專利名稱:一種5－氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種5-氟胞嘧啶核苷的合成方法，具體的說涉及一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法。
背景技術(shù)：
D-D4FC(β-D-2’，3’-雙脫氫雙脫氧-5氟胞嘧啶核苷)是一種新型抗HIV病毒的核苷類藥物。以1次/天或2次/天的劑量服用，可有效地抑制HIV原生菌，抗AZT(齊多呋啶，3’-脫氧-3’-疊氮胸苷)菌株和抗3TC(拉米呋啶，3’-硫代胞苷)菌株及抗其它NRTIs(核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)，NNRTIs(非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑)，PIs(蛋白酶抑制劑)類藥物的HIV變異菌株(AntimicrobAgents Chemother，2002，46(5)1394-1401.)。目前為止，在服用D-D4FC的病體內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)新的HIV變異菌株。重要的是，D-D4FC與除DDI(2’，3’-雙去氧肌苷)的其它病毒抑制劑聯(lián)合用藥無相互抑制作用，且?guī)缀鯚o細(xì)胞毒性，是一種極具潛力的抗HIV藥物。目前，D-D4FC正在美國，法國和德國進(jìn)行II期臨床，其III期臨床也正計劃啟動(CohenC，Katlama C，et al.3th IAS Conference，2005，Rio de Janeiro，Brazil.)。
到目前為止，D-D4FC多為有化學(xué)合成法的報道(J Org Chem，1992，57(14)3887；J MedChem，1999，42(5)859；Bioorg Med Chem Lett，1998，8(22)3245；J Med Chem，1999，42(5)859；Carbohydrate Res.1997，300(4)375；Tetrahedron Lett，2005，468099-8102.)，這些合成路線的收率都比較低，摩爾總收率都在10％左右；化學(xué)合成的條件比較苛刻，需在低溫下操作，工業(yè)化難度比較大；在化學(xué)合成的過程中需要用不可回收的重金屬催化劑，不僅對工人的身體有毒害，而且對環(huán)境也很不友好，不符合現(xiàn)在倡導(dǎo)的綠色友好化學(xué)的主題。
2006年，酶法合成D-D4FC的方法被報道，產(chǎn)率達(dá)到25％(Biocatal and Biotransform，2006，24(4)253-256.)。該方法可一步合成D-D4FC，產(chǎn)品光學(xué)純度高，副產(chǎn)物少，反應(yīng)無污染。然而，此方法受到酶的催化平衡的影響，產(chǎn)率只能達(dá)到25％。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶合成方法，以解決現(xiàn)有化學(xué)方法及酶法合成中總體產(chǎn)率低于25％，耗時長，且不利于工業(yè)化大規(guī)模連續(xù)生產(chǎn)的不足。
本發(fā)明的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，包括如下步驟
將反應(yīng)式中結(jié)構(gòu)式1的胸腺嘧啶核苷在整細(xì)胞存在的緩沖液中與5-氟胞嘧啶進(jìn)行堿基交換反應(yīng)，37℃-50℃反應(yīng)10-40小時，得到結(jié)構(gòu)式2的含氟核苷類似物即5-氟胞嘧啶核苷。
其中反應(yīng)式為 所述的緩沖液為KH2PO4緩沖液、NaH2PO4緩沖液、Tris緩沖液中的一種或幾種的混合。反應(yīng)過程中加入25 mmol/L D-D4T和50 mmol/L 5-FC，并加入含有N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的整細(xì)胞3g；所述的含有N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的整細(xì)胞是乳酸桿菌整細(xì)胞。
優(yōu)選的合成方法為1mL 50mmol//L pH＝6～10的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)及0.1～3g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在37～50℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應(yīng)10～20h。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)體系凍存于-20℃終止。
本發(fā)明公開的方法使D-D4T到D-D4FC的轉(zhuǎn)化率達(dá)到49.4％，相比于化學(xué)合成法約10％和酶法約25％的產(chǎn)率，該法使D-D4FC的產(chǎn)率得到了很大提高；該法在20小時內(nèi)即可達(dá)到49.4％轉(zhuǎn)化率，相比其它方法，時間大大縮短；并且該法中應(yīng)用整細(xì)胞催化，回收方便，可連續(xù)應(yīng)用，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求
書所限定的范圍。
實(shí)施例11mL 50mmol//L pH＝8的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC 6.4mg(50mmol/L)，及1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應(yīng)12.5h。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細(xì)胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
實(shí)施例21mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6 mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)，及2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應(yīng)12.5h。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細(xì)胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
實(shí)施例31mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 5.6mg(25 mmol/L)，5-FC6.4mg(50 mmol/L)，及1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應(yīng)100h。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細(xì)胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
實(shí)施例41mL 50mmol//L pH＝6.85的NaH2PO4緩沖液中，加入D-D4T 11.2mg(50mmol/L)，5-FC12.8mg(100mmol/L)，及1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口。在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應(yīng)12.5h。反應(yīng)結(jié)束，將反應(yīng)體系凍存于-20℃終止。樣品解凍后以10000r/min，15min離心去除整細(xì)胞，所得清液過濾后，用于HPLC檢測。
反應(yīng)過程中定性分析采用TLC法二氯甲烷-甲醇-水(8∶2∶0.25，v/v)為展開劑，紫外顯色；反應(yīng)混合物凍干后以甲醇萃取并減壓蒸干，所得固體混合物過硅膠層析柱(20％CH3OH/CH2Cl2，v/v)純化；反應(yīng)混合物離心去除整細(xì)胞并過濾處理后，可用于HPLC定量檢測。
權(quán)利要求
1.一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，包括步驟(1)1mL 50mmol緩沖液，加人25mmol/L胸腺嘧啶核苷，50-100mmol/L5-氟胞嘧啶，pH6～10進(jìn)行堿基交換反應(yīng)；(2)加人0.1～3g含有N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的整細(xì)胞，37℃-50℃，反應(yīng)10-40小時，結(jié)束后將反應(yīng)體系凍存于-20℃終止。
2.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，其特征在于所述的緩沖液是KH2PO4緩沖液、NaH2PO4緩沖液或Tris緩沖液中的一種或幾種的混合。
3.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，其特征在于所述的含有N-脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶的整細(xì)胞是乳酸桿菌整細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，其特征在于所述的1.2g乳酸桿菌于5mL的錐形瓶中，以多層紗布封口，在40℃空氣搖床中以120r/min振蕩反應(yīng)12.5h。
5.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，其特征在于所述的50mmol/L5-氟胞嘧啶及2g乳酸桿菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求
1所述的一種5-氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，其特征在于所述的100mmol/L5-氟胞嘧啶及1.2g乳酸桿菌。
專利摘要
本發(fā)明公開了一種5－氟胞嘧啶核苷的整細(xì)胞酶促合成方法，包括胸腺嘧啶核苷在整細(xì)胞(含有N－脫氧核糖轉(zhuǎn)移酶)存在的緩沖液中與5－氟胞嘧啶進(jìn)行堿基交換反應(yīng)，37℃－50℃反應(yīng)10－20小時，得含氟核苷類似物即5－氟胞嘧啶核苷。該方法中5－氟胞嘧啶核苷產(chǎn)率在20小時內(nèi)可達(dá)到49.4％，相比于其它合成方法，產(chǎn)率提高，時間縮短，并且該法應(yīng)用整細(xì)胞催化，回收方便，可連續(xù)應(yīng)用，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號C12P19/00GK1995370SQ200610118924
公開日2007年7月11日 申請日期2006年11月30日
發(fā)明者朱利民, 戚娜 申請人:東華大學(xué)導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan