專利名稱：一種提取動(dòng)物組織樣品中病原核酸的試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種動(dòng)物組織樣品中攜帶病原核酸的提取試劑。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，甲型Hmi流感、禽流感等烈性人畜共患病在世界上呈現(xiàn)爆發(fā)性流行，在國(guó)內(nèi)已經(jīng)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失，而且時(shí)刻威脅著國(guó)人的健康；非洲豬瘟、裂谷熱等動(dòng)物疫病已經(jīng)逼近國(guó)境，尼帕病毒、裂谷熱等新的動(dòng)物源性人畜共患病在我國(guó)周邊國(guó)家時(shí)有爆發(fā)等等。這一系列跨國(guó)境傳播的潛在動(dòng)物疫病，給我國(guó)防范高風(fēng)險(xiǎn)動(dòng)物疫病在國(guó)內(nèi)流行提出了嚴(yán)峻的考驗(yàn)。與此同時(shí)，隨著我國(guó)外交外貿(mào)事業(yè)的發(fā)展，進(jìn)出境動(dòng)物及動(dòng)物產(chǎn)品數(shù)量逐年增多，為防止口岸動(dòng)物疫情傳入傳出，保障我國(guó)畜牧業(yè)生產(chǎn)安全以及國(guó)民身體健康，提高我國(guó)動(dòng)物及其動(dòng)物產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)能力和適應(yīng)“快檢快放”大通關(guān)的需求，提高動(dòng)物疫病口岸檢出率，從而提高我國(guó)檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)的檢疫把關(guān)能力非常必要。目前，對(duì)動(dòng)物疫病的檢測(cè)主要依據(jù)的是分子生物學(xué)的技術(shù)，而分子生物學(xué)的基礎(chǔ)是核酸抽提。其中酚抽提法、異丙醇沉淀法、甲酰胺裂解法及TriZol法是比較經(jīng)典的核酸抽提方法，目前很多方法的改進(jìn)都是在這些方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行的，前面三種方法均是利用蛋白酶K和十二烷基硫酸鈉(SDQ消化破碎細(xì)胞，而TriZol法是用異硫氰酸胍消化破碎細(xì)胞。細(xì)胞破碎后甲酰胺法是利用高濃度的甲酰胺解聚蛋白質(zhì)與DNA的結(jié)合，然后利用透析來(lái)處理DNA樣品，但其它三種方法則是先用酚/氯仿去除蛋白質(zhì)，再分別用乙醇或異丙醇沉淀DNA。這些經(jīng)典方法獲得的核酸純度比較高，基本能滿足后續(xù)PCR及酶切等各種試驗(yàn)的要求，但存在很多缺陷一是整個(gè)操作過(guò)程用時(shí)長(zhǎng)，消化破碎細(xì)胞需放置2-3個(gè)小時(shí)或過(guò)夜； 二是操作繁瑣，需酚等有機(jī)試劑反復(fù)抽提以除去蛋白，且Trizol法還需要低溫4°C離心 ’三是缺少能夠更好的配合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP)等口岸核酸快速檢測(cè)技術(shù)的簡(jiǎn)便快速的核酸提取方法；四是提取效率受限，不能滿足實(shí)驗(yàn)室核酸提取的精準(zhǔn)要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)單、安全、快速的動(dòng)物組織樣品中攜帶病原核酸的提取試劑，以克服上述不足。本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用上述試劑提取動(dòng)物組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)液中病原核酸的方法。異硫氰酸胍是一種白色結(jié)晶性粉末，有刺激性，對(duì)光敏感，溶于乙醇和水，熔點(diǎn) 118°C。用于變性裂解細(xì)胞和提取RNA和DNA，且無(wú)RNA酶和DNA酶活性。檸檬酸鈉為無(wú)色或白色結(jié)晶顆?；蚪Y(jié)晶性粉末，無(wú)嗅、味咸、涼、易溶于水、難溶于乙醇，過(guò)熱分解，熔點(diǎn) 150°C (此溫度時(shí)失去結(jié)晶水)，溶液pH值約為8，檸檬酸鈉安全無(wú)毒，具有金屬離子絡(luò)合能力和良好的PH調(diào)節(jié)及緩沖性能，還具有優(yōu)良的緩凝性能及穩(wěn)定性能，作為抗氧化劑抗凝劑廣泛應(yīng)用于化工和醫(yī)藥行業(yè)。十二烷基肌氨酸鈉(SLQ為白色粉末，易溶于熱水，屬陰離子表面活性劑，具有優(yōu)異的滲透、洗滌、潤(rùn)濕、去污和乳化作用。