專(zhuān)利名稱(chēng)：測(cè)量聚合酶活性的閃爍鄰近測(cè)定法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及聚合酶的生物學(xué)測(cè)定，且更具體地涉及用于測(cè)量RNA和DNA聚合酶酶活性的閃爍鄰近測(cè)定法。
背景技術(shù)：
丙型肝炎病毒是遍及世界的慢性肝病的主要原因(Boyer，N.等人 J.HepatoL. 2000 3298-112)。感染了HCV的患者有發(fā)展為肝硬化繼之以肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)，因此HCV是肝移植的主要指標(biāo)。
HCV已被歸為包括黃病毒屬、瘟病毒屬和包括丙型肝炎病毒的肝炎病毒屬的黃病毒科成員(Rice，C.M.，F(xiàn)laviviridaeThe viruses and theirreplication.InFields Virology，編輯B.N.Fields，D.M.Knipe和P.M.Howley，Lippincott-Raven Publishers，Philadelphia，Pa.，第30章，931-959，1996)。HCV是有包膜病毒，其含有約9.4kb的正義單鏈RNA基因組。所述病毒基因組由5’非翻譯區(qū)(UTR)、編碼約3011氨基酸的多蛋白前體的長(zhǎng)開(kāi)放閱讀框和短的3’UTR組成。所述5’UTR是HCV基因組中最為高度保守的部分，且對(duì)于起始和控制多蛋白翻譯非常重要。非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)5即NS5B的羧基一半包含依賴(lài)RNA的RNA聚合酶。
目前存在有限數(shù)量的已被承認(rèn)的療法可用于HCV感染的治療。治療HCV和抑制HCV NS5B聚合酶的新的和現(xiàn)存的方法已被綜述于以下文獻(xiàn)中R.G.Gish，Sem.Liver.Dis.，1999 195；Di Besceglie，A.M.和Bacon，B.R.，Scientific American，1999年10月，80-85；G.Lake-Bakaar，Currentand Future Therapy for Chronic Hepatitis C Virus Liver Disease，Curr.Drug Targ Infect Dis.2003 3(3)247-253；P.Hoffman等人，Recent patentson experimental therapy for hepatitis C virus infection(1999-2002)，Exp.Opin.Ther. Patents 2003 13(11)1707-1723；M.P.Walker等人，PromisingCandidates for the treatment of chronic hepatitis G，Exp.Opin.investing.Drugs 2003 12(8)1269-1280；S.-L.Tan 等人，Hepatitis CTherapeuticsCurrent Status and Emerging Strategies，Nature Rev.DrugDiscov.2002 1867-881；J.Z.Wu和Z.Hong，Targeting NS5BRNA-Dependent RNA Polymerase for Anti-HCV Chemotherapy，Curr.DrugTarg.-Infect.Dis.2003 3(3)207-219。
在體外，HCV NS5B的聚合酶活性依賴(lài)于RNA模板并需要RNA或DNA引物。已發(fā)展了多種測(cè)量HCV NS5B聚合酶活性的體外測(cè)定法。通常，標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物包括緩沖液、鹽、二價(jià)陽(yáng)離子、還原劑和核苷三磷酸以及RNA模板和引物。最通用的模板和引物是合成的同聚模板/引物，如聚腺苷單磷酸寡尿苷單磷酸(polyAoligo U；見(jiàn)例如，S.-E.Behrens等人，EMBO J.1996 15(1)12-22，V.Lohmann等人，J. Virol. 199771(11)8416-8428)。
