一種具有免疫原性的prrsv病毒樣顆粒及其制備與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒及其制備與應用，屬于農(nóng)業(yè)獸用生物【技術領域】。通過將豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白和GP5蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；重組的桿粒染昆蟲細胞，培養(yǎng)轉染的昆蟲細胞，得到重組桿狀病毒。采用該重組桿狀病毒感染昆蟲細胞來表達N蛋白和GP5蛋白，可獲得具有較好空間構型的蛋白，且可以自動組裝為PRRSV病毒樣顆粒。本發(fā)明的病毒樣顆粒具有高的免疫原性，可用于制備預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗。本發(fā)明的PRRSV病毒樣顆粒免疫保護率高，能產(chǎn)生對PRRSV強毒株的攻毒保護；本發(fā)明的PRRSV病毒樣顆粒更加安全有效，不存在毒力返強的風險。
【專利說明】—種具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒及其制備與應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)獸用生物【技術領域】，具體涉及一種具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒及其制備與應用。
【背景技術】
[0002]豬繁殖與呼吸綜合征(PorcineR印roductive and Respiratory Syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的傳染病。該病于1987年最早發(fā)現(xiàn)于美國。1991年，荷蘭中央獸醫(yī)研究所確定該病的病原是一種新的RNA病毒，并命名為Lelystad病毒。1996年郭寶清等首次從國內(nèi)疑似PRRS感染豬群中分離出PRRSV，從而證實了本病在我國的存在。2006年4月我國豬群暴發(fā)了高致病性豬繁殖與呼吸綜合征，高致病性豬繁殖與呼吸綜合征是由高度變異的PRRSV引起的豬的烈性傳染病，是我國新出現(xiàn)的重大動物疫病，已成為當前危害我國養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一。目前國內(nèi)用于預防PRRS的疫苗毒株至少有9株，生產(chǎn)廠家近20家。其中包括經(jīng)典PRRS滅活苗和弱毒苗，HP-PRRS滅活苗和弱毒苗，由于活疫苗普遍存在毒力可能返強的問題，而滅活疫苗存在的主要問題是免疫效力欠佳。世界上尚沒有一種滿意的疫苗用于該疾病的預防，而目前，我國政府大量采購的疫苗是高致病性豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗(JXAl-R株)，該疫苗株是由高致病性強毒株經(jīng)過細胞連續(xù)傳代至弱而成的，其疫苗也存在毒力返強的風險。因此研發(fā)確實、可靠、高效的新一代疫苗也是未來一個方向。
[0003]PRRSV是動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬的單股正鏈RNA病毒。其全基因組長約15kb，含有8個開放閱讀框(ORFs)，ORFla和ORFlb編碼蛋白聚合酶，0RF2~7分別編碼結構蛋白GP2、GP3、GP4、GP5、M和N蛋白。其中，N蛋白也稱核衣殼蛋白，由0RF7編碼，在病毒粒子中含量較高，N基因高度保守。N蛋白約15kD，至少有5個抗原決定簇，其中包括兩型的共同決定簇和特異性決定簇，具有一個`糖基化位點，但它不是糖基化蛋白。N蛋白的C端在維持蛋白構象上起重要作用。其N端半段是由Arg、LyS、His3種堿性氨基酸組成，可能和RNA基因組間的相互作用有關。N蛋白之間形成同源二聚體，對病毒的組裝至關重要。GP5蛋白約25kD，由0RF5編碼，是一個糖基化蛋白，含有4個糖基化位點，且非常不保守，三次跨膜，并有一個70個氨基酸殘基的胞外區(qū)，有6個抗原決定簇。有證據(jù)表明GP5在PRRSV的抗體識別過程中起關鍵作用，是誘導機體產(chǎn)生中和抗體的主要結構蛋白，病毒中和作用與抗GP5抗體效價呈顯著相關性，同時GP5還可誘導細胞凋亡，是公認的PRRSV的主要保護性抗原。N蛋白和GP5蛋白冋時在體外表達時可自王裝配，能自動形成完整的病毒樣顆粒，具有良好的免疫原性，成為病毒疫苗研究的主要方向。病毒樣顆粒(virus-like particles,VLPs)是某種病毒的一個或多個結構蛋白裝配成的空心顆粒，它既有類似天然病毒的穩(wěn)定性和免疫原性，又具備攜帶外源蛋白或多肽的潛能，不含有病毒的核酸，沒有感染性，使其有望成為構建多價疫苗的良好載體。