本發(fā)明根據(jù)上述化學(xué)試劑的特性，研制了一種核酸的提取試劑，其配方為溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4M-6M異硫氰酸胍，20mM-25mM檸檬酸鈉，質(zhì)量百分比 0. 2% -0. 5%的 SLS。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的核酸提取試劑，其配方為溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)6M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，質(zhì)量百分比0. 5%的SLS。本發(fā)明提供了上述試劑在提取動(dòng)物組織樣本和/或細(xì)胞培養(yǎng)物中DNA和/或RNA 的應(yīng)用。本發(fā)明提供的試劑，其PH值為7-9。當(dāng)用于提取DNA時(shí)，所述試劑pH值為8-9，或，用于提取RNA時(shí)，所述試劑pH值為7。本發(fā)明提供了一種提取動(dòng)物組織樣品中攜帶的病原核酸的方法，包括如下步驟(1)動(dòng)物組織預(yù)處理；(2)裂解組織樣本在預(yù)處理后的動(dòng)物組織中加入本發(fā)明的試劑，上下顛倒混勻；(3)將樣品室溫放置10-30min后，15_25°C，13000g離心5min，去除雜質(zhì)；(4)核酸沉淀將步驟(3)的上清液轉(zhuǎn)移到新管，加入異丙醇，異丙醇加入量為步驟O)中試劑加入量的一半，來(lái)回顛倒混勻，IOOOOg離心8-lOmin，棄去上清；加75%乙醇洗滌核酸沉淀，5000g離心3min，倒去上清，室溫干燥2_;3min ；(5)加入無(wú)核酸酶的無(wú)菌水溶解核酸沉淀，55°C放置2min。。其中，步驟(1)所述的動(dòng)物組織預(yù)處理方法為勻漿或液氮研磨。其中，步驟(2)試劑的用量為30_70mg動(dòng)物組織中加入ImL本發(fā)明提供的提取動(dòng)物組織樣品中病原核酸的試劑。其中，步驟(3)所述的雜質(zhì)為未消化的組織及蛋白。本發(fā)明還提供了一種提取細(xì)胞培養(yǎng)液中病原核酸的方法，其包括如下步驟(1)加入本發(fā)明的試劑于細(xì)胞培養(yǎng)液，添加體積比為5 1 ；(2)將混合液室溫放置10-30min后，15_25°C，13000g離心5min，去除雜質(zhì)；(3)核酸沉淀將步驟O)的上清液轉(zhuǎn)移到新管，加入異丙醇，異丙醇加入量為步驟O)中試劑加入量的一半，來(lái)回顛倒混勻，IOOOOg離心8-lOmin，棄去上清；加75%乙醇洗滌核酸沉淀，5000g離心3min，倒去上清，室溫干燥2_;3min ；(4)加入無(wú)核酸酶的無(wú)菌水溶解核酸沉淀。所述加入無(wú)菌水的量與步驟O)中所加提取核酸試劑的量相同，55°C放置aiiin。本發(fā)明提供的試劑應(yīng)用于提取動(dòng)物組織樣品或細(xì)胞培養(yǎng)液中病原核酸，消化破碎細(xì)胞的時(shí)間短，15min左右，操作簡(jiǎn)單，且提取效率高。與現(xiàn)有的核酸提取方法相比，本發(fā)明提供的試劑及方法能快速的提取高質(zhì)量的核酸，能同時(shí)滿足快速和高效兩個(gè)方面，因此能夠更好的配合LAMP等快速檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)檢疫工作中。本發(fā)明中的核酸提取試劑具有簡(jiǎn)單、快速、安全的特點(diǎn)，可應(yīng)用于動(dòng)物疫病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)和口岸檢驗(yàn)檢疫。


圖1顯示的是采用本發(fā)明實(shí)施例1提供試劑提取蛤組織中派琴蟲(chóng)DNA進(jìn)行PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M.為2000bp的Marker ； 1-4.為樣品1_4的PCR的擴(kuò)增結(jié)果；陰性對(duì)照為已知未感染派琴蟲(chóng)的蛤組織DNA的PCR的擴(kuò)增結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照為派琴蟲(chóng)DNA的PCR的擴(kuò)增結(jié)果；圖2顯示的是采用Trizol法提取蛤組織中派琴蟲(chóng)DNA進(jìn)行PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M.為2000bp的Marker ； 1-4.為樣品1_4的PCR的擴(kuò)增結(jié)果；陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同圖1 ；圖3顯示的是采用本發(fā)明試劑及方法提取細(xì)胞培養(yǎng)液中口蹄疫病毒RNA進(jìn)行 RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M.