專利名稱：高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，尤其涉及均勻、大小厚度可控基質(zhì)薄膜制備方法，以及樣品定量分析方法。本發(fā)明的原理基于將能夠吸收激光能量的有機(jī)分子在恒定高壓下壓縮成薄膜(Compressed Matrix Thin Film,簡(jiǎn)稱為CMTF)，所制得的基質(zhì)薄膜既能實(shí)現(xiàn)普通方法所得基質(zhì)吸收激光能量的功能，又能作為疏水薄膜吸附樣品分子，而使無(wú)機(jī)鹽原位水洗除去，并且消除樣品在靶上的擴(kuò)散，提高方法的靈敏度。該方法還能處理固體樣品，提高了應(yīng)用范圍。
背景技術(shù)：
基質(zhì)輔助激光解析離解質(zhì)譜是廣泛應(yīng)用的一種分析技術(shù)，該技術(shù)利用可吸收激光能量的有機(jī)小分子基質(zhì)與樣品混合，并將能量傳遞給樣品分子，使之汽化并離子化，再被質(zhì)量分析器檢測(cè)。在該技術(shù)中，有機(jī)小分子基質(zhì)與樣品分子混合模式是關(guān)鍵，因?yàn)樗苯佑绊懛治鼋Y(jié)果的準(zhǔn)確度、分辨率以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重現(xiàn)性和定量分析的能力?，F(xiàn)有的技術(shù)中，常常采用有機(jī)溶劑先溶解基質(zhì)，再讓基質(zhì)溶液與樣品溶液混合，待溶劑揮發(fā)后，樣品與基質(zhì)分子形成混晶?，F(xiàn)有技術(shù)的主要缺點(diǎn)在于很難形成大小均勻，形貌可控的晶體，從而使得激光在不同掃描時(shí)間所獲得的圖譜不具有重現(xiàn)性，信號(hào)強(qiáng)度與樣品量之間沒(méi)有定量關(guān)系。并且，由于晶體大小和形貌的差異，造成激光轟擊樣品分子之后所得離子的初速度和方向不同，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分辨率和質(zhì)量準(zhǔn)確度。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的旨在提供一種高壓成型基質(zhì)薄膜(CMTF)輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，具體為將有機(jī)小分子基質(zhì)在高壓下壓制成均勻、大小厚度可控的薄膜，避免溶劑重結(jié)晶過(guò)程的不確定性，獲得的基質(zhì)薄膜既能吸收紫外光，又能作為反相疏水層吸附樣品分子，而使無(wú)機(jī)鹽被原位水洗除去。同時(shí)，本方法提供的疏水表面還能避免樣品溶液在樣品靶表面的擴(kuò)散，提高方法的靈敏度。本方法無(wú)需有機(jī)溶劑重結(jié)晶過(guò)程，可以處理固體樣品，擴(kuò)大應(yīng)用范圍。本方法所獲得的譜圖信號(hào)穩(wěn)定，信號(hào)強(qiáng)度與樣品量之間有良好的線性關(guān)系，重現(xiàn)性好，靈敏度高。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案:一種高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，該方法將有機(jī)小分子基質(zhì)在高壓下壓制成薄膜，再將薄膜粘在質(zhì)譜儀的樣品靶上，樣品點(diǎn)在薄膜上并自然風(fēng)干，將樣品原位洗滌除去無(wú)機(jī)鹽，自然風(fēng)干后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的有機(jī)小分子基質(zhì)包括:α -氰基-4-羥基肉桂酸(，α -cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA), 2, 5 二輕基苯甲酸(2, 5-dihydroxybenzoicacid, DHB)。本發(fā)明的 技術(shù)方案中，所述的有機(jī)小分子基質(zhì)在高壓下壓制成薄膜，是將有機(jī)小分子基質(zhì)單獨(dú)壓制成薄膜，或者與固體樣品混合后壓制成薄膜。
本發(fā)明的技術(shù)方案中，基質(zhì)單獨(dú)壓制成薄膜的方法步驟包括:1)、稱取基質(zhì)α -氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸，基質(zhì)的種類和量根據(jù)不同的樣品而定；2)、將步驟1)得到的基質(zhì)用瑪瑙研缽磨細(xì)，使其顆粒大小小于2 μ m ;3)、將步驟2)得到的基質(zhì)粉末放入壓片機(jī)的模具，模具面積50X70mm，再放入壓片機(jī)，施加4800kg壓力，并在此壓力下保持I分鐘；4)、將步驟3)壓制的基質(zhì)薄膜取出，保存在室溫即可。本發(fā)明的技術(shù)方案中，基質(zhì)與固體樣品混合后壓制成薄膜的方法步驟包括:1)、稱取基質(zhì)α -氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸，基質(zhì)的種類和量據(jù)不同的樣品而定；稱取固體樣品；2)、將步驟1)得到的基質(zhì)和固體樣品用瑪瑙研缽磨細(xì)，使其顆粒大小小于2 μ m，以便使壓制得到的基質(zhì)薄膜大小和厚度均勻；3)、將步驟2)得到的基質(zhì)和固體樣品粉末，按基質(zhì)與固體樣品摩爾比為300: I比例混合，放入壓片機(jī)的模具，模具面積50 X 70mm,再放入壓片機(jī),施加4800kg壓力，并在此壓力下保持I分鐘；4)、將步驟3)壓制的薄膜取出，所得薄膜可直接進(jìn)行激光解析離解質(zhì)譜分析。