專(zhuān)利名稱(chēng)：嬰幼兒米粉中核苷酸含量檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種嬰幼兒米粉中核苷酸含量的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
核苷酸包括胞嘧啶核苷酸、腺嘌呤核苷酸、尿嘧啶核苷酸、鳥(niǎo)嘌呤核苷酸和次黃嘌呤核苷酸，分別簡(jiǎn)稱(chēng)為CMP、AMP、UMP、GMP和IMP，核苷酸可以維持免疫系統(tǒng)的正常功能，提高人體對(duì)各類(lèi)病菌的抵抗力。核苷酸能促進(jìn)小腸成熟，改善腸道吸收功能。還可以刺激雙歧桿菌生長(zhǎng)，減少嬰兒便秘、腹瀉的發(fā)生。此外核苷酸還有極好的抗氧化作用，維持肝臟的正常功能。目前公司新推出的嬰幼兒米粉產(chǎn)品中便添加了核苷酸，對(duì)于食品中核苷酸的含量測(cè)定，國(guó)標(biāo)中尚未有相應(yīng)的檢測(cè)方法。因此，開(kāi)發(fā)嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測(cè)方法對(duì)調(diào)配出最適于嬰幼兒成長(zhǎng)所需的含核苷酸米粉有著重要意義。因谷基中含較多淀粉和植物蛋白，樣品溶解后呈糊狀，容易造成干擾和過(guò)濾困難，因此加入高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶進(jìn)行酶解解決存在問(wèn)題。為將谷基樣品中的核苷酸充分提取出來(lái)，本方法采用超聲提取，再進(jìn)行離心凈化。最大限度減少損失和干擾，提高了實(shí)驗(yàn)的可行性和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供ー種嬰幼兒米粉中核苷酸含量的檢測(cè)方法。g在以方便、快捷、準(zhǔn)確地檢測(cè)嬰幼兒米粉中核苷酸的含量。本發(fā)明，其原理是將嬰幼兒米粉中的淀粉和植物蛋白先用高峰氏淀粉酶和木瓜蛋白酶酶解后，利用超聲波提取，高速離心凈化，經(jīng)紫外檢測(cè)器測(cè)定，外標(biāo)法定量。本發(fā)明，包括如下工作步驟
(I)試劑準(zhǔn)備，所用試劑包括
Ca)甲醇色譜純；
(b)四丁基硫酸氫銨色譜純；
(c)磷酸氫ニ鉀分析純；
(d)磷酸ニ氫鉀色譜純；
Ce)こ酸優(yōu)級(jí)純；
Cf)木瓜蛋白酶酶活カ彡600U/g，0. 2-0. 4g ；
(g)高峰氏淀粉酶酶活カ彡4000U/g,O. 2-0. 4g ；
(h)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:純度彡98% ；
(i)0.lmol/L磷酸ニ氫鉀溶液稱(chēng)取13. 60g磷酸ニ氫鉀用超純水溶解并定容至IOOOmL ；
(j)0. lmol/L磷酸氫ニ鉀溶液稱(chēng)取2. 28g磷酸氫ニ鉀用超純水溶解并定容至IOOmL ；
(k) 100mL/Lこ酸溶液吸取IOmLこ酸，加超純水定容至IOOmL ；(1)含I.40mmol/L四丁基硫酸氫銨的O. Olmol/L磷酸二氫鉀緩沖液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氫鉀溶液，加O. 4753g四丁基硫酸氫銨，用O. lmol/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH至3. 3，用超純水定容到IOOOmL ；
Cm)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)混合液分別準(zhǔn)確稱(chēng)取核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg,混合后用超純水溶解并定容至100ml，此標(biāo)準(zhǔn)混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各為 100-20(^g/mL ；
(η)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)工作液分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5個(gè)IOOml容量瓶中，加超純水定容至IOOmL,配成核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液；
(2)儀器設(shè)備，儀器設(shè)備包括
Ca)高效液相色譜儀島津LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器；(b)電子天平精確至O.OOOlg ；
(c)超聲波提取器；
(d)高速離心機(jī)；
(3)樣品處理:
(a)酶解稱(chēng)取樣品5g-10g，精確至Img,置于100mL_200mL三角瓶中，加入O.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h ；
(b)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲提取10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調(diào)pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容；
(c)高速離心凈化過(guò)濾定容后樣液轉(zhuǎn)入50mL離心管于10000r/min的離心機(jī)離心5min,上清液經(jīng)中速濾紙過(guò)濾，用一次性注射器吸取濾液l_2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過(guò)濾，濾液即為最終樣液，供HPLC測(cè)定。保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量；
