亨德拉病毒和尼帕病毒g糖蛋白免疫原性組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及亨德拉病毒(Hendra)和尼帕病毒(Nipah)免疫原性組合物和使用方法。本發(fā)明還涉及區(qū)分接種了本發(fā)明的免疫原性組合物的受試者與感染了亨德拉病毒和/或尼帕病毒的受試者的方法。
【專利說明】
亨德拉病毒和尼帕病毒G糖蛋白免疫原性組合物
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及包含來自亨德拉病毒(HeV)的G糖蛋白的免疫原性組合物和疫苗組合 物、以及在馬中的使用方法。本發(fā)明還涉及改進的給藥方案，所述方案有助于在疫苗接種后 的一段較長的時間內(nèi)維持升高的抗體滴度。
【背景技術】
[0002] 導致大量人類死亡的NiV的反復暴發(fā)最近一直是成問題的（參見例如Butler (2000)Nature 429,7)。還已知他￥會導致人類和動物死亡并且與附￥在遺傳學和免疫學上 密切相關。目前僅已知存在一種用于預防由尼帕病毒或亨德拉病毒所引起的感染或疾病的 疫苗(W0 2009/117035)。尼帕病毒和亨德拉病毒這兩者均是美國國家過敏和感染性疾病研 究所（United States,National Institute of Allergy and Infectious Disease)生物 防御關注的C類優(yōu)先級病原體。此外，由于這些病毒是人畜共患病生物安全等級-4病原體 (BSL-4)，因此安全地產(chǎn)生疫苗和/或診斷劑是成本非常高的和困難的。因此，需要允許高通 量生產(chǎn)疫苗和/或診斷劑的另外的和改進的尼帕病毒或亨德拉病毒疫苗和診斷劑。
[0003]諸如HeV和NiV的副粘病毒在病毒顆粒的包|旲中具有兩種主要的|旲錯定糖蛋白。一 種糖蛋白是為病毒體附著到宿主細胞上的受體所必需的并且被命名為血凝素-神經(jīng)氨酸苷 酶蛋白（HN)或血凝素蛋白（H)，而另一種是糖蛋白（G)，它既沒有血細胞凝集作用，也沒有神 經(jīng)氨酸苷酶活性。附著糖蛋白是II型膜蛋白，其中分子的氨基(N)末端是朝向細胞質(zhì)取向的 并且蛋白質(zhì)的羧基(C)末端在細胞外。另一種主要的糖蛋白是融合(F)糖蛋白，它是一種三 聚體I類融膜包膜糖蛋白，所述糖蛋白含有兩個七肽重復(HR)區(qū)和疏水性融合肽。HeV和NiV 在受體結(jié)合后經(jīng)由它們的附著G糖蛋白和F糖蛋白的協(xié)同作用而引起的向接受宿主細胞中 的非pH值依賴性膜融合過程來感染細胞。HeV和NiV附著G糖蛋白的主要功能在于接合宿主 細胞的表面上適當?shù)氖荏w，對于大部分的被充分表征的副粘病毒來說，所述受體是唾液酸 部分。HeV和NiV的G糖蛋白利用了宿主細胞蛋白質(zhì)受體肝配蛋白B2和/或肝配蛋白B3，并且 已經(jīng)研發(fā)了阻斷通過G糖蛋白進行的病毒附著的抗體（W02006137931;Bishop(2008) J. Virol. 82:11398-11409)。此外，已經(jīng)研發(fā)了如下的疫苗，所述疫苗也使用G糖蛋白作為產(chǎn) 生對抗HeV和NiV感染的免疫保護性反應的手段(W02009117035)。
[0004] 給藥部位反應性對于在獸醫(yī)學上以及對人類在疫苗制劑中使用奎爾A(Quil A)來 說都是一個主要的問題。避免奎爾A的這種毒性的一種方式是使用免疫刺激復合物(Rajput (2007)J.Zhejiang Univ. Sci .B，8:153-161)。這主要是因為奎爾A在被并入免疫刺激復合 物中時由于它與復合物中的膽固醇的締合降低了它從細胞膜中提取膽固醇的能力，因此降 低了它的細胞裂解效應而具有更小的反應性。此外，需要更少量的奎爾A來產(chǎn)生相似水平的 佐劑作用?？鼱朅皂苷的免疫調(diào)節(jié)特性以及在它們被并入免疫刺激復合物中時源自于這些 皂苷的附加益處已經(jīng)描述于W02000041720中。
[0005] 在單一疫苗中HeV和/或NiV G糖蛋白與免疫刺激復合物的組合代表了在研發(fā)有效 的HeV和NiV疫苗方面的進步，這是鑒于在這些組分被組合施用時免疫反應性有所增強而佐 劑副作用有所減少的潛能。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明涵蓋了一種免疫原性組合物，所述組合物包含有效量的亨德拉病毒和/或 尼帕病毒G蛋白、免疫刺激復合物（ISC)以及一種或多種賦形劑，所述量在向受試者施用后 有效引起對抗亨德拉病毒和/或尼帕病毒的中和抗體的產(chǎn)生。在一些實施方案中，所述免疫 原性組合物包含皂苷、磷脂、以及類固醇。
[0007] 在一些實施方案中，可溶性亨德拉病毒G糖蛋白由天然亨德拉病毒G糖蛋白（SEQ ID N0: 2)的氨基酸73至604組成。在一些實施方案中，所述可溶性亨德拉病毒G糖蛋白是由 包含SEQ ID N0:16的核苷酸64至1662的核苷酸序列編碼的。在一些實施方案中，所述可溶 性亨德拉病毒G蛋白以二聚體形式存在，其中每一個可溶性亨德拉病毒G糖蛋白二聚體亞基 由一個或多個二硫鍵連接。在一些實施方案中，所述可溶性亨德拉病毒G蛋白以四聚體形式 存在。在一些實施方案中，所述四聚體形式以非共價連接和/或由一個或多個二硫鍵連接的 二聚體的二聚體形式存在。在所述免疫原性組合物中可溶性亨德拉病毒G蛋白的濃度可以 是約 5μg/ml 至 100μg/ml。
[0008] 在一些實施方案中，所述阜苷是從莫利納阜皮樹(Quillaja saponaria Molina) 中分離而來并且可以選自QH-A、QH-B、QH-C或QS21。在一些實施方案中，所述磷脂選自由以 下各項組成的組:磷脂酰膽堿(PC)、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、磷脂酸(磷脂酸酯）（PA)、 磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酰 肌醇雙磷酸酯(PIP2)、磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)、磷酸膽堿(SPH)、神經(jīng)酰胺磷酰乙醇胺 (Cer-PE)、以及神經(jīng)酰胺磷酰甘油。在一些實施方案中，所述皂苷是奎爾A，所述磷脂是DPPC 并且所述類固醇是膽固醇，并且在所述組合物中奎爾A:DPPC:膽固醇的比率是以重量計5: 1:1〇
[0009] 本發(fā)明還涵蓋了一種在受試者中產(chǎn)生對抗亨德拉病毒和/或尼帕病毒的中和抗體 反應的方法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中和抗體反應的量和持續(xù)時間向所述受試者施 用本文所述的免疫原性組合物。在一些實施方案中，所述中和抗體反應減少了所述受試者 體內(nèi)亨德拉病毒和/或尼帕病毒的繁殖并且還可以減少所述受試者體內(nèi)亨德拉病毒和/或 尼帕病毒脫落。在一些實施方案中，所述受試者尚未暴露于亨德拉病毒和/或尼帕病毒，而 在其它實施方案中，所述受試者患有亨德拉病毒和/或尼帕病毒感染。在一些實施方案中， 本發(fā)明涵蓋了一種在受試者中產(chǎn)生對抗亨德拉病毒的中和抗體反應的方法，所述方法包括 以有效產(chǎn)生所述中和抗體反應的量和持續(xù)時間向所述受試者施用本文所述的免疫原性組 合物。在一些實施方案中，本發(fā)明涵蓋了一種在受試者中產(chǎn)生對抗尼帕病毒的中和抗體反 應的方法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中和抗體反應的量和持續(xù)時間向所述受試者施用 本文所述的免疫原性組合物。
[0010] 在一些實施方案中，肌內(nèi)施用所述免疫原性組合物。在一些實施方案中，分多次劑 量施用所述免疫原性組合物，并且在首次劑量后是在首次劑量后的至少約二十一天至約四 十二天時給予的第二次劑量。在一些實施方案中，在首次劑量后是在首次劑量后的二十八 天時給予的第二次劑量，進一步繼而是在第二次劑量后的二十八天時給予的第三次劑量。 在一些實施方案中，在最后一次劑量后的六個月時施用加強劑量。在實施方案中，在不施用 第三次劑量的情況下，所述第二次劑量是最后一次劑量。在實施方案中，在施用第三次劑量 的情況下，所述第三次劑量是最后一次劑量。在另一個實施方案中，在加強劑量后的一年時 施用另外的劑量。在一些實施方案中，每一次劑量含有約5〇yg或約lOOyg的可溶性亨德拉病 毒G蛋白。
[0011] 本發(fā)明還涵蓋了一種區(qū)分接種了本文所述的免疫原性組合物的受試者與暴露于 亨德拉病毒和/或尼帕病毒的受試者的方法，所述方法包括在從所述受試者分離的生物樣 品中檢測對抗選自由以下各項組成的組的以下HeV和/或NiV病毒蛋白中的任一種的至少一 種的抗體的存在:融合蛋白（F)、基質(zhì)蛋白（M)、磷蛋白（P)、大蛋白（L)以及核衣殼蛋白（N)。
[0012] 本發(fā)明的免疫原性組合物和方法可以向諸如以下各項的受試者施用:人類、馬、母 牛、綿羊、豬、山羊、雞、狗或貓。
[0013] 本發(fā)明還涵蓋了一種在人類受試者中產(chǎn)生對抗亨德拉病毒和/或尼帕病毒的中和 抗體反應的方法，所述方法包括以有效產(chǎn)生所述中和抗體反應的量和持續(xù)時間向所述受試 者施用免疫原性組合物，所述組合物包含亨德拉病毒可溶性G糖蛋白。在一些實施方案中， 所述免疫原性組合物還包含佐劑。
【附圖說明】
[0014] 圖1示出了馬隨時間推移的直腸溫度，所述馬接受了用250yg的免疫刺激復合物佐 劑化的50yg或100yg/劑的重組亨德拉病毒可溶性糖蛋白（sG)的施用，繼而在第0天暴露于 活的亨德拉病毒。
[0015] 圖2示出了馬隨時間推移的心率，所述馬接受了用250yg的免疫刺激復合物佐劑化 的50yg或100yg/劑的重組亨德拉病毒可溶性糖蛋白（sG)的施用，繼而在第0天暴露于活的 亨德拉病毒。
[0016] 圖3描繪了用于制備免疫刺激復合物的示意圖。
[0017] 圖4描繪了sGHeV疫苗接種和NiV攻擊方案的示意圖。sGHeV疫苗接種、NiV攻擊以及 安樂死的日期由箭頭指示。在如所示(*)的第-42天、第-7天、第0天、攻擊后的第3天、第5天、 第7天、第10天、第14天、第21天、以及第28天采集血液和拭子樣品?；疑淖直硎竟魰r間 線(頂行）；黑色文字表示疫苗接種時間線(底行）。示出了每一個疫苗劑量組中的受試者以 及一個對照受試者的非洲綠猴(AGM)編號。
[0018] 圖5描繪了受NiV感染的受試者的存活曲線。使用來自對照受試者(n = 2)和接受 sGHeV疫苗接種的受試者（n = 9)的數(shù)據(jù)來產(chǎn)生卡普蘭-邁耶存活曲線（Kaplan-Meier survival curve)。對照包括來自一個另外的歷史對照受試者的數(shù)據(jù)。被接種疫苗的受試者 接受兩次皮下施用的l〇yg、50yg或100yg的sGHeV。到終末期疾病的平均時間在對照受試者 中是11天，而所有被接種疫苗的受試者存活直到在研究結(jié)束時安樂死為止。
[0019] 圖6描繪了被接種疫苗的受試者中的NiV特異性免疫球蛋白和HeV特異性免疫球蛋 白（Ig)。從被接種疫苗的受試者采集血清和鼻拭子并且使用sGHeV、和sGMV多重化微球體 測定來評價IgG反應、IgA反應以及IgM反應。單獨地測定來自同一疫苗劑量組(n = 3)中的受 試者的血清或拭子，并且計算微球體中值熒光強度(M.F.I.)的平均值，它示于Y軸上。誤差 棒表示平均值的標準誤差。血清sG特異性I g以黑色符號（sGHeV (空心三角形）、sGNi V (實心 三角形））示出，并且粘膜sG特異性IgA以灰色符號（sGHeV(空心三角形）、sGNiV(實心三角 形））示出。
【具體實施方式】 疫苗和免疫原性組合物
[0020] 本發(fā)明的疫苗和免疫原性組合物在已經(jīng)接受所述組合物的施用的受試者中誘導 多種體液免疫反應和細胞免疫反應中的至少一種，或有效增強對抗HeV和/或NiV中的至少 一種毒株的至少一種免疫反應，因此所述施用適用于實現(xiàn)疫苗接種的目的和/或預防HeV 和/或NiV中的一種或多種毒株所引起的HeV和/或NiV感染。本發(fā)明的組合物向有需要的受 試者遞送來自HeV和/或NiV的G糖蛋白，包括可溶性G糖蛋白；以及免疫刺激復合物（ISC)，所 述免疫刺激復合物充當佐劑。在一些實施方案中，G糖蛋白的量包括但不限于每毫升5yg、10 yg、15yg、20yg、25yg、30yg、35yg、40yg、45yg、50yg、75yg、1 OOyg、150yg、200yg 或 250yg，它還 可以含有每毫升 10(^8、125以8、15(^8、17548、20(^8、22548、25(^8、27548或30(^8的13(：。在 一些實施方案中，G糖蛋白的量是每毫升5yg、50yg或100yg，并且ISC的量是每毫升250yg。 A. HeV和NiV的G蛋白
