專利名稱：：含有假異胞嘧啶核堿基衍生物的3’修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應(yīng)用的制作方法含有假異胞嘧啶核堿基衍生物的3'修飾寡核苷酸及其作為引物或探針的應(yīng)用本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增，例如應(yīng)用于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的化合物和方法。檢測是否存在靶核酸在各種領(lǐng)域中起著重要作用，包括醫(yī)學(xué)診斷、法醫(yī)學(xué)和遺傳分析。PCR是核酸擴(kuò)增方法的例子之一，其提供的高度靈敏方法通過選擇性擴(kuò)增耙核酸序列來檢測是否存在耙核酸。核酸擴(kuò)增，例如PCR的重要問題是會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。會(huì)在PCR反應(yīng)中造成問題的非特異性擴(kuò)增過程的例子之一是"引物-二聚體"擴(kuò)增。例如，當(dāng)引物的3'末端區(qū)域與其自身或另一引物有一定程度互補(bǔ)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致引物-二聚體擴(kuò)增。這些引物能彼此雜交形成引物-二聚體。然后，引物-二聚體的擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生引物-二聚體擴(kuò)增子，進(jìn)而用作進(jìn)一步擴(kuò)增的模板。這種過程的后果之一是消耗了引物，從而導(dǎo)致靈敏度降低或者甚至不能擴(kuò)增所需的靶核酸。熟知在PCR反應(yīng)期間加入過量的引物使得甚至3'末端區(qū)域的弱互補(bǔ)性亦會(huì)產(chǎn)生引物-二聚體擴(kuò)增子，從而使該問題愈加復(fù)雜。因此，需要開發(fā)能抑制擴(kuò)增反應(yīng)，例如PCR中引物-二聚體形成的試劑和方法。本文出乎意料地發(fā)現(xiàn)在引物的3'末端區(qū)域摻入某些修飾的核堿基(nudeobase)對擴(kuò)增反應(yīng)期間的引物-二聚體擴(kuò)增子形成有有益影響。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供的多核苷酸在離該多核苷酸3'末端不超過4個(gè)核苷酸處含有至少一個(gè)嘧啶核堿基，其中所述修飾的嘧啶核堿基具有以下結(jié)構(gòu)其中R選自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、CrCV烷基、0<36取代的烷基、C3-C1()芳基、C3-do取代的芳基、C3-C,o芳基醚、CVdo取代的芳基醚、-CF3、胺、取代的胺、CVC6環(huán)狀烷基、CVC6取代的環(huán)狀垸基、苯基、取代的苯基和雜芳基。在一些實(shí)施方式中，R可以是-H。在一些實(shí)施方式中，R可以是C,-C6垸基。在一些實(shí)施方式中，R可以是C,-C6取代的烷基。在一些實(shí)施方式中，R可以是C3-Cu)芳基。在一些實(shí)施方式中，R可以是CVC,o取代的芳基。在一些實(shí)施方式中，R可以是-CF3。在一些實(shí)施方式中，R可以是氨基。在一些實(shí)施方式中，R可以是取代的氨基。在一些實(shí)施方式中，R可以是C3-C6環(huán)狀垸基。在一些實(shí)施方式中，R可以是CVC6取代的環(huán)狀烷基。在一些實(shí)施方式中，R可以是苯基。在一些實(shí)施方式中，R可以是取代的苯基。在一些實(shí)施方式中，R可以是雜芳基。在一些實(shí)施方式中，R可以是氰基。在一些實(shí)施方式中，R可以是硝基。在一些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)修飾的嘧啶核堿基離多核苷酸3'末端不超過3個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)修飾的嘧啶核堿基離多核苷酸3'末端不超過2個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述至少一個(gè)修飾的嘧啶核堿基是多核苷酸的3'末端核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可以是引物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸在3'-末端可延長。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可包含可檢測標(biāo)記、猝滅劑或小溝結(jié)合劑中至少一個(gè)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可用作探針。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸的方法，包括將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸引物與該變性DNA模板一條鏈上的互補(bǔ)多核苷酸序列退火以形成引物-模板復(fù)合物；和延伸該引物-模板復(fù)合物的引物部分以形成雙鏈擴(kuò)增子，其中所述多核苷酸引物是本發(fā)明引物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸方法，包括在延伸步驟后使雙鏈擴(kuò)增子變性。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少1次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少40次。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸方法，其中所述延伸在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下發(fā)生從而形成DNA擴(kuò)增子片段。在一些實(shí)施方式中，引物延伸方法包括檢測DNA擴(kuò)增子片段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸方法，包括i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物與變性DNA模板的第一和第二鏈退火，使得該第一多核苷酸引物與該變性DNA模板第一鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，該第二多核苷酸引物與該變性DNA模板第二鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，從而形成第一和第二引物-模板復(fù)合物，和ii)延伸該第一和第二引物-模板復(fù)合物中至少一個(gè)的引物部分以形成雙鏈DNA擴(kuò)增子，其中該第一多核苷酸引物或該第二多核苷酸引物中至少一個(gè)可以是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸的方法，包括先形成包含第一多核苷酸引物、第二多核苷酸引物、DNA模板和其它引物延伸試劑的混合物，再進(jìn)行退火步驟。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸的方法，包括在形成(混合物)步驟之后但在退火步驟之前使DNA模板變性，從而形成變性DNA模板和第二變性DNA模板的第一鏈。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸的方法，包括先進(jìn)行延伸步驟，再使雙鏈DNA擴(kuò)增子變性。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟1-100次?？扇芜x重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟l-50次。應(yīng)該知道，本發(fā)明包括重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟1-100次之間所有可能的范圍。即，重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟可以重復(fù)1次，最多100次以及中間的任何次數(shù)。例如，1-10的范圍應(yīng)理解為包括使用1-10之間所有整數(shù)，即1、2、3、4、5、6、7、8、9、IO的所有可能范圍。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟超過l次。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟超過10次。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟超過20次。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟超過30次。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟超過40次。在一些實(shí)施方式中，可任選重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟超過50次。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸的方法，包括先使多核苷酸探針與變性DNA模板的第一或第二鏈退火，從而使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第一鏈的互補(bǔ)多核苷酸序列退火和/或使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第二鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，再進(jìn)行延伸引物部分的步驟。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸探針包含至少一個(gè)可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸探針還包含猝滅劑、小溝結(jié)合劑中的至少一個(gè)或二者。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸探針可以是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供連接寡核苷酸的方法，包括i)形成包含與DNA模板退火的第一和第二多核苷酸鏈的復(fù)合物，從而使該第一多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第一互補(bǔ)多核苷酸序列退火和使該第二多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第二互補(bǔ)多核苷酸序列退火，其中該變性DNA模板鏈的第二互補(bǔ)多核苷酸序列位于該變性DNA模板鏈的第一互補(bǔ)多核苷酸序列的5'端，和ii)在該第一和第二多核苷酸鏈之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，其中該第一多核苷酸鏈或第二多核苷酸鏈中至少一個(gè)是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測靶多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶多核苷酸鏈與第一探針對反應(yīng)，所述第一探針對包含(i)含有與該靶鏈中第一靶區(qū)域互補(bǔ)的序列的第一多核苷酸探針和(ii)含有與該靶鏈中第二靶區(qū)域互補(bǔ)的序列的第二多核苷酸探針，其中該第二區(qū)域位于該第一區(qū)域的5'端并與該第一區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸堿基重疊，該反應(yīng)在能使該第一和第二探針分別與該靶鏈中第一和第二區(qū)域雜交以形成第一雜交復(fù)合物的有效條件下進(jìn)行，(b)切割該第一雜交復(fù)合物中的第二探針以形成含有該靶鏈、該第一探針和該第二探針的第一片段的第二雜交復(fù)合物，其中該第二探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第一探針的3'末端核苷酸，(c)連接該第一探針與該第二探針的雜交片段以形成與該靶鏈雜交的第一連接鏈，(d)使該第一連接鏈變性(脫離)該靶鏈，和(e)再進(jìn)行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最后一輪中可任選省去步驟(d)，其中該第一探針、該第二探針中至少一個(gè)或二者是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述修飾的嘌呤核堿基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過2個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述修飾的嘌呤核堿基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過1個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，修飾的嘌呤核堿基是該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端核苷酸。