[0004]E.H.J.Wissink等認為PPRSV的GP5和M蛋白是組成病毒粒子所不可或缺的部分(JOURNAL OF VIROLOGY，2005 年，第 79 卷，第 19 期，12495 - 12506)。Hae-Mi Nam 等公開了含有PPRSV GP5和M蛋白的病毒樣顆粒，上述兩種蛋白通過重組桿狀病毒表達,再組裝而成病毒樣顆粒，可用于制備疫苗(Arch Virol.，2013年，第158卷，1275 - 1285)。李楊將PRRSV的0RF5和0RF6兩個基因或0RF5、0RF6和0RF7三個基因或0RF5、0RF6、0RF7和NSP2a四個基因組合后都可以在桿狀病毒表達載體中形成病毒樣顆粒(華中農(nóng)業(yè)大學2012屆碩士研究生學位論文)。呂風林等人(專利申請?zhí)?01110000815.6)將編碼PRRSV的M蛋白、N蛋白和GP5蛋白的基因分別克隆到真核表達載體(如pHWD2000、pOPI3CAT、pCAGGS、pcDNA6/TR、pCMV-HA)中同時轉染同一細胞系表達3種蛋白能夠形成病毒樣顆粒，并能產(chǎn)生良好的細胞免疫和體液免疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的首要目的在于提供一種更加可靠、高效的預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒。
[0006]本發(fā)明的另一目的在于提供上述PRRSV病毒樣顆粒的制備。
[0007]本發(fā)明的再一目的在于提供上述PRRSV病毒樣顆粒的應用。
[0008]本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn):
[0009]在本發(fā)明的第一方面，提供一種表達載體，其包括第一表達盒和第二表達盒，所述的第一表達盒含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的編碼序列，所述的第二表達盒含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5蛋白的編碼序列。
[0010]在另一優(yōu)選例中，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株(PRRSV⑶株，GenBank:EU109503.1), N蛋白和GP5蛋白的編碼序列分別如SEQ ID NO:1和2所示。
[0011]在另一優(yōu)選例中，所述的表達載體是pFastBacDaul (pFBD)載體。
[0012]在本發(fā)明的另一方面，提供一種重組桿狀病毒，其可用于感染昆蟲細胞而獲得重組蛋白，所述的重組桿狀病毒的基因組中含有至少一個上述第一表達盒和至少一個上述第
二表達盒。
[0013]在另一優(yōu)選例中，所述的重組桿狀病毒僅包括上述第一表達盒和第二表達盒。
[0014]在另一優(yōu)選例中，所述的重組桿狀病毒僅表達豬繁殖與呼吸綜合征病毒的N蛋白和GP5蛋白。
[0015]在另一優(yōu)選例中，所述的重組桿狀病毒包含上述表達載體。
[0016]在另一優(yōu)選例中，所述的重組桿狀病毒通過以下步驟制備:(A)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株N蛋白的編碼序列和GP5蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；(B)將(A)獲得的重組的桿粒轉染昆蟲細胞，培養(yǎng)轉染的昆蟲細胞；和(0收獲重組桿狀病毒。
[0017]在另一優(yōu)選例中,所述的桿粒是Bac-mid桿粒。更優(yōu)選的是,Bac_mid桿粒來源于大腸桿菌DHlOBac株。
[0018]在另一優(yōu)選例中 ，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。
[0019]在本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供上述表達載體或上述重組桿狀病毒的應用，用于制備PRRSV病毒樣顆粒。
[0020]在本發(fā)明的另一方面，提供一種生產(chǎn)PRRSV病毒樣顆粒的系統(tǒng)，包括:(I)上述重組桿狀病毒；和(2)昆蟲細胞。
[0021]在另一優(yōu)選例中，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。