然而，當(dāng)使用雜聚序列(包括來(lái)自HCV基因組的序列)的RNA模板時(shí)，NS5B也能夠以不依賴(lài)引物的方式起始體外RNA合成。這些序列包括位于HCV基因組5’非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(HCV IRES；Kieft等人，RNA 2001 7194-206)和3’非翻譯區(qū)(HCV 3’-UTR；Pellerin等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.2002 295682-688)。在此處，模板的3’末端被用作引物，且延伸經(jīng)由折返機(jī)制從發(fā)夾環(huán)進(jìn)行，產(chǎn)生其中模板和產(chǎn)物共價(jià)連接的雙鏈分子。
閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)使用某些電子發(fā)射器限定的光程長(zhǎng)度(Hart等人，Molecular Immunology 1979 16265-267；Hart，美國(guó)專(zhuān)利No.4,271,139和No.4,382,074以及Bertoglio-Matte，美國(guó)專(zhuān)利No.4,568,649)。有代表性的SPA是由溶液中的分析物、接觸電子時(shí)閃爍的塑料珠以及結(jié)合于珠子上且特異于溶液中的分析物的特異性結(jié)合配偶體(如抗體)組成。如果所述分析物摻入發(fā)射相對(duì)短光程長(zhǎng)度電子的放射性標(biāo)記(如氚)，則僅當(dāng)塑料珠與分析物懸浮于溶液中，放射性分析物為結(jié)合配偶體特異性結(jié)合并因此定位于珠子表面附近時(shí)，所述塑料珠才閃爍。
已發(fā)展和開(kāi)發(fā)了用于多種分析目的的SPA。SPA已被用于放射性免疫測(cè)定、競(jìng)爭(zhēng)性測(cè)定、酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定、配體/受體及抗原/抗體相互作用的研究以及細(xì)胞過(guò)程的研究(見(jiàn)Cook，Drug Discovery Today 1996 1287-294和Cook，美國(guó)專(zhuān)利No.5,665,562)。迄今為止，所述SPA全部依賴(lài)于特異性結(jié)合的相互作用，如抗體-抗原相互作用、配體-受體相互作用、與鏈霉抗生物素(蛋白)包被的珠子結(jié)合的生物素化試劑、目的物質(zhì)螯合絡(luò)合物的形成或依賴(lài)于結(jié)合配偶體的精確且特異性的結(jié)構(gòu)互補(bǔ)性的其它相互作用。盡管這賦予SPA對(duì)目的分析物的高度特異性，但還需要額外的步驟準(zhǔn)備試劑以及開(kāi)發(fā)目的反應(yīng)特異性的結(jié)合配偶體系統(tǒng)所需的時(shí)間和花費(fèi)。這也限制其只能用于可以找到或開(kāi)發(fā)特異性結(jié)合配偶體的系統(tǒng)。例如，對(duì)于抗原-抗體測(cè)定需要特異性抗體，對(duì)于配體-受體測(cè)定需要特異性受體，螯合配體必須與與其形成螯合絡(luò)合物的離子的幾何結(jié)構(gòu)相匹配。如果沒(méi)有用于檢測(cè)物質(zhì)的可用抗體或受體，則需要用結(jié)合對(duì)(如生物素-鏈霉抗生物素蛋白)成員特異性修飾分析物。
因此，為了使用標(biāo)準(zhǔn)SPA測(cè)定測(cè)量包括HCV NS5B聚合酶的任意聚合酶活性，合成的引物(如寡尿苷酸)必須用親和標(biāo)簽分子(如生物素)修飾，使其能夠與適當(dāng)?shù)耐勰０逋嘶?在此情況下是聚腺苷酸)并且能夠與用可以結(jié)合標(biāo)簽分子的分子(如鏈霉抗生物素蛋白)包被的SPA珠子反應(yīng)。然而，發(fā)展可藉以在SPA測(cè)定中使用無(wú)引物或未經(jīng)修飾引物的雜聚模板測(cè)量聚合酶酶活性的系統(tǒng)將是有用且有成本效益的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明是基于這一發(fā)現(xiàn)，即通過(guò)在酸性pH下將聚合酶產(chǎn)生的產(chǎn)物與SPA的支持結(jié)構(gòu)(如珠子)相接觸可以實(shí)行SPA測(cè)定以測(cè)量不用引物或使用未經(jīng)修飾引物的聚合酶酶活性。通過(guò)消除對(duì)與親和標(biāo)簽分子連接的修飾引物的需要(其本身是有成本效益的)，可以使用代表更精確條件的給定聚合酶的天然的核苷酸序列或其它雜聚序列作為模板實(shí)行SPA測(cè)定，以測(cè)量聚合酶活性。