在一些實(shí)施方式中，該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者含有可檢測標(biāo)記、猝滅劑或小溝結(jié)合劑中至少一種或它們的任何組合。在一些實(shí)施方式中，該第一區(qū)域與該第二區(qū)域有一個(gè)核苷酸堿基重疊。在一些實(shí)施方式中，該第一探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第一探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二探針的5'端以核苷酸5，羥基結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二探針的3'端以除核苷酸3'羥基以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二探針的3'端以核苷酸3'磷酸基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測靶多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶互補(bǔ)鏈與第二探針對反應(yīng)，所述第二探針對包含(i)含有與該靶互補(bǔ)鏈中第一區(qū)域互補(bǔ)的序列的第三多核苷酸探針和(ii)含有與該靶互補(bǔ)鏈中第二區(qū)域互補(bǔ)的序列的第四多核苷酸探針，其中該第二區(qū)域位于該第一區(qū)域的5'端并與該第一區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸堿基重疊，該反應(yīng)在能使該第三和第四探針分別與該靶互補(bǔ)鏈中第一和第二區(qū)域雜交以形成第三雜交復(fù)合物的有效條件下進(jìn)行，(b)切割該第二雜交復(fù)合物中的第四探針以形成含有該靶互補(bǔ)鏈、該第三探針和該第四探針的第一片段的第四雜交復(fù)合物，其中該第四探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第三探針的3'末端核苷酸，(c)連接該第三探針與該第四探針的雜交片段以形成與該靶互補(bǔ)鏈雜交的第二連接鏈，(d)使該第二連接鏈變性(脫離)該靶互補(bǔ)鏈，和(e)再進(jìn)行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最后一輪中可任選省去步驟(d)。在一些實(shí)施方式中，該第三探針或該第四探針中至少一個(gè)或二者是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述修飾的嘌呤核堿基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過2個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，至少一個(gè)所述修飾的嘌呤核堿基離該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端不超過1個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，所述修飾的嘌呤核堿基是該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者的3'末端核苷酸。在一些實(shí)施方式中，該第一多核苷酸探針、該第二多核苷酸探針或二者可含有可檢測標(biāo)記、猝滅劑或小溝結(jié)合劑中至少一種或它們的任何組合。在一些實(shí)施方式中，該第三探針的5'端任選以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第三探針的5'端任選以核苷酸5'羥基結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第四探針的5'端任選以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第四探針的5'端任選以核苷酸5，羥基結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第一、第二、第三和第四探針的5，端任選以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第四探針的3'端任選以除核苷酸3'羥基以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第四探針的3'端任選以核苷酸3'磷酸基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，這些探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是酶。在一些實(shí)施方式中，該第一探針和該第三探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第一探針和該第三探針各含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第一探針和該第三探針上的可檢測標(biāo)記相同。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針各含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針含有相同的可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，所述切割產(chǎn)生了未與該第二雜交復(fù)合物相結(jié)合的該第二探針的第二片段，該方法還包括檢測該第二探針的所述第二片段。在一些實(shí)施方式中，所述切割產(chǎn)生了未與該第四雜交復(fù)合物相結(jié)合的該第四探針的第二片段，該方法還包括檢測該第四探針的所述第二片段。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個(gè)同時(shí)含有(i)熒光染料和(ii)在熒光染料與熒光激發(fā)能量接觸時(shí)能猝滅熒光發(fā)射的猝滅劑染料，所述切割切開該第二探針和/或第四探針中熒光染料和猝滅劑染料之間的共價(jià)鍵，從而增強(qiáng)該熒光染料的可觀察熒光信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針各含有(i)熒光染料和(ii)猝滅劑染料。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括檢測兩種第二片段。在一些實(shí)施方式中，該第二片段含有基本上不與該靶鏈互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)田比連核苷酸。在一些實(shí)施方式中，該一個(gè)或多個(gè)毗連核苷酸包含l-20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括將該第二片段固定到固體支持物上。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括將對該第二片段進(jìn)行電泳。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括通過質(zhì)譜法檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在最后一輪后檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在多輪期間或之后檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在所有輪次期間檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明檢測靶多核苷酸序列的方法還包括在至少一輪后檢測該第一雜交復(fù)合物、第二雜交復(fù)合物或二者。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在至少一輪后檢測該第三雜交復(fù)合物、第四雜交復(fù)合物或二者。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在至少一輪后檢測該第一連接鏈、第二連接鏈或二者。在一些實(shí)施方式中，該檢測包括電泳分離步驟。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分析片段的方法，包括i)使寡核苷酸引物與變性的DNA模板退火，從而使得該寡核苷酸引物同該變性DNA模板一條鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火以形成引物-模板復(fù)合物，ii)在有脫氧核糖核酸和不可延伸的核糖核酸存在下延伸該引物-模板復(fù)合物的引物部分以形成DNA擴(kuò)增子片段，和iii)檢測DNA擴(kuò)增子片段，其中所述寡核苷酸引物是本發(fā)明多核苷酸。以下方案i說明了含多個(gè)(x)核苷酸"N"的示范性多核苷酸，其定義了所需的核苷酸序列，其中下標(biāo)l、2、3...x指核苷酸在引物中相當(dāng)于3'端的位置，"…"表明N,和N7之間可能有一個(gè)或多個(gè)核苷酸。5'-Nx…N7關(guān)5N4N3N2N'-3'方案l因此，N,位于該示范性多核苷酸的3'末端，其可以稱為該示范性多核苷酸的3'末端核苷酸。類似地，N2位于第二核苷酸位，其可以稱為離3'末端1個(gè)核苷酸。類似地，N3位于第三核苷酸位，其可以稱為離3'末端2個(gè)核苷酸。類似地，N4位于第四核苷酸位，其可以稱為離3'末端3個(gè)核苷酸。據(jù)信，在引物中摻入本發(fā)明核堿基導(dǎo)致的引物-二聚體形成減少作用會(huì)使得在N4位附近更接近3'-末端的任何位置不含本發(fā)明核苷酸的引物減少。本文所用的術(shù)語"寡核苷酸"、"多核苷酸"和"核酸"可互換使用來表示DNA、RNA或二者的單鏈或雙鏈多聚物，包括含有修飾的或非天然存在的核苷酸的多聚物。此外，術(shù)語"寡核苷酸"、"多核苷酸"和"核酸"表示含有骨架和多個(gè)核堿基的任何其它類型多聚物，其能通過核堿基特異性堿基配對與互補(bǔ)的多核苷酸鏈形成雙螺旋，包括但不限于例如Nielsen等，Science254:1497-1500(1991)公開的肽核酸(PNA)、雙環(huán)DNA寡聚物(Bolli等，NucleicAcidsRes.24:4660-4667(1996))和相關(guān)的結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可包含天然存在的糖或糖苷部分，例如卩-D-呋喃核糖的骨架。此外，在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明修飾的核苷酸可包含含有一個(gè)或多個(gè)"糖類似物"的骨架。