專利名稱：一種提取橡膠樹樹皮組織全蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種高效提取橡膠樹樹皮組織總蛋白的 方法。
背景技術(shù)：
-各種生物材料中全蛋白質(zhì)和可溶性蛋白的提取方法主要包括TCA-丙酮沉淀 法和雙乙法，在此基礎(chǔ)上，針對(duì)特定的樣品，由于其性質(zhì)的特異性，還需要作一 些適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，以便能夠采取相應(yīng)的提取方法，獲得高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品。植物 樹皮組織由于質(zhì)地堅(jiān)硬、蛋白質(zhì)含量低，加之纖維素以及酚類、色素等雜質(zhì)含量 高，對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)提取存在一定的難度。目前在國(guó)內(nèi)還沒(méi)有關(guān)于植物樹皮組織 中全蛋白和可溶性蛋白提取方法的研究報(bào)道，即便是在國(guó)際上，也還沒(méi)有較理想 的樹皮蛋白提取方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從橡膠樹樹皮組織中高效提取總蛋白，用于開展與橡膠樹死 皮機(jī)制、砧穗相互作用和乙烯利等激素刺激相關(guān)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究。一種高效提取橡膠樹樹皮組織中總蛋白的方法，包括樹皮樣品采集和預(yù)處 理、蛋白質(zhì)提取和定量等步驟。其特征是1. 樹皮樣品的采集和預(yù)處理選擇待采集樣品的植株，用鋒利的小刀刮去采集部位的樹皮周皮，然后將樹 皮分割為若干小塊，劃割深度到木質(zhì)部；用刀片撬起樹皮，并用錫箔紙包住，做 好標(biāo)記，然后迅速冰浴或者置液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室。用刀將樹皮切成薄片，-70--80 'C保存?zhèn)溆谩?. 蛋白質(zhì)提取采用改進(jìn)的三氯醋酸(TCA) —丙酮沉淀法(先抽提后沉淀)結(jié)合雙乙法提取植物樹皮組織中的總蛋白。具體操作流程為(1) 將干凈研缽、包含10% TCA的丙酮溶液A以及丙酮置于-2(TC冰箱預(yù)冷；(2) 稱取一定量的樹皮樣品置于液氮中冷卻；(3) 用液氮蕩洗研缽卜2次，然后將樣品置入研缽中，加入樣品的質(zhì)量的 0. 5y。-2。/。聚乙烯吡咯垸酮(PVPP)，然后加液氮充分研磨樹皮樣品(約10-30 min)，至細(xì)粉末狀。將粉末盛裝于離心管；(4) 按1:10-20 (w/v)的比例向粉末中加入蛋白抽提液l， w是重量，單位為 克、v是體積，單位是毫升。蛋白抽提液l的pH-8.5，配方為4-7M尿素，0.5-2 M試劑A， 0.5-2 °/。 CHAPS (3-丙磺酸內(nèi)鹽)，0.5-2 °/。兩性電 解質(zhì)載體(pH3. 5-9.5)， 40mMTris (三羥甲基氨基甲烷)，％均為質(zhì)量百 分比，M為摩爾，mM為毫摩爾。然后加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA (乙二胺四乙酸)，PMSF和EDTA的終濃度均為1-2 mM。渦旋混勻，冰浴 5-10 min;(5) 加入二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為10mM，超聲5min，室溫放置1 h (或 者37'C孵育1 h)，其間不斷混勻樣品，以充分溶解蛋白；(6) 4-10。C， 30， 000-40， OOOg離心10-30 min，收集上清液；(7) 向上清液中加入相當(dāng)于5-10倍體積(w/V)的溶液A，再加入PMSF和EDTA， PMSF和EDTA的終濃度均為1-2 mM，渦旋混勻，冰浴5min;加DTT至終 濃度10 mM，超聲1 tnin，于-2(TC下靜置2-15 h后，4-10。