[0021] 在一些實施方案中，所述疫苗和免疫原性組合物包含如本文所述的一種或多種 HeV和/或NiV的G糖蛋白。術語蛋白質(zhì)在本文中寬泛地用于包括多肽或其片段。舉例來說而 非限制，HeV G糖蛋白可以呈可溶性形式，并且包含Wang(2000)J.Virol.74,9972-9979中的 HeV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸73-604(還參見Yu(1998)Virology 251,227-233)。還 舉例來說而非限制，NiV G糖蛋白可以呈可溶性形式，并且包含Harcourt(2000)Virology 271:334-349,2000中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸71-602(還參見Chua( 2000) Science，288，1432-1)。
[0022] 一般來說，HeV和NiV的G糖蛋白的可溶性形式包含HeV或NiV的G糖蛋白的胞外域 (例如細胞外）的全部或一部分，并且一般是通過使G糖蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)域的全部或一部分 以及G糖蛋白的細胞質(zhì)尾區(qū)的全部或一部分缺失而產(chǎn)生的。舉例來說，可溶性G糖蛋白可以 包含HeV或NiV的G糖蛋白的完整胞外域。還舉例來說而非限制，可溶性G糖蛋白可以包含HeV 或NiV的G糖蛋白的胞外域的全部或一部分以及跨膜結(jié)構(gòu)域的一部分。
[0023]本發(fā)明的可溶性HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白一般保留相應的天然病毒糖蛋白的 一種或多種特征，如與病毒宿主細胞受體相互作用或結(jié)合的能力、可以一種低聚形式或多 種低聚形式產(chǎn)生、或引出能夠識別天然的G糖蛋白的抗體(包括但不限于病毒中和抗體）的 能力。另外的特征的實例包括但不限于阻止或預防宿主細胞被感染的能力?？梢岳贸Ｒ?guī) 的方法來評價可溶性HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白的一種或多種特征。
[0024]舉例來說而非限制，編碼可溶性HeV G糖蛋白的多核苷酸可以包含編碼Wang (2000)J.Virol.74,9972-9979中的HeV G糖蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)的大約氨基 酸73-604的多核苷酸序列。還舉例來說而非限制，編碼可溶性HeV G糖蛋白的多核苷酸可以 包含Wang(2000)J.Virol.74,9972-9979中的HeV G糖蛋白的多核苷酸序列的核苷酸9129至 10727。此外，還可以利用編碼HeV G糖蛋白的氨基酸序列（SEQ ID N0:2)的大約氨基酸73- 604的經(jīng)過密碼子優(yōu)化的多核苷酸序列。在一些實施方案中，這些經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列包 含SEQ ID N0:16的核苷酸64至1662或由SEQ ID N0:16的核苷酸64至1662組成。在另外的實 施方案中，所述經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列包含SEQ ID N0:16或由SEQ ID N0:16組成，所述SEQ ID NO: 16包括編碼IgK前導序列的核苷酸。
[0025] 舉例來說而非限制，NiV G糖蛋白可以呈可溶性形式，并且包含Harcourt(2000) Virology 271,334-349中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的氨基酸71-602?？梢杂糜跇?gòu)建可 溶性NiV G糖蛋白的序列的非限制性實例可以見于Harcourt(2000)Virology 271,334-349 中。一般來說，來自任何尼帕病毒分離株或毒株的G糖蛋白序列均可以用于衍生本發(fā)明的多 核苷酸和多肽。
[0026]舉例來說而非限制，編碼可溶性NiV G糖蛋白的多核苷酸可以包含編碼Harcourt (2000)Virology 271,334-349中的NiV G糖蛋白的氨基酸序列的大約氨基酸71-602的多核 苷酸序列。還舉例來說而非限制，編碼可溶性NiV G糖蛋白的多核苷酸可以包含Harcourt (2000)Virology 271,334-349中的NiV G糖蛋白（SEQ ID N0:4)的多核苷酸序列的234- 2042。此外，還可以利用編碼NiV G糖蛋白的氨基酸序列的大約氨基酸71-602的經(jīng)過密碼子 優(yōu)化的多核苷酸序列。
[0027] 在本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物中可以使用這些G糖蛋白的功能等同 物。舉例來說而非限制，功能上等同的多肽具有以下特征中的一種或多種:與病毒宿主細胞 受體相互作用或結(jié)合的能力、可以一種或多種二聚體或四聚體形式產(chǎn)生、引出能夠識別天 然G糖蛋白的抗體(包括但不限于HeV和/或NiV病毒中和抗體)的能力和/或阻止或預防宿主 細胞被感染的能力。
[0028] 在一些實施方案中，所述G糖蛋白可以呈二聚體形式和/或四聚體形式。這樣的二 聚體取決于G糖蛋白中的半胱氨酸殘基之間所形成的二硫鍵的形成。這樣的二硫鍵可以對 應于當在HeV或NiV的表面中表達時天然G糖蛋白中所形成的那些（例如半胱氨酸的位置保 持不變），或可以在G糖蛋白中的存在或位置上發(fā)生改變(例如通過改變氨基酸序列中的一 個或多個半胱氨酸的位置），以形成G糖蛋白的不同二聚體形式和/或四聚體形式，這些形式 增強了抗原性。此外，在再次考慮到G糖蛋白存在許多構(gòu)象依賴性表位（即由三級三維結(jié)構(gòu) 產(chǎn)生)并且維持許多這樣的天然表位對于賦予中和抗體反應來說是非常優(yōu)選的情況下，非 二聚化的形式和非四聚化的形式也落入本發(fā)明內(nèi)。
[0029] 本發(fā)明的HeV免疫原性組合物和疫苗組合物可以含有具有可變長度的蛋白質(zhì)，但 是包括SEQ ID N0:2的氨基酸殘基73至604。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的包膜蛋 白與SEQ ID勵：2的拖￥糖蛋白（包括氨基酸73至604)至少約85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一。因此，本發(fā)明的!^6糖蛋白包含天然!^6糖蛋 白的具有足夠數(shù)目的氨基酸以產(chǎn)生構(gòu)象表位的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性實 例包括可以具有至少530個、531個、532個、533個、534個或535個或更多個氨基酸的長度的 氨基酸序列。在一些實施方案中，所述HeV G糖蛋白包含SEQ ID N0:2或還包含IgK前導序列 的合成構(gòu)建體（SEQIDN0:15)或由SEQIDN0:2或還包含Igκ前導序列的合成構(gòu)建體（SEQ ID N0:15)組成。
[0030] 本發(fā)明的NiV免疫原性組合物和疫苗組合物可以含有具有可變長度的蛋白質(zhì)，但 是包括SEQ ID N0:4的氨基酸殘基71至602。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的包膜蛋 白與SEQ ID N0:4的NiV糖蛋白（包括氨基酸71至602)至少約85%、90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%、或99%同一。因此，本發(fā)明的附￥6糖蛋白包含天然附￥6糖蛋 白的具有足夠數(shù)目的氨基酸以產(chǎn)生構(gòu)象表位的免疫原性片段。免疫原性片段的非限制性實 例包括可以具有至少528個、529個、530個、531個、532個、或533個或更多個氨基酸的長度的 氨基酸序列。在一些實施方案中，所述NiV G糖蛋白包含SEQ ID NO:4或還包含前導序列的 合成構(gòu)建體或由SEQ ID NO:4或還包含前導序列的合成構(gòu)建體組成。
[0031]如本文所述的免疫原性片段含有所述抗原的至少一個表位并且顯示出HeV和/或 NiV抗原性，并且在存在于合適的構(gòu)建體中時，例如像在與其它HeV和/或NiV抗原融合或存 在于載體上時，能夠引起免疫反應，所述免疫反應是針對天然抗原。在本發(fā)明的一個實施方 案中，所述免疫原性片段含有來自HeV和/或NiV抗原的至少20個連續(xù)氨基酸，例如來自HeV 和/或NiV抗原的至少50個、75個或100個連續(xù)氨基酸。
[0032] HeV G糖蛋白和NiV G糖蛋白實施方案還包括一種分離的多肽，所述多肽包含與天 然HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白具有至少85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、 97%、98%、99%或100%同一性的氨基酸序列，其中所述多肽序列可以與天然HeV G糖蛋白 或NiV G糖蛋白的氨基酸序列相同，或與天然的HeV G蛋白或NiV G蛋白氨基酸序列相比可 以包括最多一定整數(shù)個氨基酸改變，其中所述改變選自由以下各項組成的組:至少一個氨 基酸缺失;取代，包括保守取代和非保守取代;或插入，并且其中所述改變可以存在于參考 多肽序列的氨基末端或羧基末端位置或那些末端位置之間的任何位置處，這些位置單獨地 穿插在參考序列中的氨基酸之間或以一個或多個連續(xù)組的形式穿插于天然HeV G糖蛋白或 NiV G糖蛋白的氨基酸序列內(nèi)。
[0033] 在氨基酸序列水平上的序列同一性或同源性可以通過BLAST(基本局部比對搜索 工具）分析，使用由程序131&8七卩、131&81：11、131&8七叉、1：131&81：11以及1：131&8七叉(厶]^8(311111(1997) Nucleic Acids Res.25,3389-3402;以及 Karlin(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87， 2264-2268)所用的算法來確定，所述程序被定制用于序列相似性搜索。由BLAST程序所使用 的方法在于首先考慮在查詢序列與數(shù)據(jù)庫序列之間具有空位(非連續(xù))和沒有空位(連續(xù)） 的相似段，然后評價所鑒定出的所有匹配的統(tǒng)計顯著性，以及最終僅匯總那些滿足了預先 選擇的顯著性閾值的匹配。關于序列數(shù)據(jù)庫的相似性搜索中的基本問題的論述，參見 八1七8(：11111(1994)似1：1^6 661161:;^8 6，119-129。用于直方圖、說明、比對、期望值（即報告相 對于數(shù)據(jù)庫序列的匹配的統(tǒng)計顯著性閾值）、截止值、矩陣以及過濾器(低復雜度)的搜索參 數(shù)處在默認設置。由13]^8七口、13138七1、1：131381：11以及1：13138七1所使用的默認計分矩陣是 BL0SUM62 矩陣（Henikoff(1992)Proc .Natl .Acad. Sci. USA 89,10915-10919)，該矩陣被推 薦用于具有超過85個氨基酸的長度的查詢序列。
[0034]本發(fā)明的疫苗組合物和免疫原性組合物還可以包含來自不同毒株的另外的HeV G 蛋白和/或NiV G蛋白，所述G蛋白可以進一步加強本發(fā)明的免疫方法。 B.免疫刺激復合物
[0035] -般來說，本發(fā)明提供了包括疫苗組合物在內(nèi)的免疫原性組合物，所述組合物包 含HeV和/或NiV的G糖蛋白包膜蛋白的可溶性形式與免疫刺激復合物（ISC)的組合；以及使 用這些組合物在受試者中預防和治療HeV和/或NiV感染的方法。在本發(fā)明中，疫苗組合物 和/或免疫原組合物包含免疫刺激復合物，它充當佐劑。如本文所用的"佐劑"指的是雖然本 身不具有任何特異性抗原作用，但是可以刺激免疫系統(tǒng)，從而提高對抗原的反應的試劑。 [0036] ISC具有使它成為對于某些應用來說理想的佐劑的許多特征：
[0037] 節(jié)約抗原：如例如Wee(2008)Mucosal Immunol · 1,489-496中所指出，在其中抗原 的可用性是有限的或抗原成本較高的情形下，ISC已經(jīng)被證實允許節(jié)約抗原多達10倍至100 倍。這最有可能是因為與其它佐劑相比提高的效率或更適當?shù)淖饔脵C制的組合。
[0038] 交叉提呈：如例如Schnurr(2009)J. Immunol · 182，1253-1259中所指出，由抗原提 呈細胞(APC)對抗原進行的提呈通常遵循兩個途徑之一。外來抗原通常由APC吞噬，然后被 加工并且在主要組織相容性復合體(MHC)II類分子的背景下重新表達在APC的表面上。它們 然后能夠由淋巴細胞注意到，并且如果存在恰當?shù)墓泊碳ひ蜃?信號，那么在適當時對其作 出反應。自身抗原或癌抗原以及病毒抗原通常被加工并且在I類分子的背景下表達，這是因 為它們存在于APC的細胞質(zhì)中。針對癌抗原和病毒抗原的有效免疫需要進入I類途徑。這在 病毒感染或細胞穩(wěn)態(tài)(對內(nèi)部抗原的細胞更新)期間自然發(fā)生。作為疫苗所引入的抗原（病 毒或自身）需要找到它們從細胞外部到細胞的抗原加工細胞器的方式并且進入II類途徑到 I類途徑中。這可以在樹突狀細胞(DC，專職APC)中自然發(fā)生或可以通過用與作為佐劑的ISC 混合的抗原進行疫苗接種來實現(xiàn)。外源性抗原找到它進入抗原提呈的I類途徑中的方式的 這一過程被稱作交叉提呈。ISC實現(xiàn)抗原的交叉提呈的精確機制沒有完全被闡明，但是可能 依靠 ISC組分的膜擾動作用。