本文所用的術(shù)語"糖類似物"指糖核糖的類似物。示范性核糖糖類似物包括但不限于具有5個(gè)以上或以下環(huán)原子的取代或未取代的呋喃糖，例如赤癬糖和己糖和取代或未取代的3-6碳無環(huán)糖。典型的取代的呋喃糖和無環(huán)糖是其中一個(gè)或多個(gè)碳原子被一個(gè)或多個(gè)相同或不同的-R、-OR、-NRR或鹵素基團(tuán)取代的那些糖，其中各R獨(dú)立為-H、(Q-C6)烷基或(C3-d4)芳基。具有5個(gè)環(huán)原子的未取代和取代的呋喃糖的例子包括但不限于2'-脫氧核糖、2'-(d-C6)-烷基核糖、2'-(C,-C6)-垸氧基核糖、2'-(Cs-CM)-芳氧基核糖、2'，3'-二脫氧核糖、2',3'-二脫氧核糖、2'-脫氧-3'-鹵代核糖、2'-脫氧-3'-氟代核糖、2'-脫氧-3'-氯代核糖、2'-脫氧-3'-氨基核糖、2'-脫氧-3'-(C,-C6)-烷基核糖、2'-脫氧-3'-(C,-C6)-烷氧基核糖、2'-脫氧-3'-(C5-C,4)-芳氧基核糖、3'-(C廣C6)-烷基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-(C,-C6)-垸基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-(CVC6)-垸氧基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-(CVd4)-芳氧基核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-鹵代核糖-5'-三磷酸、2'-脫氧-3'-氨基核糖-5'-三磷酸、2'，3'-二脫氧核糖-5'-三磷酸或2'，3'-二脫氫核糖-5'-三磷酸。其它糖類似物包括但不限于例如"鎖核酸"(LNA)，即在C-4'和C-2'位氧原子之間含有如亞甲基橋的那些糖，例如納入本文作為參考的Wengel等，WO99/14226和WengeU，Ace.Chem.Res.，32:301-310(1998)所述的在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸包括其中的磷酸骨架含有一個(gè)或多個(gè)"磷酸類似物"的那些多核苷酸。術(shù)語"磷酸類似物"指其中磷原子處于+5氧化狀態(tài)并且一個(gè)或多個(gè)氧原子被非氧部分取代的磷酸類似物。示范性類似物包括但不限于硫代磷酸根(phosphorothioate)、二硫代磷酸根(phosphorodkhioate)、硒代磷酸根(phosphoroselenoate)、二硒代磷酸根(phosphorodiselenoate)、硫代苯胺膦酸根(phosphoroanilothioate)、苯胺磷酸根(phosphoranilidate)、亞磷酰胺、硼磷酸根(boronophosphates)和相關(guān)的抗衡離子，包括但不限于H+、NH4+、Na+、Mg++，如果存在這些抗衡離子的話。含磷酸類似物的本發(fā)明多核苷酸可包含，例如硫代磷酸鍵、甲基膦酸鍵和/亞磷酰胺(參見Chen等，NuclAcidsRes.，23:2662-2668(1995))。多核苷酸鍵(polynucleotidelinkage)的組合也屬于本發(fā)明范圍。在一些實(shí)施方式中，本文所述多核苷酸可摻入PNA和DNA/PNA嵌合體中。包括肽核酸(PNA，也稱為聚酰胺核酸)，參見，例如Nielsen等，Science254:1497-1500(199)。PNA含有通過聚酰胺骨架而不是DNA和RNA特征性的糖-磷酸骨架相連的雜環(huán)核堿基單元。PNA能與互補(bǔ)DNA和RNA靶序列雜交。PNA寡聚物的合成與用于合成PNA寡聚物的反應(yīng)性單體描述于，例如美國專利號(hào)5,539,082;5,714,331;5,773,571;5,736,336禾Q5,766,855。PNA和DNA/PNA嵌合體合成的其它方法以及PNA合成的單體已描述于，例如Uhlmann等，Angew.Chem.Int,Ed.37:2796-2823(1998)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸的大小可以自是長度為少數(shù)核苷酸單體(例如5-80個(gè))到數(shù)百或數(shù)千個(gè)核苷酸單體。例如，本發(fā)明多核苷酸可含有5-50個(gè)核苷酸、5-30個(gè)核苷酸或5-20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，當(dāng)本發(fā)明多核苷酸含有，例如5-30個(gè)核苷酸時(shí)，這種范圍包括5-30之間所有可能的整數(shù)范圍，例如長度為5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29和30個(gè)核苷酸。除非另有指明，當(dāng)用一串字母，例如"ATGCCTG"表示多核苷酸時(shí)，應(yīng)該知道這些核苷酸自左向右是5'到3'順序，并且"A"表示脫氧腺苷、"C"表示脫氧胞苷、"G"表示脫氧鳥苷和"T"表示胸苷。此外，當(dāng)用包含"X"的一串字母表示本發(fā)明多核苷酸時(shí)，應(yīng)該知道"X"表示不同的核苷酸單體，其中"X"是除"A"、"C"、"G"或"T"以外的核苷酸單體。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可用作擴(kuò)增反應(yīng)的引物。本文所用的"引物"指本文所定義的多核苷酸，可通過加入一個(gè)或多個(gè)核苷酸單體或與連接探針相連延伸其3'末端。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可包含各自獨(dú)立含有修飾的核堿基的一個(gè)或多個(gè)核苷酸。本文所用的術(shù)語"修飾的核堿基"包括可通過加入和/或刪除一個(gè)或多個(gè)功能基團(tuán)、在雜環(huán)結(jié)構(gòu)中有差異(即，用碳取代雜原子，或反之)和/或與一個(gè)或多個(gè)取代基相連而不同于天然存在堿基(例如，A、G、C、T和U)的核堿基。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所用修飾的核堿基包含具有以下結(jié)構(gòu)的修飾嘧啶核堿基<formula>formulaseeoriginaldocumentpage19</formula>其中R選自-H、-F、-Cl、C,-C6烷基、C,-C6取代的垸基、CVdo芳基、C3-C10取代的芳基、C3-do芳基醚、C3-do取代的芳基醚、-CF3、-NR,R,、C3-Q環(huán)狀烷基、CVC6取代的環(huán)狀垸基、苯基、取代的苯基和雜芳基，其中R,選自-H、-F、-Cl、C,-C6垸基、C,-C6取代的垸基、C3-Qo芳基、C3-do取代的芳基。本文所用的"烷基"指從母體焼烴、烯烴或炔烴的一個(gè)碳原子上除去一個(gè)氫原子而衍生的取代或未取代、支鏈、直鏈或環(huán)狀單價(jià)烴基團(tuán)。典型的烷基包括但不限于甲基(甲烷基(methanyl));乙基，例如乙烷基(ethanyl)、乙烯基、乙炔基；丙基，例如丙烷-l-基、丙垸-2-基(異丙基)、環(huán)丙垸-l-基、丙-l-烯-l-基、丙隱1-烯-2-基、丙-2-烯-l-基、環(huán)丙-l-烯-l-基、環(huán)丙-2-烯-l-基、丙-l-炔-l-基、丙-2-炔-l-基等；丁基，例如丁垸-l-基、丁烷-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙烷-l-基(異丁基)、2-甲基-丙垸-2-基(叔丁基)、環(huán)丁烷-l-基、丁-l-烯-l-基、丁-l-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁_2-烯-1-基、丁隱2-烯-2-基、丁-l,3-二烯-l-基、丁-l,3-二烯-2-基、環(huán)丁-l-烯-l-基、環(huán)丁-l-烯-3-基、環(huán)丁-l，3-二烯-l-基、丁-l陽炔-l-基、丁-l-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；等等。本文所用的"芳基"指從芳族環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)碳原子上除去一個(gè)氫原子而衍生的單價(jià)芳族烴基團(tuán)。典型的芳基包括但不限于衍生自以下的基團(tuán)醋蒽烯、苊、苯并熒蒽(acephenanthrylene)、蒽、奠、苯、窟、暈苯、熒蒽、芴、并六苯、己芬、環(huán)已烯(hexalene)、不對稱引達(dá)省(as-indaeene)、對稱引達(dá)省(s-indacene)、茚滿、茚、萘、并八苯(octacene)、辛芬(octaphene)、氯甲橋萘(octalene)、卵苯、戊-2,4-二烯、并五苯、并環(huán)戊二烯(pentalene)、戊芬、茈、非那烯(phenalene)、菲、茜、七曜烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉紅省、苯并菲、三萘(trinaphthalene)等。在一些實(shí)施方式中，芳基是(CVC2())芳基或(C5-Ch))芳基。其它芳基是苯基(C6芳基)和萘基(Qo芳基)。本文在"取代的垸基"、"取代的芳基醚"、"取代的芳基"、"取代的胺基"、"取代的環(huán)狀烷基"或"取代的苯基"中所用的"取代的"表示烷基、芳基、胺、環(huán)狀垸基或苯基部分被一個(gè)或多個(gè)非氫取代基取代。這種取代基包括但不限于:-F、-Cl、-Br、-CF3、胺基、-OH、-CC13、-CN、國CHO、-C02R、-S03R、-P03RR、-C(0)NRR和-N02，其中R可以是-H、C廣CV烷基或CrC1()芳基中任一個(gè)。本文所用的"雜芳基"表示具有選自N、O或S的至少一個(gè)雜原子的任何芳環(huán)系統(tǒng)。雜芳基部分的實(shí)例包括但不限于呋喃、噻吩、吡啶、吡咯、吡嗪、喹啉和哌嗪(piperizine)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所用修飾的核堿基包括但不限于假異胞嘧啶(pseudoisocytisine)Pankiewicz，K,等，JOrg.Chem.，v.47，458-8(1982)和Chu，C.K.等，J.HetChem.，v.14，1119-21(1977)公開了其2'-脫氧衍生物。本領(lǐng)域已知本發(fā)明所用具有各種R取代基的修飾核堿基的其它實(shí)例和制備方法，包括但不限于Ashki認(rèn)i，R.等，WO01019801Al;Hlavka，J.等，美國專利號(hào)4,577,018;Hlavka，J.等，J.Het.Chem.，22(5)，1317-22(1985);Skulnick，H.等，J.Med.Chem.，28(12)，1864-9(1985);Lazarus,R.等，Biochemistry,20(24)，6834-41(1981);Hunter,J.等，DE2522090;Wierenga，W.等，J.Med.Chem.，23(3)，237-9(1980)及它們引用的參考文獻(xiàn)所述的。本發(fā)明所用核堿基和核苷/核苷酸的其它例子及制備方法可見本領(lǐng)域已知的各種數(shù)據(jù)庫，包括Scifinder⑧Scholar、ChemicalAbstracts⑧等。應(yīng)該知道，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過本領(lǐng)域熟知的化學(xué)合成方法聯(lián)用或不用本文和以上參考文獻(xiàn)的指導(dǎo)不難獲得本發(fā)明所用的其它核苷和核苷酸。本發(fā)明寡核苷酸包括天然存在的堿基、修飾的堿基和堿基類似物的所有互變異構(gòu)體形式。因此，具有DNA、PNA或DNA/PNA的正常堿基、修飾的嘧啶核堿基、通用堿基、糖修飾或骨架修飾的組合的多核苷酸屬于本發(fā)明范圍。在一些實(shí)施方式中，可將本發(fā)明多核苷酸與至少一種可檢測標(biāo)記、無熒光猝滅劑和/或至少一種穩(wěn)定部分偶聯(lián)。在一些實(shí)施方式中，與至少一種可檢測標(biāo)記、無熒光猝滅劑和/或至少一種穩(wěn)定部分偶聯(lián)的本發(fā)明多核苷酸可用作擴(kuò)增反應(yīng)的探針或引物。