggcc 2880catgcgggcc tgcgggacct tgcggtggca gttgagcccg tcgtcttctc tgacatggag 2940accaagatca tcacctgggg ggcagacacc gcggcgtgtg gggacatcat cctgggtcta 3000cccgtctccg cccgaagggg gaggtaa 3027<210>59<211>1524<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1524)<223>
<400>59atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg ggaaaattag ataaatggga aaaaattcgg60ttacggccag gaggaaagaa acaatataga ttaaaacatt tagtatgggc aagcagggaa 120ttagaacgat tcgcagttaa tcctggcctt ttagagacag cagaaggctg taaacaaatt 180ctggaacagc tacaaccatc ccttcagaca ggatcagaag aacttaggtc attatttaat 240acagtagcaa ccctctattg tgtccatcag aggatagagg taagagacac caaggaagcc 300ttagataagg tagaggagga gcaaaacaac agtaagaaaa aggcacagca agcagcagct 360ggcacaggaa atagcagcca ggccagccaa aattacccta tagtgcagaa catgcagggg 420caaatggtac atcaggcaat atcacccaga actttaaatg catgggtaaa agtagtagaa 480gaaaagggtt ttagcccaga agtaataccc atgttttcag cattatcaga aggaggcacc 540ccacaagatt taaacaccat gctaaacaca atagggggac atcaagcagc catgcaaatg 600ttaaaagaca ccatcaatga ggaagctgca gaatgggaca gattacatcc agtgcatgca 660ggacctatcc caccaggcca gatgagggaa cctaggggaa gtgatatagc tggatccact 720agtacccttc aggaacaaat acaatggatg acaagcaacc cacctgtccc agtgggagaa 780atctataaaa gatggattat cctaggatta aataaaatag taagaatgta tagccctgtc 840
agcattttgg acataaaaca agggccaaag gaacccttta gagactacgt agacaggttc 900tttaaaaccc taagagctga gcaagctaca caggaagtaa agggttggat gacagacacc 960ttgttggtcc aaaatgcgaa cccagattgt aagaccattt taaaagcact gggaccaggg 1020gcttcactag aagaaatgat gacagcatgt cagggagtag gaggacccgg ccataaagca 1080agagttttgg ctgaagcaat gagccacatg acaaattcag ctgctataat gatgcagaaa 1140ggcaatttta ggaatcaaag aaaaactgtc aagtgtttca attgtggcaa agaagggcac 1200atagccagaa attgcagggc ccctagaaaa aagggctgtt ggaaatgtgg aagagaagga 1260caccaaatga aagactgcac tgaaagacag gctaattttt tagggagaat gtggccttcc 1320cacaagggga ggccgggaaa tttccttcag aacaggccag agccaacagc cccaccagca 1380gagagcttcg ggttcggaga ggagataacc ccatctccga aggtgacccc ctctccgaag 1440caggagcaga agcaggagca gaaggacgag ggactgtacc ctcccttagc ttccctcaaa 1500tcactctttg gcaacgacca ctag 1524<210>60<211>3045<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(3045)<223>
<400>60atgtttttta gggagaatgt ggccttccca caaggggagg ccgggaaatt tccttcagaa60caggccagag ccaacagccc caccagcaga gagcttcggg ttcggagagg agataacccc 120atctccgaag gtgaccccct ctccgaagca ggagcagaag caggagcaga aggacgaggg 180actgtaccct cccttagctt ccctcaaatc actctttggc aacgaccact agttacaata 240aaaatagagg gacagctaat ggaagctcta ttagatacag gagcagatga tacagtatta 300gaagatgtaa atttgccagg aaaatggaga ccaaaaatga tagggggaat tggaggtttt 360atcaaagtaa aacagtatga taacatactc atagaaattt gtggacataa ggctataggt 