[0039] 體液反應和細胞介導的反應:如例如Maraskovsky(2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376中所指出，憑借ISC的作用機制，使適應性免疫系統(tǒng)的體液分支和細胞分支這兩者 均參與。在一些物種中，這類似于通過使用這種佐劑進行疫苗接種所刺激的細胞因子的特 征。1型免疫反應的特征在于白細胞介素-2和IFN-γ表達以及針對細胞內(nèi)病原體(細菌、原 生動物以及病毒)的保護，并且2型反應的特征在于白細胞介素-4的表達以及產(chǎn)生中和抗體 以用于抗毒素和抗病原體相關免疫。ISC在這兩個極端之間提供了平衡的細胞因子特征，從 而允許免疫反應的更大寬度。此外，許多研究已經(jīng)顯示ISC在疫苗被鼻內(nèi)遞送的情況下可以 是有效的。這允許粘膜表面的致敏并且因此在這種情況下特別相關的病原體進入部位提供 了相關免疫(粘膜免疫），還參見 Sj0lailder(2001)Vaccine 19,4072-4080。
[0040] 可無菌過濾和一致的制造標準：ISC顆粒的尺寸通常是40nm的直徑，從而允許它穿 過用于在配制后期對制劑進行滅菌的過濾器。此外，在研發(fā)ISC的制造方法中已經(jīng)利用了如 在奎爾A中所存在的三萜皂苷與膽固醇和磷脂締合的自然傾向。將沒有形成ISC顆粒的奎爾 A物質(zhì)從最終產(chǎn)物中透析掉。通過控制組分的比率，由一系列異質(zhì)的奎爾A皂苷產(chǎn)生一致的 產(chǎn)物。這一比率是重要的，這是因為偏差會產(chǎn)生不屬于特征性40nm顆粒的結(jié)構(gòu)(螺旋、薄片 等）。ISC膠體的自由流動的性質(zhì)以及它能使用透射電子顯微鏡法、HPLC以及其它技術被測 量的能力使得這種佐劑適合于釋放測定和其它質(zhì)量量度的研發(fā)。
[0041]因此，基于以上所述，在一些實施方案中，免疫刺激復合物與最佳量的G糖蛋白的 制劑包括皂苷、磷脂以及類固醇分子。在一些實施方案中，皂苷、磷脂、類固醇分子的摩爾比 是5:1:1的比率。免疫刺激復合物可以含有例如5重量％至10重量％的皂苷、1重量％至5重 量％的類固醇分子和磷脂以及包含G糖蛋白的其余部分。G糖蛋白可以直接或在將載體蛋白 (例如嵌合蛋白或融合蛋白）并入到免疫刺激復合物中之后通過與所述載體蛋白化學偶聯(lián) 而被并入到免疫刺激復合物中。在提到免疫刺激復合物時，應當理解的是，包括提到其衍生 物、化學等同物以及類似物。在一些實施方案中，將ISC與HeV G糖蛋白和/或NiV G糖蛋白分 開混合，然后將G糖蛋白與ISC混合。在一些實施方案中，將G糖蛋白直接與皂苷、磷脂以及類 固醇分子混合。
[0001]合適的皂苷包括三萜皂苷。這些三萜系化合物是一組來源于植物的表面活性糖苷 并且共有共同的化學核心，所述化學核心由親水區(qū)（通常是若干糖鏈)構(gòu)成，所述親水區(qū)與 類固醇或三萜系化合物結(jié)構(gòu)的疏水區(qū)締合。由于這些相似性，因此共有這種化學核心的皂 苷有可能具有相似的佐劑化特性。適用于佐劑組合物中的三萜系化合物可以來自許多來 源，無論是植物衍生的或是合成的等同物，包括但不限于皂皮樹、番茄堿、人參提取物、蘑 菇、以及在結(jié)構(gòu)上類似于類固醇皂苷的生物堿糖苷。
[0042] 在一些實施方案中，用于本發(fā)明中的皂苷是奎爾A和/或它的衍生物?？鼱朅是從南 美樹木莫利納阜皮樹中分離的一種阜苷制劑并且最初由Dalsgaard( 1974)，《阜苷佐劑 (Saponin ad juvants)》，Archiv· fiir die gesamte Virusforschung，第44卷，Springer Verlag，第243-254頁描述為具有佐劑活性。已經(jīng)通過HPLC分離出奎爾A的純化片段，所述片 段保留了佐劑活性而沒有與奎爾A相關的毒性(EP 0362278)，例如QS7和QS21(也被稱為QA7 和QA21KQS21是源自于莫利納皂皮樹的樹皮的天然皂苷，它誘導CD8+細胞毒性T細胞 (CTL)、Thl細胞以及主要的IgG2a抗體反應并且是用于本發(fā)明的背景下的一種皂苷。用于 ISC中的其它合適的皂苷包括但不限于奎爾A的QH-A、QH-B以及QH-C亞級分、來自除皂樹 (Quillaia saponaria)以外的物種的那些，如來自人參屬（Panax)(人參）、黃苗屬 (Astragalus)、牛膝屬(Achyranthes)、大豆、金合歡屬(Acacia)以及黨參屬（Codonopsis) 的那些。在一些實施方案中，皂苷是從除皂樹以外的物種中分離的。
[0043] 用于本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物中的磷脂的非限制性實例包括具有 二?；视王ソY(jié)構(gòu)的分子和鞘磷脂。具有二?；视王ソY(jié)構(gòu)的磷脂的非限制性實例包括磷 脂酸(磷脂酸酯）(PA)、磷脂酰乙醇胺(腦磷脂）(PE)、磷脂酰膽堿(卵磷脂）(PC)、二棕櫚?；?磷脂酰膽堿(DPPC)或磷脂酰絲氨酸(PS)。具有二?；视王ソY(jié)構(gòu)的磷脂的另一個非限制性 實例包括磷酸肌醇。示例性磷酸肌醇包括但不限于磷脂酰肌醇（PI)、磷脂酰肌醇磷酸酯 (PIP)、磷脂酰肌醇雙磷酸酯(PIP2)或磷脂酰肌醇三磷酸酯(PIP3)。鞘磷脂的非限制性實例 包括神經(jīng)酰胺磷酸膽堿(神經(jīng)鞘磷脂）（SPH)、神經(jīng)酰胺磷酰乙醇胺(神經(jīng)鞘磷脂）（Cer-PE) 或神經(jīng)酰胺磷酰甘油。
[0044] 用于本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物中的類固醇分子包括包含類固醇作 為它們結(jié)構(gòu)的一部分的分子。類固醇分子的非限制性實例包括膽固醇、孕烯醇酮、17-α-羥 基孕烯醇酮、脫氫表雄酮、雄烯二醇、孕酮、17-α-羥基孕酮、雄烯二酮、睪酮、二羥基睪酮、脫 氧皮質(zhì)酮、11-脫氧皮質(zhì)酮、皮質(zhì)醇、皮質(zhì)酮、醛固酮、雌酮、雌二醇或雌三醇。
[0045]在一些實施方案中，免疫刺激復合物通常是但不限于具有30ηΜ-40ηΜ直徑的小的 籠狀結(jié)構(gòu)。在一些實施方案中，免疫刺激復合物的制劑具有5:1:1比率的摩爾比的奎爾Α、膽 固醇以及磷脂酰膽堿。免疫刺激復合物可以含有例如5重量％至10重量％的奎爾A、1重量％ 至5重量％的膽固醇和磷脂以及包含G糖蛋白的其余部分。G糖蛋白可以直接或在將載體蛋 白（例如嵌合蛋白或融合蛋白）并入到免疫刺激復合物中之后通過與所述載體蛋白偶聯(lián)而 被并入到免疫刺激復合物中。在提到免疫刺激復合物時，應當理解的是，包括提到其衍生 物、化學等同物以及類似物。舉例來說，在提到免疫刺激復合物的衍生物時，包括提到了如 下的免疫刺激復合物，其中奎爾A、膽固醇、磷脂酰膽堿或蛋白質(zhì)中的一種或多種例如被除 去、取代，或其中還將除奎爾A、膽固醇、磷脂酰膽堿或蛋白質(zhì)之外的組分添加到復合物中。 免疫刺激復合物的功能等同物可以是如下的免疫刺激復合物，其中它的四種組分中的一種 或多種被替換為功能等同物。在本發(fā)明的一些實施方案中，免疫刺激復合物的G糖蛋白組分 被除去。這種類型的免疫刺激復合物在本文中被稱為無蛋白質(zhì)免疫刺激復合物。
[0046] 在一些實施方案中，本發(fā)明包括但不限于免疫原性組合物，所述組合物包含分離 的HeV G蛋白或NiV G蛋白，所述G蛋白能夠在體外誘導對抗HeV和/或NiV的多種毒株的交叉 反應性中和抗血清產(chǎn)生；以及佐劑，所述佐劑包含奎爾A、DPPC以及膽固醇，例如其中所述組 合物含有:5yg、50yg或100yg的可溶性HeV G蛋白或NiV G蛋白以及適量的奎爾A、DPPC以及 膽固醇。免疫刺激復合物的另外的示例性實施方案以及其制備描述于EP 0242380B1和EP 0180564B1以及W02000041720中（參見例如其中第3頁和第9頁，參考:Cox和Coulter(1992) 《佐劑技術和應用在利用生物技術進行動物寄生蟲控制方面的進步（Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology)》，第4章，Yong(編著），CRC Press;Dalsgard( 1974)GesamteVirusforsch， 44，243-254;澳大利亞專利說明書號558258、589915、590904以及632067)。還參見美國專利 6,506,386中所述的代表性方案，以及其中對以下公知事實的提及，即可以使用如下的免疫 刺激復合物，其中在形成時將蛋白質(zhì)抗原包括在免疫刺激復合物中（參見EP 0109942B1)， 或作為另外一種選擇，提供預先形成的免疫刺激復合物，然后將所述免疫刺激復合物與抗 原的單獨添加的等分部分混合以形成疫苗(參見EP 0436620B1)。如一般將公認的那樣，還 可以使蛋白質(zhì)抗原與免疫刺激復合物共價連接(再次參見EP 0180564B1)。如也是本領域公 認的那樣，可以經(jīng)由粘膜疫苗接種來施用免疫刺激復合物（參見Mowat( 1991) Immunology 72,317-322)并且本發(fā)明的免疫刺激復合物可以通過包括膜靶向蛋白而被進一步改進用于 粘膜疫苗接種(W0 9730728)。
[0047] 在一些實施方案中，本發(fā)明包括但不限于免疫原性組合物，所述組合物包含分離 的HeV G蛋白或NiV G蛋白，所述G蛋白能夠在體外誘導對抗HeV和/或NiV的多種毒株的交叉 反應性中和抗血清產(chǎn)生；以及佐劑，所述佐劑包含奎爾A、DPPC以及膽固醇，例如其中所述組 合物含有:5yg、50yg或100yg的可溶性HeV G蛋白或NiV G蛋白以及適量的奎爾A、二棕櫚酰 磷脂酰膽堿（DPPC)以及膽固醇。免疫刺激復合物的另外的示例性實施方案描述于 W02000041720 中。
[0048] 在本發(fā)明的另一個實施方案中，所述疫苗組合物和免疫原性組合物可以是藥物組 合物的一部分。本發(fā)明的藥物組合物可以含有合適的藥學上可接受的載體，所述載體包括 賦形劑和輔劑，所述載體有助于將活性化合物加工成可以在藥學上用于遞送到作用部位的 制劑。 C.賦形劑
[0049] 本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物還可以包含藥學上可接受的載體、賦形劑 和/或穩(wěn)定劑(參見例如《雷明頓:藥物科學和實踐(Remington:The Science and practice of Pharmacy)》，（2005)Lippincott Williams)，它們呈凍干制劑或水溶液的形式。可接受 的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑在所述劑量和濃度下對接受者是無毒的，并且可以包括緩沖劑，如 磷酸鹽、檸檬酸鹽、以及其它有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸和甲硫氨酸；防腐劑（如汞 ((鄰羧基苯基)硫代）乙基鈉鹽(硫柳汞）、十八烷基二甲基苯甲基氯化銨;氯己雙銨;苯扎氯 銨、芐索氯銨;苯酚、丁醇或苯甲醇;對羥基苯甲酸烷酯，如對羥苯甲酸甲酯或?qū)αu苯甲酸丙 酯；兒茶酚；間苯二酚;環(huán)己醇；3-戊醇；以及間甲酚）；蛋白質(zhì)，如血清白蛋白、明膠、或免疫 球蛋白；親水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮;氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、組氨 酸、精氨酸、或賴氨酸;單糖、二糖、以及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖;螯 合劑，如EDTA;糖，如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇;成鹽抗衡離子，如鈉;金屬絡合物 (例如Zn-蛋白質(zhì)絡合物）；和/或非離子型表面活性劑，如聚乙二醇(PEG)、吐溫(TWEEN)或普 魯蘭尼克(PLURONIC)。
[0050] 本發(fā)明的組合物可以處在如下的劑量，所述劑量懸浮在具有足夠體積以承載所述 劑量的任何適當?shù)乃幬锩浇槲锘蜉d體中。一般來說，包括載體、佐劑等在內(nèi)的最終體積通常 將是至少1.0ml。上限由待施用的量的實用性決定，所述量一般不多于約0.5ml至約2.0ml。 使用方法
[0051] 本發(fā)明涵蓋了預防和/或治療亨德拉病毒和/或尼帕病毒感染的方法，所述方法包 括向任何哺乳動物受試者施用本發(fā)明的免疫原性組合物和疫苗組合物。通過用HeV G糖蛋 白和/或NiV G糖蛋白連同本文所述的佐劑一起進行疫苗接種所引出的主動免疫可以引發(fā) 或加強細胞免疫反應或體液免疫反應?？梢灾苽溆行Я康腍eV G糖蛋白和/或NiV G糖蛋白 或其抗原片段與佐劑的混合物以制備疫苗。