(4)色譜條件，色譜條件包括
Ca)色譜柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相當(dāng)者；
(b)進(jìn)樣量10μ ；
(c)流速1.OmL/min ；
(d)紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm;
(e)柱溫25°C；
(f)流動(dòng)相4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，低壓濃度洗脫；
(5)定量分析
(a)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；
(b)試液測(cè)定將制備好的樣液注入高效液相色譜儀，測(cè)得相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，測(cè)得試液濃度；
(C)計(jì)算，計(jì)算公式為X=CXV1X 100/(mX 1000)，式中
X :試樣中核苷酸各組分的含量，單位為mg/100g ；
C :由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試液濃度，單位為Pg/mL ；
V1 :試樣定容體積，單位為mL ； m:試樣質(zhì)量，單位為g ；試樣中核苷酸含量ΖζΧ^Χλμρ+Χ^ρ+Χ^Χ^ρ。本方法流動(dòng)相為4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，pH為3. 3。流動(dòng)相比例和pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響非常大，所以必須嚴(yán)格控制，且標(biāo)準(zhǔn)曲線和流動(dòng)相必須同一天配制和使用。本發(fā)明，在嬰幼兒米粉中檢測(cè)核苷酸的含量，具有方便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。對(duì)調(diào)配出最適于嬰幼兒成長(zhǎng)所需的含核苷酸米粉有著重要意義。


圖I為核苷酸含量標(biāo)準(zhǔn)色譜圖；圖2為樣品核苷酸色譜圖；圖3為CMP峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖4為AMP峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖5為UMP峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖6為GMP峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖7為IMP峰面積與濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖；圖中，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度，縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)應(yīng)的峰面積。在圖I和圖2中，出峰順序以核苷酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單標(biāo)進(jìn)樣確定為CMP、AMP、UMP、GMP、IMP，保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。
具體實(shí)施例方式一種嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測(cè)方法，包括如下工作步驟
(I)試劑準(zhǔn)備，所用試劑包括
(a)甲醇色譜純；
(b)四丁基硫酸氫銨色譜純；
(C)磷酸氫二鉀分析純；
(d)磷酸二氫鉀色譜純；
Ce)乙酸優(yōu)級(jí)純；
Cf)木瓜蛋白酶酶活力彡600U/g，0. 2g ；
(g)高峰氏淀粉酶酶活力彡4000U/g,O. 2g ；
(h)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:純度彡98% ；
(i)0.lmol/L磷酸二氫鉀溶液稱(chēng)取13. 60g磷酸二氫鉀用超純水溶解并定容至IOOOmL ；
(j)0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液稱(chēng)取2. 28g磷酸氫二鉀用超純水溶解并定容至IOOmL ；
(k) 100mL/L乙酸溶液吸取IOmL乙酸，加超純水定容至IOOmL ；
(I)含I. 40mmol/L四丁基硫酸氫銨的O. 01mol/L磷酸二氫鉀緩沖液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氫鉀溶液，加0. 4753g四丁基硫酸氫銨，用0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH至3. 3，用超純水定容到IOOOmL ；
Cm)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)混合液分別準(zhǔn)確稱(chēng)取核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMPlOmg、AMP20mg、UMPIOmg,GMPlOmg和MPlOmg，混合后用超純水溶解并定容至100ml，此標(biāo)準(zhǔn)混合液中，CMP含量為lOOPg/mL，AMP 含量為 20(^g/mL，UMP 含量為 lOOPg/mL，GMP 含量為 lOOPg/mL，IMP 含量為lOOM-g/mL ；