420acagtgttgg taggacctac gcctgtcaac ataattggaa gaaacatgat gactcagatt 480ggttgtactt taaattttcc aattagtcct attaggactg taccagtaaa attgaagcca 540ggaatggatg gcccaaaggt taaacaatgg ccattgacag aagaaaaaat aaaagcatta 600acagaaatat gtttggaaat ggaaaaagaa ggaaaaattt caaaaattgg gcctgaaaat 660ccatacaata ctccagtatt tgccataaag aaaaaagaca gtactaaatg gagaaaatta 720gtagatttca gagaacttaa taaaagaact caagattttt gggaaattca attaggaata 780ccacatcctg cagggttaaa aaagaaaaag tcagtgacag tactggatgt gggagatgca 840tatttttcaa ttcccttaga tgaggatttc aggaagtaca ctgcattcac catacctagt 900
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<211>2583<212>DNA<213>人免疫缺陷病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(2583)<223>
<400>61atgagagtga gggggatgca gaggaattgg caggacttgg ggaagtgggg ccttttattc60ctgggaatat taataatctg taatgctgaa caaaatttgt gggtcacagt ctattatggg 120gtacctgtgt ggaaagaagc atccactact ctattctgtg catcagatgc taaatcatat 180gaaagagaag tgcataatgt ctgggctaca catgcctgtg tacccacaga tcccaatcca 240caagaactag ttctgggaaa tgtaacagaa aattttgata tgtggaaaaa tgatatggta 300gaacaaatgc atgaagatat aattagctta tgggatcaaa gcctaaaacc atgtgtgaag 360ttaaccccac tctgtgttac tttaaactgt actaatgcca aggccattaa ctcctctgac 420aatgccacca attctactcc cttgcctata accagccccc tgaaggaaga ggcaggggca 480atacaaaact gttctttcaa tgtgaccaca gagttaagag ataagaagaa gaaagaatat 540gcaatttttt ataaacttga tatagtacca atagaacaaa tcagcaataa aagttacaat 600acatacaggc taataaattg taacacctca accactacac aggcttgtcc aaaggtatct 660tgggatccaa ttcccataca ttattgtgct ccagctggtt ttgcgattct aaagtgtaat 720aataaaacgt tcaatgggac agggccatgc aagaatgtca gtacagtaca atgtacacat 780ggaattaaac cagtggtatc aactcaattg ttgttaaatg gtagcctagc agaagaagat 840atagtaatca gatttcaaaa tatctcagat aatgcaaaaa ccataatagt acactttaat 900gaatctgtac agattaattg tacaagaccc aacaacaata caagaaaagg tatacatatg 960ggaccaggac aagcatttta tgcagcagga gaaataatag gagacatcag aaaagcatat 1020tgtactatta atggaacaca atggaatgac actttagaac aggtaaaggc aaagttgcag 1080gagcatttcc ctaatagaac aataatgttt aactcatctg caggagggga cctagaaatt 1140acaacacata tttttaattg tagaggagaa tttttttact gcaatacatc agaactgttt 1200aataacacaa aaaacaatgg caccatcatt ctcccatgta aaataaaaca aattgtaaac 1260atgtggcaga gagtaggacg agcaatgtat gccaatccca ttgcaggaaa aattaactgt 1320aactcaaata ttacaggtct attattgaca agagatggtg gtaatcaggc taatgagact 1380agtggtattc agactaatgg gactgagatc ttcagacctg gaggaggaaa tatgagagac 1440aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtacaaa ttaaaccact aggaatagca 1500cccaccaggg caaaaagacg agtggtgcag agagcaagaa gagcagtggg aataggagct 1560cttttcattg gattcttagg agcagcagga agcactatgg gcgcggcgtc aataacgctg 1620acggtacagg ccagacaatt attgtctgga atagtgcaac agcaaaacaa tttactgcag 1680