術(shù)語"可檢測標(biāo)記"指當(dāng)與本發(fā)明多核苷酸相連時(shí)可采用已知的檢測方法檢測這種多核苷酸的任何部分。示范性可檢測標(biāo)記包括但不限于能用合適的檢測器直接檢測標(biāo)記化合物的熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素、自旋標(biāo)記、酶標(biāo)記或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記，或者結(jié)合對，例如配體，如能以高親和力特異性結(jié)合可檢測抗配體(如標(biāo)記的抗體或親和素)的抗原或生物素。在一些實(shí)施方式中，標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記，例如熒光素或羅丹明染料或熒光染料對，如FRET染料。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明多核苷酸可包含一個(gè)或多個(gè)"無熒光猝滅劑"部分。本文所用的"無熒光猝滅劑"包括但不限于例如特定的偶氮染料(如DABCYL或DABSYL染料和它們的結(jié)構(gòu)類似物)，三芳基甲烷染料，如孔雀綠或酚紅，4',5'-二醚取代的熒光素(美國專利號(hào)4,318,846)，不對稱花青染料猝滅劑(參見，Lee等，美國專利號(hào)6,080,868和Lee等，美國專利號(hào)6,348,596)，或在一個(gè)或多個(gè)氨基氮原子之處被芳族或雜芳族環(huán)系統(tǒng)取代的3-和/或6-氨基咕噸的無熒光衍生物(Haugland等，美國專利號(hào)6,399,392)。本文所用的"無熒光"表明對于本文的任何方法，所述試驗(yàn)溶液中猝滅部分在發(fā)射-、皿的熒光效率小于或等于5%發(fā)射。在一些實(shí)施方式中，在發(fā)射-^，的熒光效率小于或等于1%發(fā)射。在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中.，共價(jià)連接的猝滅部分在發(fā)射-、皿顯示量子產(chǎn)率低于約0.1%發(fā)射。在一些實(shí)施方式中，在發(fā)射-^^低于約0.01%發(fā)射。在一些實(shí)施方式中，可將本發(fā)明多核苷酸與至少一個(gè)"穩(wěn)定部分"偶聯(lián)。本文所用的術(shù)語"穩(wěn)定部分"所指的部分包括但不限于小溝結(jié)合劑(MGB)部分。參考文獻(xiàn)描述了各種合適的小溝結(jié)合劑。參見，例如Kutyavin等，美國專利號(hào)5,801,155;Wemmer,D.E.禾卩DervanP.B.，CurrentOpinoninStructuralBiology,7:355-361(1997);Walker,W.L.，K叩ka,J.L.和Goodsell,D.S.，Biopolymers,44:323-334(1997);Zimmer，C和Wahnert,U.，Prog.Biophys.Molec.Bio.，47:31-112(1986)和Reddy，B.S.P.，Dondhi,S.M.和Lown，J,W.，Pharmacol.Therap.，84:1-111(1999)。將MGB(以及報(bào)道基團(tuán)，如上述熒光團(tuán)和猝滅劑)通過接頭與多核苷酸相連的合適方法見，例如美國專利號(hào)5,512,677;5,419,966;5,696,251;5,585,481;5,942,610和5，736,626。小溝結(jié)合劑包括，例如3-氨甲?；?l,2-二氫-(3-H7)-吡咯[3,2-e]吲哚-7-羧酸酯的三聚物(CDPl3)和N-甲基吡咯-4-羧-2-酰胺的五聚物(MPC5)。其它MGB部分見美國專利號(hào)5,801,155。在某些實(shí)施方式中，可將MGB與增強(qiáng)水溶性的基團(tuán)相連(例如，糖或氨基酸)。本發(fā)明多核苷酸可用于，例如多核苷酸鏈延伸或連接反應(yīng)的引物和/或探針。本文所用的"鏈延伸反應(yīng)"指其中至少一種本發(fā)明多核苷酸(例如，作為引物或連接探針)可與至少一條DNA模板鏈退火的引物延伸反應(yīng)。在多核苷酸鏈延伸反應(yīng)中，退火步驟后可將引物延伸至少一個(gè)核苷酸從而形成擴(kuò)增子或延伸產(chǎn)物?；蛘?，在多核苷酸鏈延伸反應(yīng)中，退火步驟后可將引物與第二連接探針相連從而形成連接產(chǎn)物。本發(fā)明包括所有可能的鏈延伸反應(yīng)，包括但不限于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、嵌套式PCR(nestedPCR)、異步PCR(asynchronousPCR)、實(shí)日寸PCR、TaqMan試驗(yàn)、DNA測序、循環(huán)DNA測序(cycledDNAs叫uencing)、寡核苷酸連接試驗(yàn)(OLA)和片段分析，這些反應(yīng)描述于，例如ThePCRTechnique:DNASequencingII(《PCR技術(shù)DNA測序II》)，EatonPublishingCo.(1997);GenomeAnalysis,ALaboratoryManualVolumeI:AnalyzingDNA(《基因組分析實(shí)驗(yàn)室手冊》，第1巻DNA分析)，Birren，B.，Green，E.，Klapholz，S.，Myers,R.M.和Roskams，J.編，冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(1997);Innis，M.等，PCRProtocols:AGuidetoMethodsandA卯lications(《PCR方案:方法與應(yīng)用指南》)，AcademicPress(1989);Chen,C.等，美國專利申請公布號(hào)2003/0207266Al;Erlich等，美國專利號(hào)5,314,809;美國專利號(hào)6，221，606和Bi，W.等，美國專利號(hào)6,511,810。本發(fā)明寡核苷酸可各自合適地作為引物或探針用于以上任何引物延伸反應(yīng)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸方法，包括將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸與該變性DNA模板一條鏈上的互補(bǔ)多核苷酸序列退火以形成引物-模板復(fù)合物；和延伸該引物-模板復(fù)合物的引物部分以形成雙鏈擴(kuò)增子，其中所述多核苷酸引物是本發(fā)明引物。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸方法，包括在延伸步驟后使雙鏈擴(kuò)增子變性。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少1次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少40次。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸方法，包括i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物與變性DNA模板的第一和第二鏈退火，使得該第一多核苷酸引物與該變性DNA模板第一鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，該第二多核苷酸引物與該變性DNA模板第二鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，從而形成第一和第二引物-模板復(fù)合物，和ii)延伸該第一和第二引物-模板復(fù)合物中至少一個(gè)的引物部分以形成雙鏈DNA擴(kuò)增子，其中該第一多核苷酸引物或該第二多核苷酸引物中至少一個(gè)可以是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，該方法可以包括先形成含第一多核苷酸引物、第二多核苷酸引物、DNA模板和其它引物延伸試劑(包括，例如緩沖液和聚合酶)的混合物，再進(jìn)行退火步驟。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明所用聚合酶可包括至少一種熱穩(wěn)定聚合酶，包括但不限于ra《、尸/w、Vent、DeepVent、/Vo、UITma和Tth聚合酶及它們的酶活性突變體和變體?？缮唐坊彽檬熘倪@種聚合酶。聚合酶的其它描述見萬維網(wǎng)URL:the-scientist.library.upenn.edu/yrl998/jan/profilel_980105.html。在一些實(shí)施方式中，該方法在形成(混合物)步驟之后但在退火步驟之前使DNA模板變性，從而形成變性DNA模板和第二變性DNA模板的第一鏈。在一些實(shí)施方式中，先進(jìn)行延伸步驟，再使雙鏈DNA擴(kuò)增子變性。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟1-100次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟10-100次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟20-100次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)雙鏈DNA擴(kuò)增子的退火、延伸和變性步驟30-100次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少l次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少10次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少20次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少30次。在一些實(shí)施方式中，可重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少40次。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供引物延伸的方法，包括先使多核苷酸探針與變性DNA模板的第一或第二鏈退火，從而使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第一鏈的互補(bǔ)多核苷酸序列退火和/或使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第二鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，再進(jìn)行延伸引物部分的步驟。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸探針包含至少一個(gè)可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸探針還包含猝滅劑、小溝結(jié)合劑中的至少一個(gè)或二者。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸探針可以是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供"片段分析"或"遺傳學(xué)分析"的方法，其中可通過模板指導(dǎo)的酶促合成使用標(biāo)記的引物或核苷酸產(chǎn)生標(biāo)記的多核苷酸片段；可通過尺寸依賴性分離方法，例如電泳或?qū)游龇蛛x這些片段；和在分離后檢測(例如通過激光誘導(dǎo)的熒光)分離的片段。在一些實(shí)施方式中，同時(shí)分離多類多核苷酸，通過光譜學(xué)可分辨的標(biāo)記區(qū)分不同類別。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分析片段的方法，其中可根據(jù)末端核苷酸鑒定和確定片段類別，從而能在四種可能的末端堿基與一組光譜學(xué)可分辨染料的諸成員之間建立聯(lián)系。使用可商品化購得的分光光度計(jì)通過檢測發(fā)射和吸收帶寬不難從本領(lǐng)域已知的熒光染料裝配這些染料組。