(η)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)工作液分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5個(gè)IOOml容量瓶中，加超純水定容至IOOmL,配成核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液；(2)儀器設(shè)備，儀器設(shè)備包括
Ca)高效液相色譜儀島津LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器；
(b)電子天平精確至O.OOOlg ；
(c)超聲波提取器；
(d)高速離心機(jī)；
(3)樣品處理:
(d)酶解稱(chēng)取樣品5g，精確至lmg，置于IOOmL三角瓶中，加入O.2g高峰氏淀粉酶，O. 2g木瓜蛋白酶，加入30mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2_4h ；
(e)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲提取10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調(diào)pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容；
Cf)高速離心凈化過(guò)濾定容后樣液轉(zhuǎn)入50mL離心管于10000r/min的離心機(jī)離心5min,上清液經(jīng)中速濾紙過(guò)濾，用一次性注射器吸取濾液l_2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過(guò)濾，濾液即為最終樣液，供HPLC測(cè)定。保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量；
(4)色譜條件，色譜條件包括
Ca)色譜柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相當(dāng)者；
(b)進(jìn)樣量10μ ；
(c)流速1.OmL/min ；
(d)紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm;
(e)柱溫25°C；
(f)流動(dòng)相4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，低壓濃度洗脫；
(5)定量分析
(a)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3-圖7所示。利用高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析時(shí)，可直接讀出峰面積的數(shù)值；
(b)試液測(cè)定將制備好的樣液注入高效液相色譜儀，測(cè)得相應(yīng)的峰面積，以圖3-圖7標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，測(cè)得樣液中UMP的濃度為I. 907Pg/mL、AMP的濃度為0. 724ug/ml、GMP的濃度為4. 904ug/ml、IMP的濃度為I. 056ug/ml、CMP含量未檢出；
(c)根據(jù)公式X=CXV1X100/(mX 1000)可計(jì)算得出樣品中UMP的含量為3. 80mg/100g、AMP 含量為 I. 44mg/100g、GMP 含量為 9. 76mg/100g、MP 含量為 2. 10mg/100g、CMP含量未檢出；
權(quán)利要求
1.一種嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測(cè)方法，包括樣品酶解、超聲波提取、高速離心凈化過(guò)濾、色譜條件和定量分析，其特征在于包括如下工作步驟 (1)酶解稱(chēng)取樣品5g-10g，精確至Img,置于100mL-200mL三角瓶中，加入0.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h ； (2)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調(diào)pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容； (3)高速離心凈化過(guò)濾定容后樣液轉(zhuǎn)入50mL離心管于10000r/min的離心機(jī)離心5min，上清液經(jīng)中速濾紙過(guò)濾，用一次性注射器吸取濾液l-2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過(guò)濾；供HPLC測(cè)定，外標(biāo)法定量。
