專利名稱：：用磁珠支持基質(zhì)及質(zhì)譜判斷正常人與肝癌的試劑盒和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種新的肝癌生物樣品中蛋白質(zhì)分析方法的試劑盒。一種通過能與蛋白質(zhì)結(jié)合的基質(zhì)去捕獲生物標(biāo)志，并用有定量控制的質(zhì)譜分析來檢測(cè)肝癌生物標(biāo)志。在此提及的此項(xiàng)發(fā)明涉及蛋白質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域，為一種新的非侵入性的體外質(zhì)譜檢測(cè)方法。本發(fā)明可以應(yīng)用到己經(jīng)脫離人體的體液中的肝癌生物標(biāo)志組合的檢測(cè)方法或試劑盒。背聚技術(shù)隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施和完成,科學(xué)家們提出了后基因組(post-genome)計(jì)劃的概念，研究要點(diǎn)轉(zhuǎn)移到功能基因組學(xué)上，而生物功能主要體現(xiàn)物質(zhì)是蛋白質(zhì)。1994年，澳大利亞Macquarie大學(xué)的Wilkins和Williams首先提出蛋白質(zhì)組(proteome)的概念，指的是"一種基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)"，即包括一種細(xì)胞乃至一種生物所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。對(duì)于蛋白質(zhì)組的研究是功能基因組學(xué)研究的核心，稱為蛋白質(zhì)組學(xué)(proteo邁ics)。蛋白質(zhì)組學(xué)被認(rèn)為是后基因組研究中最主要的部分。與基因組相比，蛋白質(zhì)組的組成更復(fù)雜，功能更活躍，應(yīng)用前景更廣泛。蛋白質(zhì)組學(xué)從細(xì)胞整體水平進(jìn)行蛋白質(zhì)屬性的研究，如表達(dá)水平、翻譯后修飾及相互作用等，并由此獲得對(duì)于疾病過程、細(xì)胞生理生化特征和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的廣泛完整的認(rèn)識(shí)。所以，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)正在逐步成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及制藥學(xué)等的重要研究手段。不論是細(xì)胞的正常功能還是病理特性都在一定程度上取決于細(xì)胞所表達(dá)的蛋白質(zhì)功能。因此，鑒定人體內(nèi)表達(dá)的蛋白質(zhì)的區(qū)別，可用于體外疾病樣本診斷及篩査，并最終用于藥物開發(fā)和疾病治療，而要進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和功能的差異化分析，要求能夠達(dá)到分辨細(xì)胞內(nèi)分子的復(fù)雜混合物的程度。但細(xì)胞內(nèi)許多物質(zhì)往往以微量存在，目前用于分析蛋白的方法在上述各方面都有局限，用這些常規(guī)手段難以進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)序列鑒定分析。用質(zhì)譜聯(lián)合可克服這一技術(shù)缺點(diǎn)。血液，由于易采集性和對(duì)機(jī)體的生理狀況的易記錄性，成為研究生物標(biāo)記物的最好的來源之一。蛋白指紋圖譜(質(zhì)譜)技術(shù)(MALDI-T0F-MS、SELDI-TOF-MS)是近幾年發(fā)展起來的實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)，它且具有操作較簡(jiǎn)便、多樣本檢測(cè)、檢測(cè)快速、靈敏性和特異性商等優(yōu)點(diǎn)，是實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)革命性的進(jìn)展。蛋白指紋圖譜技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，主要用于多種疾病，特別是腫癯的早期診斷。蛋白指紋圖譜技術(shù)是一項(xiàng)發(fā)展前景非常好的診斷技術(shù)，具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。使用蛋白指紋圖譜技術(shù)己經(jīng)成為研究比較蛋白質(zhì)組學(xué)和發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)記物可選用的方法，尤其在多肽及低分子量蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的研究中非常有用。但是，我們?cè)谶M(jìn)行蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析時(shí)發(fā)現(xiàn)沒有一個(gè)臨床肝癌質(zhì)譜診斷標(biāo)準(zhǔn)化的試劑盒。國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)在2006年已將人類重要生物標(biāo)志物圖譜的實(shí)驗(yàn)確證和分析技術(shù)研究列為國家目標(biāo)導(dǎo)向類專題課題。