因此，本發(fā)明提供了測(cè)定聚合酶活性的方法孵育反應(yīng)混合物，其含有聚合酶、適當(dāng)?shù)哪０逡约岸喾N適當(dāng)?shù)胤派湫詷?biāo)記的和非放射性標(biāo)記的核苷三磷酸，以提供使用或不使用未修飾引物的標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物；在從約2.0到約4.5的pH范圍內(nèi)將標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物與SPA支持結(jié)構(gòu)的懸浮液相接觸；并測(cè)量與聚合酶酶活性相關(guān)的閃爍水平。在另一實(shí)施方案中，在調(diào)節(jié)聚合酶酶活性的化合物存在下孵育反應(yīng)混合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
考慮到本發(fā)明的下列詳述連同所附的用來(lái)說(shuō)明代表性實(shí)施方案的實(shí)施例，本發(fā)明的上述和其它優(yōu)點(diǎn)及特征以及實(shí)現(xiàn)所述優(yōu)點(diǎn)和特征的方式將會(huì)變得更加顯而易見(jiàn)。
附圖的簡(jiǎn)短說(shuō)明

圖1為NS5B聚合酶濃度的影響。實(shí)驗(yàn)在384孔板中實(shí)行，其中NS5B濃度范圍從0到160nM。HCV IRES模板為0.26μg/孔，在含有40mMTris(pH8.0)、4mM乙酸鎂和4mM DTT的緩沖液中存在1μM的CTP、GTP、ATP和1μCi3H-UTP。在30℃孵育2.5小時(shí)后用含有100mM乙酸鈉(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白質(zhì)A-PVT SPA珠子的溶液終止反應(yīng)。
圖2為已知的NS5B抑制劑的劑量應(yīng)答曲線(xiàn)實(shí)驗(yàn)在384孔板中實(shí)行，NS5B的濃度為0.23μg/20μl。 HCV IRES模板為0.26μg/20μl，在含有40mM Tris(pH8.0)、4mM乙酸鎂、4mM DTT和10％DMSO的緩沖液中存在1μM的CTP、GTP、ATP和1μCi3H-UTP。在30℃孵育2.5小時(shí)后用含有100mM乙酸鈉(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白質(zhì)A-PVT SPA珠子的溶液終止反應(yīng)。
定義術(shù)語(yǔ)“聚合酶”指催化核苷酸聚合作用(即聚合酶活性)的酶。通常，聚合酶將起始在與多核苷酸模板序列退火的引物3’末端的合成，并將向模板鏈的5’末端進(jìn)行?！癛NA聚合酶”催化核糖核苷酸的聚合作用，而“DNA聚合酶”催化脫氧核糖核苷酸的聚合作用?！癉NA聚合酶”可以包括利用RNA作為模板產(chǎn)生DNA鏈的“依賴(lài)RNA的DNA聚合酶”(如逆轉(zhuǎn)錄酶)，以及利用DNA作為模板產(chǎn)生DNA鏈的“依賴(lài)DNA的DNA聚合酶”。
術(shù)語(yǔ)“病毒聚合酶”指在病毒基因組中含有的催化核糖核苷酸或脫氧核苷酸的聚合作用并使病毒能夠復(fù)制的聚合酶。
術(shù)語(yǔ)“NS5B”指位于HCV病毒基因組3’末端附近的HCV基因組的部分，其特指被稱(chēng)之為“NS5B蛋白質(zhì)”、“NS5B多肽”、“NS5B聚合酶”、或在本文中可互換使用的這些術(shù)語(yǔ)的組合的蛋白質(zhì)的編碼區(qū)域。NS5B在其天然狀態(tài)下作為依賴(lài)RNA的RNA聚合酶(RdRp)起作用。編碼NS5B蛋白質(zhì)的核酸區(qū)域還可以被稱(chēng)之為“NS5B”基因。因此，視使用所述術(shù)語(yǔ)的上下文而定，術(shù)語(yǔ)“NS5B”可以指編碼NS5B多肽的核酸、NS5B基因或NS5B多肽，或其任意部分。NS5B還可以指NS5B核酸序列或NS5B多肽的天然等位基因變體、突變體以及衍生物。所述NS5B核酸、NS5B基因或NS5B蛋白質(zhì)指有功能的聚合酶或依然結(jié)合于正確模板的無(wú)功能的聚合酶。
“閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)”指產(chǎn)生在一定水平上可量化的光能的均質(zhì)測(cè)定操作，該水平與測(cè)定介質(zhì)中放射性標(biāo)記產(chǎn)物的量相關(guān)。光能由被摻入到支持結(jié)構(gòu)(珠子或其它可以用于測(cè)定方法的固體表面)之中或形成其一部分的閃爍體產(chǎn)生。盡管支持結(jié)構(gòu)可以用捕獲分子包被，捕獲分子并非本發(fā)明的實(shí)施所必須的。在直接測(cè)定法中，在含有閃爍體支持結(jié)構(gòu)的水性溶液中混合有含放射性標(biāo)記產(chǎn)物的樣品。使放射性標(biāo)記的產(chǎn)物結(jié)合于含有閃爍體的支持結(jié)構(gòu)。使用閃爍計(jì)數(shù)器可以常規(guī)地檢測(cè)到閃爍體激活所產(chǎn)生的光發(fā)射。產(chǎn)生的光量與結(jié)合于支持結(jié)構(gòu)表面的反應(yīng)物的量直接地成比例。在SPA中使用的珠子可以是直徑約5μm的微球，且可以制備自疏水聚合物如但不限于聚丙烯酰胺、丙烯酰胺、瓊脂糖、聚苯乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯和聚甲基苯乙烯，或制備自無(wú)機(jī)閃爍劑如硅酸釔。珠子的核心可以用減少珠子疏水性的聚羥基膜包被。在一個(gè)實(shí)施方案中，含有有機(jī)閃爍體如二苯基唑的SPA珠子制備自硅酸釔或聚甲基苯乙烯，并且可以從Amersham Biosciences(Piscataway，N.J.)商購(gòu)。
“適當(dāng)?shù)胤派湫詷?biāo)記”分子的同位素指具有相對(duì)低能量的β發(fā)射的同位素，例如氚或碘-125俄歇電子。樣品中僅結(jié)合于或鄰近于含閃爍體支持結(jié)構(gòu)的部分產(chǎn)生可以被計(jì)數(shù)的閃爍事件。未結(jié)合的放射性標(biāo)記分子與閃爍體距離太遠(yuǎn)而不能產(chǎn)生閃爍，其β衰減能量散失在液體水性介質(zhì)中。
如本文所用術(shù)語(yǔ)“親和標(biāo)簽”指這樣的配體(其連接于引物)，其對(duì)“受體”具有的強(qiáng)親和力可以被用來(lái)從溶液中選取與配體連接的實(shí)體。這類(lèi)配體的實(shí)例包括生物素或其衍生物、組氨酸多肽、直鏈淀粉的蔗糖部分或特異性抗體可識(shí)別的限定表位。這樣的“親和標(biāo)簽”優(yōu)選地連接于溶液中的引物，并由連接于固體支持物的合適“受體”部分捕獲。
本文所用術(shù)語(yǔ)“引物”指當(dāng)被置于正確的環(huán)境中時(shí)能夠作為依賴(lài)模板的核酸合成的起始子功能性地起作用的寡核苷酸，其可以為RNA或DNA；可以為單鏈或雙鏈；可以來(lái)自生物系統(tǒng)，由限制性酶消化產(chǎn)生，或者是合成制備。當(dāng)與合適的核酸模板、適當(dāng)?shù)暮怂岬暮塑杖姿崆绑w、聚合酶、適當(dāng)?shù)妮o因子以及適當(dāng)?shù)臈l件(如適當(dāng)?shù)臏囟群蚿H)同時(shí)存在時(shí)，引物可以通過(guò)聚合酶在其3’末端添加核苷酸而被延長(zhǎng)(延伸)，或通過(guò)相似活性產(chǎn)生引物延長(zhǎng)(延伸)的產(chǎn)物?？梢匀Q于應(yīng)用的特定條件和需要改變引物長(zhǎng)度。例如，在本發(fā)明的方法中，核苷酸或寡核苷酸引物通常長(zhǎng)度為1-24或更多的核苷酸。所述引物必須與期望的模板充分互補(bǔ)以引發(fā)期望的延伸產(chǎn)物的合成，即，引物能夠與期望的模板鏈以這樣的方式退火，從而足以保證引物的3’羥基部分與類(lèi)似的酶合適地并置。引物序列并不需要呈現(xiàn)與期望模板的精確互補(bǔ)。例如，非互補(bǔ)的核苷酸序列可以被連接在另外的互補(bǔ)引物的5’端。備選地，只要引物序列與期望的模板鏈的序列充分互補(bǔ)，足以為延伸產(chǎn)物的合成功能性地提供引物-模板復(fù)合物，非互補(bǔ)的堿基就可以被散布在寡核苷酸引物序列中。
本文所用術(shù)語(yǔ)“未修飾的引物”指未修飾的或未連接“親和標(biāo)簽”分子的引物。
術(shù)語(yǔ)“RNA合成”和“轉(zhuǎn)錄”可互換使用，并被定義為由RNA聚合酶進(jìn)行的具體步驟識(shí)別并結(jié)合模板起始位點(diǎn)；通過(guò)摻入第一互補(bǔ)核苷酸引發(fā)合成；以及連續(xù)地加入互補(bǔ)核苷酸以延長(zhǎng)新生RNA鏈。
術(shù)語(yǔ)“模板”指作為聚合酶底物之一的長(zhǎng)度至少為50核苷酸的DNA，或優(yōu)選地RNA的寡核苷酸。模板序列與聚合酶在轉(zhuǎn)錄期間產(chǎn)生的序列互補(bǔ)。對(duì)于聚合酶，“合適的”模板是能夠作為給定聚合酶的底物的模板。術(shù)語(yǔ)“同聚模板”指整個(gè)序列由一種核苷酸組成的模板，如聚腺苷酸或聚鳥(niǎo)苷酸。術(shù)語(yǔ)“雜聚模板”指非“同聚”的且其序列由一種以上核苷酸組成的模板。