本發(fā)明的技術(shù)方案中，所述的樣品原位洗滌除去無(wú)機(jī)鹽的方法是，使用移液器將IOy I或更多濃度0.1wt % TFA(三氟乙酸)水溶液將樣品點(diǎn)完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無(wú)塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無(wú)機(jī)鹽被除去，重復(fù)洗2-3次。本發(fā)明的高 壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，分析蛋白質(zhì)樣品:取一定量蛋白的酶解液，將樣品調(diào)至酸性，pH 1-2，使用移液器將I μ I樣品點(diǎn)在樣品靶，等待其自然風(fēng)干后，使用移液器將 ο μ I或更多濃度0.lwt%三氟乙酸水溶液將樣品點(diǎn)完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無(wú)塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無(wú)機(jī)鹽被除去，重復(fù)洗2-3次，自然風(fēng)干后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析；所述的蛋白質(zhì)為α酪蛋白。激光束以一定頻率轟擊樣品分子，由于按照此法制得的樣品和基質(zhì)均勻分布，因此采得的信號(hào)穩(wěn)定，信號(hào)絕對(duì)強(qiáng)度與樣品的量具有良好的線性關(guān)系，可以進(jìn)行定量分析，本發(fā)明的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，分析固體樣品:將固體樣品與基質(zhì)按照摩爾比為1: 300的比例混合并按照上述的方法制備成薄膜，所得薄膜可直接進(jìn)行激光解析離解質(zhì)譜分析；所述的固體樣品為α酪蛋白酶解液的冷凍干燥干粉。本發(fā)明的效果和優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，所得基質(zhì)薄膜表面均勻，大小厚度可控，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需有毒有害試劑，綠色環(huán)保。2.整個(gè)制備過(guò)程簡(jiǎn)單，容易控制，耗能少，質(zhì)量穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，并且易于表征，成本低，適合于進(jìn)行大規(guī)模實(shí)際生產(chǎn)，便于質(zhì)量控制和產(chǎn)業(yè)化。由于基質(zhì)輔助激光解析離解質(zhì)譜是廣泛應(yīng)用的分析技術(shù)，因此本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景。3.與現(xiàn)有基質(zhì)制備方法相比，本發(fā)明無(wú)需有機(jī)試劑，不僅綠色環(huán)保，而且消除了重結(jié)晶過(guò)程的不確定性。本發(fā)明所制得基質(zhì)薄膜均勻，所獲得信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定，絕對(duì)信號(hào)強(qiáng)度與樣品量之間的良好線性關(guān)系，可以進(jìn)行樣品定量分析。
4.樣品原位除鹽洗脫容易，金屬離子加合物干擾小，分析速度快。以下結(jié)合附圖和實(shí)施例進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明。


圖1-A為實(shí)施例1高壓成型制備的DHB薄膜圖1-B為實(shí)施例1高壓成型制備的CHCA薄膜圖1-C為DHB高壓成型薄膜的100倍顯微鏡1-D為CHCA高壓成型薄膜的100倍顯微鏡1-E為重結(jié)晶的DHB的100倍顯微鏡下1-F為重結(jié)晶的CHCA的100倍顯微鏡圖以上圖片顯示，高壓成型基質(zhì)薄膜表面光滑均勻，而重結(jié)晶所獲得晶體大小形狀不一。下面圖2-圖5是實(shí)施例2所得產(chǎn)物進(jìn)行樣品分析總離子流圖。圖2是為DHB重結(jié)晶法所得總離子流圖。圖3為DHB高壓成型基質(zhì)薄膜所得總離子流4為CHCA重結(jié)晶法所得總離子流5為CHCA高壓成型基質(zhì)薄膜所得總離子流2-圖5顯示高壓成型基質(zhì)薄膜上所獲得信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小。下面圖6-圖9是實(shí)施例3高壓成型基質(zhì)薄膜原位除鹽效果6為α -酪蛋白酶解液在DHB基質(zhì)的質(zhì)譜中，箭頭所指為鈉和鉀加合物峰。圖7為α -酪蛋白酶解液在DHB基質(zhì)上原位除鹽后所得質(zhì)譜圖由圖可見(jiàn)，鈉峰和鉀峰明顯降低。圖8為α -酪蛋白酶解液在CHCA基質(zhì)的質(zhì)譜中箭頭所指為鈉和鉀加合物峰。圖9為α -酪蛋白酶解液在CHCA基質(zhì)上原位除鹽后所得質(zhì)譜圖由圖可見(jiàn)，鈉峰和鉀峰明顯降低。圖10是實(shí)施例4高壓成型基質(zhì)薄膜分析固體樣品質(zhì)譜中:α -酪蛋白酶解液冷凍干粉樣品直接與CHCA基質(zhì)混合后高壓成型，然后進(jìn)行質(zhì)譜分析，可見(jiàn)所獲得質(zhì)譜圖與常規(guī)分析法所獲得質(zhì)譜圖一致。下面圖11-圖13是實(shí)施例5高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜法的定量分析能力圖11是m/zl337多肽的工作曲線圖由圖可見(jiàn)，線性范圍為l.0yg-0.005 μ g，相關(guān)系數(shù)平方分別為0.7066。.