gctattgaag cgcaacagca tctgttgcag ctcacagtct ggggcattaa acagctccag 1740gcaagactcc tggctgtgga aagattccta catgatcaac agctcctagg gctttggggc 1800tgctctggaa aactcatctg caccactagt gtgccctgga actctagttg gagcaataaa 1860tcttatgaca agatttggga taacatgacc tggatggagt gggaaaaaga gattagcaat 1920tactcagatg aaatatacag gttaattgaa aaatcgcaga accagcagga aataaatgaa 1980caagaattat tagcattgga taaatgggca agtctgtgga attggtttga cataacaagc 2040tggctgtggt atataaaaat attcataatg atagtaggag gcttgatagg cttaagaata 2100gtttttactg tgctttctat agtaaataga gttaggaagg gatactcacc tttgtcattt 2160cagacccata tcccaagctc gagggaacaa cccgacaggc ccgaaggaat cgaagaagga 2220ggtggagagc aagacaaaga cagatccgtg agattagtga gcggattctt agctcttgtc 2280tggaacgacc tgagggacct gtgcctcttc agctaccacc tcttgagaga cttcacatta 2340cttgcagcga ggattgtgga cagagggctg aggagggggt gggaagccct caaatatctg 2400tggaatctcg cgcagtattg gagtcgggaa ctaaagaata gtgctattag cttgtttaat 2460accacagcaa tagtagtagc tgaagggaca gatagagttc tagaagcttt gcaaagagct 2520ggtagagctg ttctccatat ccctagaaga ataagacagg gctttgaaag agctttgcta 2580taa2583<210>62<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>62gaggactctt ggactctca 19<210>63<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>63ccgtgtgcac ttcgcttcac ctctg25<210>64<211>19<212>DNA<213>人工序列<400>64catcacatca ggattccta 19
<210>65<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>65ctcagtttac tagtgccatt tgttc25<210>66<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>66catcacatca ggattcctaa a21<210>67<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>67agaagatctc aatctcggga atctc25<210>68<211>18<212>DNA<213>人工序列<400>68cccgctcaat gcctggag18<210>69<211>111<212>DNA<213>丙肝病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(111)<223>
<400>69atggttttcg gcggccattg gggtgtggtg tttggcttgg cctatttttc catgcaagga 60gcgtgggcca aagtcattgc catcctcctc cttgtcgcag gagtggacgc g 111<210>70<211>1098<212>DNA<213>丙肝病毒<220>
<221>CDS<222>(1)..(1098)<223>
<400>70ggcacctata ccaccggtgc agtcacgggt cgaaccacca atgtgtttac tagcctcttt60tcatctgggt cccagcagaa gctcagttta atcaacacca atggcagctg gcacataaac 120cggaccgccc tcaattgcaa tgacagcctg cagacggggt ttatcgcctc cttgttttac 180acgcacaggt ttaacagctc cggctgcccc gagcgcttgt cttcctgccg caggctggaa 240gatttccgca tcgggtgggg aaccttggaa tacgagacta atgtcaccaa tgatgaggac 300atgaggccgt actgctggca ttaccctcca agaccctgcg gtatcgtcca ggctaagacg 360gtttgcgggc cggtctattg tttcaccccc agccctgtcg tcgtgggtac cactgacagg 420cagggcgtgc ccacttacag ctggggggaa aatgagaccg atgttttctt gttaaatagt 480acaagacccc cgcaaggagc ctggttcggc tgcacttgga tgaatgggac tgggttcact 540aagacatgcg gtgcaccacc ttgccgcatt