研究血清(漿)樣品分離、肝癌多肽圖譜快速掃描和肝癌特征峰等系列用于肝癌血清標(biāo)志物圖譜發(fā)現(xiàn)的質(zhì)譜診斷關(guān)鍵技術(shù)，創(chuàng)建具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的健康人群和3-4種我國常見惡性腫瘤人群"血清質(zhì)譜多肽圖譜"的任務(wù)即將拉開戰(zhàn)幕。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是建立一種在肝癌生物樣品中檢測(cè)的方法。該方法為肝癌的早期檢測(cè)提供了新的途徑，并為進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)新的肝癌生物標(biāo)志提供了基礎(chǔ)。本發(fā)明涉及一種通過生物標(biāo)志結(jié)合的基質(zhì)表面，并用定量性質(zhì)譜分析來同時(shí)檢測(cè)多種生物標(biāo)志狀態(tài)。本發(fā)明中的生物標(biāo)志是利用一臺(tái)質(zhì)譜儀來發(fā)現(xiàn)的。該設(shè)備的質(zhì)量精確度約為+/-0.1%。基質(zhì)是任何能與生物標(biāo)志選擇性或特異性結(jié)合的物質(zhì)。舉例說明，WCX陰離子,C8/C18疏水作用基質(zhì)吸附劑，分離生物化學(xué)中的這些方法和由這些方法產(chǎn)生的吸附劑具有診斷反面的用途(即陰離子吸附劑捕獲陽離子蛋白質(zhì))。底基洗去未吸附的物質(zhì)。任何適宜的洗液均可使用。生物標(biāo)志首先能夠被具有能與生物標(biāo)志物結(jié)合基質(zhì)吸附表面捕獲，非吸附物能從基質(zhì)上洗脫，吸附到底基的生物標(biāo)志物在質(zhì)譜儀中被檢測(cè)。生物標(biāo)志通過離子發(fā)生源，如激光，被離子化，產(chǎn)生的離子被一個(gè)離子感受集合器收集，然后質(zhì)量分析器分析那些通過的離子。之后，檢測(cè)器將檢測(cè)的離子信息轉(zhuǎn)換為質(zhì)荷比。定l:性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。生物標(biāo)志的檢測(cè)明顯地將與信號(hào)強(qiáng)度的檢測(cè)有關(guān)。這樣，生物標(biāo)志的數(shù)量與質(zhì)i都可以被檢測(cè)出來。飛行質(zhì)譜對(duì)待分析物的分析生成飛行時(shí)間譜。該飛行時(shí)間譜的最終分析并不表示離子化能量攻擊一個(gè)樣本產(chǎn)生的單獨(dú)的脈沖信號(hào)，而是一系列脈沖的信號(hào)之和。這樣降低了干擾，并增加了動(dòng)態(tài)范圍。該飛行時(shí)間數(shù)據(jù)受數(shù)據(jù)處理軟件的影響，軟件中數(shù)據(jù)處理主要包括轉(zhuǎn)換飛行時(shí)間與質(zhì)荷比而產(chǎn)生質(zhì)譜，降低基線而減少儀器的偏移量，和過濾高頻噪音而減輕高頻噪音。通過對(duì)生物標(biāo)志的吸附和檢測(cè)而產(chǎn)生的數(shù)據(jù)可利用計(jì)算機(jī)的數(shù)據(jù)分析程序進(jìn)行分析。該計(jì)萬機(jī)程序分析這些數(shù)據(jù)以顯示檢測(cè)出的生物標(biāo)志的數(shù)量，并顯示信號(hào)的強(qiáng)度和確定被檢測(cè)的每個(gè)生物標(biāo)志的分子量。數(shù)據(jù)分析還能包括一系列的確定生物標(biāo)志的信號(hào)強(qiáng)度和矯正數(shù)據(jù)對(duì)預(yù)定統(tǒng)計(jì)分布狀態(tài)的偏離。例如，通過計(jì)算與某些參數(shù)相關(guān)的每個(gè)峰值的髙度，可規(guī)范觀測(cè)到的峰。該參數(shù)可能是由儀器和類似能量吸收分子等化學(xué)成分產(chǎn)生的不重要的干擾，這可以設(shè)置調(diào)零。計(jì)算機(jī)可以將計(jì)算結(jié)果數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成各種形式來表現(xiàn)。其標(biāo)準(zhǔn)譜可以表示，但在一種形式中只有峰髙和質(zhì)量信息可以在譜帶中保留，產(chǎn)生一個(gè)較清晰的圖，并使具有幾乎相同分子量的生物標(biāo)志物更易顯現(xiàn)。在另一種形式中，兩個(gè)或更多的譜比較，便于突顯獨(dú)特的生物標(biāo)志物和那些高于或低于校準(zhǔn)樣本的生物標(biāo)志物。分析一般包括展示從待分析物得到的信號(hào)的圖譜中峰的鑒定。峰可以通過視圖進(jìn)行選擇，軟件是可用的，它可自動(dòng)檢測(cè)峰。一般情況下，該軟件通過鑒定信號(hào)具有信噪比高于一個(gè)選擇閑值并標(biāo)記出在峰信號(hào)的質(zhì)心處的峰的質(zhì)量這樣的方式操作。在一個(gè)有效的程序中，比較許多譜線以認(rèn)定出現(xiàn)在質(zhì)譜中某一選定范圍內(nèi)同樣的一些峰。該軟件的一個(gè)版本聚集所有出現(xiàn)在確定的質(zhì)量范圍內(nèi)的各條光譜的峰，對(duì)所有在質(zhì)量(質(zhì)荷比)中值附近的峰指定一個(gè)質(zhì)量(質(zhì)荷比)簇。