[0052] 本發(fā)明涵蓋了在人類受試者中預防和/或治療亨德拉病毒和/或尼帕病毒感染的 方法，所述方法包括施用免疫原性組合物和/或疫苗組合物，所述組合物包含可溶性HeV G 糖蛋白和/或NiV G糖蛋白或其組合單獨或與適用于人類的至少一種佐劑的組合。適用于人 類的佐劑可以被單獨使用或組合使用。適用于人類的佐劑的實例包括但不限于鋁鹽。鋁鹽 的實例包括但不限于氫氧化鋁、氫氧化鋁凝膠(Alhydrogel?)、磷酸鋁、明礬(硫酸鋁鉀）、或 混合鋁鹽。適用于人類的佐劑的另外的實例包括但不限于油包水乳液、水包油乳液、以及 AS04(氫氧化鋁和單磷酰脂質(zhì)A的組合）以及CpG寡脫氧核苷酸。CpG寡脫氧核苷酸是合成寡 核苷酸，它們在特定的序列背景下含有未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序）。這些CpG基序在 細菌DNA中存在的頻率是在哺乳動物DNA中的20倍。CpG寡脫氧核苷酸由Toll樣受體9(TLR9) 識別，從而引起強免疫刺激作用。
[0053]包含HeV G糖蛋白和/或NiV G糖蛋白以及本文所述的一種或多種佐劑的疫苗組合 物或免疫原性組合物的施用可以用于實現(xiàn)預防目的或治療目的。在本發(fā)明的一個方面，所 述組合物可用于實現(xiàn)預防目的。當被預防性提供時，所述疫苗組合物是在HeV和/或NiV感染 的任何檢測或癥狀前提供的。有效量的所述一種或多種化合物的預防性施用用來預防或減 弱任何后續(xù)的HeV和/或NiV感染。
[0054]當被治療性提供時，所述疫苗是在檢測到實際感染的癥狀后以有效量提供的。如 果組合物的施用可以由接受者所耐受，那么將它說成是"藥理學上可接受的"。如果所施用 的量在生理學上是有意義的，那么將這樣的組合物說成是以"治療或預防有效量"施用的。 如果本發(fā)明的疫苗組合物或免疫原性組合物的存在使得接受患者的生理發(fā)生可檢測的變 化，這例如是通過增強對HeV和/或NiV的一種或多種毒株的廣泛反應性體液免疫反應或細 胞免疫反應而實現(xiàn)的，那么它在生理學上是有意義的。所提供的保護不需要是絕對的（即 HeV或NiV感染不需要被完全預防或根除），前提條件是相對于對照群體，有統(tǒng)計顯著性改 善。保護可以限于減輕疾病癥狀發(fā)作的嚴重程度或快速性。
[0055]本發(fā)明的疫苗組合物或免疫原性組合物可以賦予對HeV和/或NiV的多種毒株的抵 抗力。如本文所用，如果疫苗向受試者的施用使得感染的癥狀或病況有完全或部分的減弱 (即抑制)或使得個體對感染有完全或部分的免疫力，那么它被認為預防或減弱感染。
[0056]可以通過實現(xiàn)預期目的的任何手段，使用如本文所述的藥物組合物來施用本發(fā)明 的至少一種疫苗組合物或免疫原性組合物。舉例來說，這樣的組合物的施用可以通過各種 腸胃外途徑來實現(xiàn)，如皮下途徑、靜脈內(nèi)途徑、真皮內(nèi)途徑、肌內(nèi)途徑、腹膜內(nèi)途徑、鼻內(nèi)途 徑、透皮途徑、或頰面途徑。在本發(fā)明的一個實施方案中，皮下施用所述組合物。腸胃外施用 可以通過推注或通過隨時間推移逐步灌注來實現(xiàn)。
[0057]通過活性特異性細胞免疫治療來預防、抑制或治療可以通過細胞免疫反應來緩解 的疾病或病況的典型方案包括施用有效量的如上文所述的疫苗組合物，所述組合物是作為 單一治療施用的或在最多并且包括一周至約二十四個月的時間段內(nèi)作為增強或加強劑量 反復施用。非限制性實例包括首次劑量，繼而是在首次劑量(第〇天)后的約至少10天、11天、 12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天或24天時給予的第二 次劑量。在另一個實例中，在首次劑量后的42天時施用第二次劑量。在又另一個實例中，在 首次劑量后的28天時施用第二次劑量，繼而在第二次劑量后的28天時施用第三次劑量。在 再又另一個實例中，在最后一次疫苗接種后的6個月時施用加強劑量，并且繼之以在加強劑 量后的1年時進行每年的疫苗再接種。所述免疫原性組合物或疫苗組合物的劑量與在第0天 所施用的首次劑量相比可以更小、相同或更大。
[0058]根據(jù)本發(fā)明，疫苗組合物或免疫原性組合物的"有效量"是足以實現(xiàn)所期望的生物 效應，在這種情況下，是對HeV和/或NiV的一種或多種毒株的細胞免疫反應或體液免疫反應 中的至少一種的量。應當了解的是，有效劑量將取決于受試者的年齡、性別、健康情況、以及 體重、并行治療（如果有的話）的種類、治療頻率、以及所期望的作用的性質(zhì)。下文所提供的 有效劑量的范圍不意圖限制本發(fā)明并且代表了可能適用于施用本發(fā)明的組合物的劑量范 圍的實例。然而，所述劑量可以被調(diào)控用于單個受試者，如本領域技術人員所了解和可確定 的那樣，而無需過多的實驗。
[0059] 本發(fā)明的疫苗組合物和免疫原性組合物的接受者可以是任何受試者，所述受試者 可以經(jīng)由對HeV和/或NiV的細胞免疫反應或體液免疫反應而獲得特異性免疫，其中所述細 胞反應是通過MHC i類或ii類蛋白所介導的。在哺乳動物當中，所述接受者可以是靈長目的 哺乳動物(包括人類、黑猩猩、猿以及猴）。在本發(fā)明的一個實施方案中，提供了一種用本發(fā) 明的疫苗組合物或免疫原性組合物治療人類的方法。所述受試者可以感染了 HeV和/或NiV 或提供了實驗研究中的HeV或NiV感染的模型。在一些實施方案中，所述受試者是馴養(yǎng)的哺 乳動物，包括但不限于馬、母牛、公牛、水牛、綿羊、豬(Mingyi(2010)Vet.Res.41，33)、山羊、 狗（《生物安全警報：亨德拉病毒更新(Biosecurity Alert-Hendra Virus Update)》,2011 年7月27日，Press Release，Biosecurity Queensland)或貓。在一些實施方案中，所述受試 者是家禽，包括雞。
[0060] 本發(fā)明的疫苗還以用于防止亨德拉病毒感染的劑量提供了對抗尼帕病毒感染的 交叉保護作用并且因此還提供了對抗尼帕病毒的有效疫苗接種。
[0061] 在提到有效免疫反應時，應當被理解為提到了直接或間接產(chǎn)生有益的預防作用或 治療作用的免疫反應。在其中免疫原包含如本文所述的HeV G糖蛋白或NiV G糖蛋白的情況 下，這樣的反應包括在動物中減少或阻止病毒繁殖和/或病毒脫落和/或減輕疾病癥狀。應 當了解的是，功效是功能量度并且不是單獨通過參考抗HeV和/或抗NiV抗體滴度來確定的， 這是因為單獨存在循環(huán)抗體并不一定指示了所述循環(huán)抗體阻止病毒繁殖和脫落的能力。
[0062] 還舉例來說而非限制，如果本發(fā)明的可溶性G蛋白多肽被施用以加強感染了或疑 似感染亨德拉病毒或尼帕病毒的受試者的免疫反應和/或如果本發(fā)明的抗體是作為被動免 疫治療的形式被施用的，那么所述組合物還可以包含例如其它治療劑(例如抗病毒劑）。
[0063] 下文實施例4提供了有關用于對馬進行疫苗接種的某些優(yōu)選的組合物的信息。對 于可能感染了亨德拉病毒，并且因此需要接受疫苗接種以保護動物以及因此人類這兩者防 止亨德拉病毒感染和尼帕病毒感染這兩者的其它動物，以下信息一般也適用并且可以容易 由本領域技術人員調(diào)整。一般來說，伴侶動物(狗和貓)需要約25微克的亨德拉病毒抗原，并 且可以受益于25微克至150微克范圍的ISC佐劑，雖然可以使用如本文所公開的組成物質(zhì)中 的任一種，但是5:1:1比率的皂苷、磷脂以及固醇是優(yōu)選的ISC組合物之一。對于伴侶動物， 優(yōu)選的是，最終劑量是約lml。還可以使用Polygen?(MVP科技公司(MVP Technologies))，它 是一種基于共聚物的佐劑，優(yōu)選以約5%-15%(v/v)使用。
[0064] 一般來說，對于更大的農(nóng)畜（綿羊、母牛、豬等），本文另外對于馬提供的抗原和佐 劑給藥(和最終給藥體積)量也適用，即可以使用50微克-100微克的抗原，以及通常約250微 克的ISC，最終體積例如是lml -3ml。對于豬來說，替代性和有效的佐劑制劑包括(對于大致 相同量的抗原來說）ISC和離子多糖的共混物，特別是在lml-3ml最終劑量體積中100mg DEAE葡聚糖和800微克ISC(再次是5:1:1的奎爾A:磷脂酰膽堿：膽固醇（參見W0 2000/ 41720))〇 被接種疫苗的動物的區(qū)分
[0065]本發(fā)明還涵蓋了區(qū)分健康的被接種疫苗的動物與暴露于或感染了 HeV和/或MV的 動物的方法。在病毒感染期間，HeV和NiV表達除G糖蛋白（G)以外的另外的蛋白質(zhì)，包括融合 蛋白（F)、基質(zhì)蛋白（M)、磷蛋白（P)、大蛋白（L)以及核衣殼蛋白（N)。這些另外的蛋白質(zhì)有以 與這些蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體或T細胞免疫的形式誘導動物的免疫反應的潛能。通?？梢酝ㄟ^ 諸如酶聯(lián)免疫測定(EIA)的測定來測量對這些其它蛋白質(zhì)的抗體反應的水平。在一些實施 方案中，本發(fā)明的免疫原性制劑和疫苗制劑僅含有G糖蛋白作為HeV和/或NiV抗原并且因此 將以僅針對HeV和/或NiV的G糖蛋白的抗體誘導免疫反應。接種了本文所述的免疫原性組合 物并且隨后感染了HeV或NiV的動物將對G糖蛋白發(fā)動加強免疫反應，但是也將顯示出對除G 糖蛋白以外的一些其它HeV和NiV蛋白質(zhì)的抗體呈現(xiàn)的變化。因此，可以在EIA中測量針對融 合蛋白（F)、基質(zhì)蛋白（M)、磷蛋白（P)、大蛋白（L)以及核衣殼蛋白（N)中的任一種的抗體的 存在來確定在血清樣品中存在或不存在對這些蛋白質(zhì)具有特異性的抗體。如果檢測到針對 這些其它蛋白質(zhì)（即除G糖蛋白以外）中的任一種的抗體，則所述動物已經(jīng)暴露于HeV和/或 NiV。或者，如果沒有發(fā)現(xiàn)針對這些其它蛋白質(zhì)的抗體并且僅檢測到結(jié)合G蛋白的抗體，則所 述動物只是已經(jīng)被接種疫苗。
[0066]本發(fā)明的EIA在檢測和區(qū)分感染了 HeV和/或NiV的動物與已經(jīng)接種了本文所述的 免疫原性組合物的健康動物方面具有高特異性和高選擇性。本發(fā)明可以在同質(zhì)環(huán)境和異質(zhì) 環(huán)境這兩者中利用包括ELISA在內(nèi)的多種測定程序。可以對諸如血液、血清、奶液、或含有抗 體的任何其它體液的樣品進行測定程序。
[0067]在一些實施方案中，用于EIA中的抗體可以唯獨與通過用G糖蛋白進行疫苗接種所 誘導的抗體競爭，但不與在動物中由感染HeV和/或NiV所誘導的抗體競爭。這不僅允許對 HeV感染和NiV感染進行血清學診斷，而且還允許在單一測定中區(qū)分了疫苗接種與感染?？?以對標準血清樣品或含有抗體的任何體液或分泌物進行EIA程序。EIA程序可以使用針對G 糖蛋白和任何其它HeV和/或NiV病毒蛋白（例如融合蛋白（F)、基質(zhì)蛋白（M)、磷蛋白（P)、大 蛋白（L)以及核衣殼蛋白（N)，這是因為這些蛋白質(zhì)不存在于被接種疫苗的沒有暴露于HeV 和/或NiV的健康的動物中）的單克隆抗體和/或多克隆抗體?？梢栽诰哂谢驔]有計算機輔助 數(shù)據(jù)分析簡化軟件和硬件的許多可商購獲得的固定或便攜式的手動、半自動化或機器人自 動化ELISA設備中進行EIA。在一些實施方案中，可以對從馴養(yǎng)哺乳動物分離的生物樣品進 行所述區(qū)分健康的被接種疫苗的動物與暴露于或感染了 HeV和/或NiV的動物的方法，所述 哺乳動物包括但不限于馬、母牛、綿羊、豬、山羊、狗或貓。在一些實施方案中，所述受試者是 家禽，包括雞。在一些實施方案中，所述受試者是人類。 實施例
[0068]以下實施例僅說明了本發(fā)明的某些而非所有的實施方案，并且因此不應當被視作 限制本發(fā)明的范圍。 實施例1:載體構(gòu)建體
[0069] 構(gòu)建載體以表達跨膜/細胞質(zhì)尾區(qū)缺失的HeV G或NiV G。通過PCR擴增全長HeV G 蛋白或NiV G蛋白的所克隆的cDNA以產(chǎn)生具有編碼跨膜結(jié)構(gòu)域/細胞質(zhì)尾區(qū)缺失的HeV G蛋 白或NiV G蛋白的約2600個核苷酸的片段。
[0070] 合成以下寡核苷酸引物以擴增H e V G〇sHGS:5'- GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3'(SEQ ID NO :5)〇 sHGAS：5'- GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3'(SEQ ID NO:6)〇