2.—種嬰幼兒米粉中核苷酸的含量檢測(cè)方法，包括如下工作步驟 (I)試劑準(zhǔn)備，所用試劑包括 (a)甲醇色譜純； (b)四丁基硫酸氫銨色譜純； (c)磷酸氫二鉀分析純； (d)磷酸二氫鉀色譜純； Ce)乙酸優(yōu)級(jí)純； Cf)木瓜蛋白酶酶活力彡600U/g，0. 2-0. 4g ； (g)高峰氏淀粉酶酶活力彡4000U/g,0. 2-0. 4g ； (h)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品，包括CMP、AMP、UMP、GMP和MP:純度彡98% ； (i)0.lmol/L磷酸二氫鉀溶液稱(chēng)取13. 60g磷酸二氫鉀用超純水溶解并定容至10OOmT,； (j)0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液稱(chēng)取2. 28g磷酸氫二鉀用超純水溶解并定容至IOOmL ； (k) 100mL/L乙酸溶液吸取IOmL乙酸，加超純水定容至IOOmL ； (1)含I.40mmol/L四丁基硫酸氫銨的0. 01mol/L磷酸二氫鉀緩沖液取IOOmLO. Imol/L磷酸二氫鉀溶液，加0. 4753g四丁基硫酸氫銨，用0. lmol/L磷酸氫二鉀溶液調(diào)pH至3. 3，用超純水定容到IOOOmL ； Cm)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)混合液分別準(zhǔn)確稱(chēng)取核苷酸標(biāo)準(zhǔn)品CMP、AMP、UMP、GMP、IMP各10-20mg,混合后用超純水溶解并定容至100ml，此標(biāo)準(zhǔn)混合液中的CMP、AMP、UMP、GMP、IMP含量各為 100-200l^g/mL ； (n)核苷酸標(biāo)準(zhǔn)工作液分別吸取標(biāo)準(zhǔn)混合液2mL、4mL、6mL、8mL、10mL于5個(gè)IOOml容量瓶中，加超純水定容至IOOmL,配成核苷酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作液； (2)儀器設(shè)備，儀器設(shè)備包括 Ca)高效液相色譜儀島津LC-20AT泵，SPD-20A紫外檢測(cè)器； (b)電子天平精確至0.OOOlg ； (c)超聲波提取器； (d)高速離心機(jī)； (3)樣品處理:(a)酶解稱(chēng)取樣品5g-10g，精確至lmg,置于100mL-200mL三角瓶中，加入0.2-0. 4g高峰氏淀粉酶，0. 2-0. 4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50°C水，攪拌均勻，置50°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h ； (b)超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲提取10-20min，取出冷卻至室溫，用100mL/L乙酸溶液調(diào)pH至3. 3，將試樣移入IOOmL容量瓶，用超純水定容； (c)高速離心凈化過(guò)濾定容后樣液轉(zhuǎn)入50mL離心管于10000r/min的離心機(jī)離心5min,上清液經(jīng)中速濾紙過(guò)濾，用一次性注射器吸取濾液l_2mL經(jīng)0. 45Mm水系濾膜過(guò)濾，濾液即為最終樣液，供HPLC測(cè)定，保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量； (4)色譜條件，色譜條件包括 Ca)色譜柱CAPCELL PAK C18 (250 mmX4. 6mm, 5Mm)或相當(dāng)者； (b)進(jìn)樣量:10ML；(c)流速1.OmL/min ； (d)紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)254nm; (e)柱溫25°C； (f)流動(dòng)相4%甲醇-96%磷酸鹽緩沖液，低壓濃度洗脫； (5)定量分析 (a)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液分別注入高效液相色譜儀，測(cè)定相應(yīng)的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； (b)試液測(cè)定將制備好的樣液注入高效液相色譜儀，測(cè)得相應(yīng)的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，測(cè)得試液濃度； (c)計(jì)算，計(jì)算公式為X=CXV1X100/(mX 1000)，式中 X :試樣中核苷酸各組分的含量,單位為mg/100g ； C :由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試液濃度，單位為Pg/mL ； V1 :試樣定容體積，單位為mL ； m:試樣質(zhì)量，單位為g ； 試樣中核苷酸含量ZzXeMp+X.+X^p+X^X^p。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種嬰幼兒米粉中核苷酸含量的檢測(cè)方法。包括如下工作步驟包括樣品酶解、超聲波提取、高速離心凈化過(guò)濾、色譜條件和定量分析，其中酶解稱(chēng)取樣品5g-10g，置于100mL-200mL三角瓶中,加入0.2-0.4g高峰氏淀粉酶，0.2-0.4g木瓜蛋白酶，加入30-60mL40-50℃水，攪拌均勻，置50℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2-4h；超聲波提取將酶解后的樣品置于超聲波振蕩器上超聲，用乙酸溶液調(diào)pH值，用超純水定容；高速離心凈化過(guò)濾樣液經(jīng)離心機(jī)離心后，上清液經(jīng)中速濾紙過(guò)濾，再經(jīng)0.45μm水系濾膜過(guò)濾，供HPLC測(cè)定，外標(biāo)法定量。在嬰幼兒米粉中檢測(cè)核苷酸的含量，具有方便、快捷、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102621261SQ20121002922
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月9日
發(fā)明者林旭彬, 陳潤(rùn)漢, 黃樹(shù)杰 申請(qǐng)人:廣東東泰乳業(yè)有限公司