專利名稱：用于檢測(cè)dna中的烷基化胞嘧啶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測(cè)DNA中的烷基化胞嘧啶的方法。本發(fā)明的方法采用能有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶和胞嘧啶的酶。通過在DNA與至少一種這樣的酶溫育后評(píng)估DNA的酶修飾的水平測(cè)定出烷基化胞嘧啶在DNA中的存在情況。對(duì)DNA中的烷基化胞嘧啶的檢測(cè)對(duì)于診斷及其他目的都是有用的。
背景技術(shù)：
在原核生物、真核生物、噬菌體和/或病毒基因組中已經(jīng)鑒定出至少七種不同的共價(jià)堿基修飾(1)。在更高等的真核生物中，最廣泛的共價(jià)修飾堿基是位于CpG二核苷酸的鳥嘌呤的5’端的5-甲基胞嘧啶。已經(jīng)推定甲基化形式在基因轉(zhuǎn)錄、X染色體失活、基因組印跡(genomicimprinting)、細(xì)胞分化和致癌作用中都發(fā)揮著作用(2)。
癌細(xì)胞的異常表型可歸結(jié)于定性和/或定量的改變?；谛蛄械亩ㄐ愿淖?遺傳突變)被保留在基因組DNA中，這有助于對(duì)它們的檢測(cè)和表征。基于基因表達(dá)的信息的遺傳被稱為表觀遺傳學(xué)(epi-genetics)。通過改變基因的表達(dá)以及通過在細(xì)胞分裂期間傳遞DNA甲基化模式，核酸中的胞嘧啶堿基的甲基化可以實(shí)現(xiàn)表觀遺傳。已經(jīng)頻繁地發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞含有遺傳的和表觀遺傳的突變。
腫瘤細(xì)胞同時(shí)含有與甲基化模式相關(guān)的多種異常。它們經(jīng)常具有廣泛分布的基因組的低甲基化和更多的局部區(qū)域的超甲基化(1)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)位于基因啟動(dòng)子區(qū)域內(nèi)的正常未甲基化的CpG島的局部甲基化與相關(guān)基因的下調(diào)有關(guān)。這種超甲基化可以作為編碼用于失活腫瘤抑制基因的局部突變的另一種機(jī)制。與人類腫瘤相關(guān)的具有CpG島超甲基化的基因?qū)嵗╬16(肺、乳腺、結(jié)腸、前列腺、腎、肝、膀胱、和頭頸部腫瘤)、E-cadherin(乳腺、前列腺、結(jié)腸、膀胱、肝腫瘤)、von Hippel Lindau(VHL)基因(腎細(xì)胞腫瘤)、BRCA1(乳腺腫瘤)、p15(白血病、Burkitt淋巴瘤)、hMLH1(結(jié)腸)、ER(乳腺、結(jié)腸、肺腫瘤；白血病)、HIC1(腦、乳腺、結(jié)腸、腎腫瘤)、MDG1(乳腺腫瘤)、GST-π(前列腺腫瘤)、O6-MGMT(腦腫瘤)、降鈣素(癌、白血病)、和myo-D(膀胱腫瘤)(1，3)。
也已經(jīng)報(bào)告了相反的情況，其中認(rèn)為CpG低甲基化促進(jìn)了腫瘤進(jìn)展。例如，發(fā)現(xiàn)尿激酶的CpG島在早期的、未轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)是超甲基化的，而在高度轉(zhuǎn)移的乳腺腫瘤細(xì)胞內(nèi)是低甲基化的(4)。相似地，與轉(zhuǎn)移相關(guān)的S100A4基因內(nèi)的一個(gè)區(qū)域的低甲基化已經(jīng)被推定為結(jié)腸腺癌細(xì)胞株的基因活化的機(jī)制(5)。
至少8種不同的方法與它們的一些變異方法一起可以表征DNA基因組的5-甲基胞嘧啶或相關(guān)的修飾堿基(2)。每種方法在特異性、分辨率、敏感性和潛在的人為假象上都有著優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。
通過將DNA通過化學(xué)方法或酶學(xué)方法水解為其組成核苷酸、然后用標(biāo)準(zhǔn)方法(層析法、電泳法和高壓液相層析法)將其分鎦和分析就可以測(cè)定出基因組的總的核酸堿基組成。這個(gè)方法可定量基因組中所存在的修飾堿基的數(shù)量，但它沒有給出任何關(guān)于基因組的哪一部分最初是被修飾的信息。通過最近鄰位序列分析可以測(cè)定出二核苷酸的組成和頻率，但是這個(gè)方法也只能生成有限的序列信號(hào)。所有的這些方法都不是基因組特異性的，且來自病毒和其他的體內(nèi)寄生蟲對(duì)樣品的污染都可以導(dǎo)致令人誤解的結(jié)果。
現(xiàn)有的更為特異的方法能提供關(guān)于修飾堿基位于基因組序列的哪個(gè)位置的準(zhǔn)確數(shù)據(jù)。用對(duì)甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶可以分析基因組DNA。但是，對(duì)于這種方法，可以被檢測(cè)的位點(diǎn)數(shù)目受甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶所識(shí)別的序列數(shù)目的限制。測(cè)序能提供序列特異的信息，但是在PCR期間或當(dāng)在細(xì)菌中經(jīng)分子克隆擴(kuò)增真核DNA時(shí)都不能保留甲基化模式。
有必要通過一種甲基化特異性方式有區(qū)別地修飾堿基，以產(chǎn)生一種修飾的序列，其中在測(cè)序方案期間保留有甲基化特異性改變。目前有三種依賴于分析不同的堿基修飾的方案。所有的這些方案都涉及對(duì)DNA的化學(xué)處理所誘導(dǎo)的DNA修飾，隨后是對(duì)DNA序列的分析。根據(jù)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)，肼(N2H4)、高錳酸鹽(MnO4)、和亞硫酸氫鹽(HSO3)都能有區(qū)別地修飾基因組DNA中的胞嘧啶堿基。
肼對(duì)5-甲基胞嘧啶具有比胞嘧啶或胸腺嘧啶更弱的反應(yīng)性。在DNA與肼溫育后，在測(cè)序凝膠上對(duì)所述DNA進(jìn)行電泳。比較肼處理的DNA和用其他的堿基特異性化學(xué)裂解化合物處理的DNA可以測(cè)定出DNA序列。在用肼處理的DNA標(biāo)本中，與來自基因組DNA的測(cè)序反應(yīng)物的胞嘧啶和胞嘧啶+胸腺嘧啶的特異條帶比較，在含有5-甲基胞嘧啶的序列位置上出現(xiàn)了條帶缺失或強(qiáng)度減低的條帶。因此肼方案生成了與5-甲基胞嘧啶的存在相關(guān)的陰性結(jié)果。對(duì)5-甲基胞嘧啶的清晰鑒定要求生成陽性信號(hào)。用于5-甲基胞嘧啶鑒定的肼修飾的另一個(gè)缺點(diǎn)是需要μg水平的模板DNA。
在弱酸性pH和室溫下，高錳酸鉀優(yōu)先與胸腺嘧啶和5-甲基胞嘧啶反應(yīng)，而與胞嘧啶和鳥嘌呤的反應(yīng)較弱。在DNA與高錳酸鉀溫育后，在測(cè)序凝膠上進(jìn)行DNA電泳。比較用高錳酸鉀處理的DNA和用其他的堿基特異性化學(xué)裂解化合物處理的DNA可以測(cè)定出DNA序列。因此，高錳酸鉀對(duì)DNA的氧化可被用于區(qū)分胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶(6)。盡管高錳酸鉀方案生成了陽性結(jié)果，并因此具有優(yōu)于肼方案的優(yōu)點(diǎn)，但是高錳酸鉀的確與胞嘧啶進(jìn)行較弱反應(yīng)，因此對(duì)胞嘧啶與5-甲基胞嘧啶的區(qū)分依賴于它們?cè)跍y(cè)序凝膠上的條帶的強(qiáng)度。高錳酸鉀修飾的另一個(gè)缺點(diǎn)是也需要μg水平的模板DNA。
對(duì)基因組DNA的亞硫酸氫鹽處理可將核酸模板中的未甲基化的胞嘧啶堿基脫氨基成尿嘧啶，而5-甲基胞嘧啶可耐受脫氨基作用。亞硫酸氫鹽對(duì)雙鏈DNA中的胞嘧啶堿基幾乎沒有活性，所以優(yōu)選地要將基因組雙鏈DNA變性成單鏈DNA。標(biāo)準(zhǔn)的亞硫酸氫鹽修飾方案使用了強(qiáng)堿(NaOH)進(jìn)行溫育以將雙鏈DNA變性成單鏈DNA(7)。亞硫酸氫鹽緩慢地使胞嘧啶脫氨基，溫育時(shí)間必須在所有胞嘧啶的完全脫氨基作用和DNA在長時(shí)間溫育后的片段化之間達(dá)到一種妥協(xié)。亞硫酸氫鹽修飾方案使用了一定范圍內(nèi)的溫育時(shí)間，通常在亞硫酸氫鹽中溫育4到20個(gè)小時(shí)。
Grunau等(8)研究了亞硫酸氫鹽介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的最佳條件，他們發(fā)現(xiàn)在55℃下溫育4個(gè)小時(shí)使得99％的胞嘧啶脫氨基，但在這些條件下，84％到96％的DNA被降解，減少了后繼步驟的產(chǎn)量。另外，加熱使得5-甲基胞嘧啶以比胞嘧啶更快的速度脫氨基。例如，在60℃時(shí)，5-甲基胞嘧啶的脫氨基速度比胞嘧啶的脫氨基速度高1.5倍(9)。與亞硫酸氫鹽在更低溫度下的溫育減少了DNA的片段化，但是溫育時(shí)間必須被延長到14到20個(gè)小時(shí)以實(shí)現(xiàn)胞嘧啶的完全脫氨基。亞硫酸氫鹽需要近10ngDNA用于隨后的使用基于PCR方法的分析。
亞硫酸氫鹽修飾所產(chǎn)生的修飾的DNA有義和反義鏈不再是互補(bǔ)的，因此必須用引物進(jìn)行隨后的PCR擴(kuò)增，引物被設(shè)計(jì)成是鏈特異性的，即引物與修飾的有義鏈或修飾的反義鏈?zhǔn)腔パa(bǔ)的。當(dāng)用PCR擴(kuò)增相關(guān)區(qū)域時(shí)，尿嘧啶(原先的胞嘧啶)轉(zhuǎn)變成了胸腺嘧啶以及5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)變成了胞嘧啶(7)。隨后可以用標(biāo)準(zhǔn)的DNA測(cè)序(7)或生成序列信息的其他的基于PCR的技術(shù)例如甲基化特異性PCR(10)或REMS-PCR(36)、和限制性內(nèi)切酶(3)或甲基化特異性的探針的分析(11)分析PCR產(chǎn)物(擴(kuò)增子)。