[0022]在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備PRRSV病毒樣顆粒的方法，包括:(a)將上述重組桿狀病毒感染昆蟲細胞；(b)從昆蟲細胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
[0023]在另一優(yōu)選例中，通過蔗糖密度梯度離心分離病毒樣顆粒。
[0024]在本發(fā)明的另一方面，提供一種具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒由豬繁殖與呼吸綜合征病毒的N蛋白和GP5蛋白組成。
[0025]在另一優(yōu)選例中，所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株，N蛋白和GP5蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:3和4所示。
[0026]在另一優(yōu)選例中，所述的PRRSV病毒樣顆粒其由所述制備病毒樣顆粒的方法產(chǎn)生，所述病毒樣顆粒的平均直徑為45~65nm。
[0027]在本發(fā)明的另一個方面，提供所述PRRSV病毒樣顆粒的應用，用于制備預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗。
[0028]在本發(fā)明的另一方面，提供一種預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗，所述的疫苗包含:(a) 所述具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒jP(b)輔助劑，所述的輔助劑是保護劑、穩(wěn)定劑或佐劑 。
[0029]在本發(fā)明的另一方面，提供一種制備預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的方法，所述方法包括:給予需要預防的對象有效量的所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒，或所述的疫苗。
[0030]本發(fā)明具有如下優(yōu)點和效果:
[0031]本發(fā)明采用桿狀病毒感染昆蟲細胞來表達PRRSV⑶株的結構蛋白GP5和N蛋白，可獲得具有較好空間構型的蛋白，可以自動組裝為PRRSV病毒樣顆粒。
[0032]本發(fā)明的PRRSV病毒樣顆粒具有高的免疫原性；制備的病毒樣顆粒疫苗相對于現(xiàn)有的滅活疫苗，其免疫保護率高，能產(chǎn)生對PRRSV強毒株的攻毒保護。本發(fā)明的PRRSV病毒樣顆粒制備的疫苗相對于現(xiàn)有的活疫苗，更加安全有效，不存在毒力返強的風險。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1是pFBD-N-GP5桿狀病毒表達載體Tn7內(nèi)片段結構示意圖。
[0034]圖2是pFBD-M-GP5桿狀病毒表達載體Τη7內(nèi)片段結構示意圖。
[0035]圖3是pFBD-N-M-GP5桿狀病毒表達載體Τη7內(nèi)片段結構示意圖。
[0036]圖4是免疫熒光檢測桿狀病毒系統(tǒng)表達N和GP5目的蛋白表達；Sf9昆蟲細胞用重組桿狀病毒感染，3天后收集細胞用GP5抗體和N抗體進行免疫熒光檢測:A是GP5抗體免疫熒光，B是N抗體免疫熒光。
[0037]圖5是病毒樣顆粒的蔗糖密度梯度離心分析；細胞裂解物被鋪在10~50%的蔗糖梯度上進行超速離心后，從上到下收集6個組分分別用PRRSV-N蛋白抗體和PRRSV-GP5蛋白抗體進行Western blot分析，A是PRRSV-N蛋白抗體Western blot ；B是PRRSV-GP5蛋白抗體Western blot ;其中蛋白Marker條帶從上到下依次為170、130、100、70、55、40、35、25、15kD。
[0038]圖6是Bac-N_GP5病毒樣顆粒的電鏡圖。[0039]圖7是Bac-M_GP5病毒樣顆粒的電鏡圖。
[0040]圖8是Bac-N-M_GP5病毒樣顆粒的電鏡圖。
【具體實施方式】
[0041]發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，發(fā)現(xiàn)采用桿狀病毒感染昆蟲細胞來表達高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株的GP5糖基化結構蛋白和N蛋白，可獲得較好空間構型的蛋白，并可以自動組裝為病毒樣顆粒，得到的病毒樣顆粒具有高的免疫原性。在此基礎上完成了本發(fā)明。