[0071] 合成以下寡核苷酸引物以擴增N i V G。s N G S : 5 ' - CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3 ' ( SEQ ID NODosNCASd'- CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3'(SEQ ID NO:8)〇 使用Accupol DNA聚合酶(PGS科技公司(PGS Scientifics Corp))，使用以下設置進行 所有的PCR反應:最初94°C，持續(xù)5分鐘;然后94°C，持續(xù)1分鐘；56°C，持續(xù)2分鐘;72°C，持續(xù)4 分鐘；25個循環(huán)。這些引物產(chǎn)生了由Sal 1位點側(cè)接的sHeV G 0RF以及由Xho 1位點側(cè)接的 sNiV G 0RF的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物進行凝膠純化(快而精公司（Qiagen))。在凝膠純化后，將 sHeV G和sNiV G亞克隆到Τ0Ρ0載體(英杰公司（Invitrogen))中。
[0072]將PSectag2B(英杰公司）購得并且修飾以含有S肽標簽或myc表位標簽。合成重疊 寡核苷酸，所述重疊寡核苷酸編碼S肽的序列并且消化Κρη 1和EcoRl突出端。 SPEPS：5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT-3'(SEQ ID NO:9)〇 SPEPAS：5,AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3 ,(SEQ ID NO: 10)〇
[0073] 合成重疊寡核苷酸，所述重疊寡核苷酸編碼myc表位標簽的序列并且消化Kpn 1和 EcoRl突出端。 MTS：5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3'(SEQ ID NO:11)〇MTAS：5'- AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3 '（SEQ ID NO:12)。
[0074] 將64pmol的SPEPS和64pmol的SPEPAS混合并且加熱到65°C，持續(xù)5分鐘，并且緩慢 冷卻到50°C。將64pmol的MTS和64pmol的MTAS混合并且加熱到65°C，持續(xù)5分鐘，并且緩慢冷 卻到50°C。將這兩種混合物稀釋并且克隆到Kpnl-EcoRl消化的pSecTag2B中以產(chǎn)生S肽修飾 的pSecTag2B或myc表位修飾的pSecTag2B。最初通過限制性消化對所有構(gòu)建體進行篩選并 且通過測序進一步驗證。
[0075]將Τ0Ρ0 sG構(gòu)建體用Sal 1消化，進行凝膠純化(快而精公司）并且在框內(nèi)亞克隆到 S肽修飾的pSecTag2B或myc表位修飾的pSecTag2B的Xho 1位點中。最初通過限制性消化對 所有構(gòu)建體進行篩選并且通過測序進一步驗證。
[0076] 然后將IgK前導序列-S肽-s HeVG(sGs標簽）和IgK前導序列-myc標簽-sHeVG (sGmy。標構(gòu)建體亞克隆到牛痘穿梭載體pMC02中。合成寡核苷酸SEQS:5'- TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3 '（SEQ ID N0:13)，并且將其與寡核苷酸sHGAS組 合用于通過PCR擴增sGsfi^和sGmycfi簽。使用Accupol DNA聚合酶(PGS科技公司），使用以下設 置進行所有的PCR反應:最初94°C，持續(xù)5分鐘；然后94°C，持續(xù)1分鐘；56°C，持續(xù)2分鐘；72 °C，持續(xù)4分鐘；25個循環(huán)。這些引物產(chǎn)生由Sal 1位點側(cè)接的PCR產(chǎn)物。將PCR產(chǎn)物進行凝膠 純化(快而精公司）。在凝膠純化后，將sGstSl和sGmyc^l亞克隆到Τ0Ρ0載體(英杰公司）中。將 sG S標簽和sG myc標簽用Sal 1消化并且亞克隆到pMC02的Sal 1位點中。最初通過限制性 消化對所有構(gòu)建體進行篩選并且通過測序進一步驗證。隨后產(chǎn)生經(jīng)過密碼子優(yōu)化的核苷酸 序列以有助于在真核細胞系中產(chǎn)生，所述序列描繪于SEQ ID N0:16中。
[0077] 為了使用Chromos人工染色體表達(ACE)系統(tǒng)在CH0細胞中表達亨德拉病毒sG蛋 白，使用Pfx聚合酶(英杰公司），根據(jù)制造商的說明書，通過PCR擴增編碼亨德拉病毒sG蛋白 的DNA。模板是p⑶NA亨德拉病毒sG(沒有S肽標簽）。用于擴增DNA的寡核苷酸引物是：5'_ GATATCGCCACCATGGAAACCGACACCCTG-3'（SEQ ID N0:18)和5'-GGTACCTCAGCTCTCGCTGCACTG- 3'（SEQ ID NO: 19)。使用QiaQuick凝膠提取(快而精公司），遵循制造商的說明書來對片段 進行凝膠純化。然后將PCR產(chǎn)物連接到Zer〇Blunt?TOK>? (英杰公司）中，并且將連接混 合物轉(zhuǎn)化到One Shot Max efficiency細胞(英杰公司）中。將來自陽性轉(zhuǎn)化體的DNA純化， 并且使用ΚρηΙ和EcoRV將sG插入序列切除，并且連接到pCTV927中，所述pCTV927是ACE系統(tǒng) 靶向載體(ATV)。然后將連接反應物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌OmniMax細胞(英杰公司）中。在鑒定陽 性克隆后，分離PCTV927/亨德拉病毒sG T1質(zhì)粒，然后通過測序確認插入序列。 實施例2:使用CH0細胞進行的可溶性G蛋白的蛋白質(zhì)產(chǎn)生 [0078]將來自圣路易斯(St. Loui s)的中國倉鼠卵巢(CH0)ChK2細胞解凍并且轉(zhuǎn)移到容納 CD-CH0培養(yǎng)基（英杰公司）和6mM Glutamax(Gibco公司）的無菌125ml燒瓶中，并且進行傳 代。在轉(zhuǎn)染前的1小時之時，將培養(yǎng)基去除并且更換為新鮮的ChK2貼壁培養(yǎng)基。將pCTV927/ 亨德拉病毒sG T1質(zhì)粒分離，進行乙醇沉淀，并且重懸達到0.85yg/yL的濃度。用 Lipofectamine?2000(英杰公司），根據(jù)制造商的說明書，使用OptiMEM I(Gibco公司）將貼 壁細胞用ACE整合酶(pSI0343)和pCTV927/亨德拉病毒sG T1共轉(zhuǎn)染。ACE整合酶由從噬菌體 λ?ΝΑ擴增，但是被優(yōu)化用于哺乳動物表達的整合酶基因組成。在37°C/5%C02下將培養(yǎng)物與 新鮮的ChK2貼壁培養(yǎng)基一起孵育過夜。第二天，去除培養(yǎng)基，并且將細胞小心地用PBS洗滌， 繼而添加2mL胰蛋白酶溶液以使細胞脫壁，并且再添加4mL新鮮的ChK2貼壁培養(yǎng)基。然后在 96孔板中對細胞進行有限連續(xù)稀釋，繼而在96孔板中沉積后的24小時之時，用2mg/mL潮霉 素(Hygromycin)選擇。
[0079] 在小心監(jiān)測17天后，選擇80個單個轉(zhuǎn)染的克隆并且將它們用含有6mM glutamax (Gibco公司）和O.lmg/ml潮霉素的lml⑶-CHO(英杰公司）（維持選擇培養(yǎng)基)分配到24孔板 中。四天后，用維持選擇培養(yǎng)基將克隆分到如下文所示的新的24個板中。將五百微升(yL)的 懸浮培養(yǎng)物從每一個表達燒瓶中取出，并且以500 Xg離心5分鐘。將上清液取出并且轉(zhuǎn)移到 清潔的新管中并且冷凍在-20°C。隨后將所有上清液解凍并且使用NuPAGE?Novex? Bis-Tris微型凝膠（英杰公司）進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)。對于每一個樣品運行兩 組，一個用于進行凝膠染色并且另一個用于蛋白質(zhì)印跡分析。使用iBlot?凝膠轉(zhuǎn)移裝置 (英杰公司）將第二組的凝膠轉(zhuǎn)移到硝化纖維素上。使用抗G蛋白多克隆抗體作為一抗，繼而 使用過氧化物酶綴合的親和純化的抗兔IgG抗體(羅克蘭公司（Rockland))。然后通過添加 TMB膜過氧化物酶底物(KPL公司）使印跡顯影。確認G蛋白的表達。 實施例3:使用牛痘進行的可溶性G蛋白的蛋白質(zhì)產(chǎn)生
[0080]為了產(chǎn)生蛋白質(zhì)，使用含有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列的基因構(gòu)建體以產(chǎn)生重組痘病 毒載體(牛痘病毒，WR株）。然后使用標準技術，利用tk選擇和GUS染色來獲得重組痘病毒。簡 單地說，使用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒(普洛麥格公司(Promega))將CV-1細胞用pMC02sHeV G融合 體或pM⑶2sNiV G融合體轉(zhuǎn)染。然后將這些單細胞層用牛痘病毒的西里瑟夫（Western Reserve，WR)野生型毒株以0.05PFU/細胞的感染復數(shù)(Μ0Ι)感染。2天后，收集細胞沉淀物作 為粗制的重組病毒原液。在25μg/ml的5-溴-2'-脫氧尿苷(BrdU) (Calbiochem公司）存在下 將ΤΙΓ細胞用重組粗制原液感染。2小時后，將病毒替換為含有1 %低熔點(LMP)瓊脂糖(生命 科技公司（Life Technologies))和25μg/ml的BrdU的EMEM-10覆蓋層。在孵育2天后，再添加 含有1 % LMP瓊脂糖、25μg/ml的BrdU以及0.2mg/ml的5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡萄糖醛酸 (X-GLUC)(Clontech公司）的EMEM-10覆蓋層。在24小時至48小時內(nèi)，藍色空斑是明顯的，對 它們進行挑取并且再進行兩輪雙重選擇空斑純化。然后通過標準方法將重組牛痘病毒 vKB16(sHeV G融合體)和vKB22(sNiV G融合體)擴增和純化。簡單地說，將重組牛痘病毒通 過以下各項來純化:空斑純化，細胞培養(yǎng)擴增，在超速離心機中進行蔗糖墊沉淀以及通過空 斑測定來滴定。在細胞裂解物和培養(yǎng)上清液中驗證sHeV G的表達。 實施例4:使用293F細胞進行的可溶性G蛋白的蛋白質(zhì)產(chǎn)生 [0081 ]使用含有經(jīng)過密碼子優(yōu)化的序列的基因構(gòu)建體來將293F細胞(英杰公司）轉(zhuǎn)化以 產(chǎn)生表達HeV可溶性G糖蛋白的穩(wěn)定細胞系。也可以使用CH0-S細胞(英杰公司）進行轉(zhuǎn)化和 表達HeV可溶性G糖蛋白。將轉(zhuǎn)化的細胞用35ml DMEM-10接種到162cm2的組織培養(yǎng)瓶上。使 細胞貼壁并且在37 °C和5 % -8 % C02下培養(yǎng)幾天。在細胞匯合時，將它們用含150μg/ml潮霉 素 B的DMEM-10(每個燒瓶30ml)分到多個燒瓶中。當細胞達到70%-80%匯合時，將它們用 30ml PBS洗滌兩次，然后添加20ml的293SFM II(英杰公司）并且在37°C和5%-8%C02下將 細胞孵育過夜。第二天，將細胞用200ml的SFM II培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到錐形瓶中。將細胞在37°C和 5 % -8 % C02下以125rpm培養(yǎng)5天-6天直到細胞開始死亡為止。此時，收集上清液。
[0082]將來自每一個錐形瓶的培養(yǎng)基以3,500rpm離心30分鐘。然后將上清液轉(zhuǎn)移到 250ml離心瓶中并且以10，OOOrpm旋轉(zhuǎn)1小時。收集所得上清液并且根據(jù)制造商的建議添加 蛋白酶抑制劑以及添加 Triton X-100達到0· 1 %的最終濃度。然后將上清液經(jīng)由0·2μπι低蛋 白結(jié)合濾膜過濾。
[0083]經(jīng)由使用S-蛋白瓊脂糖親和柱將HeVsG純化。將20ml床體積的S-蛋白瓊脂糖 (Novagen公司）加入XK 26柱(通用電氣醫(yī)療公司（GE Healthcare))中。將柱用10X床體積 的結(jié)合/洗滌緩沖液(0.15M NaCl、20mM Tris-HCl(pH 7.5)以及0.1%的Triton X-100)洗 滌。將所制備的HeVsG上清液施加到柱上以維持3毫升/分鐘的流速。將柱用10 X床體積 (200ml)的結(jié)合/洗滌緩沖液I洗滌，繼而用6 X床體積（120ml)的洗滌緩沖液1 X洗滌緩沖液 (0.15M NaCl和20mM Tris-HCl(pH 7.5))洗滌。
[0084]然后將栗停止并且使洗滌緩沖液排放直到在添加30ml洗脫緩沖液(0.2M檸檬酸， pH 2)時它到達珠粒表面為止。收集前10ml的流過液(這應當仍是洗滌緩沖液），然后將洗脫 緩沖液與珠粒一起孵育10分鐘。隨后，將15ml的洗脫液收集到容納25ml的中和緩沖液（1M Tris，pH 8)的50mL無菌的尖底離心管中。將pH值調(diào)節(jié)到中性并且將洗脫和孵育重復三次。 將所有的經(jīng)過中和的洗脫液合并并且濃縮到約4ml。將所收集的HeVsG(4ml)經(jīng)由0.2μπι低蛋 白結(jié)合濾膜(具有〇.2μηι HT Tuffryn膜的Acrodisc 13mm注射式過濾器)純化。