為2000bp的Marker ； 1-4.為樣品1_4的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；陰性對(duì)照為未接毒細(xì)胞RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照為口蹄疫病毒RNA的RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果；圖4顯示的是采用Trizol法提取滅活口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液RNA進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M.是2000bp的Marker ； 1-4.為樣品1-4的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同圖3 ；圖5顯示的是陽(yáng)性口蹄疫模擬病料提取RNA進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中 M.是2000bp的Marker ； 1-4.為樣品1_4的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；陰性對(duì)照為已知未感染口蹄疫的組織RNA的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；陽(yáng)性對(duì)照為口蹄疫病毒RNA的RT-PCR的擴(kuò)增結(jié)果；圖6顯示的是采用Trizol法提取滅活口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液RNA進(jìn)行RT-PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中M.是2000bp的Marker ； 1-4.為樣品1-4的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果；陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照同圖5。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段， 實(shí)施例中所用的生化試劑均為市售。實(shí)施例1提取病原核酸試劑的制備1,0. 75M檸檬酸鈉(ρΗ7· 0)的配制稱取11. 03g檸檬酸鈉，加40mLddH20，用鹽酸調(diào)節(jié)PH值至7. 0，用ddH20定容至50mL，高壓滅菌。2,10% SLS的配制稱取5g SLS放入試劑瓶中，加50mL ddH20，加熱攪拌溶解，過(guò)
濾除菌，獲得濾液。3、提取病原核酸試劑的配制稱取35. 448g異硫氰酸胍放入無(wú)菌試劑瓶中，加入 1. 667mL 0. 75M檸檬酸鈉(pH7. 0)溶液，2. 5mL10% SLS。用NaOH調(diào)節(jié)pH至8. 7，用無(wú)菌水定容至50mL。各溶質(zhì)終濃度分別為6M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，0.5% SLS。常溫放置實(shí)施例2提取病原核酸試劑的制備1,0. 75M檸檬酸鈉(ρΗ7· 0)的配制同實(shí)施例1。2、10% SLS的配制同實(shí)施例1。3、提取病原核酸試劑的配制稱取異硫氰酸胍放入試劑瓶中，加入1. 533mL 0. 75M 檸檬酸鈉(ρΗ7· 00)溶液，1. 5mL10% SLS。用 NaOH 調(diào)節(jié) pH 至 7. 0，用無(wú)菌水定容至50mL。各溶質(zhì)終濃度分別為5M異硫氰酸胍，23mM檸檬酸鈉，0.3% SLS。常溫放置備用。實(shí)施例3提取病原核酸試劑的制備1,0. 75M檸檬酸鈉(ρΗ7· 0)的配制同實(shí)施例1。2、10% SLS的配制同實(shí)施例1。3、提取病原核酸試劑的配制稱取23. 632g異硫氰酸胍放入試劑瓶中，加入 1. 333mL 0. 75M(pH7. 00)檸檬酸鈉溶液，ImLlO % SLS0用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 0，用水定容至 50mL。各溶質(zhì)終濃度分別為4M異硫氰酸胍，20mM檸檬酸鈉，0. 2% SLS0實(shí)施例4蛤組織中派琴蟲(chóng)基因組的提取與PCR檢測(cè)1、提取蛤組織中的DNA的方法(1)隨機(jī)挑取4個(gè)蛤仔樣品分別稱取鰓組織50mg，用手持勻漿儀勻漿，加入ImL實(shí)施例1制得的試劑，若溶液中還有肉眼可見(jiàn)的肉塊，繼續(xù)用勻漿儀勻漿。