盡管亞硫酸氫鹽方法具有容易使用和高于其他現(xiàn)有方案的敏感性的優(yōu)點(diǎn)，但是在試驗(yàn)方案中可以出現(xiàn)潛在的人為假象(2)，也就是說不是所有的胞嘧啶都轉(zhuǎn)化成了尿嘧啶，一小部分5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化成了胸腺嘧啶(12)(DNA聚合酶不能區(qū)分尿嘧啶和胸腺嘧啶)，并且存在因長時(shí)間溫育引起的片段化所造成的DNA的丟失，并需要非生理學(xué)緩沖液(8)。整個(gè)方案是長時(shí)間的和辛苦的，包括在得到結(jié)果之前需要2到3天的操作以及在亞硫酸氫鹽中至少溫育4到20個(gè)小時(shí)。在所有的表觀遺傳學(xué)研究中的限速步驟是使用亞硫酸氫鹽修飾方案制備樣品的步驟。
利用亞硫酸氫鹽處理并結(jié)合基于PCR方法分析，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)從多種類型的標(biāo)本包括正常組織和腫瘤組織、石蠟包埋組織、和血漿及血清中所提取的DNA都含有異常甲基化的序列(4，13，14)。
已經(jīng)描述了多種能使胞嘧啶堿基脫氨基的酶。胞嘧啶核苷脫氨酶(EC 3.5.4.5.)將胞嘧啶核苷轉(zhuǎn)化成尿嘧啶核苷，它廣泛地分布在原核和真核生物。胞嘧啶脫氨酶(EC 3.5.4.1.)將胞嘧啶轉(zhuǎn)化成尿嘧啶。脫氧胞嘧啶核苷脫氨酶(EC 3.5.4.14.)將脫氧胞嘧啶核苷轉(zhuǎn)化成脫氧尿嘧啶核苷以及脫氧胞嘧啶核苷酸脫氨酶將5-磷酸脫氧胞嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)化成5-磷酸脫氧尿嘧啶核苷酸。根據(jù)酶的來源，這些酶顯示出不同程度的底物特異性。胞嘧啶核苷脫氨酶和胞嘧啶脫氨酶(分別)區(qū)分作為底物的5-甲基胞嘧啶核苷和5-甲基胞嘧啶以及它們的未甲基化類似物的能力具有物種特異性。來自人的胞嘧啶核苷脫氨酶以不同的效率使多種胞嘧啶核苷衍生物包括胞嘧啶、脫氧胞嘧啶核苷和5-甲基胞嘧啶核苷脫氨基(15、16)。來自假單胞菌的胞嘧啶脫氨酶能利用5-甲基胞嘧啶(17)，而腸道菌所產(chǎn)的酶只能用胞嘧啶作為底物。來自真菌煙曲菌(Aspergillus fumigatus)的胞嘧啶脫氨酶和酵母菌酶能用5-甲基胞嘧啶作為底物(18、19)。
載脂蛋白B mRNA編輯酶(ApoBRe)是RNA編輯體(editsome)的核心成分，它的生理作用是特異地使胃腸組織的apoB mRNA的#6666位上的胞嘧啶堿基脫氨基成尿嘧啶以形成提前的終止密碼子(20，21)。具有胞嘧啶核苷脫氨酶活性的催化成分被稱為載脂蛋白B mRNA編輯酶催化多肽1(APOBEC1)。盡管mRNA是該酶的生理學(xué)底物，但是有一些證據(jù)表明它在體內(nèi)對(duì)DNA具有活性。載脂蛋白B mRNA編輯酶在轉(zhuǎn)基因小鼠內(nèi)的錯(cuò)誤表達(dá)使得小鼠對(duì)癌癥易感(22)，以及人載脂蛋白B mRNA編輯酶在大腸桿菌中的表達(dá)造成了突變體表型，其中在UNG缺陷型菌株的不同位點(diǎn)上看到了數(shù)千倍增加的突變頻率。UNG是一種涉及修復(fù)自發(fā)性胞嘧啶脫氨基所引起的U:G錯(cuò)配的酶，這種酶的缺乏使得細(xì)胞不能修復(fù)它們基因組內(nèi)的脫氨基的胞嘧啶(23)。對(duì)DNA的測(cè)序顯示突變是由DNA中的胞嘧啶向尿嘧啶的轉(zhuǎn)化所引起的。在這個(gè)模型所研究的小段DNA中表現(xiàn)出一定程度的特異性(23)，即需要5’側(cè)的嘧啶。盡管事實(shí)是在生理學(xué)RNA底物上該酶所唯一進(jìn)行脫氨基的胞嘧啶堿基(#6666)具有5’側(cè)的嘌呤(腺嘌呤)。載脂蛋白B mRNA編輯酶對(duì)具有5’側(cè)嘧啶的胞嘧啶的脫氨基作用可能需要大腸桿菌模型所不能提供的因子。
Petersen-Mahrt和Nerberger的新近成果(24)研究了載脂蛋白BmRNA編輯酶體外對(duì)DNA底物的脫氨基活性。他們發(fā)現(xiàn)酶對(duì)雙鏈DNA沒有活性，但是它容易使化學(xué)合成的單鏈DNA底物中的胞嘧啶堿基脫氨基，在酶的粗提取物內(nèi)溫育120分鐘時(shí)，3個(gè)胞嘧啶堿基有57％被脫氨基。當(dāng)用RNase處理時(shí)，酶的活性表現(xiàn)出輕微增高。作者計(jì)算出粗提取物中的1分子載脂蛋白B mRNA編輯酶能使化學(xué)合成的單鏈DNA底物中的單個(gè)胞嘧啶堿基在10分鐘內(nèi)脫氨基。他們將這種緩慢速度的脫氨基歸結(jié)于他們的檢測(cè)可能是亞最佳的這一情況。這可歸結(jié)于缺乏對(duì)于活性來說是必需的、但在大腸桿菌宿主中沒有表達(dá)的其他因子，在大腸桿菌宿主內(nèi)人的酶可能沒有被正確地折疊，以及大腸桿菌宿主不能提供活性所需的任何翻譯后修飾的事實(shí)。
活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶(稱為AID或AICDA)是一種B細(xì)胞特異性蛋白?；罨T導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的表達(dá)是類別轉(zhuǎn)換重組和體細(xì)胞高突變的首要步驟，類別轉(zhuǎn)換重組是介導(dǎo)免疫球蛋白的同型轉(zhuǎn)換的過程，體細(xì)胞高突變包括將多種點(diǎn)突變引入到免疫球蛋白可變區(qū)基因內(nèi)。還不清楚活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的作用方式?，F(xiàn)有的理論集中在活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶具有與載脂蛋白B mRNA編輯酶和胞嘧啶核苷脫氨酶同源的序列基序的事實(shí)。
關(guān)于活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的作用方式的早期理論假定酶的RNA編輯功能可能涉及編輯編碼類別轉(zhuǎn)換重組和體細(xì)胞高突變所必需的蛋白的mRNA。有著最多實(shí)驗(yàn)支持的理論說明活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶作用為DNA特異的胞嘧啶核苷脫氨酶。這個(gè)模型說明活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶使體細(xì)胞高突變的熱點(diǎn)序列中的胞嘧啶堿基脫氨基以產(chǎn)生G:U錯(cuò)配，而這些是被有區(qū)別地解決的以實(shí)現(xiàn)體細(xì)胞高突變或類別轉(zhuǎn)換重組(25)。后者理論的證據(jù)包括體細(xì)胞高突變是由普通型DNA損傷所啟動(dòng)的以及高突變的第一階段是特異地靶向于dC/dG對(duì)的說法。這將需要具有針對(duì)DNA的胞嘧啶脫氨酶活性的活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶。所有已發(fā)表的關(guān)于活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的研究都集中于確定體內(nèi)底物以闡明酶在免疫球蛋白的體細(xì)胞高突變和同型轉(zhuǎn)換中的作用。
多個(gè)實(shí)驗(yàn)室的研究已經(jīng)顯示出人活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶體外能使單鏈DNA中的胞嘧啶脫氨基(26-29)，但不能使單鏈RNA上的胞嘧啶脫氨基(26，27)?；罨T導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶對(duì)雙鏈DNA的體外活性被限定于與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的DNA。已經(jīng)假定轉(zhuǎn)錄通過形成能提供單鏈DNA底物例如穩(wěn)定的R環(huán)和莖環(huán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，可以使雙鏈DNA脫氨基(28)。通過產(chǎn)生DNA的中央部位的非互補(bǔ)區(qū)的泡狀結(jié)構(gòu)(bubble)或環(huán)型結(jié)構(gòu)可以體外模擬出雙鏈DNA的互補(bǔ)區(qū)之間的這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，這些二級(jí)結(jié)構(gòu)都是單鏈的?；罨T導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶使這些泡狀結(jié)構(gòu)中的胞嘧啶脫氨基。脫氨基的效率依賴于單鏈的泡狀結(jié)構(gòu)的長度。Bransteitter等(27)測(cè)定了溫育5分鐘時(shí)的被脫氨基的化學(xué)合成的雙鏈DNA底物的百分比，結(jié)果顯示具有1個(gè)核苷酸的泡狀結(jié)構(gòu)的底物沒有被脫氨基，3個(gè)核苷酸的泡狀結(jié)構(gòu)顯示出5％脫氨基，4個(gè)核苷酸的泡狀結(jié)構(gòu)顯示出8％脫氨基，5個(gè)核苷酸的泡狀結(jié)構(gòu)顯示出35％脫氨基，以及9個(gè)核苷酸的泡狀結(jié)構(gòu)顯示出56％脫氨基。
已經(jīng)假定活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶將被限定于生理學(xué)靶點(diǎn)(免疫球蛋白基因座)，因?yàn)椴皇芗s束的DNA脫氨酶活性對(duì)于細(xì)胞將是有害的。這里有一些活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的脫氨酶活性是序列特異的說法(30)，以及假定活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶將對(duì)體細(xì)胞高突變熱點(diǎn)序列RGYW(一種在免疫球蛋白基因的可變區(qū)內(nèi)常被突變的序列)表現(xiàn)出最大的活性。Bransteitter等(27)顯示活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶在體外對(duì)兩個(gè)熱點(diǎn)序列的活性比非熱點(diǎn)序列高近3倍。相反地，Dickerson等(26)發(fā)現(xiàn)活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的脫氨酶活性是序列特異的，但是發(fā)現(xiàn)冷點(diǎn)序列(體內(nèi)從未發(fā)現(xiàn)突變的免疫球蛋白的可變區(qū)的序列)與熱點(diǎn)序列同樣發(fā)生脫氨基，而一些熱點(diǎn)序列僅僅具有背景水平的脫氨基。