在一些實(shí)施方式中，通過DNA測序的鏈終止方法，即二脫氧DNA測序或桑格型測序檢測片段類別。桑格型測序包括利用要測定序列的單鏈或雙鏈DNA模板通過DNA聚合酶在體外合成DNA鏈。在按照寡核苷酸引物與模板退火之處確定的位點(diǎn)開始合成。通過摻入不支持DNA繼續(xù)延伸的核苷酸來終止合成反應(yīng)。示范性鏈終止核苷酸類似物包括缺乏3'-5'DNA鏈延伸所需的3'-OH的2'，3'-二脫氧核苷5'-三磷酸(ddNTP)。當(dāng)使用適當(dāng)比例的dNTP(2'-脫氧核苷5'-三磷酸)禾卩4種ddNTP之一時(shí)，鏈群體的一部分中酶催化聚合將在慘入ddNTP的各位點(diǎn)終止。如果各反應(yīng)使用標(biāo)記的引物或標(biāo)記的ddNTP，高分辨率電泳分離后可通過熒光檢測序列信息。在鏈終止方法中，可將本發(fā)明染料與測序引物或二脫氧核苷酸相連。在該方法中，可將熒光染料分子與以下位置的互補(bǔ)官能團(tuán)相連例如引物5'末端，如Fung等，美國專利號(hào)4,757,141所述；引物的核堿基上；或二脫氧核苷酸的核堿基上，如通過納入本文作為參考的Hobbs等，歐洲專利申請?zhí)?7305844.0和Hobbs等，JOrg.Chem.，54:3420(1989)所述的炔基氨基連接基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，優(yōu)選通過電泳方法分離標(biāo)記的多核苷酸，所述電泳方法公開于，例如Ricl(wood禾口Hames編，GelElectrophoresisofNucleicAcids:APracticalApproach(《核酸凝膠電泳實(shí)用方法》)，IRLPressLimited,倫敦，1981;Osterman，MethodsofProteinandNucleicAcidResearch(蛋白質(zhì)與核酸研究方法)，第1巻，Springer-Verlag，伯林，1984;或美國專利5,374,527;5,624,800和/或5,552,028。在一些實(shí)施方式中，電泳基質(zhì)的類型可以是濃度(重量體積比)在約2-20重量百分比之間的交聯(lián)或未交聯(lián)聚丙烯酰胺。在一些實(shí)施方式中，聚丙烯酰胺濃度在約4-8百分比之間。在一些實(shí)施方式，例如DNA測序中，電泳基質(zhì)可包含變性劑，例如脲、甲酰胺等。構(gòu)建這種基質(zhì)的詳細(xì)方法見，例如Maniatis等，"FractionationofLowMolecularWeightDNAandRNAinPolyacrylamideGelsContaining98%Fo醒mideor7MUrea"(用含98%甲酰胺或7M脲的聚丙烯酰胺凝膠分級(jí)低分子量DNA和RNA)，刊于MethodsinEnzymology,65:299-305(1980);Maniatis等，"ChainLengthDeterminationofSmallDouble-andSingle-StrandedDNAMoleculesbyPolyacrylamideGelElectrophoresis"(通過聚丙烯酰胺凝膠電泳測定雙鏈和單鏈小DNA分子的鏈長)，Biochemistry,14:3787-3794(1975);Maniatis等，MolecularCloning:ALaboratoryManual(《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊》)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，紐約，第179-185頁，(1982);和ABIPRISM377DNASequencerUser'sMa薩l(DNA測序儀用戶手冊)，Rev.A，1995年1月，第2章(AppliedBiosystems，F(xiàn)osterCity,加利福尼亞州)。應(yīng)該知道，最佳電泳條件，例如具體分離采用的多聚物濃度、pH、溫度和變性劑濃度取決于許多因素，包括待分離核酸的大小范圍、它們的堿基組成、它們是單鏈還是雙鏈、電泳所探尋信息的類別性質(zhì)。電泳分離后，可釆用，例如檢測標(biāo)記多核苷酸的染料發(fā)射的熒光來檢測標(biāo)記的多核苷酸。為進(jìn)行這種檢測，可采用標(biāo)準(zhǔn)方法，例如高強(qiáng)度汞蒸氣燈、激光等照射標(biāo)記的多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，照射方式是照射束的波長大于約600nm的激光。在一些實(shí)施方式中，用He-Ne氣體激光或固態(tài)二級(jí)管激光產(chǎn)生的激光照射染料-多核苷酸。照射后，可利用光敏檢測器，例如光電倍增管、電荷耦合器件檢測標(biāo)記多核苷酸的熒光強(qiáng)度。示范性電泳檢測系統(tǒng)描述于，例如美國專利號(hào)5,543,026;5,274,240;4,879,012;5,091,652和4,811,218。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供分析片段的方法，包括使多核苷酸引物與變性的DNA模板退火，從而使得該多核苷酸引物同該變性DNA模板一條鏈的互補(bǔ)多核苷酸序列退火以形成引物-模板復(fù)合物，在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下延伸該引物-模板復(fù)合物的引物部分以形成DNA擴(kuò)增子片段，和檢測該DNA擴(kuò)增子片段。在一些實(shí)施方式中，該多核苷酸引物可以是本發(fā)明寡核苷酸。本發(fā)明片段分析方法的氣體實(shí)施方式可見，例如納入本文作為參考的美國專利號(hào)6,221,606。本文所用的"連接反應(yīng)"指其中等位基因特異性連接探針與至少一條DNA模板鏈退火，從而形成探針-模板復(fù)合物的反應(yīng)。退火步驟后，通過連接試劑在探針和第二寡核苷酸片段之間形成共價(jià)鍵從而產(chǎn)生連接產(chǎn)物。本發(fā)明連接試劑可包含任何數(shù)量的酶或化學(xué)(即，非酶的)試劑。例如，連接酶是在合適條件下能在毗鄰多核苷酸的3'-OH和5'-磷酸之間形成磷酸二酯鍵的一種酶連接試劑。溫度敏感的連接酶包括但不限于噬菌體T4連接酶、噬菌體T7連接酶和大腸桿菌連接酶。熱穩(wěn)定的連接酶包括但不限于r^連接酶、T7/z連接酶和尸/"連接酶?？蓮氖葻峄蚴雀邷厣铮ǖ幌抻谠松?、真核生物或古生物獲得熱穩(wěn)定的連接酶。本發(fā)明方法也可用一些RNA連接酶。化學(xué)連接試劑包括但不限于活化、縮合和還原劑，例如碳二亞胺、溴化氰(BrCN)、N-氰基咪唑、咪唑、1-甲基咪唑/碳二亞胺/胱胺、二硫蘇糖醇(DTT)和紫外光。自連接，即在沒有連接試劑存在下的自發(fā)連接也屬于本發(fā)明范圍?；瘜W(xué)連接方法的詳述方案和合適反應(yīng)基團(tuán)的描述可見Xu等，NucleicAcidRes.，27:875-81(1999);Gryaznov和Letsinger，NucleicAcidRes.21:1403-08(1993);Gryaznov等，NucleicAcidRes.22:2366-69(1994);Kanaya禾口Yanagawa，Biochemistry25:7423-30(1986);Luebke禾口Dervan，NucleicAcidsRes.20:3005-09(1992);Sievers禾卩vonKiedrowski，Nature369:221-24(1994);Liu和Taylor,NucleicAcidsRes.26:3300-04(1999);Wang禾口Kool，NucleicAcidsRes.22:2326-33(1994);Purmal等，NucleicAcidsRes.20:3713-19(1992);Ashley和Kushlan，Biochemistry30:2927-33(1991);Chu和Orgel，NucleicAcidsRes.16:3671-91(1988);Sokolova等，F(xiàn)EBSLetters232:153-55(1988);Naylor和Gilham，Biochemistry5:2722-28(1966);美國專利號(hào)5,476,930;和Royer,EP324616Bl)等。在一些實(shí)施方式中，連接試劑是"活化"或還原劑。應(yīng)該知道如果使用化學(xué)連接，第一探針的3'端和第二探針的5'端應(yīng)包含有助于連接的合適反應(yīng)基團(tuán)。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供連接寡核苷酸的方法，包括i)形成包含與DNA模板退火的第一和第二多核苷酸鏈的復(fù)合物，從而使該第一多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第一互補(bǔ)多核苷酸序列退火和使該第二多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第二互補(bǔ)多核苷酸序列退火，其中該變性DNA模板鏈的第二互補(bǔ)多核苷酸序列位于該變性DNA模板鏈的第一互補(bǔ)多核苷酸序列的5'端，和ii)在該第一和第二多核苷酸鏈之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，其中該第一多核苷酸鏈或第二多核苷酸鏈中至少一個(gè)是本發(fā)明多核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供連接寡核苷酸的方法，包括第一寡核苷酸與變性DNA模板的一條鏈退火，使得該第一寡核苷酸與該變性DNA模板鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，從而形成第一寡核苷酸-模板復(fù)合物；第二寡核苷酸與該第一寡核苷酸-模板復(fù)合物中與該第二寡核苷酸互補(bǔ)的寡核苷酸序列退火，從而形成第二寡核苷酸-模板復(fù)合物，其中該第二寡核苷酸與該第一寡核苷酸-模板復(fù)合物退火使得該第一寡核苷酸的3'末端和該第二寡核苷酸的5'末端與變性DNA模板的毗鄰核苷酸相連；和在該第一寡核苷酸的3'末端和該第二寡核苷酸的5'末端之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵。在一些實(shí)施方式中，該第一寡核苷酸或該第二寡核苷酸中至少一個(gè)可以是本發(fā)明寡核苷酸。在一些實(shí)施方式中，本發(fā)明提供檢測靶多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶多核苷酸鏈和靶互補(bǔ)鏈與第一探針對和第二探針對反應(yīng)，所述第一探針對包含(i)含有與該靶鏈中第一耙區(qū)域互補(bǔ)的序列的第一多核苷酸探針和(ii)含有與該耙鏈中第二靶區(qū)域互補(bǔ)的序列的第二多核苷酸探針，其中該第二區(qū)域位于該第一區(qū)域的5'端并與該第一區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸堿基重疊，所述第二探針對包含(i)含有與該靶互補(bǔ)鏈中第一區(qū)域互補(bǔ)的序列的第三多核苷酸探針和(ii)含有與該靶互補(bǔ)鏈中第二靶區(qū)域互補(bǔ)的序列的第四多核苷酸探針，其中該第二區(qū)域位于該第一區(qū)域的5'端并與該第一區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸堿基重疊，該反應(yīng)在能使該第一和第二探針分別與該靶鏈中第一和第二區(qū)域雜交以形成第一雜交復(fù)合物，以及該第三和第四探針分別與該靶互補(bǔ)鏈中第一和第二區(qū)域雜交以形成第二雜交復(fù)合物的有效條件下進(jìn)行；(b)切割該第一雜交復(fù)合物中的第二探針，以及該第二雜交復(fù)合物中的第四探針以形成(i)含有該靶鏈、該第一探針和該第二探針的第一片段的第三雜交復(fù)合物，其中該第二探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第一探針的3'末端核苷酸，和(ii)含有該靶互補(bǔ)鏈、該第三探針和該第四探針的第一片段的第四雜交復(fù)合物，其中該第四探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第三探針的3'末端核苷酸；(c)連接該第一探針與該第二探針的雜交片段以形成與該靶鏈雜交的第一連接鏈，連接該第三探針與該第四探針的雜交片段以形成與該靶互補(bǔ)鏈雜交的第二連接鏈；(d)使該第一連接鏈變性(脫離)該靶鏈，使該第二連接鏈變性(脫離)該靶互補(bǔ)鏈；和(e)再進(jìn)行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最后一輪中可任選省去步驟(d)。