發(fā)明中使用的生物標(biāo)志是基質(zhì)所捕獲。這些生物標(biāo)記是進(jìn)一步通過質(zhì)譜(mass印ectrometry)測(cè)定其不同分子量來知道它們特定的身份。對(duì)生物標(biāo)志的檢測(cè)需要將一個(gè)樣本放基質(zhì)的一個(gè)吸附點(diǎn)上，接著進(jìn)行清洗。電噴霧電離質(zhì)譜(electrosprayionizsationmassspectrometry,ESI-MS)是在毛細(xì)管的出口處施加一髙電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，最后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。基質(zhì)輔助激光解析/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix-assistedlaserdesorption/ionizationtimeoffightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)的基本原理是向吸附點(diǎn)上加入SINAPINIC酸等并讓其千燥，將分析物分散在分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使連同分析物一起進(jìn)入氣相。而后，用質(zhì)譜測(cè)定法對(duì)基質(zhì)進(jìn)行分析，而一個(gè)顯示了蛋白質(zhì)分子的遺留物圖將生成，這張圖是在蛋白質(zhì)分子的質(zhì)量-電荷比的基礎(chǔ)上，以彼此分開的峰圖的形式顯示出來的。然而，如果有必要，這些生物標(biāo)志也可通過，比如，確定多肽的氨基酸序列來進(jìn)行鑒別。在蛋白質(zhì)化學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，為了增加蛋白質(zhì)鑒定的可信度，獲得一段蛋白質(zhì)肽片段內(nèi)部序列信息通常是非常重要的。對(duì)于蛋白質(zhì)及多肽的序列測(cè)定，傳統(tǒng)的方法是采用Edman降解方法，而該方法最大的不足之處在于費(fèi)時(shí)太長(zhǎng)(一個(gè)殘基需花費(fèi)30-40分鐘)。近年來，隨著質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展，尤其是多級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)以及源后裂解(PSD)等技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用質(zhì)譜測(cè)序巳成為一種流行的方法。例如，一個(gè)生物標(biāo)志能用許多酶描繪出來，例如V8蛋白酶(V8protease)或胰蛋白酶，而且消化片段(digestionfragments)的分子量可被用來在數(shù)據(jù)庫中搜索序列，這些序列與由多種酶生成的消化片斷的分子量相吻合?；蛘?，如果此生物標(biāo)志不是已知數(shù)據(jù)庫中的蛋白質(zhì)分子，在生物標(biāo)志的N極氨基酸序列(N-terminalAminoAcidSequence)的基礎(chǔ)上，可使用降解探針，而后，這些探針會(huì)被用來描繪由探測(cè)到了生物標(biāo)志的樣本所生成的基因組或cDNA庫。最后，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志可用蛋白質(zhì)梯狀排序法(proteinladdersequencing)進(jìn)行排序。通過將分子碎成碎片并將碎片用瞎解作用或其他可按順序從碎片末端除去一個(gè)單個(gè)氨基酸分子的方法進(jìn)行處理后，可生成蛋白質(zhì)梯度(proteinladders)-然后，用質(zhì)譜對(duì)此梯度進(jìn)行分析。階梯狀碎片(ladderfragments)在質(zhì)量上的差異可鑒別出從分子末端被除去的貧基酸。因此，本發(fā)明可以用于生物標(biāo)志鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)。特異性是指某一物質(zhì)或某種疾病的專一屬性，它是代表某種物質(zhì)或某種疾病的特征。通過某些特征可以識(shí)別某種物質(zhì)或某種疾病，從而把它和其他物質(zhì)或疾病區(qū)分開來。對(duì)專有特征的識(shí)別往往依賴于特殊的檢測(cè)方法，例如要了解某種疾病是否存在有特異性抗原就要用有關(guān)特異性抗體來檢測(cè)。自蛋白質(zhì)組學(xué)研究有新發(fā)展以來，這種傳統(tǒng)意義上特異性檢測(cè)和界定方法有了很大的突破。如一個(gè)蛋白質(zhì)不同片段變異是不同類型腫瘤的標(biāo)志。本發(fā)明利用WCX陰離子基質(zhì)及利用C8/C18疏水基質(zhì)磁珠為例對(duì)正常人與肝癌血清(漿)進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)比分析。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。一種用磁珠支持基質(zhì)及質(zhì)譜判斷正常人與肝癌的試劑盒和方法的具體操作步驟以下是用本發(fā)明提供的一個(gè)操作方案及肝癌試劑盒實(shí)例。