Pham等(31)的研究用大的單鏈DNA末端測(cè)定了活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶體外使胞嘧啶堿基脫氨基的能力。在這些實(shí)驗(yàn)中，單鏈DNA模板是含有噬菌體環(huán)型DNA底物，它含有作為365個(gè)核苷酸的單鏈缺口區(qū)域的一部分的、230個(gè)核苷酸的lacZa報(bào)告子序列的靶點(diǎn)。用500ng雙鏈?zhǔn)删wDNA底物、40倍過量的酶在含有1mM EDTA和1mM二硫蘇糖醇的10mM TRIS緩沖液(pH 8.0)中、30℃下溫育20分鐘。通過將突變噬菌體(給出白色或淺藍(lán)色斑)轉(zhuǎn)化到UNG缺陷型大腸桿菌以及隨后對(duì)克隆測(cè)序測(cè)定出突變譜。在所用的測(cè)試條件下，發(fā)現(xiàn)活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的脫氨基能力隨著序列背景的不同而有所不同，作者假定他們的結(jié)果說明了酶是一種移動(dòng)分子，它前進(jìn)式地使單鏈DNA中的胞嘧啶分子脫氨基。
Pham等(31)也描述了一種用于測(cè)定活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶在它們的轉(zhuǎn)錄活性版噬菌體底物中的脫氨基活性。用30nM雙鏈?zhǔn)删wDNA底物在含有1mM EDTA和10mM MgCl2的50mM HEPES緩沖液(pH 7.5)中、37℃下溫育30分鐘。溫育包括T7RNA聚合酶和rNTP以生成轉(zhuǎn)錄活性的DNA，該DNA是一種活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的更易接近的底物(27)。這些溫育顯示出活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶所介導(dǎo)的在非轉(zhuǎn)錄鏈上的脫氨基作用需要RNA聚合酶(活性轉(zhuǎn)錄)，而在“被保護(hù)的”作為RNA-DNA雜交體的轉(zhuǎn)錄鏈上的脫氨基作用以低于其近15倍的速度進(jìn)行。這些溫育也證實(shí)有優(yōu)勢(shì)的脫氨基作用發(fā)生在熱點(diǎn)基序上。
具有異位表達(dá)活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的模型體內(nèi)表現(xiàn)出非靶向的胞嘧啶脫氨基，即有非免疫球蛋白基因的可變區(qū)的其他基因的脫氨基。例如，大腸桿菌顯然不含人免疫球蛋白靶基因，在大腸桿菌中所表達(dá)的人活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶在用于篩選突變的基因上產(chǎn)生了的事件特異性脫氨基作用(context specific deaminations)(30)。沒有檢查這種事件特異性脫氨基作用的原因。
Bransteitter等(27)最近在體外將人活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶與各種化學(xué)合成的核酸底物溫育。這個(gè)研究顯示，在非常簡單的模型中，活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶能以比對(duì)5-甲基胞嘧啶堿基高10倍的特異活性使胞嘧啶堿基脫氨基。這個(gè)模型包括將活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶與27或33個(gè)核苷酸的化學(xué)合成的單鏈DNA分子溫育，單鏈DNA分子含有1個(gè)或2個(gè)胞嘧啶堿基以及不存在互補(bǔ)的DNA鏈。存在高濃度的這些人工底物，濃度為100nM，這是活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的2倍過量的濃度。沒有測(cè)定到也不認(rèn)為活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶能有區(qū)別地將從個(gè)體中所提取到的基因組DNA的復(fù)雜混和物中的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而對(duì)5-甲基胞嘧啶沒有或具有很小活性，在復(fù)雜的DNA混和物中有著多種具有多種不同的胞嘧啶堿基序列背景的巨堿基片段，以及存在著有義鏈和互補(bǔ)的反義鏈。
1，10-菲咯啉(1，10-phenanthroline)(一種強(qiáng)螯合劑)抑制了活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的脫氨酶活性，但酶活性不能被EDTA(一種更弱的螯合劑)所抑制。這說明活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的脫氨酶活性需要緊密結(jié)合的金屬離子，這可能是鋅離子(27，29)?；罨T導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶在50到150mM的鹽水平上保持了其脫氨酶活性，可以耐受中等水平的EDTA(5到10mM)，在大范圍的pH(測(cè)試了從7.6到9.0)中工作以及以不同的效率在從室溫到37℃的溫度中工作(26)。這些條件有助于保持基因組DNA的完整性，不發(fā)生片段化?；罨T導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶在65℃被加熱30分鐘后仍是有活性的(26)。
酶的突變體形式可以天然存在(例如等位變體和體內(nèi)突變所生成的形式)或可以人工生成。用于生成突變蛋白的方法在本領(lǐng)域是已知的(39)。可以遵循有序的方法例如其中生成了特異的氨基酸取代、缺失或添加，人工地生成突變體，或可以隨機(jī)地生成突變體，并測(cè)試了蛋白的突變形式的所需活性。
修飾DNA的酶只需要數(shù)個(gè)小時(shí)的溫育。例如，純化的限制性內(nèi)切酶在最佳條件下只需要1個(gè)小時(shí)的溫育就能完全地裂解雙鏈DNA。Bransteitter等(27)測(cè)定了活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶在16分鐘內(nèi)使得化學(xué)合成的單鏈DNA底物中的95％的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成了尿嘧啶，以及在5分鐘后使得具有9個(gè)核苷酸的單鏈泡狀結(jié)構(gòu)的合成底物中的56％的胞嘧啶轉(zhuǎn)化成了尿嘧啶。但是，在不同反應(yīng)條件下的其他小組的工作已經(jīng)顯示出在與活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶溫育30分鐘后，只有10％的含有單個(gè)胞嘧啶的化學(xué)合成的單鏈DNA底物轉(zhuǎn)化成了尿嘧啶。

發(fā)明內(nèi)容
在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種用于檢測(cè)來自個(gè)體的基因組或線粒體雙鏈DNA樣品中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平的方法，方法包括(a)獲得來自個(gè)體的雙鏈DNA樣品；(b)將雙鏈DNA的至少一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)化為單鏈DNA；(c)將來自步驟(b)的單鏈DNA的靶區(qū)域與至少一種酶反應(yīng)，所述酶能有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶和胞嘧啶；以及(d)確定酶對(duì)靶區(qū)域的酶修飾的水平。
通常地，應(yīng)用酶的反應(yīng)條件是酶基本上只與烷基化胞嘧啶或胞嘧啶反應(yīng)而不與兩者都反應(yīng)的反應(yīng)條件。優(yōu)選地，酶基本上只能與烷基化胞嘧啶或胞嘧啶的其中一種反應(yīng)。
優(yōu)選地，雙鏈DNA的區(qū)域向單鏈DNA的轉(zhuǎn)變將至少包括部分地分離兩條鏈。例如，可以通過DNA的熱變性或使用鏈置換探針實(shí)現(xiàn)鏈的分離。可以采用的其他技術(shù)包括雙鏈DNA的化學(xué)或酶的變性。該方法也可以包括抑制雙鏈DNA的已經(jīng)被分離的兩條鏈之間發(fā)生退火，以有利于酶接近單鏈DNA的靶區(qū)域。
可以用能與雙鏈DNA的相應(yīng)鏈雜交的一個(gè)或多個(gè)探針抑制所分離的鏈發(fā)生退火。當(dāng)使用多個(gè)探針時(shí)，探針可以只與其中一條鏈雜交，或一個(gè)或多個(gè)探針可以與一條鏈雜交，而剩余的探針與另一條鏈雜交。
因此，本發(fā)明的方法還包括在雙鏈DNA的兩條鏈分離之后以至少一種探針與雙鏈DNA的一條鏈雜交，以抑制所述鏈之間發(fā)生退火，并由此有利于酶接近單鏈DNA的靶區(qū)域。
每個(gè)探針正常地是寡核苷酸并可以選自由有義探針、用于形成單鏈DNA中的環(huán)使得酶接近到靶區(qū)域的環(huán)型探針、反義探針和它們的組合所構(gòu)成的組。更普遍地，探針可以與雙鏈DNA的鏈的單個(gè)連續(xù)區(qū)、或位于用于評(píng)價(jià)烷基化胞嘧啶的存在情況或水平的鏈的靶區(qū)域的側(cè)翼的鏈的分離的不連續(xù)的上游和下游區(qū)域雜交。