C、30' 000-40， OOOg 離心10-30 min,棄上清得到沉淀A;(8) 沉淀A用冰浴丙酮重懸浮，冰浴丙酮體積是沉淀A的5-10倍，再加入PMSF 和EDTA， PMSF和EDTA的終濃度均為1-2 mM，渦旋混勻，冰浴5 min;加 DTT至終濃度為10 mM，搖勻，于-2(TC下靜置0.5-2 h后，4-l(TC、 30， 000-40, 000 g離心10-30 min，棄上清得到沉淀B;(9) 重復(fù)步驟8—至兩次，得到沉淀C;(10) 取出沉淀C真空干燥或置超凈工作臺(tái)風(fēng)干(冰浴中)約5-10 min，以除 盡有機(jī)溶劑。所得干粉末置-70—8(TC保存?zhèn)溆没蚪酉乱徊剑?11) 按1:10-20 (w/v)的比例向干粉末中加蛋白抽提液2，蛋白抽提液2的 pH=8. 5，配方7-9 M尿素，0.5-4 °/。 CHAPS， 0.5-2 °/。兩性電解質(zhì)載體 (pH 3. 5-9. 5) ， 40 mM Tris，然后加入PMSF和EDTA至終濃度為1-2 mM， 渦旋混勻，冰浴5-10 min;加DTT至終濃度10raM，超聲1-5 min，室溫 放置l-2 h (或者37'C孵育1-2 h)，其間不斷混勻樣品，以充分溶解蛋 白，4-10。C、 30, OOOg-40, 000 g離心10-30 min，上清為蛋白溶液A;(12) 向蛋白溶液A中加入TCA粉末至終濃度為12鬼,充分搖勻使TCA溶解，4-10 。C放置30 min-2 h;(13) 4。C、 30, 000-40 , OOOg離心10-30min，得到沉淀D，取沉淀D用4。C預(yù)冷 的10-20倍體積樣品的乙醇乙醚(1:1)重懸，于-20。C下靜置0. 5-2 h;(14) 4'C、 30， 000-40， 000 g離心10-30 min，棄上清；得到沉淀E，取出沉淀 E真空干燥或置超凈工作臺(tái)風(fēng)干(冰浴)約5-10 rain，以除盡有機(jī)溶劑；(15) 按1:5-20 (w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2，然后加入PMSF 和EDTA至終濃度為1-2 mM,渦旋混勻，冰浴5-10 min;加DTT至終濃度 10幽，超聲2-5 min，然后4-1CTC、 30， 000-40'000 g離心10-30 min，上清即為所需的蛋白溶液B;(16) 蛋白溶液B用1.5 mL印pendorf離心管分裝，-70—-8(TC保存?zhèn)溆谩?3.蛋白質(zhì)定量采用Bio-rad公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)所獲得的樣品進(jìn)行定量，方法見試 劑盒使用說(shuō)明書。利用本發(fā)明，可以從橡膠樹的樹皮組織中提取獲得高質(zhì)量和高得率的蛋白質(zhì) 樣品，用于開展與橡膠樹死皮機(jī)制、砧穗相互作用和乙烯利等激素刺激相關(guān)的蛋 白質(zhì)組學(xué)研究。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。從橡膠樹樹皮組織中提取蛋白質(zhì)樣品。其詳細(xì)步驟為1. 橡膠樹樹皮樣品的采集和預(yù)處理選擇待采集樣品的橡膠樹，用鋒利的小刀刮去采集部位的樹皮周皮，然后將樹皮分割為若干小塊，劃割深度到木質(zhì)部；用刀片撬起樹皮，并用錫箔紙包住， 做好標(biāo)記，然后迅速冰浴或者是置液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室。用刀將樹皮切成薄片， -8(TC保存?zhèn)溆谩?. 蛋白質(zhì)的提取(1) 將干凈研缽、溶液A (包含10% TCA的丙酮溶液)和丙酮置于-2(TC冷卻；(2) 稱取一定量的樣品置于液氮中冷卻；(3) 用液氮預(yù)冷研缽，然后將樣品置入研缽中，加1%的交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)以及少量石英砂，然后加液氮充分研磨樹皮樣品(約15 rain)， 至細(xì)粉末狀，將粉末盛裝于離心管；(4) 按1:20 (w/v)的比例，向粉末中加入蛋白抽提液1 pH=8. 5、配方6M尿 素，1.5M試齊i」A， 0. 5%CHAPS， 2%兩性電解質(zhì)載體(pH3.5-9. 