1.樣品處理及標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備將生物樣品稀釋在稀釋緩沖洛液中，視需要離心澄清樣品。質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)供血者10人，5男5女，血型為O型年齡為18-30歲；民族漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油三酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢查；無遺傳病家族史無重大傳染病史。女性不能懷孕，男性為不吸煙者。2.基質(zhì)與肝癌、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備、樣品上樣抽取0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液(a)41C下待血液凝固后馬上離心，41C離心5min分離血清。(b)4t:下馬上離心，4*0離心5min分離血漿。標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控或肝癌血清(漿)樣品分裝100pl—小管，于一801C儲(chǔ)存；或取混合血清(漿)l:2稀釋于U9緩沖液(9MUrea,2%CHAPS，50mMTris-HCL，pH9.0)—小管，251C儲(chǔ)存，即成為肝癌、標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)試劑盒。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血淸及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物用磁性珠。基質(zhì)是用于標(biāo)記、結(jié)合血清(漿)的。標(biāo)記至液相色譜柱子上的基質(zhì)可用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)的標(biāo)準(zhǔn)方法去分析。將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控O血清(漿)用于質(zhì)譜儀試劑盒的定量方法。3.洗漆用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。以下步驟用0.05%1%三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)磁性珠陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3咖圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5mL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。吸能分子可用Sinapinicacid或alpha-Cyano-4-hydroxycinnamicacid等,3.質(zhì)譜的定量控制及測(cè)試用激光解吸/離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀，用氣激光儀(337咖)和80cm或120cm飛行管分析陣列，或用電噴霧電離巳洗脫的生物標(biāo)志后用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)標(biāo)準(zhǔn)方法去分析滯留于各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或蛋白質(zhì)。用計(jì)算機(jī)分析數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)據(jù)重疊展示。定量性質(zhì)譜調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血淸(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da等強(qiáng)度調(diào)至5諷信號(hào)強(qiáng)度的最大值。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。用2746±1Da、5909土1Da、6634土1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn).本發(fā)明將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即WCX陰離子、C8/C18疏水作用等蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析及定量。通過分析幾百種血淸蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜可以用于區(qū)分正常與肝癌。