在前一種情況中，可以使用至少兩種這樣的探針，其中一種探針與所述鏈的位于靶區(qū)域下游的區(qū)域雜交，而另一種探針與位于靶區(qū)域上游的區(qū)域雜交，這樣就抑制了雙鏈DNA的另一條鏈與靶區(qū)域的雜交。
在后一種情況中，探針可以具有一種序列，當(dāng)與所述鏈上的被間隔開的上游和下游區(qū)域雜交時(shí)，上游和下游區(qū)域彼此拉籠形成包括靶區(qū)域的環(huán)型或泡狀結(jié)構(gòu)。例如探針可以具有與鏈雜交的反向末端區(qū)和中間區(qū)的不與鏈的靶區(qū)域雜交的非互補(bǔ)序列，使得形成了包括靶區(qū)域的環(huán)型或泡狀結(jié)構(gòu)，并據(jù)此抑制了雙鏈DNA的另一條鏈與靶序列的雜交。為了促進(jìn)環(huán)型或泡狀結(jié)構(gòu)的形成，探針的中間區(qū)域可以包括反向重復(fù)序列，它們?cè)谔结樑c鏈雜交后雜交在一起。
為了檢測(cè)與酶反應(yīng)的單鏈DNA的靶區(qū)域中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平，通常需擴(kuò)增靶區(qū)域并分析所形成的擴(kuò)增子中因酶對(duì)靶區(qū)域的酶修飾所生成的序列修飾。因此，一個(gè)本發(fā)明的方法還可包括對(duì)與酶反應(yīng)的所述單鏈DNA的靶區(qū)域進(jìn)行包含熱循環(huán)及引物的擴(kuò)增過程以得到擴(kuò)增產(chǎn)物，和分析擴(kuò)增產(chǎn)物中與所述單鏈DNA的靶區(qū)域的烷基化胞嘧啶的存在情況一致的序列變異。
利用任何能檢測(cè)序列修飾例如點(diǎn)突變的技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)烷基化胞嘧啶水平的確定。這些技術(shù)包括，但不限于，核酸測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、限制性內(nèi)切酶消化、和包括使用與特異性核酸序列結(jié)合的探針。確定可以包括對(duì)單鏈DNA的靶區(qū)域的烷基化胞嘧啶含量的定量和/或定性分析。特別地，用本發(fā)明的方法可以檢測(cè)超甲基化或低甲基化，以及更特別地，可以測(cè)定DNA中的胞嘧啶烷基化的模式。
所評(píng)價(jià)的DNA可以包括一個(gè)基因或它的一個(gè)區(qū)域，以及優(yōu)選地包括基因的調(diào)節(jié)性非編碼區(qū)例如5’非編碼區(qū)。5’非編碼區(qū)可以包括基因的啟動(dòng)子或啟動(dòng)子區(qū)。雙鏈DNA通常是基因組DNA。
因此，在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于檢測(cè)來自個(gè)體的基因組DNA樣品中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平的方法，該方法包括(a)獲得來自個(gè)體的基因組DNA樣品；(b)將基因組DNA的至少一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)化為單鏈DNA；(c)將來自步驟(b)的單鏈DNA的靶區(qū)域與至少一種酶反應(yīng)，所述酶能有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶和胞嘧啶；以及(d)確定酶對(duì)靶區(qū)域的酶修飾的水平。
仍在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種用于診斷個(gè)體的疾病或病變的方法，它涉及檢測(cè)個(gè)體的基因組DNA樣品中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平，該方法包括
(a)獲得來自個(gè)體的基因組DNA樣品；(b)將基因組DNA的至少一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)化為單鏈DNA；(c)將來自步驟(b)的單鏈DNA的靶區(qū)域與至少一種酶反應(yīng)，所述酶能有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶和胞嘧啶；以及(d)確定酶對(duì)靶區(qū)域的酶修飾的水平。
典型地，在本發(fā)明的方法中所用的酶是脫氨酶。所檢測(cè)的烷基化胞嘧啶通常是5-烷基胞嘧啶，且通常是5-甲基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶的存在情況是許多病變和疾病狀態(tài)的有用標(biāo)記物，并用于上調(diào)或下調(diào)基因表達(dá)。對(duì)5-甲基胞嘧啶的存在情況的檢測(cè)對(duì)于突變和表觀遺傳學(xué)多態(tài)性分析也是有用的。
因此，對(duì)DNA中的5-甲基胞嘧啶的檢測(cè)有著顯著的診斷和其他的應(yīng)用。
仍在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一種本發(fā)明方法所使用的試劑盒，其中試劑盒包括一種或多種用于進(jìn)行所述方法的試劑以及使用說明書。例如試劑可以選自酶、緩沖液、PCR引物和用于分離所用的雙鏈DNA的鏈的探針。
術(shù)語“個(gè)體”在此是取其最廣泛的含義，并打算在其范圍內(nèi)包括人和非人的動(dòng)物、細(xì)菌、酵母菌、真菌和病毒。
說明書中所提及的所有文章均通過引用在此一同并入本文。任何對(duì)在本說明書中已經(jīng)包含的文件、法案、材料、設(shè)備、文章等的討論只是用于給本發(fā)明提供背景的目的。不能視為已經(jīng)認(rèn)可任何或所有的這些物質(zhì)構(gòu)成了現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的部分或在本申請(qǐng)的每個(gè)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期之前的任何地方已經(jīng)存在的本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的公知常識(shí)。
在整個(gè)說明書中，應(yīng)該理解，單詞“包括”或“包含”意味著包括所提及的元素、整體或步驟、或元素、整體或步驟的組、但不排除任何其他的元素、整體或步驟、或元素、整體或步驟的組。
通過下面的對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的描述，在本發(fā)明的范圍內(nèi)的方法的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)將變得更為清晰。


圖1舉例說明了用于生成在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方式中所用的合成的內(nèi)對(duì)照DNA的方法學(xué)。
圖2A-2C舉例說明了用于酶介導(dǎo)的E-cadherin DNA脫氨基的引物延伸檢測(cè)法。
圖3A舉例說明了利用與靶序列互補(bǔ)的DNA寡核苷酸(環(huán)型探針)“圈出(loop out)”基因的靶區(qū)域的區(qū)的示意圖。
圖3B舉例說明了利用與非靶序列互補(bǔ)的DNA寡核苷酸(反義探針)通過與DNA的互補(bǔ)鏈的結(jié)合“圈出”靶基因的區(qū)域的示意圖。
圖3C舉例說明了對(duì)限制性內(nèi)切酶的選擇以提供核酸外切酶III對(duì)位置#972周圍的E-cadherin啟動(dòng)子序列(基因庫編碼；L34545)的非靶鏈的選擇性消化。
具體實(shí)施例方式
一般而言，在本發(fā)明的方法中所用的酶具有胞嘧啶核苷或胞嘧啶脫氨酶活性，并能使基因組DNA中的胞嘧啶堿基脫氨基成尿嘧啶，且基本上不會(huì)使DNA中的任何5-甲基胞嘧啶堿基脫氨基。酶可以是來自嗜熱生物體的熱穩(wěn)定的胞嘧啶核苷或胞嘧啶脫氨酶。
例如酶可以選自活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶(AID)(GenBank人mRNA參照序列#NM_020661；GenBank人蛋白序列#NP_065712.1)、胞嘧啶核苷脫氨酶(也稱為胞嘧啶核苷氨基水解酶EC 3.5.4.5)、胞嘧啶脫氨酶(也稱為胞嘧啶氨基水解酶EC3.5.4.1)、脫氧胞嘧啶核苷脫氨酶(也稱為脫氧胞嘧啶核苷氨基水解酶EC3.5.4.14)、脫氧胞嘧啶核苷酸脫氨酶(也稱為脫氧胞嘧啶核苷酸氨基水解酶)、載脂蛋白B mRNA編輯酶(ApoBRe)和它們的催化片段、同源物和變體。催化片段意思是一種具有完整的酶的一些或全部催化活性的酶片段。一般而言，在本發(fā)明的方法中所利用的催化片段基本上將具有與完整的酶相同的催化活性。ApoBRe的催化片段包括APOBEC1(催化多肽1，轉(zhuǎn)錄變體1GenBank人mRNA參照序列#NM_001644，GenBank人蛋白序列#NP_001635.1；催化多肽1，轉(zhuǎn)錄變體2GenBank人mRNA參照序列#NM_005889；GenBank人蛋白序列#NP_005880.1)。APOBEC1的同源物包括APOBEC2和APOBEC3A到APOBEC3G，在此所述的方法中也可以利用一種或多種這樣的同源物。從國立生物技術(shù)信息中心(Rockville Pike，Bethesda，MD，USA)的GenBank數(shù)據(jù)庫中也可公開地得到這些同源物的序列數(shù)據(jù)(APOBEC2GenBank人mRNA參照序列#NM_006789，GenBank人蛋白序列#NP_006780.1；APOBEC3AGenBank人mRNA參照序列#NM_145699，GenBank人蛋白序列#NP_663745.1；APOBEC3BGenBank人mRNA參照序列#NM_004900，GenBank人蛋白序列#NP_004891.3；APOBEC3CGenBank人mRNA參照序列#NM_014508，GenBank人蛋白序列#NP_055323.2；APOBEC3DGenBank人mRNA參照序列#NM_152426，GenBank人蛋白序列#NP_689639.1；APOBEC3EGenBank人mRNA參照序列#NM_002331；APOBEC3FGenBank人mRNA參照序列#NM_143298，GenBank人蛋白序列#NP_660341.2；APOBEC3GGenBank人mRNA參照序列#NM_021822，GenBank人蛋白序列#NP_068594.1)。