[0042]桿狀病毒
[0043]本發(fā)明提供了一種重組的桿狀病毒，其可用于感染昆蟲而獲得蛋白。所述的桿狀病毒的基因組中含有至少一個含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株N蛋白的編碼序列的第一表達盒；和至少一個含有高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株的GP5蛋白的編碼序列的第二表達盒。
[0044]所述重組的桿狀病毒可以穩(wěn)定傳代，零下70°C可以長期保存并具有高的滴度。利用該病毒感染昆蟲細胞后3-4天后可以得到重組蛋白，且表達穩(wěn)定。
[0045]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述桿狀病毒通過以下步驟制備:
[0046](A)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株的N蛋白的編碼序列SEQ IDNO:1和GP5蛋白的編碼序列SEQ ID NO:2克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；
[0047](B)將(A)獲得的重組的桿粒轉染昆蟲細胞，培養(yǎng)轉染的昆蟲細胞；
[0048](C)收獲重組的桿狀病毒。
[0049]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式,所述的桿粒是Bac-mid桿粒。更優(yōu)選的是,Bac_mid桿粒來源于大腸桿菌DHlOBac株。
[0050]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲細胞選自sf9昆蟲細胞，HighFive昆蟲細胞；最優(yōu)選的是，所述的昆蟲細胞為sf9昆蟲細胞。
[0051]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株N蛋白的編碼序列和GP5蛋白的編碼序列及其兩端重組序列，在轉座酶的作用下重組入Bacmid桿粒的Tn7位點。更優(yōu)選的，所述的轉座酶由大腸桿菌DHlOBac中攜帶的輔助質粒所表達。
[0052]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，在步驟(A)中，所述重組的桿粒通過以下步驟獲得:
[0053](a)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株N蛋白的編碼序列SEQ IDNO:1和GP5蛋白的編碼序列SEQ ID NO:2插入穿梭載體(優(yōu)選pFASTBacDual載體)的多克隆位點中，獲得插入了外源編碼序列的重組載體；
[0054](b)將(a)獲得的重組載體轉入宿主細胞DHlOBac，獲得轉化的宿主細胞，所述轉化的宿主細胞中含有重組桿粒，所述的重組桿粒攜帶所述的外源編碼序列；
[0055](C)從所述轉化的宿主細胞中提取重組桿粒。
[0056]所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株的N蛋白具有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列。所述的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株GP5蛋白具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。
[0057]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的桿狀病毒是通過將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株的N蛋白的編碼基因和GP5蛋白的編碼基因克隆進入pFASTBac的多克隆位點內(nèi)，然后將pFASTBac轉化DHlOBac基因工程菌，在轉座酶的作用下發(fā)生重組，獲得桿粒后轉染昆蟲細胞獲得的。將這種病毒感染昆蟲細胞后數(shù)小時，病毒即可進入昆蟲細胞，開始復制病毒，并且轉錄病毒重組區(qū)域中蛋白翻譯區(qū)的外源核酸序列。感染3-4天后表達具有病毒重組區(qū)域中蛋白翻譯區(qū)所對應的氨基酸序列的蛋白。
[0058]此外，在所述的桿狀病毒感染昆蟲細胞并表達外源蛋白后，還可以通過例如密度梯度離心等方法從培養(yǎng)物中回收重組桿狀病毒，用于下次感染。