在一些實(shí)施方式中，該第一區(qū)域與該第二區(qū)域有一個(gè)核苷酸堿基重疊。在一些實(shí)施方式中，該第一和第三探針的5'端可以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第一和第三探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二和第四探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二和第四探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第一、第二、第三和第四探針的5'端各自獨(dú)立以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二和第四探針的3，端各自獨(dú)立以除核苷酸3'羥基以外的基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，該第二和第四探針的3'端各自獨(dú)立以核苷酸3，磷酸基團(tuán)結(jié)尾。在一些實(shí)施方式中，這些探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是熒光標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是放射性標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該標(biāo)記可以是酶。在一些實(shí)施方式中，該第一探針和該第三探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第一探針和該第三探針各含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第一探針和該第三探針上的可檢測標(biāo)記可以相同。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針各含有可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針可含有相同的可檢測標(biāo)記。在一些實(shí)施方式中，切割步驟產(chǎn)生了未與該第三雜交復(fù)合物結(jié)合的該第二探針的第二片段，該方法還包括檢測所述第二片段。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針中至少一個(gè)同時(shí)含有(i)熒光染料和(ii)在熒光染料與熒光激發(fā)能量接觸時(shí)能猝滅熒光發(fā)射的猝滅劑染料，所述切割切開該第二探針和/或第四探針中熒光染料和猝滅劑染料之間的共價(jià)鍵，從而增強(qiáng)該熒光染料的可觀察熒光信號(hào)。在一些實(shí)施方式中，該第二探針和該第四探針各含有(i)熒光染料和(ii)猝滅劑染料。在一些實(shí)施方式中，切割步驟產(chǎn)生了未與該第四雜交復(fù)合物相連的該第四探針的第二片段，該方法還包括檢測兩種第二片段。在一些實(shí)施方式中，該第二片段含有基本上不與該靶鏈互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)毗連核苷酸。在一些實(shí)施方式中，一個(gè)或多個(gè)毗連核苷酸包含l-20個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括將該第二片段固定在固體支持物上。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括對該第二片段進(jìn)行電泳。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括通過質(zhì)譜法檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在最后一輪后檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在多輪期間或之后檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在所有輪次期間檢測該第二片段。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在至少一輪后檢測該第一雜交復(fù)合物、第二雜交復(fù)合物或二者。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在至少一輪后檢測該第三雜交復(fù)合物、第四雜交復(fù)合物或二者。在一些實(shí)施方式中，該方法還包括在至少一輪后檢測該第--連接鏈、第二連接鏈或二者。在一些實(shí)施方式中，該檢測包括電泳分離步驟。用于檢測靶多核苷酸的連接方法的其它實(shí)施方式可見全文納入本文作為參考的Bi，W.等，美國專利號(hào)6,511,810。實(shí)施例材料與方法除非另有表述，所有合成反應(yīng)均在氬氣氣氛中在烘箱或火焰干燥的玻璃器皿中進(jìn)行。在氬氣氣氛中用氫化鈣(CaH2)蒸餾二氯甲垸(CH2Cl2)。除非另有表述，所有其它溶劑從分配器接收使用。用購自Sigma-Aldrich(密爾沃基，威斯康星州)的1mm硅膠板進(jìn)行薄層層析(TLC)，用紫外光(Spectroline;ENF-240C型)或用KMn04或磷鉬酸染色觀察。用購自Sigma-Aldrich(密爾沃基，威斯康星州)的平均粒徑為40pm的硅膠進(jìn)行快速柱層析。未衍生的CPG支持物購自AppliedBiosystemsInc(P/N360139,FosterCity，加利福尼亞州)。除非另有表述，所有其它試劑購自Sigma-Aldrich。除非另有表述，用ABI394DNA合成儀按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行0.2pmol規(guī)模的自動(dòng)DNA合成。用Agilent1100HPLC系統(tǒng)通過反相HPLC純化寡核苷酸。用Mariner質(zhì)譜儀(AppliedBiosystems,FosterCity)記錄ESI-TOF質(zhì)譜。用AgilentCE系統(tǒng)通過毛細(xì)管電泳(CE)檢測合成寡核苷酸的純度。合成2'-脫氧-假異胞苷CPG:按照方案1合成2'-脫氧-假異胞苷(2'-Deoxy-pseudoisocvtidine)CPG。如Mayer,A.，Nucleosides,Nucleotides&NucleicAcids，第22巻，1919-25(2003)所述合成N-苯甲?；Ｗo(hù)的2'-脫氧-假異胞苷(1)。方案14'-(3-羧基丙?；?-5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脫氧-假異胞苷(2):向攪拌的30mg1的0.7mL012(:12溶液中加入8.5mg琥珀酸酐，2.9mgDMAP和14pL三乙胺(Et3N)。攪拌12小時(shí)后，用7mLCH2C12稀釋混合物，用5%檸檬酸水溶液(1X7mL)和飽和的氯化鈉，NaCl(1X7mL)洗滌。用Na2S04干燥有機(jī)層，蒸發(fā)，采用硅膠層析純化殘留物得到18mg4'-(3-羧基丙酰基)-5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脫氧-假異胞苷。2'-脫氧-假異胞苷CPG(3):向上文獲得的17mg5-三氟甲基-4'-(3-羧基丙?；?-5'-二甲氧基三苯甲基-2'-脫氧尿苷的0,6mL二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入8.3mg2-(lH-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲鏡六氟磷酸鹽(HBTU)、5.7pL二異丙基乙胺(DIPEA)和594mgCPG(37|iM/g)?；旌衔镎袷?小時(shí)，然后用DMF(4X20mL)和THF(2X20mL)洗滌。高度真空下干燥5-三氟甲基-2'-脫氧尿苷CPG產(chǎn)物4小時(shí)。2'-脫氧-假異胞苷的3'-末端核苷酸如上所述，用ABI394DNA合成儀按照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行0.2pmol規(guī)模的自動(dòng)DNA合成。用Agilent1100HPLC系統(tǒng)通過反相HPLC純化寡核苷酸。結(jié)果合成了表1所示多核苷酸。正向引物ATIRFcC和反向引物ATIRRcC血管緊張素II1型受體基因(ATIR，100bp)。正向引物L(fēng)IGFcC和反向引物L(fēng)IGRcC擴(kuò)增部分人DNA連接酶I基因(LIG，250bp)。正向引物D10SFcC和反向以引物D10SRcC擴(kuò)增部分人染色體10克隆RP11-143D9(D10S，102bp)。表l<table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table>每15反應(yīng)(體系)用5000拷貝的gDNA進(jìn)行所有g(shù)DNA擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)條件使用未修飾和/或修飾的引物在含以下試劑的15反應(yīng)(體系)中進(jìn)行擴(kuò)增-10mMTris-HCl緩沖液，pH8.3-50mMKCl，3mMMgCl2，0.01。/。v/v明膠-0,2mMdATP，0.2mMdCTP，0.2mMdGTP禾P0.4mMdUTP-0.025單位/pLAmpliTaqGoldDNA聚合酶(AppliedBiosystems，P/NN808-0107)-200nM各種正向和反向引物-無模板對照(NTC)實(shí)驗(yàn)用水或15ng基因組DNA(AppliedBiosystems，P/N403062)。如SYBRGreenPCRMasterMixandRT陽PCR:Protocol(SYBR⑧綠色PCR主混合物和RT-PCR:方案)(AppliedBiosystems,2002)所述，通過SYBRGreenassay(SYBI^綠色試驗(yàn))使用ABIPRISM7900HT序列檢測系統(tǒng)(AppliedBiosystems;FosterCity，加利福尼亞州)實(shí)時(shí)監(jiān)測所有PCR反應(yīng)的進(jìn)展。擴(kuò)增反應(yīng)分析如下所示通過凝膠電泳分析所有擴(kuò)增產(chǎn)物。用5^L無核酸酶的水稀釋PCR反應(yīng)混合物(15nL)。將該溶液連同25bpDNA梯加載入4。/。瓊脂糖凝膠孔中(Invitrogen，P/NG5018-04)。在12VDC，880mA進(jìn)行電泳30分鐘。采用紫外照射觀察溴化乙錠染色的dsDNA條帶，采用裝配了柯達(dá)數(shù)碼相機(jī)的AlphaDigDoc1000軟件(AlphaI腸tech;SanLeandro，加利福尼亞州)定量測定。熱循環(huán)采用以下熱循環(huán)參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增溫度循環(huán)。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>對于各引物對，使用未修飾和3'-修飾的引物進(jìn)行含有對應(yīng)于引物對的gDNA的擴(kuò)增反應(yīng)。此外，使用未修飾和3'-修飾引物進(jìn)行不含任何模板的擴(kuò)增反應(yīng)作為無模板對照(NTC)反應(yīng)。如上所述進(jìn)行凝膠電泳分析。依據(jù)所用的引物組，凝膠電泳顯示含未修飾引物的NTC擴(kuò)增中在約40-50bp處有顯著量的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，表明有引物-二聚體擴(kuò)增子形成。