所用的酶也可以是這些野生型酶或催化片段或同源物的突變體形式，它也具有胞嘧啶核苷或胞嘧啶脫氨酶活性。通過本領(lǐng)域已知的有序的或隨機(jī)的突變方案可以從自然界分離出或生成這些突變體酶(例如，見Twyman R.M.Recombinant DNA and molecular cloning.Chapter 24.InAdvanced Molecular BiologyA Concise Reference.BIOS ScientificPublishers Limited(39))。在本發(fā)明的方法中可以采用所有這些具有所需活性的突變體酶形式。此外，在此所述的方法可以利用單一的酶或具有所需活性的不同的酶的組合，這些酶獨(dú)立地選自例如野生型酶、和它們的變體、同源物、修飾和突變體形式、以及催化片段。
從多種來源中都可純化出具有胞嘧啶脫氨酶活性的酶，這些來源包括B淋巴細(xì)胞和轉(zhuǎn)導(dǎo)表達(dá)體系例如大腸桿菌和昆蟲細(xì)胞。例如AID可以在昆蟲細(xì)胞的棒狀病毒體系中被表達(dá)為GST融合蛋白，并經(jīng)親和柱所純化(Bransteitter 2003.PNAS 1004102)。
基因組DNA通常將被用于本發(fā)明的方法并可以提取自認(rèn)為合適的任何細(xì)胞或生物學(xué)樣品。標(biāo)準(zhǔn)方案所提取的基因組DNA是被不同程度片段化的并且大部分都是雙鏈的?；罨T導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶和其他的具有胞嘧啶核苷脫氨酶活性的酶通常對(duì)單鏈DNA、或雙鏈DNA的單鏈環(huán)型結(jié)構(gòu)的區(qū)域具有最高的活性(27)。通過各種方法包括熱變性、化學(xué)變性、蛋白結(jié)合和核酸外切酶活性以及任何這些可以利用的技術(shù)可以將雙鏈DNA制成單鏈DNA。
熱變性常被用于生成單鏈DNA以及用于例如PCR的方法中?；瘜W(xué)變性包括在化學(xué)物例如堿(7，32)或甲酰胺(32)中溫育。與那些與單鏈DNA結(jié)合的蛋白例如噬菌體T4基因32蛋白(以及該蛋白的截?cái)嘈问?進(jìn)行溫育使得基因組DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定并降低了二級(jí)結(jié)構(gòu)(33，34)。酶變性也可以被用于包括通過與核酸外切酶的溫育選擇性地酶降解雙鏈DNA的一條鏈，例如來自大腸桿菌的核酸外切酶III，它催化了從雙鏈DNA的3’羥基末端開始的單核苷酸的3’到5’的去除。核酸外切酶III已經(jīng)被用于制備單鏈DNA底物(見圖3A-3C)，這些底物被用于雙脫氧測(cè)序(35)、利用MALDI-TOF質(zhì)譜法的直接測(cè)序(36)和單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(32)。
核苷酸類似物例如核酸肽(Pepetide Nucleic Acids，PNA)和鎖定核酸(Locked Nucleic Acids，LNA)以高度的序列特異性和親和性與RNA及DNA結(jié)合。類似的DNA雙鏈體比DNA∶DNA鍵更為穩(wěn)定，并且含有核苷酸類似物的寡核苷酸探針能表現(xiàn)出鏈侵襲的性能。例如，PNA探針具有經(jīng)生成穩(wěn)定的PNA2∶DNA三鏈體(由Hoogsteen和Watson/Crick堿基配對(duì)所構(gòu)成)和鏈置換侵襲雙鏈DNA的能力。PNA探針表現(xiàn)出體外(單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)(40)和體內(nèi)(阻斷接近酶例如T7RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄激活因子、核酸酶、限制性內(nèi)切酶和甲基化酶(41))的作用。因此，與相關(guān)的反義鏈互補(bǔ)的鏈置換探針(即與靶有義鏈相同的鏈)可以使得靶有義鏈單鏈化，并用作為胞嘧啶脫氨酶活性的靶點(diǎn)。
鏈置換探針可以被設(shè)計(jì)成經(jīng)雙鏈體、侵襲性三鏈體或非侵襲性三鏈體的形成而結(jié)合(42，43)，它們的應(yīng)用可以使得先前的DNA變性步驟變得多余。通過反應(yīng)條件或?qū)λ鼈兊脑O(shè)計(jì)的修飾可以提高/改變鏈置換探針的結(jié)合動(dòng)力學(xué)及特異性。對(duì)鏈置換探針的設(shè)計(jì)可以包括單PNA、雙PNA(當(dāng)與dsDNA結(jié)合時(shí)形成了P環(huán))、雙PNA開啟子(opener)(44)、添加陽離子殘基例如賴氨酸以及結(jié)合假異胞嘧啶(J堿基)(45)。因此，本發(fā)明可以被明確地?cái)U(kuò)展到包括或由核苷酸類似物例如PNA和LNA構(gòu)成的核酸類似物探針用于至少部分分離雙鏈DNA的用途。
被用于與基因組DNA的鏈分離所生成的單鏈DNA雜交以抑制所分離的鏈的退火，并據(jù)此容許酶接近相關(guān)的靶區(qū)域的探針通常是合成的寡核苷酸探針或核酸類似物探針。更具體地，探針或每種探針可以獨(dú)立地是DNA探針或它的類似物，例如RNA、PNA、或LNA探針、或其他的包括一種或多種核苷酸類似物的核酸類似物探針，核苷酸類似物包括或由核苷酸類似物所構(gòu)成。此外，探針可以選自有義探針、反義探針、環(huán)型探針或它們的組合。探針在PCR過程中通常能作用為引物并被延伸。探針通常具有約10個(gè)堿基長度，通常具有10和50個(gè)堿基之間的長度，以及優(yōu)選地具有約17到約30個(gè)堿基長度。但不除外更長的探針，它可以被用于在所檢測(cè)的DNA鏈的長度上生成多個(gè)環(huán)型或泡狀結(jié)構(gòu)，以促進(jìn)酶與鏈中的多個(gè)位點(diǎn)的反應(yīng)(見圖3A-3C)。
能發(fā)現(xiàn)的可用于探針的核苷酸類似物包括，但不限于，下表中的類似物。


單鏈基因組DNA與具有優(yōu)先地使胞嘧啶而不是5-甲基胞嘧啶脫氨基的能力的酶的溫育造成了序列中的胞嘧啶殘基被尿嘧啶所取代，但是5-甲基胞嘧啶殘基基本上沒有變化。通過變更一種或多種所用的反應(yīng)條件可以測(cè)定出DNA與所選的脫氨酶反應(yīng)的最佳的反應(yīng)條件。
直結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480的基因組DNA顯示出在P16基因的啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的CpG位點(diǎn)上所出現(xiàn)的胞嘧啶完全地被5-甲基化?；虻倪@個(gè)區(qū)域的DNA也含有未甲基化的胞嘧啶。因此，該細(xì)胞株的基因組DNA提供了一種用作為具有胞嘧啶核苷脫氨酶活性的酶的脫氨基作用的底物的模型底物，其中可以測(cè)試反應(yīng)變量以確定出能最好地區(qū)分摻入到DNA內(nèi)的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶的最佳反應(yīng)條件。
為了確定出最佳反應(yīng)條件，用標(biāo)準(zhǔn)方法從SW480細(xì)胞中提取出基因組DNA。然后來自細(xì)胞的DNA被轉(zhuǎn)變成單鏈DNA，優(yōu)選地通過熱變性方法。用上述探針可以抑制分離鏈的再次退火。含有3個(gè)具有多個(gè)CpG位點(diǎn)的CpG島的E-cadherin基因的啟動(dòng)子區(qū)也可被用于優(yōu)化反應(yīng)條件或用于評(píng)價(jià)用于本發(fā)明方法的酶例如AID和其他的脫氨酶。
通過將酶加入到單鏈DNA中并在一組反應(yīng)變量的條件下溫育可以測(cè)定出酶有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶和胞嘧啶的能力，這些變量例如選自例如DNA濃度、酶濃度、溫育時(shí)間、溫育溫度、緩沖離子的組成和濃度(常用的緩沖液包括TIRS、HEPES、MOPS和咪唑)、緩沖液pH值(從pH 4.0到10.0)、鹽的濃度和類型(常用的鹽包括氯化鈉、乙酸鈉、氯化鉀、乙酸鉀、硫酸鹽和銨鹽)、各種陽離子金屬離子的濃度(例如鎂、錳、鉛和鈣)、如果需要的各種蛋白穩(wěn)定劑的濃度(例如還原劑例如二硫蘇糖醇(DTT)、其他的蛋白(例如小牛血清白蛋白(BSA))、糖(例如蔗糖、麥芽糖、葡萄糖、海藻糖、甘油和果糖)、去污劑(例如TritonX-100和Tween-20)、和輔助溶劑(例如脯氨酸、甜菜堿、甲酰胺、DMSO、乙醇和多元醇))。然后用下面進(jìn)一步描述的方案可以測(cè)定出利用這些變量的不同組合所能達(dá)到的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶之間的區(qū)分程度。本領(lǐng)域人員將明白上面所列的反應(yīng)條件變量不是排他性的，在可公開得到的文獻(xiàn)中能發(fā)現(xiàn)變更或增強(qiáng)酶的底物特異性和反應(yīng)速度的試劑及條件的其他實(shí)例。