圖12是m/z 1759多肽的工作曲線圖由圖可見(jiàn)，，線性范圍為1.0 μ g-0.005 μ g，相關(guān)系數(shù)平方為0.8917。圖13是m/z2316多肽的工作曲線圖由圖可見(jiàn)，線 性范圍為L(zhǎng) O μ g-0.005 μ g，相關(guān)系數(shù)平方分0.9629。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1高壓成型基質(zhì)薄膜的制備，制備步驟依次如下:I)、用分析天平稱取一定量的基質(zhì)，比如50mgCHCA(α -cyano-4-hydroxycinnamic acid)和 12mg DHB(2,5-dihydroxybenzoic acid),基質(zhì)的種類和量可據(jù)不同的樣品而定；2)、將步驟I)得到的基質(zhì)用瑪瑙研缽磨細(xì)，使其顆粒大小小于2 μ m ;3)、將步驟2)得到的基質(zhì)粉末放入壓片機(jī)的磨具，再放入壓片機(jī)，施加4800kg壓力，并在此壓力下保持I分鐘；4)、將步驟3)壓制得基質(zhì)薄膜(CMTF)取出，保存在室溫。其中，步驟4)所得CHCA薄膜的圖片如圖1_A所示，所得DHB薄膜的圖片如圖1_B所示，圖中顯示所得基質(zhì)薄膜表面光滑，基質(zhì)均勻。步驟4)所得CHCA薄膜和DHB薄膜在100倍顯微鏡放大后分別如圖1-C和圖1-D所示，與結(jié)晶法所得CHCA薄膜(圖1-E)及DHB薄膜(圖1-F)相比，基質(zhì)分布均勻，而結(jié)晶法所得晶體顆粒大小和形狀不均。實(shí)施例2實(shí)施例1制備的高壓成型基質(zhì)薄膜用于樣品分析信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定性I)、將實(shí)施例1制備的高壓成型基質(zhì)薄膜粘在樣品靶上；2)、將α-酪蛋白酶解液樣品調(diào)至pH 1_2，使用移液器將I μ I樣品點(diǎn)在薄膜上不同的樣品點(diǎn)位置，并讓其自然風(fēng)干；3)、取10 μ I濃度0.1wt % TFA水溶液使其覆蓋樣品點(diǎn)，保持2秒鐘，用無(wú)塵紙吸掉水珠，重復(fù)3次；4)、將樣品靶放入質(zhì)譜儀；5)、使用一定頻率的激光轟擊樣品，使待測(cè)樣品氣化并離子化，并檢測(cè)其信號(hào)強(qiáng)度；其中，步驟5)所獲得DHB高壓成型基質(zhì)薄膜總離子流圖如圖3所示，CHCA高壓成型基質(zhì)薄膜總離子流圖如圖5所示，與DHB重結(jié)晶法所得總離子流圖(圖2)及CHCA重結(jié)晶法所得總離子流圖(圖4)相比，高壓成型基質(zhì)薄膜法所獲得信號(hào)強(qiáng)度穩(wěn)定，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小。表I列出了用不同方法重復(fù)測(cè)量所獲得信號(hào)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，可見(jiàn)高壓成型基質(zhì)薄膜法明顯優(yōu)于結(jié)晶法。結(jié)晶法由于晶體大小不均，晶體顆粒在靶上的分布不均，不均導(dǎo)致信號(hào)強(qiáng)度不均，甚至使激光掃描時(shí)不能轟擊到樣品(如圖中箭頭所指位置)。
表1.不同方法所獲得的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 ^
權(quán)利要求
1.一種高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，其特征在于，該方法將有機(jī)小分子基質(zhì)在高壓下壓制成薄膜，再將薄膜粘在質(zhì)譜儀的樣品靶上，樣品點(diǎn)在薄膜上并自然風(fēng)干，將樣品原位洗滌除去無(wú)機(jī)鹽，自然風(fēng)干后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，其特征在于，所述的有機(jī)小分子基質(zhì)包括:α -氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，其特征在于，所述的有機(jī)小分子基質(zhì)在高壓下壓制成薄膜，是將有機(jī)小分子基質(zhì)單獨(dú)壓制成薄膜，或者與固體樣品混合后壓制成薄膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，其特征在于，基質(zhì)單獨(dú)壓制成薄膜的方法步驟包括: 1)、稱取基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5二羥基苯甲酸，基質(zhì)的種類和量根據(jù)不同的樣品而定； 