5)， 40 mM Tris，然后加入苯甲基磺酰氟(PMSF)和EDTA至終濃度分別為1 mM和2 mM,渦旋混勻，冰浴5min;(5) 向上述體系加入二硫蘇糖醇(DTT)至終濃度為10 mM，超聲5 min， 37 °〇孵育1 h，其間不斷混勻樣品；(6) 4'C， 35,000 g離心15 min，收集上清液；(7) 向上清液中加入相當(dāng)于5-10倍體積(w/V)的溶液A，加入PMSF和EDTA 至終濃度分別為1 mM和2 mM，渦旋混勻，冰浴5 min;加DTT至終濃度 10 mM,超聲lmin，于-2(TC下靜置2 h后，4°C， 35,000 g離心15 min， 棄上清；(8) 沉淀用10倍體積于樣品的冰浴丙酮重懸浮，加入PMSF和EDTA至終濃度 分別為1 mM禾卩2 mM，渦旋混勻，冰浴5 min;加DTT至終濃度為10 mM， 搖勻，于-2(TC下靜置0. 5h后，4'C、 35,000 g離心10 min，棄上清；(9) 重復(fù)步驟8—次；(10) 取出沉淀真空干燥或置超凈工作臺(tái)風(fēng)干(冰浴中)約5min，以除盡有機(jī) 溶劑。所得干粉置-8(TC保存?zhèn)溆没蚪酉乱徊剑?11) 按1:20 (w/v)的比例，向粉末中加蛋白抽提液2 pH=8. 5、配方7 M尿素，2%CHAPS， 0. 5°/。兩性電解質(zhì)載體pH3. 5-9. 5， 40 mM Tris'然后加入 PMSF和EDTA至終濃度分別為1 mM禾n2 mM，渦旋混勻，冰浴5 min;加 DTT至終濃度10 raM，超聲5 min， 37。C孵育lh，其間不斷混勻樣品。4 °C、 35,000 g離心15 min,上清為蛋白溶液A; (12)向蛋白溶液A中加入TCA粉末至終濃度為12%，充分搖勻使TCA溶解，4。C放置30 min-GS) 4'C， 35,000 g離心15 min,取沉淀用4'C預(yù)冷的IO倍體積樣品的乙醇 乙醚(1:1)重懸，于-20。C下靜置0.5 h;(14) 4'C， 30，000 g離心15min，棄上清；取出沉淀置超凈工作臺(tái)風(fēng)干(冰浴) 5 min，以除盡有機(jī)溶劑；(15) 按1:10 (w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2,然后加入PMSF 和EDTA至終濃度分別為1 mM和2 mM，渦旋混勻，冰浴5 min;加DTT 至終濃度10 raM，超聲5 min，然后IO'C、 35,000 g離心15 min，上清 即為所需的樣品蛋白溶液B;(16) 蛋白溶液B用1.5 mL印pendorf離心管分裝，-8CTC保存?zhèn)溆谩?3.蛋白質(zhì)定量采用Bio-rad公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)所獲得的樣品進(jìn)行定量，方法見試 劑盒使用說(shuō)明書。
權(quán)利要求
1.一種高效提取橡膠樹樹皮組織中總蛋白的方法，包括樹皮樣品采集和預(yù)處理、蛋白質(zhì)提取和定量，其特征是1)樹皮樣品的采集和預(yù)處理選擇待采集樣品的植株，用鋒利的小刀刮去采集部位的樹皮周皮，然后將樹皮分割為若干小塊，劃割深度到木質(zhì)部；用刀片撬起樹皮，并用錫箔紙包住，做好標(biāo)記，然后迅速冰浴或者置液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室，用刀將樹皮切成薄片，-70--80℃保存?zhèn)溆茫?)蛋白質(zhì)提取采用改進(jìn)的三氯醋酸-丙酮沉淀法結(jié)合雙乙法提取植物樹皮組織中的總蛋白；具體操作流程為(1)將干凈研缽、包含10％TCA的丙酮溶液A以及丙酮置于-20℃預(yù)冷；(2)稱取一定量的樣品置于液氮中冷卻；(3)用液氮蕩洗研缽1-2次，然后將樣品置入研缽中，加入樣品的質(zhì)量的0.5％-2％PVPP，然后加液氮研磨樹皮樣品10-30min，至細(xì)粉末狀，將粉末盛裝于離心管；(4)按1∶10-20(w/v)的比例向粉末中加入蛋白抽提液1，w是重量，單位為克、v是體積，單位是毫升，蛋白抽提液1pH＝8.5、配方為4-7M尿素，0.5-2M試劑A，0.5-2％CHAPS，0.5-2％兩性電解質(zhì)載體(pH3.5-9.5)，40mM