除了PCR產(chǎn)物和基因組DNA，化學(xué)合成的寡核苷酸可以被用于確定出所選定酶的最佳反應(yīng)條件以外，并可以具有或不具有5-MeC堿基。這些化學(xué)合成的寡核苷酸可以給酶提供作為單鏈DNA或雙鏈DNA(退化為化學(xué)合成的反義鏈)的底物。后者可被用于優(yōu)化方法和反應(yīng)條件以使得雙鏈底物單鏈化，這些單鏈化的DNA可以使得對(duì)其最大活性需要單鏈底物的脫氨酶例如AID的可接近性最大化。此外，通過在甲基轉(zhuǎn)移酶中溫育可以使得PCR產(chǎn)物中的胞嘧啶核苷酸被甲基化，這些甲基轉(zhuǎn)移酶例如MsssI識(shí)別并使序列5’..CG..3’中的胞嘧啶甲基化，以及HpaII使5’..CCGG..3’序列中的內(nèi)在胞嘧啶甲基化。來自細(xì)胞株或正常人供體的基因組DNA也可作為用于優(yōu)化酶介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的底物。用標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)亞硫酸氫鹽修飾和測(cè)序方法可以評(píng)價(jià)任一的上述底物(化學(xué)合成的寡核苷酸、PCR產(chǎn)物或基因組DNA)的胞嘧啶核苷酸的甲基化狀態(tài)。
在測(cè)試DNA與酶溫育之后，常用PCR擴(kuò)增DNA中的相關(guān)靶區(qū)域。一般而言，在開始PCR之前將酶熱變性。用修飾DNA作為PCR的模板造成了在所擴(kuò)增的序列(擴(kuò)增子)中胸腺嘧啶殘基取代了原始序列中的胞嘧啶以及胞嘧啶取代了5-甲基胞嘧啶。因此，酶所引起的胞嘧啶堿基向尿嘧啶的轉(zhuǎn)化、和隨后PCR所造成的向胸腺嘧啶的轉(zhuǎn)化生成了一種修飾DNA，它具有與原始DNA模板中的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)相關(guān)的序列差異。
利用任何能區(qū)分胸腺嘧啶和胞嘧啶堿基的方案可以檢測(cè)出這些序列差異，包括技術(shù)例如對(duì)區(qū)域的直接測(cè)序(例如，見Hermanetal(10))、用限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增子的消化、甲基化特異性的PCR(10)、限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)的選擇性PCR(REMS-PCR)(例如(37)；國際專利申請(qǐng)No.PCT/AU96/00213)和甲基化特異探針的雜交(11)。甲基化特異性的PCR依賴于引物，它們利用了酶轉(zhuǎn)化之后的甲基化和未甲基化區(qū)域之間的序列差異。所有的這些方法將給出所檢測(cè)的測(cè)試DNA的靶區(qū)域的胞嘧啶的甲基化狀態(tài)。
REMS-PCR擴(kuò)增的選擇特性意味著它能很好地適用于分析罕見的遺傳變異，例如正常序列背景中的腫瘤序列、或母親序列(maternalsequences)背景中的胎兒序列(foetal sequences)。因此，本發(fā)明的方法可以形成最小程度的侵襲性檢測(cè)的基礎(chǔ)，其中分析了體液中的變異序列的存在情況，這些變異序列的特點(diǎn)是改變了的或異常的胞嘧啶甲基化模式。
可以用本發(fā)明的方法檢測(cè)與人類腫瘤相關(guān)的基因的啟動(dòng)子內(nèi)的超甲基化序列，例如P16基因啟動(dòng)子內(nèi)的CpG島的超甲基化。如上述的在膀胱、乳腺、胃、頭頸部、食道、結(jié)腸、肺和肝癌中已經(jīng)檢測(cè)了這個(gè)區(qū)域的超甲基化。具有與人類腫瘤相關(guān)的CpG島超甲基化的基因的其他實(shí)例包括E-cadherin(乳腺、前列腺、結(jié)腸、膀胱和肝腫瘤)、von Hippel Lindau(VHL)基因(腎細(xì)胞腫瘤)、BRCA1(乳腺腫瘤)、p15(白血病、Burkitt淋巴瘤)、hMLH1(結(jié)腸腫瘤)、ER(乳腺、結(jié)腸、肺腫瘤、和白血病)、HIC1(腦、乳腺、結(jié)腸、和腎腫瘤)、MDG1(乳腺腫瘤)、GST-π(前列腺腫瘤)、O6-MGMT(腦腫瘤)、降鈣素(癌和白血病)、和myo-D(膀胱腫瘤)(1，3)。
在此所述的方法也可被用于鑒定低甲基化區(qū)域，例如與基因的轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)的低甲基化區(qū)域，例如尿激酶或癌癥的S100A4。
因此，改變了的甲基化模式可以被用作為腫瘤細(xì)胞的標(biāo)記物。利用這些標(biāo)記物的特異性應(yīng)用包括例如對(duì)腫瘤或癌癥的最小程度的侵襲性篩選或早期診斷、對(duì)淋巴結(jié)的微轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移病灶的檢測(cè)、對(duì)腫瘤邊緣的未切除的腫瘤細(xì)胞或其他殘留病灶的檢測(cè)、或作為預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的工具。另外，在謹(jǐn)慎遺傳基因座(discreet genetic loci)上的5-甲基胞嘧啶堿基模式的差異可被用作為胎兒DNA或疾病狀態(tài)例如脆性染色體X綜合征以及改變了的基因印跡狀態(tài)的標(biāo)記物。5-甲基胞嘧啶的存在也可以提供與病毒、細(xì)菌或其他這些微生物或病原體相關(guān)的內(nèi)源性或外源性DNA的標(biāo)記物，以及因此提供了用于指示病原體或微生物感染或鑒定病原體或微生物的手段。
對(duì)使得DNA單鏈化的緩沖液、離子強(qiáng)度、pH值和其他反應(yīng)條件的優(yōu)化以及不同酶的組合可以容許達(dá)到DNA中的靶堿基的基本全部的脫氨基。但是，全部脫氨基對(duì)于甲基化分析不是絕對(duì)需要的。例如，通過靶位點(diǎn)對(duì)內(nèi)對(duì)照的脫氨基率(程度)之間的比較可以檢測(cè)甲基化胞嘧啶的存在情況。內(nèi)對(duì)照可以是基因組DNA內(nèi)的一個(gè)已知是未甲基化的位點(diǎn)，或者它可以是摻入到反應(yīng)物內(nèi)的合成的未甲基化的DNA。例如利用實(shí)時(shí)定量甲基化特異性PCR(MSP)(11，46)方案通過比較在COBRA檢測(cè)中的降解百分比(4)、或通過比較測(cè)序凝膠中的條帶強(qiáng)度(8)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)兩個(gè)靶位點(diǎn)(靶區(qū)域和內(nèi)對(duì)照)的脫氨基率的定量分析。
在圖1中舉例說明了一種可用于生成合成的內(nèi)對(duì)照的方法。更具體的，為了制備內(nèi)對(duì)照，用具有與基因組DNA互補(bǔ)的3’末端和非互補(bǔ)的5’標(biāo)簽的引物擴(kuò)增基因組DNA模板的內(nèi)在片段(A)。然后利用特異于基因組DNA且不會(huì)擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照片段的外引物擴(kuò)增基因組DNA(B)。相似地，用特異于內(nèi)對(duì)照片段且不會(huì)擴(kuò)增基因組DNA的引物擴(kuò)增內(nèi)對(duì)照片段(C)。
或者，對(duì)照可以是在分離的反應(yīng)物中。例如，采用如上所述的定量實(shí)時(shí)MSP可以分析基因組DNA，并用亞硫酸氫鹽處理的甲基化的基因組DNA(M標(biāo)準(zhǔn)物)、亞硫酸氫鹽處理的未甲基化的基因組DNA(U標(biāo)準(zhǔn)物)和未處理的基因組DNA(W標(biāo)準(zhǔn)物)構(gòu)建出三條標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后可以用％MI＝M÷(M+U)×100計(jì)算出甲基化指數(shù)(％MI)。所計(jì)算的MI％沒有考慮到用％W＝W÷(W+M+U)×100所計(jì)算出的亞硫酸氫鹽處理所沒有進(jìn)行C到U轉(zhuǎn)變的DNA(背景)百分比(％W)。參考相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線可以估計(jì)出測(cè)試DNA樣品的每個(gè)M、U和W數(shù)值(46)。為了從％MI中去除背景，可以采用下面的計(jì)算公式％MI(減去背景)＝％MI×(1-(％W÷100))。因此，這個(gè)公式容許估計(jì)出所分析的基因組DNA測(cè)試序列中的甲基化胞嘧啶的真實(shí)量，其中在所分析的測(cè)試序列中，胞嘧啶向尿嘧啶的轉(zhuǎn)變小于100％。
用于優(yōu)化反應(yīng)條件或測(cè)定酶修飾效率的已知胞嘧啶甲基化狀態(tài)的對(duì)照DNA序列包括對(duì)照包括質(zhì)粒、用甲基5-dCTP取代dCTP所生成的PCR(38)、和商品化可得到的所有基因的DNA被普遍甲基化的人基因組DNA(CpGenomeTM普遍甲基化DNA，Intergen公司，Cat.No.S7821)。另外，從細(xì)胞株中提取的具有已知甲基化狀態(tài)的細(xì)胞株DNA可以被用作為陽性或陰性對(duì)照。例如，在肺癌細(xì)胞株H157和U1752中，p16基因的啟動(dòng)子區(qū)的CpG島內(nèi)的CpG二核苷酸是被完全甲基化的，而在肺癌細(xì)胞株H249和H209中是完全未甲基化的(10)。用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方案可以從細(xì)胞株中提取出基因組DNA。
利用認(rèn)為實(shí)現(xiàn)所用的酶對(duì)DNA中的胞嘧啶堿基的修飾所必需的最小溫育期、以及在不會(huì)導(dǎo)致DNA過多片段化的條件下通?？梢赃M(jìn)行對(duì)所檢測(cè)的測(cè)試DNA中的胞嘧啶堿基的酶修飾。有利地是，該方案常比本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)DNA修飾方案更快。
為了更清楚地了解本發(fā)明的特性，現(xiàn)在參照下面的非限制性實(shí)施例描述了本發(fā)明的優(yōu)選的形式。
實(shí)施例實(shí)施例1利用活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶對(duì)基因組DNA的酶轉(zhuǎn)化檢測(cè)p16(INK4a)基因啟動(dòng)子的CpG島的甲基化狀態(tài)。
首先用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)提取方案從個(gè)體的血液或組織標(biāo)本中提取出基因組DNA。所有基因都被普遍甲基化的人基因組DNA(CpGenomeTM普遍甲基化DNA)被用作為檢測(cè)p16基因啟動(dòng)子的CpG島內(nèi)的5-甲基胞嘧啶的陽性對(duì)照。
用熱變性從雙鏈基因組DNA生成單鏈DNA。隨后在促進(jìn)DNA中的胞嘧啶堿基而不是5-甲基胞嘧啶堿基脫氨基的條件下，將所形成的單鏈DNA與活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶一起溫育?？梢砸远喾N方式制備出活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶，包括來自活化B細(xì)胞的粗提取物(28)、和表達(dá)促進(jìn)純化的融合蛋白(26，27)。然后用PCR擴(kuò)增p16啟動(dòng)子的CpG島周圍的相關(guān)區(qū)域(GenBank編號(hào)No.X94154)。在非甲基化熱點(diǎn)的區(qū)域中選出引物，以減少擴(kuò)增的效率依賴于甲基化狀態(tài)的可能性。在Herman等(10)中描述了合適的引物序列。PCR產(chǎn)物含有胸腺嘧啶堿基，其中在模板基因組DNA中存在的是未甲基化的胞嘧啶，以及胞嘧啶堿基，其中在模板基因組DNA中存在的是5-甲基胞嘧啶堿基。然后利用上述的合適方案通過與已知參照序列的比較測(cè)定出p16基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的甲基化狀態(tài)。對(duì)p16啟動(dòng)子區(qū)的CpG島內(nèi)的甲基化CpG序列的檢測(cè)可被用作為一些器官的腫瘤的標(biāo)記物，包括膀胱、乳腺、胃、頭頸部、食道、結(jié)腸、肺或肝的腫瘤。
實(shí)施例2利用活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶對(duì)基因組DNA的酶轉(zhuǎn)化有助于檢測(cè)p16(INK4a)基因啟動(dòng)子的CpG島的甲基化狀態(tài)。
如實(shí)施例1，首先用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)提取方案從個(gè)體的血液或組織標(biāo)本中提取出基因組DNA。所有基因都被普遍甲基化的人基因組DNA(CpGenomeTM普遍甲基化DNA)被用作為檢測(cè)p16基因(也叫做CDKN2基因，GenBank編號(hào)No.X94154)啟動(dòng)子的CpG島內(nèi)的5-甲基胞嘧啶的陽性對(duì)照。
通過利用具有所分析的CpG序列周圍的互補(bǔ)性區(qū)域的合成DNA探針使得DNA探針的雜交生成了含有CpG序列或所分析的序列的單鏈DNA的中心環(huán)，將p16基因啟動(dòng)子的CpG島的特異區(qū)域稱為活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的酶轉(zhuǎn)化的靶點(diǎn)。通過將探針和基因組DNA混和在一起，然后熱變性基因組DNA并將溶液冷卻到低于探針的解鏈溫度的溫度，使得DNA探針與基因組DNA雜交。在該技術(shù)的一個(gè)變異技術(shù)中，多個(gè)這樣的DNA探針可以與基因組DNA雜交以靶向于基因組DNA的多個(gè)相關(guān)區(qū)域。在該技術(shù)的另一個(gè)變異中，探針可以包含例如PNA或LNA的修飾DNA堿基。
在有助于酶使基因組DNA中的胞嘧啶堿基而不是5-甲基胞嘧啶堿基脫氨基的條件下，隨后將與DNA探針雜交的基因組DNA與活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶一起溫育。
然后用PCR擴(kuò)增p16啟動(dòng)子的CpG島周圍的相關(guān)區(qū)域。PCR產(chǎn)物含有胸腺嘧啶堿基，其中在模板基因組DNA的環(huán)型結(jié)構(gòu)中存在的是未甲基化的胞嘧啶，以及胞嘧啶堿基，其中在模板基因組DNA中存在的是5-甲基胞嘧啶堿基。然后如實(shí)施例1一樣測(cè)定p16啟動(dòng)子區(qū)的CpG島的甲基化狀態(tài)。
甲基化特異性的PCR依賴于引物，它們利用了在試劑例如亞硫酸氫鹽進(jìn)行轉(zhuǎn)變后的甲基化和未甲基化區(qū)域之間的序列差異。為了用甲基化特異性的PCR檢測(cè)活化誘導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶的酶轉(zhuǎn)化所靶向的CpG二核苷酸，給這個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)了甲基化特異性的引物。
實(shí)施例3AID介導(dǎo)單鏈DNA中的胞嘧啶脫氨基A.底物的制備將具有與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)L34545)的#920到#999的核苷酸堿基相同的核苷酸序列的未甲基化的80bp寡核苷酸(Ecad80)在50mM NaCl中稀釋到4M。Ecad80的序列如下5′cgc tgc tgattg gct gtg gcc ggc agg tga acc ctc agc caa tca gcg gta Cgg ggg gcg gtg ctc cggggc tca cct gg 3′。在下面的D中所述的循環(huán)測(cè)序引物延伸檢測(cè)法中，用引物3ECAD11b篩選出該序列中的#52核苷酸堿基(大寫字母C)，它對(duì)應(yīng)于Ecadherin啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)L34545)的#972堿基。
B.捕捉DNA退火將每種互補(bǔ)寡核苷酸AA1(tg tttt ggg tgt gta tgg ttt ggg tgt)和AA2(aca ccc aaa cca tac aca ccc aaa aca)都在20mM NaCl中稀釋到30μM，并將混和物在95℃下加熱5分鐘，緩慢冷卻到室溫以容許互補(bǔ)鏈的退火。所形成的雙鏈“TRAP DNA”模板被用作為下面的20μL AID反應(yīng)混和物中的核酸外切酶的誘餌。
C.AID介導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨酶反應(yīng)20μL AID反應(yīng)混和物含有50mM Hepes(pH 7.5)、1mM DTT、10mMMgCl2、24pmol Trap DNA(AA1/AA2)、4pmol Ecad80底物、200ng RNaseA、和100nM野生型AID。在37℃下溫育酶混和物，并在15分鐘后加入苯酚∶異戊醇∶氯仿(25∶24∶1，Amresco#0883-100ml)終止反應(yīng)。用Eppendorf Phase LockGel管(Light，0.5ml Cat.#0032 005.004)將含有底物的水相和苯酚∶氯仿相分開。通過經(jīng)BioRad Micro Bio-spin 6層析柱(Cat.#732-6200)洗脫標(biāo)本進(jìn)一步純化水相。
D.通過引物延伸用循環(huán)測(cè)序篩選AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基用32P-標(biāo)記引物的循環(huán)測(cè)序引物延伸提供了對(duì)胞嘧啶脫氨基程度的測(cè)定。ddA在DNA底物的含有C的位點(diǎn)上的摻入與C到U的脫氨基一致。參照?qǐng)D2下面將更詳細(xì)地描述這一點(diǎn)。
在這些反應(yīng)中，用循環(huán)測(cè)序方案擴(kuò)增了4μL AID修飾的底物。具體地，循環(huán)測(cè)序反應(yīng)物含有1x熱測(cè)序酶緩沖液(USB)、3單位熱測(cè)序酶(USB)、67nM32P末端標(biāo)記的引物3ECAD11b(5′agc ccc gga gca ccg ccc3′)、80μM各種ddATP、dGTP、dCTP和ddTTP、以及20μL石蠟油。引物3ECAD11b篩選基因組DNA的E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)L34545)的#972堿基或Ecad80的#52堿基。將反應(yīng)物熱循環(huán)7個(gè)周期(95℃30秒，55℃45秒、72℃5分鐘)。用10μL含有95％甲酰胺、10mMEDTA、0.1％二甲苯藍(lán)和0.1％溴酚藍(lán)的終止溶液終止反應(yīng)，將反應(yīng)物在95℃下變性至少2分鐘并馬上放入到冰中。在20％聚丙烯酰胺凝膠上分離產(chǎn)物，在干燥前在60W下跑電泳3個(gè)小時(shí)。對(duì)條帶強(qiáng)度的定量分析提供了對(duì)在#972位點(diǎn)上已經(jīng)被脫氨基的靶向模板的百分比的估計(jì)。
E.對(duì)聚丙烯酰胺結(jié)果的解讀在聚丙烯酰胺凝膠上所形成的條帶模式代表了循環(huán)測(cè)序檢測(cè)的模板的序列。在#972位點(diǎn)上的AID誘導(dǎo)的胞嘧啶的脫氨基將改變ddA在引物延伸檢測(cè)中的摻入程度，它具有如下所解釋的所形成的條帶模式。但反應(yīng)物不含有AID時(shí)，模板序列仍未改變(圖2，A部分)。這造成了32P標(biāo)記引物在ddA道內(nèi)延伸直到第一個(gè)T(GenBank編號(hào)L34545的E-cadherin啟動(dòng)子序列的#970位點(diǎn)；或Ecad80的#50位點(diǎn))。AID介導(dǎo)的E-cadherin啟動(dòng)子序列的#972位點(diǎn)或Ecad80的#52位點(diǎn)的胞嘧啶脫氨基成尿嘧啶將造成ddA在這個(gè)位點(diǎn)上的摻入，被稱為“陽性條帶”(圖2，B和C部分)。該“陽性”條帶對(duì)應(yīng)著更小的片段(經(jīng)模板的第一個(gè)T的讀取給引物延伸產(chǎn)物添加了兩個(gè)額外的堿基)，它在聚丙烯酰胺凝膠中跑得更快。用ImageQunat軟件(Molecular Dynamics，USA)可以測(cè)定出“陽性”條帶的強(qiáng)度，并比較了上面的包括該條帶的所有條帶的強(qiáng)度(代表PCR延伸超過了該終止點(diǎn)，因此證實(shí)模板在#972位點(diǎn)上沒有被轉(zhuǎn)化)。該百分比代表在底物的該位點(diǎn)上已經(jīng)被AID脫氨基成尿嘧啶的胞嘧啶百分比。