(2)室溫放置1511^11，231，1300(^離心51^11，，棄沉淀，取上清移。(3)上清液中加0. 5mL異丙醇，23°C，IOOOOg離心lOmin，棄上清。(4) 1. 5ml 75% 乙醇洗滌 DNA 沉淀。(5)加入50 μ L無(wú)菌水55°C放置2min，溶解核酸沉淀。(6)取2μ L核酸樣品采用NanoDrop DL-1000分光光度計(jì)測(cè)濃度。濃度見(jiàn)表1。(7)按照Trizol試劑提取說(shuō)明書(shū)，采用Trizol法提取上述四份蛤組織樣品1_4中派琴蟲(chóng)DNA。取2 μ L核酸樣品采用NanoDrop DL-IOOO分光光度計(jì)測(cè)濃度。濃度見(jiàn)表1。 可見(jiàn)，本發(fā)明實(shí)施例1的試劑提取蛤仔樣品中派琴蟲(chóng)DNA的濃度高于傳統(tǒng)的Trizol法，且操作簡(jiǎn)便，快速，提取時(shí)間在40min內(nèi)即可完成，大大縮短了傳統(tǒng)方法提取核酸(傳統(tǒng)方法提取核酸所需時(shí)間為2-3h)的時(shí)間。
表1本發(fā)明試劑和Trizol試劑分別提取四份蛤仔樣品核酸的濃度對(duì)比
^Baammmim...................................................
樣品1 樣品2 樣品3 樣品4
？M (ngiiL)97.5102.298.6112.9■賦劑OD260nm/280nm1.871.851.891.85Trizd礎(chǔ)丨J？M (ngiiL)85.088.286.586.0OD260nm/280nm1.841.871.8 61.902、采用PCR方法檢測(cè)提取的DNA(I)OIE推薦的派琴蟲(chóng)通用PCR引物序列如下Primer PerkITS-85 (5，-CCGCTTTGTTTGGATCCC-3，)Primer PerkITS-750 (5，-ACATCAGGCCTTCTAATGATG-3，) 引物合成后，用ddH20稀釋至lOpmol/L，_20°C保存?zhèn)溆谩?(2)以實(shí)施例1制得的試劑提取的上述4份DNA為模板，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，
25 μ L反應(yīng)體系
10XPCR Buffer 2. 5 μ L，dNTP (各 2. 5mM) 2 μ L，上下游引物(10 μ Μ)各 1 μ L， rTaq (5U/ μ L) 0. 5 μ L，模板 2 μ L，ddH20 補(bǔ)充至 25 μ L 反應(yīng)體系。(3)反應(yīng)程序95 °C 預(yù)變性 ^iin ；95°C 變性 lmin，55°C 退火 lmin，65°C 延伸 3min，40 個(gè)循環(huán)；最后 65 °C 延伸 5min。G)PCR反應(yīng)結(jié)束后，以的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。預(yù)期得到的派琴蟲(chóng)目的基因片段大小為67;3bp。采用本發(fā)明試劑及PCR方法提取的蛤仔派琴蟲(chóng)核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。采用Trizol法提取的蛤仔派琴蟲(chóng)核酸PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2。電泳結(jié)果顯示，以兩種核酸提取方法獲得派琴蟲(chóng)總DNA為模板，采用PCR方法擴(kuò)增得到673bp的基因片段，與預(yù)期片段大小一致，說(shuō)明用本發(fā)明實(shí)施例1制得的試劑提取動(dòng)物組織樣品中派琴蟲(chóng)的核酸能夠用于PCR反應(yīng)，PCR擴(kuò)增結(jié)果特異、準(zhǔn)確。實(shí)施例5滅活口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液RNA的提取與RT-PCR檢測(cè)1、提取口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液中的RNA(1)分4次取滅活口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液各200 μ L，共4份樣品，每份加入ImL實(shí)施例2制得的試劑。(2)室溫放置10min，23°C，IOOOOg離心5min，將上清移至新管。(3)上清液中加0. 5mL異丙醇，23°C，IOOOOg離心8min，棄上清。(4) 1. 5ml 75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀。(5)加入50 μ L無(wú)菌水55°C放置2min，溶解核酸沉淀。(6)取2 μ L核酸樣品采用NanoDrop DL-1000分光光度計(jì)測(cè)濃度。