[0085]可以利用凝膠過濾將HeVsG進一步純化。在質(zhì)量控制分析和確認純度和低聚狀態(tài) 后，將四聚體+二聚體、二聚體以及單體的等分HeVsG的所匯集的級分儲存在-80°C。 實施例5:對CHO HeVsG蛋白質(zhì)進行γ輻照
[0086] 將CHO HeV主細胞種子儲備液解凍，并且在搖瓶中通過4次連續(xù)傳代按比例擴增。 將所收獲的物質(zhì)在生物反應器中通過3次連續(xù)傳代進一步按比例擴增，達到8 X106個細胞/ 毫升的最終細胞密度。通過離心去除細胞(或者這可以通過深度過濾來進行）。然后將所得 的澄清了的HeVsG培養(yǎng)物質(zhì)與抗壞血酸混合達到0.2 % (w/v)的最終濃度，并且經(jīng)受Co-60 γ 輻照源達到50千戈瑞的累積劑量。 實施例6:疫苗制劑的制備
[0087] 概述了 ISC的制備的示意圖示于圖3中并且進一步描述于下文中。
[0088] 步驟1:在注射用水(WFI)中制備90g//L癸酰基-η-甲基葡糖酰胺(Mega-ΙΟ洗滌劑） 的溶液。將溶液加熱以確保Mega 10完全溶解，然后將它立即用于步驟2中或過濾滅菌。 [0089] 步驟2:含有25g//L膽固醇和25g//L二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)的溶液是通過將這 些組分溶解在Mega 10洗滌劑的原液中來制備。將溶液加熱以溶解所有組分，然后立即用于 步驟3中或過濾滅菌。
[0090] 步驟3:用WFI制備緩沖等滲鹽水，即10mM磷酸鹽緩沖液(pH6.2± 1) (BIS)并且如果 不立即使用，那么將它無菌過濾。
[0091] 步驟4:在BIS中制備奎爾A達到100g/L的最終濃度并且如果不立即使用，那么將它 無菌過濾。
[0092] 步驟5:在攪拌的溫度受控的容器（22°C_37°C)中通過依次添加預熱的BIS、膽固 醇/DPPC的Mega-10溶液（160ml/L)、以及奎爾A溶液(200ml/L)來配制ISC。通過添加 BIS使反 應物達到目標體積。
[0093] 步驟6:使整個制劑平衡到所需的溫度（目標27°C，可接受的操作范圍是22Γ-37 °C)，然后在攪拌下孵育15分鐘以有助于ISC形成。將ISC溶液在步驟7中進一步處理或無菌 過濾以中間儲存。
[0094]步驟7:通過在溫度控制下（目標27°C，可接受的操作范圍是21°C-37°C)相對于BIS 以最少20倍體積交換進行透析(膜:Hydrosart 30kDa(哥廷根的賽多利斯公司（Sartorius AG Goett ingen))來洗滌I SC反應混合物以去除未復合的組分。
[0095]步驟8:通過使用與用于透析的膜相同的膜進行超濾將透析過的ISC濃縮約2倍。用 BIS沖洗過濾系統(tǒng)以使I SC恢復到原始體積。
[0096] 步驟9:將ISC經(jīng)由0.22μπι乙酸纖維素過濾器無菌過濾而轉(zhuǎn)移到無菌儲存容器中。
[0097] 步驟10:將ISC佐劑儲存在2 °C -8 °C直到被釋放用于疫苗制劑中為止。
[0098] 然后將免疫刺激組合物(250μg/ml)與適量的可溶性HeV G糖蛋白（例如5μg/ml、50 μg/ml、100μg/ml)組合并且在BIS中調(diào)整到一定體積。 實施例7:在馬中進行的第一次臨床實驗
[0099]測試疫苗1:用250yg的免疫刺激復合物佐劑化的100yg/劑的重組亨德拉病毒可溶 性糖蛋白（sG);用鹽水溶液將體積調(diào)整到lml/劑。
[0100] 測試疫苗2:用250yg的免疫刺激復合物佐劑化的50yg/劑的重組亨德拉病毒可溶 性糖蛋白（sG);用鹽水溶液將體積調(diào)整到lml/劑。
[0101] 測試疫苗3:用250yg的免疫刺激復合物佐劑化的5yg/劑的重組亨德拉病毒可溶性 糖蛋白（sG);用鹽水溶液將體積調(diào)整到lml/劑。
[0102] 已經(jīng)從兩批接受了含有更高水平的抗原(50yg/劑和lOOyg/劑)的疫苗的馬收集到 來自馬的血清學和攻擊保護數(shù)據(jù)。
[0103] 血清學：各自用相隔21天的兩次疫苗劑量（lOOyg sG/ISC)對兩匹馬進行免疫接 種。初免后和攻擊前的血清學確認了疫苗誘導的向HeV的血清轉(zhuǎn)化(表1)。攻擊前病毒中和 抗體水平與已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在暴露于原本致死劑量的密切相關的尼帕病毒的貓中具有保護性 的水平相當。僅接受佐劑的馬（陰性對照)沒有在病毒攻擊之前產(chǎn)生針對HeV的抗體。 表1
[0104] 因此，使每一匹馬在接受加強免疫接種后的27天時在BSL4容納設施中暴露于活的 HeV。鼻內(nèi)（1 X 106TCID5Q)和經(jīng)口（1 X 106TCID5Q)施用病毒。在攻擊時以及在之后的觀測時間 段內(nèi)，參與這一部分工作的工作人員不知道對照馬的身份。
[0105] 對于VI的臨床觀測結(jié)果:這匹馬在暴露于HeV后的觀測期間在臨床上保持良好，除 了在攻擊后第8天時注意到留置頸靜脈導管的進入部位有局部感染。這與疾病的任何全身 體征無關。在病毒攻擊后的第9天使所述馬擇期安樂死。在肉眼死后檢查時的異常局限于 l〇cm腸系膜脂肪瘤(偶然發(fā)現(xiàn)）以及歸因于巴比妥酸鹽(barbiturate)的在左心肺葉的腹側(cè) 尖端處淋巴管的輕度擴張。對組織的初始篩選沒有在這匹馬中發(fā)現(xiàn)損傷或HeV抗原的跡象。
[0106] 對于V2的臨床觀測結(jié)果:這匹馬在第3天時產(chǎn)生輕度的短暫鼻涕，但是然后在其它 方面保持良好直到在第6天時體溫升高為止，所述體溫升高與她的留置頸靜脈導管部位處 局部炎癥反應相關。將導管去除，但是損傷繼續(xù)擴大并且這匹馬變得非常煩躁，因此在第二 天(第7天)時，將這匹母馬用長效青霉素治療。在第8天時，她的體溫和她的性情已經(jīng)恢復正 常，并且將她擇期安樂死。在肉眼死后檢查時的異常局限于歸因于巴比妥酸鹽的在右心肺 葉的腹側(cè)尖端處淋巴管的輕度擴張。對組織的初始篩選沒有在這匹馬中發(fā)現(xiàn)損傷或HeV抗 原的跡象;詳細檢查當前正在完成。
[0107] 對于V3的臨床觀測結(jié)果:這匹馬在第4天時產(chǎn)生輕度的短暫鼻涕，但是然后在其它 方面保持良好直到在第6天時體溫升高為止而沒有局部體征。她的心率也已經(jīng)升高，并且她 有符合輕度脫水的輕微的皮膚皺折和腹上提(tucked-up)外觀。這一系列體征是在我們的 實驗室條件下急性He V感染的典型。在隨后的12小時內(nèi)她的體溫和心率繼續(xù)增加（圖1和圖 2 )，她略微抑郁，因此在第7天時基于人道理由使她安樂死。在死后檢查時，在肺的心葉上存 在淋巴管的中度嚴重擴張，腹側(cè)8cm-10cm受累，伴有胸膜增厚和水腫。
[0108] 在組織學檢查時，存在肺血管炎，伴有血管壁纖維素樣壞死、小葉間隔水腫以及局 灶性壞死性肺泡炎。在以下各項中存在HeV抗原的廣泛沉積:肺中血管的內(nèi)皮和中膜;腦膜； 腦實質(zhì);三叉神經(jīng)節(jié);下頌下、支氣管、腹股溝以及腎臟淋巴結(jié);脾臟;肝臟;心臟;軟腭；腎上 腺；腎小球;小腸和大腸;卵巢;咽和鼻甲；以及脾中的生發(fā)中心和偶爾的心肌細胞。脊髓、咽 鼓管囊、膀胱、以及腦的嗅極呈陰性。組織學和免疫組織學符合超急性HeV感染。
[0109] 對臨床樣品的分子分析:在整個臨床觀測期間在從接受免疫接種的馬VI和V2采集 的任何生物樣品中不存在HeV脫落的跡象。確切地說，在暴露后的任何一天從深鼻拭子或從 血液均沒有回收到基因組。
[0110]相比之下，在沒有接受免疫接種的馬V3中，從攻擊后的第3天開始，在鼻拭子中檢 測到病毒基因組。在連續(xù)的采樣日Ct值遞減表明上呼吸道中的病毒復制，并且符合早先來 自我們實驗室的在使首次接受實驗的馬暴露于HeV(雷德蘭茲(Redlands)2008)后的觀測結(jié) 果。在即將開始發(fā)熱之前在血液中以及之后在所有的分泌物中發(fā)現(xiàn)病毒基因組符合對其它 臨床體征(如抑郁癥)的最早識別，這也符合早先的觀測結(jié)果。 表2:在攻擊階段期間的樣品分析結(jié)果

從攻擊日開始獲取樣品直到使動物安樂死當天為止并且通過針對亨德拉病毒N基因的 存在所測定的TagMan PCR對樣品進行分析。-意指陰性(沒有擴增），+/-意指不確定(CT = 40-45)，+意指陽性(CT〈40,值在括號中），N/A =結(jié)果不可得
[0111] 死后樣品:TaqMan PCR(HeV N基因）確認了在V3(對照）中攻擊病毒的復制，伴有感 染向多個組織的播散(表3)。最高的復制水平似乎存在于肺、脾臟、腎臟、心肌、以及與上呼 吸道和下呼吸道相關的淋巴組織中，如先前所報告。在接受免疫接種的馬(VI和V2)的組織 中不存在病毒復制的跡象。 表3:亨德拉病毒N基因 TagMan結(jié)果
從母一 Μ動物獲取兆后組織樣品開Μ通迓針對亨徳拉柄毐N基因的仔在所測足的 TagMan PCR對樣品進行分析。-意指陰性(沒有擴增），+/-意指不確定(CT = 40-45)，+意指陽 性(CT〈40,值在括號中），ND =未進行，以及N/A=由于缺少樣品而結(jié)果不可得
[0112]攻擊后血清學:接受免疫接種的馬VI和V2在HeV攻擊后沒有滴度升高(表4)。這符 合在這些動物中攻擊病毒沒有顯著復制。在對照馬V3中，在攻擊后第7天安樂死時，沒有檢 測到抗體。認為在這一動物的病毒暴露與死亡之間的時間不足以產(chǎn)生可檢測的抗體，并且 這符合我們的實驗室用HeV(雷德蘭茲)在馬中所得到的先前的觀測結(jié)果。 表4 L〇113」 以初免-加強免疫萬案接柙/l〇〇yg
sG+ISC佐刑的網(wǎng)匹與（VI和V2)在HeV暴露之 前向HeV進行血清轉(zhuǎn)化。僅接受ISC的一匹馬(V3)保持對攻擊病毒呈血清陰性。
[0114] 在用原本致死劑量的HeV攻擊后，接受免疫接種的馬在整個觀測期間在臨床上保 持良好，這超過了所有在馬中以實驗方式誘導的HeV病例的發(fā)病時間。使沒有血清學免疫力 跡象的馬(V3)在產(chǎn)生符合急性HeV的臨床體征后安樂死。在接受免疫接種的馬中在攻擊后 沒有檢測到抗體滴度的提高，這符合在這些動物中攻擊病毒沒有復制。
[0115] 不存在接受免疫接種的馬脫落病毒的跡象，如由對所有每日臨床樣品所獲得的 PCR陰性測試結(jié)果所反映。在沒有接受免疫接種的對照中，從暴露于病毒后的第3天開始在 鼻拭子中、在即將開始發(fā)熱之前在血液中、以及從產(chǎn)生發(fā)熱之時起在所有的臨床樣品中檢 測到病毒基因組。這種脫落模式符合在該設施處在早先的研究中在暴露于HeV的首次接受 實驗的馬中所發(fā)現(xiàn)的模式。
[0116] 在將被預期是急性感染期的期間實施安樂死后，在死后檢查時所采集的接受免疫 接種的馬的任何組織中沒有HeV病毒復制的跡象。相比之下，HeV基因組和抗原以符合急性 HeV感染的模式分布于對照馬的組織各處，并且還鑒定出HeV感染典型的血管病變。 實施例8:在馬中進行的第二次臨床試驗
[0117] 各自用相隔21天的兩次疫苗劑量(50yg sG/ISC)對三匹馬進行免疫接種。初免后 和攻擊前的血清學確認了疫苗誘導的向HeV的血清轉(zhuǎn)化(表5)。攻擊前病毒中和抗體水平與 已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)在暴露于原本致死劑量的密切相關的尼帕病毒的貓中以及在本文所述的第一 次臨床試驗中對暴露于HeV的馬具有保護性的水平相當。在對接受免疫接種的馬進行病毒 攻擊之前，僅接受佐劑的馬沒有產(chǎn)生針對HeV的抗體(數(shù)據(jù)未示）。 表5
[0118] 因此，使每一匹接受免疫接種的馬在接受加強免疫接種后的27天時在BSL4容納設 施中暴露于活的HeV。鼻內(nèi)（1 X 106TCID5Q)和經(jīng)口（1 X 106TCID5Q)施用病毒。在這一研究中使 用四只豚鼠作為致病力對照，并期望這些中的至少一只將死于HeV疾病。通過腹膜內(nèi)途徑使 豚鼠暴露于50,000 1'(：1〇5()他￥。
[0119] 對于V4的臨床觀測結(jié)果:這匹馬在暴露于HeV后觀測期間在臨床上保持良好，并且 體溫和心率保持在正常限度內(nèi)。在病毒攻擊后的第8天時使所述馬擇期安樂死。在肉眼死后 檢查時沒有注意到異常。對組織的初始篩選沒有在這匹馬中發(fā)現(xiàn)損傷或HeV抗原的跡象;詳 細檢查當前正在完成。
[0120] 對于V5的臨床觀測結(jié)果:這匹馬在暴露于HeV后觀測期間在臨床上保持良好，并且 體溫和心率保持在正常限度內(nèi)（圖2)。在病毒攻擊后的第7天時使所述馬擇期安樂死。在肉 眼死后檢查時沒有注意到異常。對組織的初始篩選沒有在這匹馬中發(fā)現(xiàn)損傷或HeV抗原的 跡象;詳細檢查當前正在完成。
[0121] 對于V6的臨床觀測結(jié)果:這匹馬在暴露于HeV后觀測期間在臨床上保持良好，并且 體溫和心率保持在正常限度內(nèi)（圖2)。在病毒攻擊后的第9天時使所述馬擇期安樂死。在肉 眼死后檢查時沒有注意到異常。對組織的初始篩選沒有在這匹馬中發(fā)現(xiàn)損傷或HeV抗原的 跡象;詳細檢查當前正在完成。