[0059]具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒
[0060]本發(fā)明提供了一種制備PRRSV病毒樣顆粒的方法，該方法包括步驟:
[0061](I)將所述的桿狀病毒感染昆蟲細胞，培養(yǎng)感染后的昆蟲細胞，使之表達所述的外源蛋白。
[0062](2)從昆蟲細胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
[0063]作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的昆蟲細胞選自sf9昆蟲細胞，HighFive昆蟲細胞；最優(yōu)選的，所述的昆蟲細胞是sf9昆蟲細胞。
[0064]本發(fā)明還提供所述的具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒的用途，用于制備預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗。
[0065]疫苗
[0066]本發(fā)明還提供一種預防高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗，所述的疫苗包含:有效量的本發(fā)明所述的具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒和輔助劑，所述的輔助劑是保護劑、穩(wěn)定劑或佐劑。
[0067]動物試驗表明，利用本發(fā)明的具有免疫原性的病毒樣顆粒制成疫苗免疫動物后，可在動物體內(nèi)產(chǎn)生高效價的抗體。`
[0068]使用時，是將安全有效的本發(fā)明所述的具有免疫原性的病毒樣顆粒注射給豬，其中該安全有效量通常至少約15 μ g/頭，而且在大多數(shù)情況下不超過60 μ g/頭。
[0069]下面結合實施例及附圖對本發(fā)明做進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0070]下述實施例中所用到的材料如下:
[0071]病毒與細胞:本發(fā)明所使用的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株(PRRSV⑶株)(基因組序列見GenBank登錄號:EU109503.1 )，中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所分離鑒定并提供；本發(fā)明所使用的昆蟲細胞sf9購于美國Invitrogen公司。
[0072]基因與蛋白質:本發(fā)明所使用的N蛋白編碼基因、GP5蛋白編碼基因克隆自高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株(PRRSV⑶)，其具體序列參見SEQ ID N0.1~2，其編碼蛋白序列分別參見SEQ ID N0.3~4。
[0073]培養(yǎng)基質:采用SF900 II SFM 培養(yǎng)基(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)于 27°C培養(yǎng)昆蟲細胞sf9。
[0074]抗體^PRRSV N蛋白的鼠單克隆體購于美國VMRD公司，Prod:P080728_004 ;抗PRRSV GP5蛋白的兔多抗購于英國ABCAM公司，Prod:RS-4504R ；HRP標記兔抗鼠二抗購自SIGMA-AL0RICH 公司，Prod:A0168 ;FITC 標記羊抗鼠二抗購自 Thermo 公司，Prod: 31569 ；FITC標記羊抗兔二抗購自Thermo公司，Prod: 31583。
[0075]抗體檢測試劑盒:PRRSV GP5抗體檢測試劑盒，法國LSI公司，Batch:5-VRTPRA-028 ；PRRSV N 抗體檢測試劑盒，美國 IDEXX 公司，Prod:Z411。
[0076]實施例1桿狀病毒的構建
[0077]按照TakaR MiniBEST Viral RNA/DNA (code:DV819A)試劑盒說明書提取高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株RNA，以oligo (dT)為引物，用M-MLV反轉錄酶(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)進行反轉錄，獲得 cDNA。