濃度見(jiàn)表2。(7)按照Trizol試劑提取說(shuō)明書(shū)，采用Trizol法提取上述四份滅活口蹄疫病毒細(xì)胞培養(yǎng)液樣品1-4中病毒RNA。取2 μ L核酸樣品采用NanoDrop DL-1000分光光度計(jì)測(cè)濃度。濃度見(jiàn)表2?？梢?jiàn)，本發(fā)明實(shí)施例2的試劑提取細(xì)胞培養(yǎng)液中口蹄疫病毒RNA的濃度高于傳統(tǒng)的Trizol法，且操作簡(jiǎn)便，快速，提取時(shí)間在40min內(nèi)即可完成，大大縮短了傳統(tǒng)方法提取核酸(傳統(tǒng)方法提取核酸所需時(shí)間為2- )的時(shí)間。表2本發(fā)明試劑和Trizol試劑分別提取四份FMDV細(xì)胞培養(yǎng)液樣品核酸的濃度比較
權(quán)利要求
1.一種提取動(dòng)物組織樣品中病原核酸的試劑，其特征在于，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)，其包括異硫氰酸胍4M-6M，檸檬酸鈉20mM-25mM，SLS 0. 2wt% -0. 5wt%。
2.如權(quán)利要求1所述的試劑，其特征在于，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)6M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉，質(zhì)量百分比為0. 5%的SLS。
3.如權(quán)利要求1或2所述的試劑，其特征在于，pH值為7-9。
4.權(quán)利要求1或2所述的試劑在提取動(dòng)物組織樣本和/或細(xì)胞培養(yǎng)物中DNA和/或 RNA的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，用于提取DNA時(shí)，所述試劑pH值為8-9，或， 用于提取RNA時(shí)，所述試劑pH值為7。
6.一種提取動(dòng)物組織樣品中病原核酸的方法，包括如下步驟(1)動(dòng)物組織預(yù)處理；(2)裂解組織樣本在樣本中加入權(quán)利要求1所述試劑，上下顛倒混勻；(3)將樣品室溫放置10-30min后，15_25°C，13000g離心5min，去除未消化的組織及蛋白；(4)核酸沉淀將步驟(3)的上清液轉(zhuǎn)移到新管，加入異丙醇，來(lái)回顛倒混勻，IOOOOg 離心8-lOmin，棄去上清；加75 %乙醇洗滌核酸沉淀，5000g離心3min，倒去上清，室溫干燥 2_3min ；(5)加入無(wú)核酸酶的無(wú)菌水溶解核酸沉淀，55°C，放置aiiin。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的動(dòng)物組織預(yù)處理方法為勻漿或液氮研磨。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟(2)試劑的用量為30-70mg動(dòng)物組織中加入ImL權(quán)利要求1所述試劑。
9.一種提取細(xì)胞培養(yǎng)液中病原核酸的方法，其特征在于，包括如下步驟(1)加入權(quán)利要求1所述的試劑于細(xì)胞培養(yǎng)液，添加體積比為5:1;(2)將混合液室溫放置10-30min后，15_25°C，13000g離心5min，去除雜質(zhì)；(3)核酸沉淀將步驟O)的上清液轉(zhuǎn)移到新管，加入異丙醇，來(lái)回顛倒混勻，IOOOOg 離心8-lOmin，棄去上清；加75 %乙醇洗滌核酸沉淀，5000g離心3min，倒去上清，室溫干燥 2_3min ；(4)加入無(wú)核酸酶的無(wú)菌水溶解核酸沉淀。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述加入無(wú)菌水的量與步驟(2)中所加提取核酸試劑的量相同，55°C放置aiiin。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種動(dòng)物組織樣品中病原核酸的提取試劑。該試劑pH為7-9，溶劑是水，溶質(zhì)是如下終濃度的物質(zhì)4M-6M異硫氰酸胍，20mM-25mM檸檬酸鈉，0.2％-0.5％質(zhì)量百分比的十二烷基肌氨酸鈉(SLS)。采用該試劑提取核酸成本低廉，無(wú)有毒有害試劑，安全快速，適用于提取動(dòng)物組織樣品中病原核酸。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102417905SQ20111042516
公開(kāi)日2012年4月18日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者吳紹強(qiáng), 張麗, 張永寧, 林祥梅, 王彩霞, 鄧俊花 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院