峰值CV〉3(Wb或者p〈0.01為有顯著性差異(圖l):正常與肝癌蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜的顯著性差異1008.91392.21885.31087.133273.19499.11266.31031.71414.41906.21573.21285.41296.5l柳l.21056.61436.81929.73981.12548.92289.68938.31101.21459.21951.35345.23322.85269.58687.11123.61481.91975.1153365912.76706.33935.31127.51503.71996.21042.92267.712862.44469.21144.91524.82019.42043.55976.31536.811490.31168.21549.22131.22092.713756.44356.211700.71190.21594.42153.66566.31338.49714.450肌31212.81616.22174.87573.110269.36016.85318.21234.31638.42198.29298.31079.216844.913130.81257.91661.12220.8■53249.136951.71279.61683.32241.91104.24160.36441.41302.21705.42490.61114.43225.214151.51309.21727.65549.23893.35643.214042.81324.51750.15932.21061.56660.67944.51346.31772.26094.21840.53165.621955.21352.31793.56133.24656.25820.25957.21369.61817.47776.25892.13964.18159.51373.91862.915122.26119.24764.921808.2用從中篩選出幾個(gè)特征蛋白2043土15Da、3936土15Da、4469土15Da、5080土15Da、5318土15Da、5932土15Da、8687土15Da、8938土15Da、U490土15Da、U700土15Da、13130土15Da、13756土15Da,雙盲測(cè)試100例正常與肝癌(圖2)。試劑盒的敏感性90%,特異性93%。利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。本發(fā)明可用于體外細(xì)胞和非侵入性的體外肝癌質(zhì)譜檢測(cè)方法的定量控制，如離體體液的肝癌試劑盒用于臨床質(zhì)譜的肝癌檢測(cè)方法。可以檢測(cè)多個(gè)肝癌蛋白質(zhì)生物標(biāo)志群及質(zhì)譜多肽圖譜。本發(fā)明中的試劑盒及方法與其他非侵入性的體外檢測(cè)方法比較，具有以下的特點(diǎn)(1)準(zhǔn)確質(zhì)譜直接分析有很強(qiáng)的精確性，一般誤差率只有O.lDa。因?yàn)榈鞍踪|(zhì)是由氨基酸組成的，而貧基酸的平均質(zhì)量是己知的，如果知道了抗原或生物標(biāo)志的總分子量，那么抗原的變異(指氨基酸變化)就很容易被推測(cè)出來。(2)方便本方法將蛋白質(zhì)分成了幾大類，即陰離子、疏水作用蛋白。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。磁珠支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁性微?；虼胖椤Ｓ么判苑蛛x器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。這樣，可用質(zhì)譜儀直接進(jìn)行分析。(3)快捷用本發(fā)明提供的蛋白指紋法進(jìn)行疾病診斷時(shí)，無需對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行測(cè)序。本發(fā)明采用了計(jì)算機(jī)"條碼格式"，信號(hào)強(qiáng)度沿著線性軸以暗度強(qiáng)度值顯示。此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動(dòng)分析對(duì)比強(qiáng)弱，從而有助于臨床復(fù)雜的診斷，如可用此"蛋白指紋"或條碼格式進(jìn)行醫(yī)學(xué)分析。中國目前有1.3億乙型肝炎的攜帶者，其中包括2千3百萬乙型肝炎引起的肝硬化。肝細(xì)胞性肝癌主要由乙型肝炎導(dǎo)致的肝硬化引起。目前用于輔助診斷肝癌的甲胎蛋白試劑盒的特異性與敏感性都很差。用本方法的試劑盒可鑒別正常與肝癌，敏感性90%，特異性93%。本發(fā)明提供的一個(gè)試劑盒和方法用于質(zhì)譜檢測(cè)定量控制。從而有助于臨床復(fù)雜的肝癌檢測(cè)。說明書附圖圖1正常人與肝癌蛋白指紋圖譜及質(zhì)譜多肽譜圖2正常人與肝癌蛋白指紋圖譜及質(zhì)譜多肽譜的一個(gè)特征峰本發(fā)明將結(jié)合具體實(shí)施例作進(jìn)一步說明，這些實(shí)例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。實(shí)施例1正常與肝癌的區(qū)分及質(zhì)譜的試劑盒制備(1)實(shí)驗(yàn)方法一、材料標(biāo)本來源質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備定義符合如下標(biāo)準(zhǔn)，供血者男女各半，血型為O型年齡為18-30歲民族，漢。生化指標(biāo)正常，包括總膽固醇、甘油二酯、空腹血糖、乙肝表面抗原、肝功檢査、腎功檢査無遺傳病家族史無重大傳染病史。女性無懷孕，男性無吸煙史者。