[0078]參考GenBank登錄號:EU109503.1基因序列，設計帶酶切位點的上游引物5’ -GGATCCATGCCAAATAACAACGGCAAGC-3’ 和下游引物 5’ -AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGCTGTG-3’，以cDNA為模板擴增編碼PRRSV⑶株N蛋白的基因片段，擴增片段命名為PRRSV-N ;用BamH I和Hind III雙酶切回收，亞克隆到同樣酶切處理的pFastBacDual載體(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)(縮寫為 pFBD)中，構建得到 pFBD-PRRSV-N 重組載體。
[0079]參考GenBank登錄號:EU109503.1基因序列，設計帶酶切位點的上游引物5’-CTCGAGATGTTGGGGAAGTGCTTGACC-3’ 和下游引物 5’ -GGTACCCTAGAGACGACCCCATCGTTC-3’，以 cDNA為模板擴增編碼PRRSV GD株GP5蛋白的基因片段，擴增片段命名為PRRSV-GP5 ;用Xho I和Kpn I雙酶切回收，亞克隆到同樣酶切處理的pFBD-PRRSV-N載體上，成功構建了同時轉載兩個基因的PFBD-PRRSV-N-GP5重組表達載體，其可以在同種細胞里共同有效表達兩種蛋白。PRRSV-N基因通過Polyhedrin啟動子調控，PRRSV-GP5基因由p 10啟動子直接調控，其構建不意圖見圖1。
[0080]將pFBD-PRRSV-N-GP5重組表達載體通過Bac-to-Bac系統(tǒng)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)轉染到DHlO感受態(tài)構建成重組的桿狀病毒，按照Invitrogen說明書鑒 定重組載體，將重組桿狀病毒表達載體命名為Bac-PRRSV-N_GP5。
[0081]現(xiàn)有技術中已經(jīng)存在了由GP5和M蛋白組成的病毒樣顆粒以及由GP5、M、N蛋白組成的病毒樣顆粒。按照上述方法設計帶BamH I酶切位點的上游引物5’ -GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGAC-3’和帶Hind III酶切位點的下游引物5，-AAGCTTTTATTTGGCATATTTAACAA-3 ’擴增M蛋白基因，構建了同時表達GP5和M蛋白的重組桿狀病毒(Bac-PRRSV-M-GP5)，構建示意圖見圖2。以及設計帶BamH I酶切位點的上游引物5 ’ -GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGAC-3 ’和帶Hind III酶切位點的下游引物5’ -AAGCTTTCATGCTGAGGGTGATGC-3’ 一起擴增M蛋白和N蛋白基因，構建同時表達GP5、M和N蛋白的重組桿狀病毒(Bac-PRRSV-N-M-GP5 )，構建示意圖見圖3。
[0082]實施例2在昆蟲細胞內(nèi)表達PRRSV VLPs
[0083]按Invitrogen說明書指定的MOI用Bac-PRRSV-N_GP5重組桿狀病毒表達載體感染SF9昆蟲細胞。重組病毒感染SF9細胞72h后，PBS洗細胞兩次，80% (v/v)冷丙酮固定細胞20min，PBS洗三次，加抗PRRSV N蛋白的鼠單克隆體或抗PRRSV GP5蛋白的抗體(抗PRRSV GP5蛋白的兔多抗)的一抗(1:100) 37°C作用lh，PBS洗三次，F(xiàn)ITC標記羊抗鼠二抗或羊抗兔二抗(1:500) 37°C作用lh，PBS洗三次，50% (v/v)甘油封片，熒光顯微鏡觀察。
[0084]抗PRRSV GP5蛋白的抗體通過免疫熒光方法來檢測感染昆蟲細胞中目的蛋白的表達，結果如圖4 (A)所示；抗PRRSV N蛋白的抗體通過免疫熒光方法來檢測感染昆蟲細胞中目的蛋白表達，結果如圖4 (B)所示。Bac-PRRSV-N-GP5感染SF9細胞后有明亮綠色熒光，將感染后的病毒命名為PRRSV-GD-N-GP5病毒；空白組并未檢測到熒光信號。
[0085]將PRRSV-GD-N-GP5病毒感染SF9細胞后3天收集細胞進行超聲裂解，12000rpm4 °C離心15min,收集上清加到10~50%的鹿糖梯度上層，Beckman離心機39000rpm4°C離心 3h，分別收集 15%、20%、25%、30%、35%、40% 的 6 個蔗糖梯度(0.4mL/ 梯度)，做Western blot分析PRRSV-GD-N-GP5感染后病毒樣顆粒的構成，用PRRSV-N蛋白抗體檢測(圖5A)和PRRSV-GP5蛋白抗體檢測(圖5B)到目的蛋白主要存在梯度4#，證明病毒樣顆粒的存在(即為Bac-N-GP5病毒樣顆粒)。為直接確定病毒樣顆粒的形成，梯度4#樣品涂布在被有Formvar薄膜的銅網(wǎng)上，經(jīng)噴金和噴碳處理，再用磷鎢酸負染液(2%PTA)處理后，用Tecnai G220200KV透射電子顯微鏡分析。電鏡觀察分析，結果觀察到直徑約45~65nm的病毒樣顆粒(圖6)。