[0122] 豚鼠：4只豚鼠中有一只（3號）在HeV攻擊后的第3天時開始體重減輕。體重減輕不 斷發(fā)展直到第5天在所述動物表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)體征(歪頭、震顫)并且使它安樂死時為止。在 死后檢查時異常局限于腹膜后結(jié)締組織的水腫。
[0123] 在組織學檢查時，存在與HeV抗原的沉積相關的肺血管炎、腎周血管的血管炎、卵 巢炎、以及非化膿性腦炎。所述組織學和免疫組織學符合急性HeV感染并且確認了攻擊病毒 的致病力。
[0124] 在整個臨床觀測期間從V4、V5或V6采集的任何生物樣品中均沒有HeV脫落的跡象， 除了在第3天時來自V6的直腸拭子以外，其中在兩個重復孔中的一個中通過TaqMan PCR觀 測到36.2的Ct值(HeV N基因）而第二個孔沒有表現(xiàn)出擴增(表6)。確切地說，在暴露后的任 何一天從深鼻拭子或從血液均沒有回收到基因組。 表6:亨德拉病毒N基因 TagMan結(jié)果

從攻擊日開始獲取樣品直到使動物安樂死當天為止并且通過針對亨德拉病毒N基因的 存在所測定的TagMan PCR對樣品進行分析。-意指陰性(沒有擴增），+/-意指不確定(CT = 40-45)，+意指陽性(CT〈40,值在括號中），*結(jié)果被認為是不確定的，這是因為之前、之后的 樣品以及在同一天的其它樣品全部均呈陰性，N/A=由于缺少樣品而結(jié)果不可得
[0125]死后樣品：在接受免疫接種的馬V4、V5或V6的組織中不存在病毒復制的跡象。在一 只豚鼠（3號）中，在攻擊后的第5天時在血液(Ct 34.2)、腦、肺、以及脾臟中檢測到病毒基因 組，這證實了在這只動物中有關急性HeV感染的臨床、組織學以及免疫組織學發(fā)現(xiàn)(表7)。 表7:亨德拉病毒N基因 TagMan結(jié)果

從每一只動物獲取死后組織樣品并且通過針對亨德拉病毒N基因的存在所測定的 TagMan PCR對樣品進行分析。-意指陰性(沒有擴增），+/-意指不確定(CT 40-45)，+意指陽 性(CT〈40,值在括號中），ND =未進行，以及N/A=由于缺少樣品而結(jié)果不可得
[0126] 攻擊后血清學:接受免疫接種的馬V4、V5以及V6在HeV攻擊后沒有滴度升高(表8)。 這符合在這些動物中攻擊病毒沒有顯著復制。 表8
[0127] 以初免-加強免疫方案接種了50yg sG+ISC佐劑的三匹馬(V4、V5以及V6)在HeV暴 露之前向HeV進行血清轉(zhuǎn)化。僅接受ISC的一匹馬保持對攻擊病毒呈血清陰性。
[0128] 在用原本致死劑量的HeV攻擊后，接受免疫接種的馬在整個觀測期間在臨床上保 持良好，這超過了所有在馬中以實驗方式誘導的HeV病例的發(fā)病時間。使用作致病力對照的 一只豚鼠在產(chǎn)生符合急性HeV的臨床體征后安樂死。在接受免疫接種的馬中在攻擊后沒有 檢測到抗體滴度的提高，這符合在這些動物中攻擊病毒沒有復制。
[0129] 不存在接受免疫接種的馬脫落病毒的跡象，如由對所有每日臨床樣品所獲得的 PCR陰性測試結(jié)果所反映，除了在第3天時來自V6的直腸拭子的一個重復測定以外。正在重 復這一測試;如果觀測到相似的結(jié)果，那么一種解釋是這表示低水平的殘余接種物。在一只 沒有接受免疫接種的豚鼠中，在暴露于病毒后的第5天時在主要器官和血液中檢測到病毒 基因組。
[0130] 在將被預期是急性感染期的期間實施安樂死后，在死后檢查時所采集的接受免疫 接種的馬的任何組織中沒有HeV病毒復制的跡象。相比之下，HeV基因組和抗原以符合急性 HeV感染的模式分布于易感豚鼠的組織各處，并且還在這只動物中鑒定出HeV感染典型的血 管病變。 實施例9:評價使用亨德拉病毒疫苗對馬進行的替代性疫苗接種方案
[0131] 將3個月大或年齡更大的健康的馬招收到這一試驗中。研究組如表9中所概述。 表9
*對于研究的其余部分，至少每隔一天進行一次總體健康觀測。
[0132] 在第0天時在疫苗接種之前從所有馬采集血液以確認先前沒有暴露于馬亨德拉病 毒。此外，在第80天和第91天時采集血液樣品。通過使用經(jīng)過驗證的實驗室程序進行血清中 和測定來評估對針對亨德拉病毒的抗體的檢測。
[0133] 在指定的研究日用IVP對馬進行疫苗接種。所述IVP由用250yg/劑的免疫刺激復合 物（ISC)佐劑化的116yg經(jīng)過γ輻照的亨德拉病毒可溶性G蛋白（SG)組成。疫苗的劑量是每 一次每匹馬lml。
[0134] 首先將疫苗接種部位用80%乙醇擦拭以確保它是清潔的。由有經(jīng)驗的獸醫(yī)，使用 單個3ml無橡膠注射器和18G 1.5英寸的針頭進行疫苗施用。在所有情況下，根據(jù)標準獸醫(yī) 學程序，將疫苗施用到頸部左側(cè)中央的肌肉中。
[0135] 有效測試的標準被限定為：1)所有馬在第0天時疫苗接種之前在臨床上是正常的； 2)所有馬在第0天時無針對馬亨德拉病毒的抗體;3)對照組T01中的馬在整個研究過程中保 持無針對馬亨德拉病毒的抗體。
[0136] 結(jié)果:沒有動物被報告為在整個研究過程中遭受對疫苗的不良反應。對于處理組 T02，所有動物對疫苗作出反應，從而在第80天時實現(xiàn)256或更大的血清中和滴度(SNT)以及 在第91天時實現(xiàn)64或更大的SNT。對于處理組T03,所有動物也對疫苗作出反應，從而在第80 天時實現(xiàn)256或更大的SNT以及在第91天時實現(xiàn)32或更大的SNT。最終，對于處理組T04,所有 動物也對疫苗作出反應，從而在第80天時實現(xiàn)512或更大的SNT以及在第91天時實現(xiàn)128或 更大的SNT。
[0137] 總之，處理組T02、T03以及T04中的所有動物均對疫苗作出反應，從而在第80天時 實現(xiàn)256至>1024的SNT以及在第91天時實現(xiàn)32至2048的SNT。這些結(jié)果表明使馬亨德拉病毒 疫苗的疫苗接種時間間隔從相隔3周施用2次劑量(Τ02)到相隔6周施用2次劑量(Τ03)或相 隔4周施用3次劑量(Τ04)變動使得到最后一次劑量被遞送后的約3周（24天)時產(chǎn)生對抗馬 亨德拉病毒的血清中和抗體反應?；谄渲旭R在相隔3周的2次疫苗接種后受到攻擊并且受 到保護的早先功效研究，在當前研究中在第80天和第91天時在所有三個疫苗接種組(Τ02、 Τ03以及Τ04)中所測量的SNT將預期同樣具有對抗馬亨德拉病毒的保護性。 實施例10:亨德拉病毒疫苗在馬中免疫的持續(xù)時間
[0138] 僅將5歲-14歲大的在臨床上健康的馬招收到所述研究中。此外，使用以下標準來 選擇用于這一攻擊研究的馬：身體適應性(總體健康、心肺功能、馬蹄和四肢的完整性）；性 情；以及攻擊前低抗體滴度。所述研究的設計示于表10中。 表10
*從第219天開始沒有從一匹馬采集血液樣品。
[0139] 由于有關容納設施的限制、與有人類使用活病毒和受感染(未被接種疫苗）的馬進 行工作相關的風險、以及動物福利考慮的制約，這一研究僅利用了一組非常少的動物，而在 研究的攻擊階段期間沒有目標動物(馬)對照。先前涉及用亨德拉病毒攻擊未被接種疫苗的 馬的實驗工作已經(jīng)一致地證實了所述攻擊模型的有效性，并且隨后已經(jīng)成功地利用雪貂作 為致病力對照。在這一研究中使用相同的實驗設計，在攻擊階段期間使用2只雪貂作為對照 以確認攻擊病毒的致病力。通過口鼻途徑使每一只雪貂暴露于50,000TCID5QHeV。向雪貂對 照施用的攻擊病毒與向馬施用的攻擊病毒相同。
[0140] 對于攻擊，制備馬亨德拉病毒在組織培養(yǎng)上清液中的有病毒的溶液。將病毒培養(yǎng) 物培養(yǎng)在Vero細胞中。在攻擊當天早晨，根據(jù)以下程序制備攻擊物質(zhì):將儲備亨德拉病毒在 組織培養(yǎng)上清液中的等分部分從-80°C取出，解凍，并且適當稀釋以提供攻擊接種物。保留 接種物的等分部分以進行反滴定以確認所施用的接種物的滴度。將接種物保持在濕冰上直 到向?qū)嶒炗民R和致病力對照（雪紹)施用為止。向馬鼻內(nèi)（以1X106TCID5Q為目標)和經(jīng)口（以 1 X 106TCID5〇為目標)施用攻擊病毒。
[0141 ]在暴露于馬亨德拉病毒之前從馬采集血液。此外，在第21天、第42天、第56天、第84 天、第120天、第136天以及第178天采集血液樣品以確定在疫苗接種后針對HeV的抗體水平。 從攻擊當天(第218天)開始，每天或每隔一天采集血液樣品直到第226天為止。在第218天后 由于留置導管的問題而沒有從一匹馬采集血液樣品。通過使用經(jīng)過驗證的實驗室程序進行 血清中和測定來評估對針對亨德拉病毒的抗體的檢測。
[0142] 在攻擊前的2天(第216天和第217天）內(nèi)，每天兩次記錄體溫;還在攻擊當天對它們 進行記錄(在攻擊前一次，以及在4小時-5小時后再一次）；然后每天兩次記錄體溫直到每一 匹馬安樂死當天為止。
[0143] 每天對馬進行觀測長達4小時-5小時，并且每天兩次記錄心率和臨床體征(攻擊前 一次，攻擊后的4小時-5小時之時一次，然后之后每天兩次）。
[0144] 在第218天(攻擊前)對所有馬獲取鼻拭子、口腔拭子以及直腸拭子樣品以用于病 毒鑒定和分離，然后每天獲取這些樣品一次直到每一匹馬安樂死為止。在每一個采樣日，還 從每一匹馬的馬圈采集尿液和糞便。
[0145] 在攻擊后的第7天、第8天以及第9天(第225天、第226天以及第227天)使馬擇期安 樂死，并且在它們的馬圈內(nèi)進行驗尸。如上文所述采集拭子樣品，并且采集組織樣品以用于 病毒學和組織病理學。對所有的主要器官系統(tǒng)進行采樣，其中特別關注腦、呼吸道以及淋巴 系統(tǒng)。
[0146] 結(jié)果:對攻擊接種物進行的反滴定確認馬各自接受了3.06 X 106TCID5Q，并且雪貂 各自接受了 5.87 X 105TCID5Q的亨德拉病毒。
[0147] 有效測試的標準被限定為在雪貂致病力對照中的一只或多只中在研究的每一個 攻擊階段后產(chǎn)生符合急性HeV感染的臨床體征、以及組織學/免疫組織學發(fā)現(xiàn)。這一標準得 到滿足，這是因為在研究的這個階段中這兩只雪貂均死于急性HeV感染。主要結(jié)果標準是在 受到攻擊的馬中產(chǎn)生符合急性亨德拉病毒感染的臨床疾病或相反。
[0148] 表11和表12列出了被招收到這一研究中的三匹馬的HeV血清中和抗體滴度。所述 表中的天數(shù)是從疫苗的第一次給藥之時(第〇天)起計數(shù)的。 表11
[0149] 所有動物在死后檢查時在肉眼上是正常的，并且在任何馬中在對以下各項檢查時 沒有檢測到組織學損傷:脾臟、肝臟、心臟、腎臟(皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎盂）、膀胱、淋巴結(jié)(包括頭部 的淋巴結(jié)）、肺、腎上腺(皮質(zhì)和髓質(zhì)）、脊髓(2個水平）、大腸、小腸、卵巢、垂體、三叉神經(jīng)節(jié)、 腦(所有主要區(qū)域，包括嗅球）、咽鼓管囊、咽以及鼻甲。
[0150] 沒有動物被報告為在整個研究過程中遭受對疫苗的不良反應。
[0151] 總之，在加強(第二次)疫苗接種后的197天時對三匹馬進行攻擊，并且分別在攻擊 后的第7天、第8天以及第9天時使它們擇期安樂死。所有馬在觀測期間在臨床上保持良好， 并且沒有觀測到心率和體溫上升超出正常限度。
[0152] 在攻擊后從3匹馬中的2匹采集的血液樣品的血清學顯示滴度沒有提高，這符合在 這些被接種疫苗的動物中沒有顯著的病毒復制(表12)。由于留置導管所遇到的問題而沒有 從第三匹馬(#V12)采集血液。
[0153]在暴露于HeV后的任何時間點沒有從自靜12和靜14所采集的任何臨床樣品中回收 到亨德拉病毒基因組(N基因）；在攻擊后的第2天、第3天、第4天以及第7天時，在來自靜13的 鼻拭子樣品中發(fā)現(xiàn)低水平的基因組，但是在安樂死當天沒有發(fā)現(xiàn)。沒有從任何臨床樣品中 重新分離出病毒，包括顯示出低拷貝數(shù)的HeV N基因的鼻拭子在內(nèi)。顯然，與首次接受實驗 的對照動物相比，在被接種疫苗的馬的上呼吸道中的病毒復制要低得多。
[0154] 在死后檢查時所有動物在肉眼上都是正常的，并且在檢查所采集的組織時在任何 馬中沒有檢測到組織學損傷。在從任何馬中采樣的任何組織中均沒有檢測到HeV抗原。這些 免疫組織病理學發(fā)現(xiàn)還得到了Tagman qPCR結(jié)果的支持，這是因為在死后檢查時從這三匹 馬中的任一匹所采集的任何組織中沒有回收到HeV基因組(數(shù)據(jù)未示）。
[0155] 綜上所述，在疫苗接種后的約6個月時受到馬亨德拉病毒的活的毒株攻擊的馬受 到保護而防止亨德拉病毒感染的臨床體征。這確認了通過相隔21天的兩次劑量的HeVsG疫 苗所賦予的免疫的持續(xù)時間是至少197天(約6個月）。 實施例11:在靈長類動物中針對尼帕病毒進行的臨床試驗
[0156] 統(tǒng)計:在生物安全等級4(BSL_4)上進行動物研究，特別是非人類靈長類動物研究 嚴重限制了動物受試者數(shù)、可以獲得的生物樣品的體積以及獨立地重復測定的能力并且因 此限制了統(tǒng)計分析。因此，以由重復樣品而非重復測定計算的平均值或中值形式呈現(xiàn)數(shù)據(jù)， 并且誤差棒表示重復樣品間的標準差。
