一種鱖傳染性脾腎壞死病毒isknv的增殖方法
【技術(shù)領域】
[0001]本發(fā)明涉及鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鱖魚(Siniperca chuatsi)是我國重要的淡水特色養(yǎng)殖品種之一,而近年來由傳染性脾腎壞死病毒(Infect1us spleen and kidney necrosis virus, ISKNV)引起的績虹彩病毒病給鱖魚養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。1997年，吳淑勤等首先在患病鱖魚中發(fā)現(xiàn)了直徑150nm的球形病毒，并認為是鱖魚暴發(fā)性傳染病的病原。1998年，何建國等通過回歸感染進一步證明了該病毒的病原性，通過組織學研究發(fā)現(xiàn)鱖魚脾臟和腎臟是其感染的主要器官，將其命名為傳染性脾腎壞死病毒，并通過主衣殼蛋白(MCP)基因等序列分析確定其為一種虹彩病毒。根據(jù)國際病毒分類委員會(Internat1nal Committee on Taxonomy ofViruses, ICTV)第八次報告，ISKNV是虹彩病毒科腫大細胞病毒屬的代表種，其傳染力強，發(fā)病率高達30%，致死率高達90%以上，可以感染近60種淡水和海水魚，給鱖魚、加洲鱸、烏鱧、美國紅魚、石斑魚等海淡水魚類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大威脅。自1994年以來，ISKNV給我國鱖魚養(yǎng)殖業(yè)造成的平均年經(jīng)濟損失高達2億元，是制約鱖魚養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要瓶頸。
[0003]免疫接種是預防傳染病發(fā)生的主要手段，付小哲實驗室建立了 ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB，研制出細胞培養(yǎng)滅活疫苗。但如何以低成本生產(chǎn)獲得高滴度病毒是疫苗制備的關鍵步驟。病毒接種方法有兩種，同步接毒和異步接毒。同步接毒法是在細胞傳代同時或不久接種毒種，進行培養(yǎng)，如貓、犬傳染性腸炎疫苗(細小病毒)；異步接毒法是在細胞形成單層后接種毒種，如流行性乙型腦炎細胞培養(yǎng)疫苗。目前多數(shù)病毒采用異步接毒法這種接毒方式。
[0004]羅維等在適合豬圓環(huán)病毒2生長的PK15均質(zhì)細胞株的構(gòu)建中發(fā)現(xiàn)異步接毒樣品的PCR檢測結(jié)果均為陽性，且信號都較強，說明異步接毒比同步接毒要穩(wěn)定，重復性較好，不會出現(xiàn)接不上毒的情況。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法。
[0006]本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:
一種鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法，包括以下步驟:
1)將ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB傳代后培養(yǎng)20?96小時，使用胰酶消化細胞；
2)將消化后的CPB細胞轉(zhuǎn)入含有5%v/v?10%v/v胎牛血清的L15培養(yǎng)液中，同時接種ISKNV ；
3)28?32°C恒溫培養(yǎng)接種后的鱖腦組織細胞系CPB 2d?12d，收獲細胞并提取病毒核酸。
[0007]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟I)中ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB傳代后培養(yǎng)時間為30h?60h。
[0008]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟2)中培養(yǎng)液中胎牛血清的添加量為5%v/v?8%v/v。
[0009]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟2)中按照MOI值為0.85?2.3接種ISKNV。
[0010]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的低成本增殖方法中，步驟3)中恒溫培養(yǎng)，觀察CPE達80%以上時收獲細胞并提取病毒核酸。
[0011]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟I)中ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB傳代后培養(yǎng)時間為20h?40h。
[0012]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟2)中培養(yǎng)液中胎牛血清的添加量為8%?10%v/v。
[0013]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟2)中按照MOI值為30?45接種ISKNV。
[0014]進一步的，上述鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的短時間增殖方法中，步驟3)中恒溫培養(yǎng)，觀察CPE達80%以上時收獲細胞并提取病毒核酸。
[0015]本發(fā)明的有益效果是:
本發(fā)明采用了同步接毒法培養(yǎng)鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV。選擇處于對數(shù)生長期的ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB細胞，此時CPB細胞分裂生長旺盛，狀態(tài)良好，利于病毒增殖，是最適合接種ISKNV的細胞；同時采用同步接毒法的病毒與CPB細胞成懸浮狀態(tài)，互相接觸的表面積大，使病毒通過更多的空間受體進入細胞；此外在細胞分裂增殖的同時病毒侵染細胞，病毒不必再通過細胞間傳遞而幾乎侵染到全體細胞，所以能夠獲得高含量的鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV。
[0016]本發(fā)明單從價格成本即培養(yǎng)液的成本來考慮，按照發(fā)明中的方法，將ISKNV原液稀釋按照MOI為0.85?2.3同步接種于培養(yǎng)48h處于對數(shù)生長中期數(shù)量約為1.08 X 15個/ml的CPB細胞，培養(yǎng)液中胎牛血清終濃度為6%時，28°C恒溫培養(yǎng)9d后CPE達80%以上時收獲細胞，400ul細胞液所含病毒拷貝數(shù)最多可達2.54X 18個拷貝。核算后得到，每元人民幣所得病毒量最高為4.24X 111個拷貝，時間成本為2.31 X 10 8拷貝/天。
[0017]本發(fā)明從時間成本考慮即盡可能縮短細胞培養(yǎng)時間和病毒培養(yǎng)時間的角度來考慮，按照發(fā)明中的方法，將病毒原液稀釋按照MOI為30?45同步接種培養(yǎng)24h處于對數(shù)生長早期濃度為0.92 X 15個/mL的CPB細胞，培養(yǎng)液中胎牛血清終濃度為10%，28°C培養(yǎng)4d后CPE達80%以上時收獲細胞，每日所得病毒量最高，為3.64X 18個拷貝/天。
[0018]本發(fā)明分別提供了低成本的鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法以及短時間的鱖傳染性脾腎壞死病毒ISKNV的增殖方法?？筛鶕?jù)不同需要選擇最適合的接毒方法，即在時間充裕的情況下選擇第一種接毒方法即用最低的價格成本生產(chǎn)出最高的病毒拷貝數(shù)，當時間比較緊張時則可選取第二種接毒方法即在最短的時間內(nèi)生產(chǎn)出最高的病毒拷貝數(shù)。該研究為低成本疫苗的生產(chǎn)提供了理論依據(jù)。
【附圖說明】
[0019]圖1為ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系CPB生長曲線。
【具體實施方式】
[0020]實驗材料:
ISKNV敏感的鱖腦組織細胞系(CPB)由本實驗室付小哲等建立并保藏；鱖傳染性脾腎壞死病毒QY株(ISKNV-QY)由本實驗室分離保存；L15培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶為Gibco公司產(chǎn)品；DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品；10XTaq反應緩沖液、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Premix Ex TaqTM 購于 TaKaRa 公司。
[0021]病毒含量的測定方法:
收獲的病毒液在_20°C的條件下反復凍融3次后，置_70°C保存。取400ul含有病毒的CPB細胞液按照OMEGA公司的DNA提取試劑盒說明書提取病毒核酸后，在熒光定量PCR儀上(ABI 7500)檢測病毒含量，根據(jù)付小哲等報道的公式CT= -3.3141gx + 41.48 (x代表病毒拷貝數(shù))計算病毒拷貝數(shù)(Fu X，Li N, Lai Y, et al.A novel fish cell linederived from the brain of Chinese perch Siniperca chuats1: development andcharacterizat1n[J].Journal of Fish B1logy, 2015，86(I):32 - 45.)。
[0022]數(shù)據(jù)的處理:
以價格成本為參考因素，將所測得的病毒拷貝數(shù)進行不同方式處理，分別折算成價格成本(Y)即每元人民幣所得病毒拷貝數(shù)(拷貝/元)和時間成本(D)即每日所得的病毒拷貝數(shù)(拷貝/天)，對培養(yǎng)增殖條件進行評價。ISKNV增殖所用培養(yǎng)基成本主要包括L15培養(yǎng)基和胎牛血清，其中L15培養(yǎng)基的價錢為65元/L，胎牛血清為10000元/L，以培養(yǎng)IL體積病毒計算，胎牛血清濃度為6%的培養(yǎng)基價格分別為665元，則增殖病毒所產(chǎn)生的價格成本(Y)計算公式如下:Y =106χ /665 ;增殖病毒所產(chǎn)生的時間成本(D)計算公式如下:D=x/ (接毒前細胞培養(yǎng)天數(shù)+接毒后病毒培養(yǎng)天數(shù))，其中X代表病毒拷貝數(shù)，并依據(jù)上述公式進行數(shù)據(jù)處理。
[0023]數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:
實驗所得數(shù)據(jù)均表示為平均數(shù)土標準差(mean土SD)，采用軟件Oringin Pro 8.0進行數(shù)據(jù)處理，并利用t檢驗進行差異性分析，當P < 0.05時差異顯著，p〈0.01時差異極顯