抽取10位0型血的健康受試者(男女各半)的新鮮血液，4t:下待血液凝固后馬上離心，10，000卬m,4^C離心5min:樣品的處理和儲(chǔ)存，取混合血清(漿)lOnl,用20jilU9緩沖液(9MUrea，2%CHAPS,50mMTris-HCL,pH9.0)稀釋，而后，將以上標(biāo)本冰浴振蕩30min。將30nl上述變性后標(biāo)本加入36(^1相應(yīng)的結(jié)合緩沖液，待用。所有樣本均進(jìn)行雙份檢測(cè)以減少實(shí)驗(yàn)誤差。簡(jiǎn)要操作步驟將200nl結(jié)合緩沖液(50mMNaAC，pH4.0-4.5)加至已裝好WCX陰離子磁珠小管中，置振蕩器(MS1Minishaker)400-600rpm,簾蕩5min,用磁性分離器分離磁珠及樣品。重復(fù)上述操作兩次。用0.05免1先三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)WCX陰離子磁珠陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片(有3x3mm圓孔)上，自然干燥金屬片，加0.5fiL吸能分子(以50%乙腈，0.5%三氟乙酸制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)。然后用質(zhì)譜分析閱讀。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至5(Wb質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。數(shù)據(jù)收集在每次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)收集前，用All-in-one蛋白校正儀器，使蛋白質(zhì)分子量誤差<0.196。數(shù)據(jù)分析用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，分析所得數(shù)據(jù)的形式是用計(jì)算機(jī)讀取的條碼格式或峰，蛋白指紋顯示為沿著線性軸的暗度強(qiáng)度值信號(hào)，此強(qiáng)度可以用掃描儀記錄并用分析軟件自動(dòng)分析對(duì)比強(qiáng)弱。所有的圖譜都進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，統(tǒng)一到它們自己全部的離子總數(shù)(峰面積的總和)。將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634.0Da強(qiáng)度調(diào)至50%信號(hào)強(qiáng)度的最大值，并且用6634.ODa的峰進(jìn)行了校正，而后又進(jìn)行了"減少基線"，定義蛋白峰(s/n>5)。分析了所有700~30000Da之間的蛋白峰，并且仔細(xì)檢査了每個(gè)相應(yīng)的峰，計(jì)算出峰的平均數(shù)，標(biāo)準(zhǔn)誤差(SD)和變異系數(shù)(CV%)。通過分析幾百種血清蛋白指紋峰，發(fā)現(xiàn)下述蛋白指紋可以用于區(qū)分正常與肝癌。峰值CV〉3(W6或者p〈0.01為有顯著性差異(圖l):正常與肝癌蛋白指紋的顯著性差異1008.91031.71056.61101.21123.61127.51144.91168.21190.21212.81234.31257.91279.61302.21309.21324.51346.31352.31369.61373.91392.21414.41436.81459.21481.91503.71524.81549.21594.41616.21638.41661.11683.31705.41727.61750.11772.21793,51817.41862.91885.31906.21929.71951.31975.11996.22019.42131.22153.62174.82198.22220.82241.92490.65549.25932.26094.26133.27776.215122.21087.11573.23981.15345.2153361042.92043.52092.76566.37573.19298.31070.51104.21114.43893.31061.51840.54656.25892.16119.233273.11285.42548.93322.85912.72267.75976.313756.41338.410269.31079.213249.14160.33225.25643.26660.63165.65820.23964.14764.99499.11296.52289.65269.56706.312862.41536.84356.29714.46016.86844.936訴1.76441.414151.514042.87944.521955.25957.28159.521808.21266.3l柳l.28938.38687.13935.34469.211490.311700.75080.35318.213130.8實(shí)施例2試劑盒的雙盲測(cè)試用從實(shí)施例1中篩選出幾個(gè)特征蛋白峰2043土15Da、3936土15Da、4469土15Da、5080土15Da、5318土15Da、5932土15Da、8687土15Da、8938土15Da、U490土15Da、U700土15Da、13130土15Da、13756土15Da，雙盲測(cè)試100例正常與肝癌(圖2)。