2)、將步驟I)得到的基質(zhì)用瑪瑙研缽磨細(xì)，使其顆粒大小小于2μ m ; 3)、將步驟2)得到的基質(zhì)粉末放入壓片機(jī)的模具，模具面積50X 70mm，再放入壓片機(jī)，施加4800kg壓力，并在此壓力下保持I分鐘； 4)、將步驟3)壓制的基質(zhì)薄膜取出，保存在室溫即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，其特征在于，基質(zhì)與固體樣品混合后壓制成薄膜的方法步驟包括: 1)、稱取基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5 二羥基苯甲酸，基質(zhì)的種類和量據(jù)不同的樣品而定；稱取固體樣品； 2)、將步驟I)得到的基質(zhì)和固體樣品用瑪瑙研缽磨細(xì)，使其顆粒大小小于2μ m ; 3)、將步驟2)得到的基質(zhì)和固體樣品粉末，按基質(zhì)與固體樣品摩爾比為300: I比例混合，放入壓片機(jī)的模具，模具面積50 X 70mm,再放入壓片機(jī),施加4800kg壓力，并在此壓力下保持I分鐘； 4)、將步驟3)壓制的薄膜取出，所得薄膜可直接進(jìn)行激光解析離解質(zhì)譜分析。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法，其特征在于，所述的樣品原位洗滌除去無(wú)機(jī)鹽的方法是，使用移液器將10 μ I或更多1%三氟乙酸水溶液將樣品點(diǎn)完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無(wú)塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無(wú)機(jī)鹽被除去，重復(fù)洗2-3次。
7.權(quán)利要求1所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法分析蛋白質(zhì)樣品，其特征在于:取一定量蛋白的酶解液，將樣品調(diào)至酸性，ΡΗ1-2，使用移液器將I μ I樣品點(diǎn)在樣品靶，等待其自然風(fēng)干后，使用移液器將10 μ I或更多濃度0.lwt%三氟乙酸水溶液將樣品點(diǎn)完全覆蓋，保持2秒鐘，再用無(wú)塵紙吸取樣品上的水，樣品中所含的無(wú)機(jī)鹽被除去，重復(fù)洗2-3次，自然風(fēng)干后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析；所述的蛋白質(zhì)為α酪蛋白。
8.權(quán)利要求1所述的高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法分析固體樣品，其特征在于:將固體樣品與基質(zhì)按照摩爾比為1: 300的比例混合并按照權(quán)利要求5所述的方法制備成薄膜，所得薄膜可直接進(jìn)行激光解析離解質(zhì)譜分析；所述的固體樣品為α酪蛋白酶解液的冷凍干燥干粉。
全文摘要
一種高壓成型基質(zhì)薄膜輔助-激光解析離解質(zhì)譜定量分析方法。該方法將有機(jī)小分子基質(zhì)在高壓下壓制成薄膜，再將薄膜粘在質(zhì)譜儀的樣品靶上，樣品點(diǎn)在薄膜上并自然風(fēng)干，將樣品原位洗滌除去無(wú)機(jī)鹽，自然風(fēng)干后放入質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。本法避免了結(jié)晶法所得晶體大小和形狀的不均勻性。所得基質(zhì)薄膜能起到疏水反相固定相的作用，吸附樣品分子，而無(wú)機(jī)鹽原位水洗除去，而且能避免樣品分子在樣品靶表面的擴(kuò)散，從而提高了靈敏度。本法所得質(zhì)譜信號(hào)穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，金屬離子加合物干擾小，譜圖背景小，信號(hào)強(qiáng)度與樣品量呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，能夠進(jìn)行定量分析。本方法簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器，無(wú)需復(fù)雜的樣品前處理，無(wú)需有機(jī)溶劑，綠色環(huán)保。
文檔編號(hào)G01N27/64GK103245717SQ201210029189
公開(kāi)日2013年8月14日 申請(qǐng)日期2012年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月10日
發(fā)明者鐘鴻英, 黃璐璐, 肖瀟, 鄭石 申請(qǐng)人:華中師范大學(xué)