本發(fā)明提供通過(guò)使用閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)測(cè)定聚合酶活性的方法。SPA通過(guò)使放射性標(biāo)記分子與支持結(jié)構(gòu)閃爍體鄰近以刺激光激發(fā)的方式運(yùn)作。本發(fā)明的第一個(gè)實(shí)施方案中提供了測(cè)定聚合酶活性的方法，其包括步驟a)孵育反應(yīng)混合物以產(chǎn)生使用或不使用未修飾引物的標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物，所述反應(yīng)混合物含有所述聚合酶、合適的模板以及多種適當(dāng)?shù)胤派湫詷?biāo)記和非放射性標(biāo)記的核苷三磷酸；b)在從約2.0到約4.5的pH范圍內(nèi)將所述標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物與閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)的支持結(jié)構(gòu)接觸；和c)測(cè)量閃爍水平，其中所述閃爍水平與所述聚合酶活性相關(guān)。
在本發(fā)明第一實(shí)施方案的一個(gè)實(shí)施方案中，聚合酶是HCV NS5B聚合酶。在此測(cè)定中，NS5B結(jié)合于使用或不使用引物的單鏈RNA模板并起始ds(雙鏈)RNA的從頭合成。所述模板可以是需要互補(bǔ)引物(如聚腺苷酸-寡尿苷酸)的同聚物，或需要或不需要互補(bǔ)引物的雜聚物。不需要引物的NS5B的RNA模板包括位于HCV基因組5’非翻譯區(qū)的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(HCV IRES)和3’非翻譯區(qū)(HCV 3'-UTR)。放射性標(biāo)記的UTP以及未標(biāo)記的CTP、GTP和ATP經(jīng)聚合酶-模板結(jié)合而被摻入雙鏈螺旋。通過(guò)加入固定量的蛋白質(zhì)-A-聚甲基苯乙烯(PVT)SPA珠子(在低pH中)(其與dsRNA偶聯(lián)并阻止反應(yīng)的進(jìn)一步進(jìn)行)檢測(cè)產(chǎn)物(dsRNA)。珠子與摻入的放射性標(biāo)記UTP的鄰近導(dǎo)致光子發(fā)射，并由檢測(cè)器捕獲。沒(méi)有信號(hào)(光子)表明經(jīng)由酶/化合物阻斷而缺少dsRNA形成。
本發(fā)明的第二個(gè)實(shí)施方案提供了測(cè)定聚合酶酶活性的方法，其包括步驟a)在一種或多種調(diào)節(jié)所述聚合酶活性的化合物存在下，孵育反應(yīng)混合物以產(chǎn)生使用或不使用未修飾引物的標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物，所述反應(yīng)混合物包含所述聚合酶、合適的模板以及多種適當(dāng)?shù)胤派湫詷?biāo)記的和非放射性標(biāo)記的核苷三磷酸；b)在從約2.0到約4.5的pH范圍內(nèi)將所述標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物與閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)的支持結(jié)構(gòu)接觸；和c)測(cè)量閃爍水平，其中所述閃爍水平與所述聚合酶的活性相關(guān)。在本發(fā)明第二個(gè)實(shí)施方案的優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
本發(fā)明的方法還可以用任意數(shù)目的RNA和DNA聚合酶實(shí)施，因?yàn)橛删酆厦府a(chǎn)生的標(biāo)記的產(chǎn)物(即ds RNA或DNA)在酸性pH條件下能夠與SPA支持結(jié)構(gòu)如此鄰近，從而閃爍水平與聚合酶的活性相關(guān)。本發(fā)明適用于來(lái)自原核和真核物種以及來(lái)自RNA和DNA病毒的RNA和DNA聚合酶。DNA聚合酶可以包括依賴(lài)DNA的DNA聚合酶或依賴(lài)RNA的DNA聚合酶，如人免疫缺陷病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(HIV-RT)。