aggagggact acaacggaac cctcgaccta 600ttgtgcccca cagactgttt cagaaagcac ccagatacta cctaccttaa gtgtggagcg 660gggccttggt tgacccccaa atgcatggta gactatccct atagattgtg gcattatccg 720tgcactgtga attttaccat cttcaaggtg cggatgtatg tgggaggagt ggagcatcgg 780ttccatgcag cgtgcaatta cacgcgcggg gaccgctgca gtttggagga cagggacagg 840ggtcagcaga gtccactact gcattccacc accgagtggg cggtgttgcc atgctctttc 900tccgacctac cggcactatc cactggtcta ctgcacctcc accaaaacat cgtggacgtg 960cagtacctct atggactctc tccggctatc acaaaataca tcgtgaagtg ggaatgggtg 1020atccttcttt tcctgttgct ggcagacgcc agggtctgtg cttgcctctg gatgctcatt 1080atattgggcc aggccgaa1098<210>71<211>28<212>DNA<213>人工序列
<400>71aagtgttgct ttcattgcca agtttgtt 28<210>72<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>72Phe Leu Pro Ser Asp Phe Phe Pro Ser Val1 5 10<210>73<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>73Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val1 5<210>74<211>9<212>PRT<213>人工序列<400>74Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile1 5<210>75<211>10<212>PRT<213>人工序列<400>75Tyr Val Asn Val Asn Met Gly Leu Lys Leu1 5 10<210>76<211>9
<212>PRT<213>人工序列<400>76Glu Tyr Leu Val Ser Phe Gly Val Trp1 5<210>77<211>14<212>PRT<213>人工序列<400>77Gln Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu1 5 10
權(quán)利要求
1.一種抗免疫耐受病毒和/或囊膜病毒的雞尾酒疫苗，其包括兩種或兩種以上元件以及任選的病毒抗原重組蛋白和可藥用賦形劑，所述元件以重組DNA和/或重組病毒的形式存在，所述元件選自(A)中和抗體、受體阻斷劑、膜融合抑制劑、細胞因子編碼序列，和/或RNA干涉序列；(B)免疫佐劑編碼序列；(C)抗原基因、病毒抗原與免疫佐劑融合基因、病毒抗原表位編碼序列、多表位融合基因和/或病毒抗原表位-MHC-I SCT基因；(D)囊膜病毒融合蛋白的兩個七肽重復(fù)序列HR1、HR2和/或其聚合物的編碼序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述免疫耐受病毒是乙肝病毒(HBV)或丙肝病毒(HCV)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述囊膜病毒是人免疫缺陷病毒(HIV)、呼吸道合胞病毒(RSV)或SARS冠狀病毒(SARS-Cov)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述免疫佐劑為熱休克蛋白gp96或其氨基端片段。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述病毒抗原重組蛋白可以選自，但不限于以下序列表達的蛋白∶病毒抗原的比對保守序列，主要流行株序列或其部分序列，或病毒抗原與佐劑融合的融合基因序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，所述RNA干涉序列其靶序列可以選自，但不限于病毒編碼序列或非編碼序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述膜融合抑制劑可以選自，但不限于HIV膜融合的七肽重復(fù)序列HR1、HR2或其聚合物。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述細胞因子可以選自，但不限于細胞因子IFNα(1和2)或γ，TNFα或IL-2。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述抗原基因可以選自，但不限于病毒抗原的比對保守序列，主要流行株序列或其部分序列，或病毒抗原與佐劑融合的融合基因序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述病毒抗原表位編碼序列可以選自，但不限于病毒結(jié)構(gòu)基因或調(diào)解基因表位序列。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述多表位融合基因可以選自，但不限于病毒Th表位和MHC-I限制表位與佐劑或/和泛素融合序列。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述病毒抗原表位-MHC-I SCT基因可以選自但不限于，HLA-A2、HLA-A11、HLA-A24、HLA-30與病毒抗原和β2m的融合序列。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述重組DNA為重組質(zhì)粒。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的雞尾酒疫苗，其中所述質(zhì)粒為真核表達載體。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其中所述重組病毒為重組腺病毒或重組痘苗病毒。