[0086]按照同樣的方法分別將Bac-PRRSV-M_GP5和Bac-PRRSV-N-M_GP5重組桿狀病毒表達載體感染SF9昆蟲細胞來表達PRRSV病毒樣顆粒，電鏡觀察分析，觀察到直徑約45~65nm的Bac_M_GP5病毒樣顆粒(圖7)和Bac_N-M_GP5病毒樣顆粒(圖8)。
[0087]實施例3三種PRRSV病毒樣顆粒在小鼠中的免疫原性
[0088]用粗提純的三種病毒樣顆粒分別免疫小鼠評價其病毒樣顆粒的免疫原性，于第I和第14天分別用粗提純的三種病毒樣顆粒皮下注射I μ g/只小鼠，鋁佐劑為佐劑(與抗原的比例為3:7)。對照組免疫的為不含外源基因的pFBD空載體表達的物質與鋁佐劑。于免疫后7、14、21、28天收集小鼠血清，用PRRSV N抗體檢測試劑盒進行N抗體的測定(表1)和用PRRSV GP5抗體檢測試劑盒進行GP5抗體的測定(表2)，結果表明制備的Bac_N_GP5病毒樣顆粒疫苗免疫組21天和28天的血清N抗體和GP5抗體陽性最高，免疫原最好。
[0089]表1小鼠N抗體ELISA測定結果
【權利要求】
1.一種重組桿狀病毒，其特征在于:其基因組中含有第一表達盒和第二表達盒；所述的第一表達盒含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒N蛋白的編碼序列，所述的第二表達盒含有豬繁殖與呼吸綜合征病毒的GP5蛋白的編碼序列。
2.根據(jù)權利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于:所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株，N蛋白和GP5蛋白的編碼序列分別如SEQ ID NO:1 和 2 所示。
3.根據(jù)權利要求1所述的重組桿狀病毒，其特征在于:通過以下步驟制備:(A)將高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株N蛋白的編碼序列和GP5蛋白的編碼序列克隆入桿粒中，獲得重組的桿粒；(B)將(A)獲得的重組的桿粒轉染昆蟲細胞，培養(yǎng)轉染的昆蟲細胞；(C)收獲重組桿狀病毒。
4.權利要求1-3任一項所述的重組桿狀病毒在制備具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒中的應用。
5.—種生產(chǎn)具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒的系統(tǒng)，其特征在于:包括權利要求1-3任一項所述的重組桿狀病毒和昆蟲細胞。
6.一種具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒，其特征在于:由豬繁殖與呼吸綜合征病毒的N蛋白和GP5蛋白組成。
7.根據(jù)權利要求6所述的具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒，其特征在于:所述的豬繁殖與呼吸綜合征病毒為高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒廣東分離株，N蛋白和GP5蛋白的氨基酸序列分別如SEQ ID NO:3和4所示。
8.權利要求6或7所述的具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于包括以下步驟:(a)用權利要求`1-3任一項所述的重組桿狀病毒感染昆蟲細胞；(b)從昆蟲細胞的裂解物中分離獲得病毒樣顆粒。
9.權利要求6或7所述的具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒在制備預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗中的應用。
10.一種預防豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染的疫苗，其特征在于:包含權利要求6或7所述的具有免疫原性的PRRSV病毒樣顆粒和輔助劑；所述的輔助劑是保護劑、穩(wěn)定劑或佐劑。
【文檔編號】A61P31/14GK103555680SQ201310538271
【公開日】2014年2月5日 申請日期:2013年11月4日 優(yōu)先權日:2013年11月4日
【發(fā)明者】楊雷, 漆世華, 王煥君, 李玉萍, 謝紅玲, 溫文生, 舒銀輝, 朱薇, 馮釗 申請人:武漢中博生物股份有限公司