給出下列制備和實(shí)施例使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更清楚地理解和實(shí)施本發(fā)明。其不應(yīng)理解為本發(fā)明范圍的限制，而是僅作為對(duì)本發(fā)明的舉例說(shuō)明和代表。
實(shí)施例1HCV NS5B RNA聚合酶測(cè)定N末端組氨酸標(biāo)簽標(biāo)記的HCV聚合酶來(lái)自HCV BK菌株，基因型1b(NS5B570n-BK)，其相對(duì)于全長(zhǎng)HCV聚合酶在C末端含有21個(gè)氨基酸的缺失，并且純化自大腸桿菌(E.coli)菌株M15。在Taq啟動(dòng)子表達(dá)盒下游含有HCV BK菌株氨基酸殘基2421-2999的編碼序列(Genbank登錄號(hào)M58335)的構(gòu)建體被插入質(zhì)粒構(gòu)建體中。用所述質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌，接種菌落，并于37℃在補(bǔ)充了100μg/mL氨芐青霉素的10LTerrific培養(yǎng)液(Tartoff和Hobbs)中過(guò)夜生長(zhǎng)。當(dāng)光密度達(dá)到1.5至3.5OD600之間時(shí)，加入1mM異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，并將培養(yǎng)物在22℃繼續(xù)孵育16到18小時(shí)。使用三步法(包括隨后在Ni-NTA、SP-瓊脂糖HP和Superdex 75樹(shù)脂上柱層析)純化NS5B570n-BK至同質(zhì)。
將多種濃度的NS5B聚合酶加入384孔板，并與濃度為0.26μg/孔的377核苷酸的HCV IRES模板序列(SEQ ID NO1)(模板序列含有來(lái)自GenBank登錄號(hào)AF356827的HCV 5’非翻譯區(qū)的21-371核苷酸殘基)、溶于含有40mM Tris(pH8.0)、4mM乙酸鎂和4mM DTT的緩沖液中的1μM CTP、GTP、ATP和1μCi3H-UTP(Amersham TRK412，1mCi/ml)共孵育。在有些情況下，還加入10μM濃度的測(cè)試化合物。在30℃孵育3小時(shí)后，每孔加入含有100mM乙酸鈉溶液(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白A-PVT SPA珠子的溶液。樣品在室溫放置12小時(shí)。從SPA珠子含有的閃爍體發(fā)射的光量在Topcount plate reader(Perkin-Elmer)上被轉(zhuǎn)換為每分鐘計(jì)數(shù)(CPM)。圖1顯示了在NS5B聚合酶的不同濃度下的測(cè)定結(jié)果。圖2顯示了幾個(gè)已知的NS5B聚合酶抑制劑的劑量應(yīng)答曲線(xiàn)形式的測(cè)定結(jié)果。
實(shí)施例2HIV-1逆轉(zhuǎn)錄酶測(cè)定來(lái)自HIV-1茵株的重組逆轉(zhuǎn)錄酶(RNA指導(dǎo)的DNA聚合酶)可以在大腸桿菌中表達(dá)并如Mizrahi等人，Arch.Biochem.Biophys.1989273347-358所述純化。逆轉(zhuǎn)錄酶被加入微滴定板并與預(yù)先和2.5μg/mloligo(dT)16引物退火的5μg/ml poly(rA)模板、溶于含有40mM Tris(pH8.0)、4mM乙酸鎂和4mM DTT的緩沖液中的1μM dATP、dCTP、dGTP和1μCi[甲基-1’2’-3H] dTTP(Amersham TRK-576)混合。在37℃反應(yīng)30分鐘。孵育后，每孔加入含有100mM乙酸鈉溶液(pH3.0)和2.3mg/ml蛋白A-PVT SPA珠子的溶液，且樣品處理和閃爍檢測(cè)如實(shí)施例1所述。
實(shí)施例3大腸桿菌DNA聚合酶I(Klenow)測(cè)定可以使用無(wú)引物的帶有游離3’羥基末端的雙鏈DNA(如由Dnase I消化產(chǎn)生)或者有特異性或隨機(jī)引物的單鏈DNA作為模板，用實(shí)施例2所述方法測(cè)定商購(gòu)的(如Invitrogen Cat.No.18012-021)大腸桿菌DNA聚合酶I大(Klenow)片段的聚合酶活性。