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>敏感性90%特異性93%利用C8及C18疏水基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與上述WCX陰離子基質(zhì)磁珠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。結(jié)論用本方法的試劑盒可鑒別正常人與肝癌，敏感性90%，特異性93%。在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。權(quán)利要求1.一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中肝癌蛋白質(zhì)組的試劑盒和方法，其特征是采用蛋白指紋法對(duì)肝癌中蛋白質(zhì)組或質(zhì)譜多肽圖譜進(jìn)行鑒別檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)控制下的定量性質(zhì)譜分析來檢測(cè)。該方法通過以下步驟實(shí)現(xiàn)(1)樣品處理及質(zhì)譜標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)制備；(2)基質(zhì)與血清(漿)結(jié)合試劑盒制備、樣品上樣；(3)洗滌；(4)質(zhì)譜的定量控制及質(zhì)譜檢測(cè)；其中所述步驟(1)將生物樣品稀釋在稀釋緩沖溶液中。用O型血，男女相等，混合制備質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)；所述步驟(2)將質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)及樣品點(diǎn)樣在有支持物的基質(zhì)中的一個(gè)位點(diǎn)上。支持物用磁性珠?；|(zhì)是用WCX陰離子基質(zhì)及C8/C18疏水基質(zhì)與血清(漿)選擇性結(jié)合；所述步驟(3)用結(jié)合緩沖液洗滌。在樣品完全干燥前將第一份洗滌溶液加到該位點(diǎn)。洗滌溶液在位點(diǎn)上至少停留10秒。徹底清除第一份洗滌溶液，用第二份洗滌液重復(fù)以上步驟。用三氟乙酸徹底洗滌整個(gè)陣列點(diǎn)，將生物標(biāo)志洗脫至質(zhì)譜專用金屬片或位點(diǎn)上。所述步驟(4)加0.5μL吸能分子(以50％乙腈，0.5％三氟乙酸的制備的飽和標(biāo)準(zhǔn)溶液)用質(zhì)譜儀去分析滯留與各位點(diǎn)的生物標(biāo)志或用電噴霧電離已洗脫的生物標(biāo)志后用質(zhì)譜儀去分析。對(duì)血液進(jìn)行蛋白質(zhì)對(duì)比分析，用計(jì)算機(jī)分析血液中質(zhì)荷比數(shù)據(jù)。本試劑盒依據(jù)幾個(gè)特征蛋白峰2043±15Da、3936±15Da、4469±15Da、5080±15Da、5318±15Da、5932±15Da、8687±15Da、8938±15Da、11490±15Da、11700±15Da、13130±15Da、13756±15Da，雙盲測(cè)試的敏感性90％，特異性93％。定量性控制及質(zhì)譜激光能量調(diào)控每次測(cè)試前，用質(zhì)譜的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)，將標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控血清(漿)中用于定量的標(biāo)準(zhǔn)峰6634±1Da強(qiáng)度調(diào)至50％質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度的最大值。用2746±1Da、5909±1Da、6634±1Da標(biāo)準(zhǔn)峰為質(zhì)譜定性(分子量)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。2.權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)分析方法，在磁珠支持基質(zhì)的方法所用的基質(zhì)包括陰離子、疏水作用吸附劑。3.權(quán)利要求2中磁珠支持基質(zhì)的方法所用吸附劑的支持物是磁性微粒或磁珠.4.一種權(quán)利要求l所述的檢測(cè)試劑盒，其特征在于，它包括一容器以及裝于容器中的權(quán)利要求l所述的生物樣品。將生物樣品分裝lOOμl—小管，于一80℃儲(chǔ)存或取生物樣品1:2稀釋于一小管U9緩沖液(9MUrea,2%CHAPS,50mMTris-HCL，pH9.0),25"C儲(chǔ)存。5.如權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征于，所述的生物樣品為血清或血漿。全文摘要本發(fā)明涉及一種用磁珠支持基質(zhì)的方法捕獲生物樣品中肝癌蛋白質(zhì)組，用磁性分離器分離磁珠及樣品，無需離心樣品。然后用質(zhì)譜法進(jìn)行分析的蛋白指紋法。本發(fā)明的方法可用于正常人與肝癌的蛋白指紋或質(zhì)譜多肽圖譜的試劑盒。本方法準(zhǔn)確、方便且快捷。文檔編號(hào)G01N33/68GK101169417SQ200610140288公開日2008年4月30日申請(qǐng)日期2006年10月23日優(yōu)先權(quán)日2006年10月23日發(fā)明者洋許申請(qǐng)人:洋許