[0157] 病毒:NiV-馬來西亞(NiV_Malaysia)(基因庫保藏號:AF212302)是從喬治亞州亞 特蘭大的疾病控制和預防中心（Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,Georgia)的特殊病原體部門（Special Pathogens Branch)獲得的。如Rockx等 (2010) J. Virol. 84，9831中對于HeV所述使NiV在Vero細胞上繁殖和滴定。
[0158] 疫苗制劑：使用sGHeV的三種疫苗制劑（10yg、50yg或100yg)。如先前在Pallister (2011) Vaccine 29,5623中所述對sGHeV進行產(chǎn)生和純化。每一種疫苗制劑還含有 Allhydrogel?(Accurate Chemical&Scientific公司）和含有完全硫代磷酸酯骨架的CpG寡 脫氧核苷酸(0DN)2006(InViV〇Gen公司）。如下配制疫苗劑量，所述疫苗劑量含有固定量的 0DN 2006、不同量的sGHeV以及鋁離子（以1:25的重量比）：100yg劑量：100yg sGHeV、2.5mg 鋁離子以及150yg的0DN 2006;50yg劑量：50yg sGHeV、1.25mg鋁離子以及150yg的0DN 2006;以及10yg劑量：5yg sGHeV、250yg鋁離子以及150yg的0DN 2006。對于所有劑量，在添 加 ODN 2006之前首先將Alhydrogel?和sGHeV混合。用PBS將每一個疫苗劑量調(diào)整到lml并且 在注射前將混合物在旋轉(zhuǎn)輪上在室溫下孵育至少兩小時至三小時。每一個受試者針對初免 和加強免疫接受同樣的lml劑量并且經(jīng)由肌內(nèi)注射給予所有的疫苗劑量。
[0159] 動物：將重4kg_6kg的十只年輕的成年非洲綠猴(AGM) (Chlorocebus aethiops) (三泉科技公司（Three Springs Scientific Inc·))單獨籠養(yǎng)。在第-42天(初免)和第-21 天(加強免疫)時通過肌內(nèi)注射氯胺酮（l〇mg/kg-15mg/kg)使受試者麻醉并且用sGHeV進行 疫苗接種。三個受試者接受兩次l〇yg劑量(AGM 16、AGM 17、AGM 18)，三個受試者接受兩次 50yg 劑量(AGM 13、AGM 14、AGM 15)，三只動物接受兩次 100yg 劑量(AGM 10、AGM 11、AGM 12)并且一個受試者(AGM 9)接受單獨的佐劑。在第0天時，使受試者麻醉并且用于4ml杜氏 最低必需培養(yǎng)基(Dulbecco's minimal essential medium，DMEM)(西格瑪-奧德里奇公司 (Sigma-Aldrich))中的1X105TCID5Q(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量）的NiV進行氣管內(nèi)接種。在感 染后(P.i.)的第〇天、第3天、第5天、第7天、第10天、第14天、第21天以及第28天使受試者麻 醉以進行臨床檢查，包括體溫、呼吸速率、胸部X光照片、抽血以及鼻、口腔和直腸粘膜拭子。 在感染后的第10天時，根據(jù)獲得批準的人道終點不得不使對照受試者(AGM 9)安樂死。所有 其它受試者繼續(xù)生存直到研究結(jié)束為止，并且在感染后的第28天時安樂死。在驗尸時，采集 各種組織以用于病毒學和組織病理學。所采樣的組織包括:結(jié)膜、扁桃體、口咽/鼻咽、鼻粘 膜、氣管、右支氣管、左支氣管、右肺上葉、右肺中葉、右肺下葉、左肺上葉、左肺中葉、左肺下 葉、支氣管淋巴結(jié)(LN)、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腎上腺、胰腺、空腸、橫結(jié)腸、腦(額葉）、腦 (小腦）、腦干、頸脊髓、腦下垂體、下頌LN、唾液LN、腹股溝LN、腋窩LN、腸系膜LN、膀胱、睪丸 或卵巢、股骨骨髓。在BSL-2容納設施下進行疫苗接種。疫苗接種方案、攻擊以及生物樣品采 集日的時間線示于圖4中。
[0160]疫苗接種和NiV攻擊:先前，我們已經(jīng)證實了用105TCID5Q(半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量） 的NiV對AGM進行氣管內(nèi)接種會引起均一致命的結(jié)果(Rockx等(2010) J. Virol. 84,9831)。在 這些研究中注意到快速進行性臨床疾??；臨床體征包括重度抑郁、導致急性呼吸窘迫的呼 吸道疾病、重度神經(jīng)病以及嚴重降低的靈活性;并且達到獲得批準的安樂死人道終點標準 的時間在7天至12天的范圍。在此，我們試圖確定用sGHeV進行疫苗接種在AGM中是否可以預 防NiV感染和疾病。如方法中所述將10yg、50yg或100yg劑量的sGHeV與明礬和CpG部分混合。 在第〇天時（初免)并且再次在第21天時（加強免疫）向三個受試者皮下施用每一種疫苗制 劑，并且一個對照受試者(AGM 9)在同樣的那些天接受單獨的佐劑以進行初免和加強免疫。 在第42天時，用105TCID5QNiV對所有受試者進行氣管內(nèi)接種。對照受試者(AGM 9)在晚期疾 病時顯示出食欲不振、嚴重的持續(xù)行為變化(抑郁、活動減少、駝背姿勢）、血小板數(shù)減少以 及呼吸速率逐漸增加。隨后，AGM 9在感染后的第10天時產(chǎn)生急性呼吸窘迫并且根據(jù)獲得批 準的人道終點不得不使其安樂死。相比之下，被接種疫苗的受試者中無一者患有臨床疾病 并且全部均存活直到研究結(jié)束為止?？ㄆ仗m-邁耶存活率圖表示于圖5中。
[0161]在對照受試者中NiV介導的疾病:對照受試者中的肉眼病理變化與先前在感染了 NiV的AGM中所發(fā)現(xiàn)的那些一致(Geisbert等（2010)PL〇S One 5，el0690)。存在脾腫大和腦 表面上的血管充血并且所有的肺葉均是濕而重的。沒有從AGM 9血液樣品中回收到NiV RNA 和感染性病毒并且不存在病毒血癥的跡象。AGM 9具有顯著水平的NiV特異性IgM以及可檢 測的NiV特異性IgG和IgA。對組織樣品進行的進一步分析揭示了廣泛的NiV組織嗜性，這類 似于先前在AGM中所看到的廣泛分布的NiV感染(Geisbert等（2010)PL〇S One 5，el0690)〇 AGM 9在如所示的大部分組織中具有NiV RNA并且從許多組織中回收到感染性病毒。顯著損 傷包括間質(zhì)性肺炎、亞急性腦炎以及脾白髓的壞死和出血。肺泡腔被水腫液、纖維蛋白、核 破裂和細胞碎片、以及肺泡巨噬細胞充滿。多灶性腦炎的特征在于魏-羅二氏隙(Virchow- Robins space)被中等數(shù)目的淋巴細胞和較少的中性粒細胞擴充。更少數(shù)目的這些炎癥細 胞擴展到相鄰的實質(zhì)中。許多神經(jīng)元膨脹并且形成空泡（變性)或支離破碎而伴有核溶解 (壞死）。脾白髓中的脾小結(jié)的多灶性生發(fā)中心被出血和纖維蛋白以及少數(shù)的中性粒細胞和 細胞碎片以及核破裂碎片而隱沒。這些發(fā)現(xiàn)符合脾中生發(fā)中心的壞死和喪失。大量的病毒 抗原存在于腦干中，突出了在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NiV所導致的廣泛損害。
[0162] 對接受sGHeV疫苗接種的受試者的保護:包括在攻擊后所采集的所有血液樣品以 及在驗尸時所采集的所有組織在內(nèi)的所有生物樣品均呈NiV RNA陰性，并且沒有從任何樣 品中分離出感染性病毒。在仔細檢查來自被接種疫苗的受試者的組織切片時，組織結(jié)構(gòu)似 乎是正常的并且使用免疫組織化學技術在任何組織中均沒有檢測到NiV抗原。為了進一步 剖析疫苗所引出的保護機制，在被接種疫苗的動物中測量血清和粘膜sGNiV特異性和sGHeV 特異性IgM、IgG和IgA以及NiV和HeV血清中和滴度。如在圖6中所示，在攻擊前七天時，接受 最低sGHeV劑量的受試者具有可檢測的抗原特異性血清IgM以及最高水平的sGHeV特異性血 清IgG。接受了50yg sGHeV的受試者在攻擊前七天時也具有可檢測水平的血清IgM以及它們 最高水平的血清IgG。在第-7天時，與其它兩組相比，高劑量受試者沒有可檢測的血清IgM并 且血清IgG水平顯著更低。直到NiV攻擊當天，高劑量受試者的血清IgG水平升高并且所有被 接種疫苗的受試者具有相似的IgG水平。在NiV攻擊后，在任何受試者中，血清IgM水平都沒 有變化。中劑量受試者的血清IgG水平在NiV攻擊當天降低，并且低劑量受試者的IgG水平在 NiV攻擊后立即降低。有趣的是，這兩組的IgG水平到感染后的第3天和第5天時升高，但是從 未超過在攻擊前七天所存在的IgG水平并且在這兩組中，到感染后第28天時滴度均顯著減 少。
[0163] 相反，高劑量組的血清IgG水平保持較高并且在感染后第28天時處于它們的最高 水平。在接種疫苗后在所有受試者中，抗原特異性血清IgA均是可檢測的；然而，水平非常 低，并且攻擊前水平和攻擊后水平似乎沒有顯著差異（圖6)。在感染后的第14天時在來自低 劑量受試者的鼻拭子中檢測到粘膜抗原特異性IgA的最小程度增加，然而，所述水平如此低 以至于這些粘膜抗體在防止NiV在攻擊后的擴散中可能沒有起作用。來自血清中和測試 (SNT)的結(jié)果示于表9中。對于所有的被接種疫苗的受試者，HeV特異性中和滴度到感染后第 28天時仍相同或減少，并且NiV特異性中和滴度到感染后的第7天時沒有顯著變化，甚至是 在攻擊前具有最低滴度的受試者中也是如此。一個低劑量受試者和一個高劑量受試者到感 染后的第14天時NiV SNT滴度有對數(shù)增加，并且一個中劑量受試者到感染后的第21天時NiV SNT滴度有對數(shù)增加。對于所有其它被接種疫苗的動物，SNT滴度的變化是不一致的（滴度將 增加，然后減少)或不顯著的(滴度增加到3倍-4倍，但不超過對數(shù)）。最終，在NiV攻擊后在被 接種疫苗的受試者中測量向NiV融合(F)包膜糖蛋白的血清轉(zhuǎn)化。分別在感染后的第10天和 第21天時，在低劑量受試者和中劑量受試者中檢測到最低水平的血清抗NiV F IgM，并且這 些低的M. F. I.值表明在NiV攻擊后弱的初次抗體反應。在高劑量受試者中沒有檢測到血清 抗NiV-F IgM，這表明這些動物在攻擊后有很少到?jīng)]有循環(huán)病毒。
實施例12:在靈長類動物中針對亨德拉病毒進行的臨床試驗
[0164] 在AGM中進行第二次臨床試驗以評估用亨德拉病毒進行的疫苗接種和攻擊。使用 與實施例9中所述的制劑相同的制劑作為疫苗，但是還與接受sGHeV和單獨作為佐劑的 Alhydr〇gelTM(不存在0DN 2006)的另一組相比較。將動物在第-21天時接種疫苗，在第0天時 加強免疫，并且在第21天時接受攻擊。除非另外指明，否則所有條件與實施例7中的那些相 同。實驗概述如下：
[0165] 結(jié)果:在用105TCID5q的亨德拉病毒進行氣管內(nèi)接種后，這兩組(A和B)中的所有動 物(n = 4)在經(jīng)歷亨德拉病毒攻擊后存活。對照受試者在第8天時死亡。在被接種疫苗的受試 者中的任一個中均沒有觀測到臨床疾病，并且它們保持健康并且良好直到研究終點為止。
[0166] 通過考慮本說明書和實施本文所公開的發(fā)明，本發(fā)明的其它實施方案和用途對于 本領域技術人員來說將是顯而易見的。本文所引用的所有參考文獻，包括所有的出版物、美 國和外國專利和專利申請均具體并完全以引用方式并入本文。本說明書和實施例僅意圖被 認為具示例性，而本發(fā)明的真實范圍和精神由以下權(quán)利要求書所表明。
【主權(quán)項】
1. 一種施用免疫原性組合物的方法，所述免疫原性組合物包含亨德拉病毒G糖蛋白和/ 或尼帕病毒G糖蛋白、免疫刺激復合物（ISC)以及一種或多種賦形劑，其中分多次劑量施用 所述免疫原性組合物，進一步其中首次劑量之后是在所述首次劑量后的至少約二十一天至 約四十二天時給予的第二次劑量。2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述首次劑量之后是在所述首次劑量后的二十八天 時給予的第二次劑量，進一步后面是在所述第二次劑量后的二十八天時給予的第三次劑 量。3. 如權(quán)利要求1或2中任一項所述的方法，其中在所述最后一次劑量后的六個月時施用 加強劑量。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其中在所述加強劑量后的一年時施用另外的劑量。5. 如權(quán)利要求1至4中任一項所述的方法，其中每一次劑量含有約50yg或約lOOyg的可 溶性亨德拉病毒G糖蛋白。6. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述受試者是人類、馬、母牛、綿羊、豬、 山羊、雞、狗或貓。7. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述G糖蛋白來自亨德拉病毒。8. 如權(quán)利要求1至5中任一項所述的方法，其中所述G糖蛋白來自尼帕病毒。
【文檔編號】A61K39/155GK105828836SQ201480068468
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2014年12月15日
【發(fā)明人】N·愛德華茲, J·黃, M·韋爾林
【申請人】碩騰服務有限責任公司