16.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其是通過將所述元件任選地組合而構(gòu)建的包含重組DNA、腺病毒和/或痘病毒的多載體疫苗。
17.根據(jù)權(quán)利要求1的雞尾酒疫苗，其是通過將所述元件包含到同一個DNA或腺病毒或痘病毒載體中而構(gòu)建的單載體疫苗。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或2的雞尾酒疫苗，其中所述雞尾酒疫苗為HBV治療性雞尾酒疫苗，其包括兩種或兩種以上元件，所述元件以重組DNA和/或重組病毒的形式存在，所述元件選自(1)有效降低HBV-DNA復(fù)制的干擾RNA(siRNA)和/或干擾素(IFN)α或β編碼序列；(2)佐劑分子gp96或其氨基端片段編碼序列；(3)HBV的結(jié)構(gòu)抗原HBsAg、HBcAg或其與佐劑融合的融合基因和/或其抗原表位編碼序列、多表位融合基因、抗原表位-MHC-I SCT基因。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或2的雞尾酒疫苗，其中所述雞尾酒疫苗為HCV治療性雞尾酒疫苗，其包括兩種或兩種以上元件，所述元件以重組DNA和/或重組病毒的形式存在，所述元件選自(1)有效降低HCV復(fù)制的干擾RNA(siRNA)和/或IFNα或β編碼序列；(2)佐劑分子gp96或其氨基端片段編碼序列；(3)HCV的結(jié)構(gòu)抗原Core、E1、E2編碼序列或其與佐劑融合的融合基因和/或HCV的抗原表位編碼序列、多表位融合基因、抗原表位-MHC-I SCT基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或3的雞尾酒疫苗，其中所述雞尾酒疫苗是HIV預(yù)防性雞尾酒疫苗，其包括兩種或兩種以上元件，所述元件以重組DNA和/或重組病毒的形式存在，所述元件選自(1)可阻斷HIV與細胞融合的七肽重復(fù)序列HR1、HR2或其聚合物的編碼序列；(2)佐劑分子gp96或其氨基端片段編碼序列；(3)HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol編碼序列和/或其與佐劑融合的融合基因和/或HIV的抗原表位編碼序列、多表位融合基因、抗原表位-MHC-I SCT基因。
21.根據(jù)權(quán)利要求1或3的雞尾酒疫苗，其中所述雞尾酒疫苗為HIV治療性雞尾酒疫苗，其包括兩種或兩種以上元件，所述元件以重組DNA和/或重組病毒的形式存在，所述元件選自(1)可阻斷HIV與細胞融合的七肽重復(fù)序列HR1、HR2或其聚合物的編碼序列；(2)可有效抑制HIV復(fù)制的干擾RNA(siRNA)和/或IFNα或β編碼序列；(3)佐劑分子gp96或其氨基端片段編碼序列；(4)HIV的結(jié)構(gòu)抗原env、gag、pol和/或其與佐劑融合的融合基因和/或HIV的抗原表位編碼序列、多表位融合基因、抗原表位-MHC-I SCT基因。
22.根據(jù)權(quán)利要求1，20或21的雞尾酒疫苗，其中所述聚合物可以是HR212。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22中任一項的雞尾酒疫苗在制備預(yù)防和/或治療由免疫耐受性病毒和免疫缺陷病毒引起的疾病的藥物中的用途。
24.一種制備權(quán)利要求23所述的藥物的方法，所述方法包括將選自下列的兩種或兩種以上的元件(A)中和抗體、受體阻斷劑、膜融合抑制劑、細胞因子編碼序列，和/或RNA干涉序列；(B)免疫佐劑編碼序列；(C)抗原基因、病毒抗原與免疫佐劑融合基因、病毒抗原表位編碼序列、多表位融合基因和/或病毒抗原表位-MHC-I SCT基因；(D)囊膜病毒融合蛋白的兩個七肽重復(fù)序列HR1、HR2和/或其聚合物HR212的編碼序列，分別與重組DNA、重組病毒構(gòu)建成活性載體，將所述重組DNA和/或重組病毒活性載體與任選的病毒抗原重組蛋白和任選的藥用賦形劑進行混合。
25.一種治療由免疫耐受性病毒和免疫缺陷病毒引起的疾病的方法，其中向患所述疾病的患者給藥權(quán)利要求23所述的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種抗免疫耐受性和免疫缺陷性病毒的雞尾酒疫苗及其應(yīng)用。所述雞尾酒疫苗至少包括兩種或兩種以上元件以及任選的病毒抗原重組蛋白和可藥用賦形劑，所述元件以重組DNA和/或重組病毒的形式存在，所述元件選自(A)中和抗體、受體阻斷劑、膜融合抑制劑、細胞因子編碼序列，和/或RNA干涉序列；(B)免疫佐劑編碼序列；(C)抗原基因、病毒抗原與免疫佐劑融合基因、病毒抗原表位編碼序列、多表位融合基因和/或病毒抗原表位－MHC－I SCT基因；(D)囊膜病毒融合蛋白的兩個七肽重復(fù)序列HR1、HR2和/或其聚合物HR212的編碼序列。雞尾酒疫苗中各抗病毒元件的表達載體包括重組DNA載體、致弱的痘苗病毒載體和/或腺病毒載體。
文檔編號C12N15/861GK101057975SQ20061016510
公開日2007年10月24日 申請日期2006年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月13日
發(fā)明者田波, 張玉霞, 劉長梅, 高福 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所