另一方面，在使用3'-修飾引物的NTC擴(kuò)增的凝膠電泳圖像中觀察到引物-二聚體擴(kuò)增子形成顯著減少。使用未修飾引物的gDNA模板擴(kuò)增反應(yīng)的凝膠電泳明確顯示了對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，也顯示了對應(yīng)于有引物-二聚體擴(kuò)增子形成的條帶。使用未修飾引物的ATIR模板擴(kuò)增明確顯示在約100bp處有對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，也顯示在約50bp處有對應(yīng)于有引物-二聚體擴(kuò)增子形成的條帶。在另一方面，使用3'-修飾引物的ATIR模板擴(kuò)增明確顯示在約100bp處有對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，但未顯示形成了可鑒定的引物-二聚體擴(kuò)增子。實(shí)時(shí)RCR監(jiān)測顯示使用未修飾和3'修飾引物的ATIRgDNA擴(kuò)增效率非常相似。在另一方面，雖然使用未修飾引物的NTC擴(kuò)增的Ct值約為30，但使用2'-脫氧-假異胞苷修飾引物的NTC擴(kuò)增直到第37輪(擴(kuò)增)后也未得到可檢測的信號(hào)。使用未修飾引物的LIG模板擴(kuò)增明確顯示在約250bp處有對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，也顯示在約50bp處有對應(yīng)于引物-二聚體擴(kuò)增子形成的微弱條帶。在另一方面，使用3'-修飾引物的LIG模板擴(kuò)增明確顯示在約250bp處有對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，但未顯示形成了可鑒定的引物-二聚體擴(kuò)增子。實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測顯示使用未修飾和3'修飾引物的LIGgDNA擴(kuò)增效率相似，Ct值分別為26和33。在另一方面，雖然使用未修飾引物的NTC擴(kuò)增的Ct值約為36，但使用2'-脫氧-假異胞苷修飾引物的NTC擴(kuò)增顯示通過50輪擴(kuò)增未形成可檢測的擴(kuò)增子。使用未修飾引物的D10S模板擴(kuò)增明確顯示在約100bp處有對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，也顯示在約50bp處有對應(yīng)于引物-二聚體擴(kuò)增子形成的微弱條帶。在另一方面，使用3'-修飾引物的D10S模板擴(kuò)增明確顯示在約100bp處有對應(yīng)于所需模板擴(kuò)增子的條帶，但未觀察到形成了引物-二聚體擴(kuò)增子。實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測顯示使用未修飾和3，修飾引物的D10SgDNA擴(kuò)增效率非常相似，Ct值分別為23和26。在另一方面，雖然使用未修飾引物的NTC擴(kuò)增的Ct值約為29，但使用2'-脫氧-假異胞苷修飾引物的NTC擴(kuò)增顯示直到第40輪(擴(kuò)增)后也未得到可檢測的信號(hào)。權(quán)利要求1.一種在離其3’末端不超過4個(gè)核堿基處含有至少一個(gè)修飾的嘧啶核堿基的多核苷酸，其中所述修飾的嘧啶核堿基具有以下結(jié)構(gòu)其中R選自-H、-F、-Cl、氰基、硝基、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基、C3-C10芳基醚、C3-C10取代的芳基醚、-CF3、-NR1R1、C3-C6環(huán)狀烷基、C3-C6取代的環(huán)狀烷基、苯基、取代的苯基和C5-C10雜芳基，其中R1選自-H、C1-C6烷基、C1-C6取代的烷基、C3-C10芳基、C3-C10取代的芳基。2.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是-H。3.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C1-C6烷基.4.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C1-C6取代的烷基。5.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C3-C10芳基。6.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是C3-C10取代的芳基。7.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是-CF3。8,如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是氨基。9.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，R是取代的氨基。10.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸，其特征在于R是C3-C6環(huán)狀垸基。11.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸其特征在于，R是C3-C6取代的環(huán)狀烷基。12.如權(quán)利要求l所述的多核苷酸其特征在于R是苯基。13.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸其特征在于，R是取代的苯基。14.如權(quán)利要求1所述的多核苷酸其特征在于，R是雜芳基。15.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，在離所述多核苷酸的3'末端不超過3個(gè)核苷酸處含有至少一個(gè)修飾的嘧啶核堿基。16.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，在離所述多核苷酸的3'末端不超過2個(gè)核苷酸處含有至少一個(gè)修飾的嘧啶核堿基。17.如權(quán)利要求1-14中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸的3'末端核苷酸是至少一個(gè)修飾的核苷酸。18.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸是引物。19.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸在3'末端是可延伸的。20.如權(quán)利要求1-17中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，含有可檢測標(biāo)記、猝滅劑、小溝結(jié)合劑中至少一種或它們的任何組分。21.如權(quán)利要求20所述的多核苷酸，其特征在于，該寡核苷酸是在其3'末端不可延伸的探針。22.-—種延伸引物的方法i)將多核苷酸引物與變性DNA模板退火，從而使該多核苷酸引物與該變性DNA模板一條鏈上的互補(bǔ)多核苷酸序列退火以形成引物-模板復(fù)合物；和ii)延伸該引物-模板復(fù)合物的引物部分以形成雙鏈擴(kuò)增子，其中所述多核苷酸引物是如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。23.如權(quán)利要求22所述的方法，其特征在于，包括在延伸步驟后使該雙鏈擴(kuò)增子變性。24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少一次。25.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少十次。26.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少二十次。27.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少三十次。28.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和變性步驟至少四十次。29.如權(quán)利要求22-28中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在有可延伸的核苷酸三磷酸和不可延伸的核苷酸三磷酸存在下進(jìn)行延伸，從而形成DNA擴(kuò)增子片段。30.如權(quán)利要求29所述的方法，其特征在于，檢測該DNA擴(kuò)增子片段。31.—種延伸引物的方法，包括i)第一多核苷酸引物和第二多核苷酸引物與變性DNA模板的第一鏈和第二鏈退火，使得該第一多核苷酸引物與該變性DNA模板第一鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，該第二多核苷酸引物與該變性DNA模板第二鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，從而形成第一和第二引物-模板復(fù)合物，和ii)延伸該第一和第二引物-模板復(fù)合物中至少一個(gè)的引物部分以形成雙鏈DNA擴(kuò)增子，其中該第一多核苷酸引物或該第二多核苷酸引物中至少一個(gè)是如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，包括在形成步驟后但在退火步驟前使該DNA模板變性以形成變性DNA模板和第二變性DNA模板的第一鏈。33.如權(quán)利要求31-32中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括在延伸步驟后使該雙鏈DNA擴(kuò)增子變性。34.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和該雙鏈DNA擴(kuò)增子的變性步驟至少一次。35.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和該雙鏈DNA擴(kuò)增子的變性步驟至少十次。36.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和該雙鏈DNA擴(kuò)增子的變性步驟至少二十次。'37.如權(quán)利要求33所述的方法，其特征在于，重復(fù)退火、延伸和該雙鏈DNA擴(kuò)增子的變性步驟至少三十次。38.如權(quán)利要求31-37中任一項(xiàng)所述的方法，包括先使多核苷酸探針與變性DNA模板的第一鏈或第二鏈退火，從而使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第一鏈的互補(bǔ)多核苷酸序列退火或使該多核苷酸探針與該變性DNA模板第二鏈的互補(bǔ)寡核苷酸序列退火，再進(jìn)行延伸引物部分的步驟。39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸探針包含至少一個(gè)可檢測標(biāo)記。40.如權(quán)利要求39所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸探針還包含猝滅劑、小溝結(jié)合劑的至少一種或二者。41.如權(quán)利要求38-40中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述多核苷酸探針是如權(quán)利要求21所述的多核苷酸。42.如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在離所述探針的3'末端不超過2個(gè)核苷酸處含有至少一個(gè)所述修飾的嘌呤核堿基。43.如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)所述修飾的嘌呤核堿基離所述探針的3'末端不超過1個(gè)核苷酸。44.如權(quán)利要求38-41中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述修飾的嘌呤核堿基是所述探針的3'末端核苷酸。45.