序列表<110>弗·哈夫曼-拉羅切有限公司<120>測(cè)量聚合酶活性的閃爍鄰近測(cè)定法<130>23540<160>1<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>377<212>RNA<213>丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)<400>1guuugguuuu cuuugagguu uaggaaucgu gcucauggug cacggucuac gagaccuccc 60ggggcacucg caagcacccu aucaggcagu accacaaggc cuuucgcgac ccaacacuac 120ucggcuagua gucucgcggg ggcacgccca aaucuccagg cauugagcgg guugauccaa 180gaaaggaccc ggucguccug gcaauuccgg uguacucacc gguuccgcag accaccaugg 240cucucccggg aggggggguc ccggaggcua cacgacacuc auacuaacgc cauggcuaga 300cgcuuucugc gugaagacag uaguuccuca caggggagug aucuauggug gagugucauu 360uuuaaucaaa aauuggc37權(quán)利要求
1.測(cè)定聚合酶活性的方法，其包括步驟a)孵育反應(yīng)混合物以產(chǎn)生使用或不使用未修飾引物的標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物，所述反應(yīng)混合物含有所述聚合酶、合適的模板以及多種適當(dāng)?shù)胤派湫詷?biāo)記和非放射性標(biāo)記的核苷三磷酸；b)在從約2.0到約4.5的pH范圍內(nèi)將所述標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物與閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)的支持結(jié)構(gòu)接觸；和c)測(cè)量閃爍水平，其中所述閃爍水平與所述聚合酶的活性相關(guān)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述合適的模板是雜聚模板。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述雜聚模板從由HCV IRES和HCV3’-UTR組成的組中選擇。
5.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述合適的模板是同聚模板。
6.測(cè)定聚合酶活性的方法，其包括步驟a)在一種或多種調(diào)節(jié)所述聚合酶活性的化合物存在下，孵育反應(yīng)混合物以產(chǎn)生使用或不使用未修飾引物的標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物，所述反應(yīng)混合物包含所述聚合酶、合適的模板以及多種適當(dāng)?shù)胤派湫詷?biāo)記的和非放射性標(biāo)記的核苷三磷酸；b)在從約2.0到約4.5的pH范圍內(nèi)將所述標(biāo)記的轉(zhuǎn)錄物與閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)的支持結(jié)構(gòu)接觸；和c)測(cè)量閃爍水平，其中所述閃爍水平與所述聚合酶活性相關(guān)。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述聚合酶是HCV NS5B聚合酶。
8.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述合適的模板是雜聚模板。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述雜聚模板從由HCV IRES和HCV3’-UTR組成的組中選擇。
10.權(quán)利要求6或7的方法，其中所述合適的模板是同聚模板。
全文摘要
本發(fā)明通過(guò)使用不需要親和標(biāo)簽修飾的引物的閃爍鄰近測(cè)定法(SPA)提供了測(cè)定聚合酶活性的方法?？梢允褂萌我鈹?shù)目的RNA和DNA聚合酶實(shí)施本發(fā)明的方法。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK1979141SQ200610164548
公開(kāi)日2007年6月13日 申請(qǐng)日期2006年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者甘清芬 申請(qǐng)人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司