Tris，％均為質(zhì)量百分比，M為摩爾，mM為毫摩爾；然后加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的終濃度均為1-2mM，渦旋混勻，冰浴5-10min；(5)加入DTT至終濃度為10mM，超聲5min，室溫放置1h或者37℃孵育1h，其間不斷混勻樣品，以充分溶解蛋白；(6)4-10℃，30,000-40,000g離心10-30min，收集上清液；(7)向上清液中加入相當(dāng)于5-10倍體積(w/V)的溶液A，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的終濃度均為1-2mM，渦旋混勻，冰浴5min；加DTT至終濃度10mM，超聲1min，于-20℃下靜置2-15h后，4-10℃、30,000-40,000g離心10-30min，棄上清得到沉淀A；(8)沉淀A用冰浴丙酮重懸浮，冰浴丙酮體積是沉淀A的5-10倍，再加入PMSF和EDTA，PMSF和EDTA的終濃度均為1-2mM，渦旋混勻，冰浴5min；加DTT至終濃度為10mM，搖勻，于-20℃下靜置0.5-2h后，4-10℃、30,000-40,000g離心10-30min，棄上清得到沉淀B；(9)重復(fù)步驟8一至兩次，得到沉淀C；(10)取出沉淀C真空干燥或置超凈工作臺(tái)風(fēng)干5-10min，以除盡有機(jī)溶劑；所得干粉末置-70-80℃保存?zhèn)溆没蚪酉乱徊剑?11)按1∶10-20(w/v)的比例向干粉末中加蛋白抽提液2，蛋白抽提液2pH＝8.5、配方7-9M尿素，0.5-4％CHAPS，0.5-2％兩性電解質(zhì)載體、pH3.5-9.5，40mM Tris，然后加入PMSF和EDTA至終濃度為1-2mM，渦旋混勻，冰浴5-10min；加DTT至終濃度10mM，超聲1-5min，室溫放置1-2h或者37℃孵育1-2h，其間不斷混勻樣品，以充分溶解蛋白，4-10℃、30,000g-40,000g離心10-30min，上清為蛋白溶液A；(12)向蛋白溶液A中加入TCA粉末至終濃度為12％，充分搖勻使TCA溶解，4-10℃放置30min-2h；(13)4℃、30,000-40,000g離心10-30min，得到沉淀D，取沉淀D用4℃預(yù)冷的10-20倍體積樣品的乙醇∶乙醚(1∶1)重懸，于-20℃下靜置0.5-2h；(14)4℃、30,000-40,000g離心10-30min，棄上清；得到沉淀E，取出沉淀E真空干燥或置超凈工作臺(tái)風(fēng)干5-10min，以除盡有機(jī)溶劑；(15)按1∶5-20(w/v)的比例，向干粉末中加入蛋白抽提液2，然后加入PMSF和EDTA至終濃度為1-2mM，渦旋混勻，冰浴5-10min；加DTT至終濃度10mM，超聲2-5min，然后4-10℃、30,000-40,000g離心10-30min，上清即為所需的蛋白溶液B；(16)蛋白溶液B用1.5mL eppendorf離心管分裝，-70--80℃保存?zhèn)溆茫?)蛋白質(zhì)定量采用Bio-rad公司的蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)所獲得的樣品進(jìn)行定量。
全文摘要
本發(fā)明屬于植物生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從橡膠樹樹皮組織中提取蛋白質(zhì)樣品的方法。特點(diǎn)是采用改進(jìn)的三氯醋酸(TCA)-丙酮沉淀法(先抽提后沉淀)結(jié)合雙乙法提取植物樹皮組織中的全蛋白，不僅可以提高樣品的得率，還可以有效去除酚和色素等雜質(zhì)。本發(fā)明可以為與樹皮有關(guān)的研究提供高質(zhì)量的蛋白質(zhì)樣品。
文檔編號(hào)C07K1/14GK101274955SQ200810007660
公開日2008年10月1日 申請(qǐng)日期2008年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月4日
發(fā)明者曹建華, 楊禮富, 林位夫, 王真輝, 坤 袁 申請(qǐng)人:中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所