—種連接寡核苷酸的方法，包括i)形成包含與DNA模板退火的第一和第二多核苷酸鏈的復(fù)合物，從而使該第--多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第一互補(bǔ)多核苷酸序列退火和使該第二多核苷酸鏈與該變性DNA模板鏈的第二互補(bǔ)多核苷酸序列退火，其中該變性DNA模板鏈的第二互補(bǔ)多核苷酸序列位于該變性DNA模板鏈的第一互補(bǔ)多核苷酸序列的5'端，禾口ii)在該第一和第二多核苷酸鏈之間形成穩(wěn)定的共價(jià)鍵，其中該第一多核苷酸鏈或第二多核苷酸鏈中至少一個(gè)是如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。46.—種檢測耙多核苷酸序列的方法，包括(a)使靶多核苷酸鏈與第一探針對反應(yīng)，所述第一探針對包含(i)含有與該耙鏈中第一靶區(qū)域互補(bǔ)的序列的第一多核苷酸探針和(ii)含有與該靶鏈中第二耙區(qū)域互補(bǔ)的序列的第二多核苷酸探針，其中該第二區(qū)域位于該第一區(qū)域的5'端并與該第一區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸堿基重疊，該反應(yīng)在能使該第一和第二探針分別與該靶鏈中第一和第二區(qū)域雜交以形成第一雜交復(fù)合物的有效條件下進(jìn)行，(b)切割該第一雜交復(fù)合物中的第二探針以形成含有該靶鏈、該第一探針和該第二探針的第一片段的第二雜交復(fù)合物，其中該第二探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第一探針的3'末端核苷酸，(c)連接該第一探針與該第二探針的雜交片段以形成與該靶鏈雜交的第一連接鏈，(d)使該第一連接鏈變性脫離該靶鏈，和(e)再進(jìn)行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最后一輪中可任選省去步驟(d),其中該第一探針、該第二探針中至少一個(gè)或二者是如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。47.如權(quán)利要求46所述的方法，其特征在于，所述第一區(qū)域與所述第二區(qū)域有一個(gè)核苷酸堿基重疊。48.如權(quán)利要求46-47中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。49.如權(quán)利要求46-47中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。50.如權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。51.如權(quán)利要求46-49中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。52.如權(quán)利要求46-51中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針的3'端以除核苷酸3'羥基以外的基團(tuán)結(jié)尾。53.如權(quán)利要求46-51中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針的所述3'端以核苷酸3'磷酸基團(tuán)結(jié)尾。54.如權(quán)利要求46-53所述的方法，包括(a)使靶互補(bǔ)鏈與第二探針對反應(yīng)，所述第二探針對包含(i)含有與該耙互補(bǔ)鏈中第一區(qū)域互補(bǔ)的序列的第三多核苷酸探針和(ii)含有與該靶互補(bǔ)鏈中第二區(qū)域互補(bǔ)的序列的第四多核苷酸探針，其中該第二區(qū)域位于該第一區(qū)域的5'端并與該第一區(qū)域至少有一個(gè)核苷酸堿基重疊，該反應(yīng)在能使該第三和第四探針分別與該靶互補(bǔ)鏈中第一和第二區(qū)域雜交以形成第三雜交復(fù)合物的有效條件下進(jìn)行，(b)切割該第二雜交復(fù)合物中的第四探針以形成含有該靶互補(bǔ)鏈、該第三探針和該第四探針的第一片段的第四雜交復(fù)合物，其中該第四探針的第一片段的5'末端核苷酸緊鄰該第三探針的3，末端核苷酸，(c)連接該第三探針與該第四探針的雜交片段以形成與該靶互補(bǔ)鏈雜交的第二連接鏈，(d)使該第二連接鏈變性脫離該靶互補(bǔ)鏈，和(e)再進(jìn)行一輪或多輪步驟(a)-(d)，只要在最后一輪中可任選省去步驟(d)。55.如權(quán)利要求54所述的方法，其特征在于，所述第三探針與所述第四探針中至少一個(gè)或二者是如權(quán)利要求1-20中任一項(xiàng)所述的多核苷酸。56.如權(quán)利要求54-55中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第三探針的5，端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。57.如權(quán)利要求54-55中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第三探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。58.如權(quán)利要求54-55中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第四探針的5'端以除核苷酸5'磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。59.如權(quán)利要求54-55中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第四探針的5'端以核苷酸5'羥基結(jié)尾。60.如權(quán)利要求46-59中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一、第二、第三和第四探針的5'端任選以除核苷酸5，磷酸基團(tuán)以外的基團(tuán)結(jié)尾。61.如權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第四探針的3'端以除核苷酸3'羥基以外的基團(tuán)結(jié)尾。62.如權(quán)利要求54-58中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第四探針的所述3'端以核苷酸3'磷酸基團(tuán)結(jié)尾。63.如權(quán)利要求46-62中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，至少一個(gè)所述探針含有可檢測標(biāo)記。64.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是熒光標(biāo)記。65，如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是放射性標(biāo)記。66.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是化學(xué)發(fā)光標(biāo)記。67.如權(quán)利要求63所述的方法，其特征在于，所述標(biāo)記是酶。68.如權(quán)利要求54-63中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一探針和第三探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。69.如權(quán)利要求54-63中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第一探針和第三探針各含有可檢測標(biāo)記。70.如權(quán)利要求69所述的方法，其特征在于，所述第一探針和第三探針上的可檢測標(biāo)記相同。71.如權(quán)利要求54-63中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針和第四探針中至少一個(gè)含有可檢測標(biāo)記。72.如權(quán)利要求54-63中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針和第四探針各含有可檢測標(biāo)記。73.如權(quán)利要求72所述的方法，其特征在于，所述第二探針和第四探針含有相同的可檢測標(biāo)記。74.如權(quán)利要求54-73中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述切割產(chǎn)生了未與所述第二雜交復(fù)合物相連的所述第二探針的第二片段，所述方法還包括檢測所述第二探針的所述第二片段。75.如權(quán)利要求54-73中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述切割產(chǎn)生了未與所述第四雜交復(fù)合物相連的所述第四探針的第二片段，所述方法還包括檢測所述第四探針的所述第二片段。76.如權(quán)利要求74-75中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述第二探針和所述第四探針中至少一個(gè)同時(shí)含有(i)熒光染料和(ii)在熒光染料與熒光激發(fā)能量接觸時(shí)能猝滅熒光發(fā)射的猝滅劑染料，所述切割切開該第二探針和/或第四探針中熒光染料和猝滅劑染料之間的共價(jià)鍵，從而增強(qiáng)該熒光染料的可觀察熒光信號(hào)。77.如權(quán)利要求76所述的方法，其特征在于，所述第二探針和所述第四探針各含有(i)熒光染料和(ii)猝滅劑染料。78.如權(quán)利要求74-75中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法還包括檢測兩種所述第二片段。79.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，所述第二片段含有基本上不與該耙鏈互補(bǔ)的一個(gè)或多個(gè)毗連核苷酸。80.如權(quán)利要求79所述的方法，其特征在于，所述一個(gè)或多個(gè)毗連核苷酸包含l-20個(gè)核苷酸。81.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括將所述第二片段固定到固體支持物上。82.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括將對所述第二片段進(jìn)行電泳。83.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括通過質(zhì)譜法檢測所述第二片段。84.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括在最后一輪后檢測所述第二片段。85.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括在多輪期間或之后檢測所述第二片段。86.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括在所有輪次期間檢測所述第二片段。87.如權(quán)利要求74所述的方法，其特征在于，還包括在至少一輪后檢測所述第一雜交復(fù)合物、第二雜交復(fù)合物或二者。88.如權(quán)利要求1和15-21中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，R是氰基。89.如權(quán)利要求1和15-21中任一項(xiàng)所述的多核苷酸，其特征在于，R是硝基。90.如權(quán)利要求22-87中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，R是氰基。91.如權(quán)利要求22-87中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，R是硝基。全文摘要文中披露了在其3’末端區(qū)域含有某些修飾核堿基的引物及其各種用法，所述引物能減少擴(kuò)增反應(yīng)期間形成的引物-二聚體。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101171343SQ200580049701公開日2008年4月30日申請日期2005年4月14日優(yōu)先權(quán)日2005年4月14日發(fā)明者K·B·穆拉,馬兆春申請人:阿普里拉股份有限公司