F.討論循環(huán)測(cè)序反應(yīng)說明AID介導(dǎo)了近37％的Ecad80底物的#52位點(diǎn)上的胞嘧啶的脫氨基(如上述的E段所測(cè)定的)。沒有AID的對(duì)照反應(yīng)證實(shí)了4％的“陽性”條帶的背景水平。這可能是背景脫氨基或聚合酶引起的ddA的錯(cuò)摻入的結(jié)果。從測(cè)試反應(yīng)中減去對(duì)照反應(yīng)，這樣可以在檢測(cè)結(jié)果中將背景水平考慮進(jìn)來。
表1AID介導(dǎo)的單鏈的化學(xué)合成的DNA底物的胞嘧啶脫氨基

實(shí)施例4AID區(qū)分未甲基化的和甲基化的胞嘧啶A.底物的制備化學(xué)合成具有下面序列的DNA寡核苷酸cgc tgc tga ttg gct gtg gcX1ggc agg tga acc ctc agc caa tca gX2g gta X3gg ggg gcg gtg etc cgg ggc tca cctgg，其中X或是未被甲基化的(Ecad80-所有胞嘧啶)或是被5’甲基胞嘧啶(5’-MeC)修飾的(Ecad80M3-在X1、X2和X3上含有三個(gè)5-MeC)。將Ecad80或Ecad80M3稀釋到4μM(在50mM NaCl中)。
B.捕捉DNA退火將每種互補(bǔ)寡核苷酸T1(att ata ttt aaa tat ata aaa tat ata tta ata aat)和T2(att tat taa tat ata ttt tat ata ttt aaa tat aat)都在20mM NaCl中稀釋到30μM。將這些寡核苷酸退火以作為實(shí)施例3所述的TRAP DNA。
C.AID介導(dǎo)的胞嘧啶核苷脫氨基反應(yīng)制備20μL含有50mM Hepes(pH 7.5)、1mM DTT、10mM MgCl2、24pmol Trap DNA(T1/T2)、4pmol底物、200ng RNase A、和100nM AID的AID反應(yīng)混和物。在37℃下溫育酶混和物15分鐘。
D.循環(huán)測(cè)序引物延伸按實(shí)施例3進(jìn)行延伸，但使用了下面的熱循環(huán)條件15個(gè)循環(huán)(95℃下2分鐘，55℃下30秒、72℃下2分鐘)。將聚丙烯酰胺凝膠在60W下跑3個(gè)小時(shí)，并在分析前將其干燥。
E.結(jié)果這些結(jié)果證實(shí)減少了甲基胞嘧啶的AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基(見表2)。在15分鐘的反應(yīng)時(shí)間后，AID使35％的Ecad80的#52堿基脫氨基，而僅僅使5％的Ecad80M3的#52堿基脫氨基。
表2AID顯示出對(duì)甲基胞嘧啶的脫氨基要少于對(duì)胞嘧啶的脫氨基

實(shí)施例5AID介導(dǎo)的基因組DNA中的胞嘧啶脫氨基A.作為底物的基因組DNA的制備依照產(chǎn)品說明書，利用QIAamp DNA血液迷你試劑盒(50)(Qiagen)從來自American Type Tissue Collection(Rockville，Md，USA)的人細(xì)胞株SW480(#CCL-228)中提取出基因組DNA。利用標(biāo)準(zhǔn)的亞硫酸氫鹽和測(cè)序方法所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)表明來自SW480的基因組DNA在E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)(GenBank編號(hào)L34545)的#972堿基上是未甲基化的。用無菌水將基因組DNA稀釋為10ng/μL。
B.AID介導(dǎo)的基因組DNA的胞嘧啶脫氨基反應(yīng)所有的反應(yīng)物都含有50mM Hepes(pH 7.5)、1mM DTT、10mMMgCl2、24pmol TRAP DNA(AA1/AA2，如實(shí)施例3所制備的)、5ng基因組DNA、200ng RNase A、和200nM AID。將反應(yīng)物在37℃下溫育15分鐘。如實(shí)施例3所述的進(jìn)行循環(huán)測(cè)序引物延伸和聚丙烯酰胺凝膠分析。
C.結(jié)果循環(huán)測(cè)序結(jié)果顯示，與沒有AID的對(duì)照反應(yīng)物中的5％比較，AID介導(dǎo)的脫氨基將16％的基因組DNA轉(zhuǎn)化成了尿嘧啶核苷。
表3AID介導(dǎo)的基因組DNA的脫氨基

對(duì)基因組DNA的低水平的AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基在此證實(shí)可能是因?yàn)樵摶蚪MDNA制劑中的較少數(shù)量的單鏈DNA，或者這可能是AID對(duì)雙鏈基因組DNA的胞嘧啶脫氨基的第一個(gè)實(shí)證。先前已經(jīng)顯示AID作用于單鏈而不是雙鏈底物(27)，這就解釋了對(duì)雙鏈基因組DNA的較弱的脫氨基作用。
實(shí)施例6通過環(huán)型探針和反義探針使得底物單鏈化增強(qiáng)了AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基。
A.底物的制備將Ecad80在具有3倍過量的ASEcad80的50mM NaCl中稀釋到4μM，ASEcad80是Ecad80的反義序列(ASEcad80序列5′cc agg tga gccccg gag cac cgc ccc ccg tac cgc tga ttg gct gag ggt tca cct gcc ggc cac agc caatca gca gcg 3′)。將混和物加熱到95℃共5分鐘，并緩慢冷卻到室溫以容許互補(bǔ)鏈退火。
B.寡核苷酸環(huán)狀探針和反義探針的退火將過量的寡核苷酸探針加入到在此實(shí)施例的步驟A中所制備的雙鏈模板中，探針被設(shè)計(jì)為與靶鏈退火并在靶位點(diǎn)生成單鏈環(huán)。下面是化學(xué)合成的環(huán)型探針DNA序列LP 10-5′CGA CCG CCC CGA TTG GCT GAG G 3′(具有3′磷酸)；LP26-5′GCC CCG GAG CGA GGG TTC ACC TG 3′(具有3′磷酸)；和LP26+1-5′GCC CCG GAG CGG AGG GTT CAC CTG 3′(具有3′磷酸)。
這些環(huán)型探針分別產(chǎn)生了10、26和26+1個(gè)堿基的單鏈環(huán)。
LP26+1在環(huán)的開口處留下了一個(gè)環(huán)型探針上的未配對(duì)核苷酸(有下劃線的核苷酸)以提供增加了的靈活性?；瘜W(xué)合成反義寡核苷酸AS265′AGC CAA TCA GCG GTA CGG GGG GCG GT 3′(具有3’磷酸)。以與非靶鏈的完全互補(bǔ)性退化AS26使得在靶鏈上形成一個(gè)26個(gè)堿基的環(huán)。將探針和底物的混和物加熱到95℃共5分鐘，并容許緩慢冷卻到室溫。
C.底物的AID修飾20μl AID反應(yīng)混和物含有50mM Hepes(pH 7.5)、1mM DTT、10mMMgCl2、24pmol Trap DNA(AA1/AA2)、4pmol底物、200ng RNase A、和100nM AID。將反應(yīng)物在37℃下溫育15分鐘。
D.循環(huán)測(cè)序引物延伸如實(shí)施例4進(jìn)行。將聚丙烯酰胺凝膠在60W下跑3個(gè)小時(shí)，之后干燥1小時(shí)15分鐘并用于分析。
E.結(jié)果雙鏈DNA底物與設(shè)計(jì)用于生成不同大小的單鏈環(huán)的寡核苷酸探針(10、26或26+1bp+/-26bp反義探針)的溫育可以增加AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基，如表4中所示。
表4AID介導(dǎo)的對(duì)與環(huán)型探針和反義探針溫育的雙鏈DNA底物的脫氨基

實(shí)施例7通過改變緩沖液離子和濃度提高AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基進(jìn)行下面的實(shí)施例說明可以如何優(yōu)化所選定的酶的反應(yīng)條件、和不同條件的緩沖液離子和濃度對(duì)AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的作用。
A.底物的制備將Ecad80(5′cgc tgc tga ttg gct gtg gcc ggc agg tga acc ctc agc caa tcagcg gtaCgg ggg gcg gtg ctc cgg ggc tca cct gg 3′)在50mM NaCl中稀釋到4μM。
B.AID介導(dǎo)的底物的胞嘧啶脫氨基反應(yīng)物含有如下范圍的緩沖液類型和濃度10、50或100mMTris-HCl、Hepes、Pipes或咪唑緩沖離子。在pH 7.5中進(jìn)行所有反應(yīng)，同時(shí)含有1mM DTT、10mM MgCl2、24pmol Trap DNA(T1/T2，如實(shí)施例4所制備的)、4pmol Ecad80、200ng RNase A和100nM AID。將反應(yīng)物在37℃下溫育15分鐘。如實(shí)施例3所述的進(jìn)行循環(huán)測(cè)序引物延伸和聚丙烯酰胺凝膠分析。
C.循環(huán)測(cè)序引物延伸用引物3ECAD11b篩選如本實(shí)施例的步驟A所示的Ecad80中的C。這是基因組DNA的E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)的#972核苷酸堿基的等價(jià)物。在被干燥1個(gè)小時(shí)之前，將聚丙烯酰胺凝膠在9W下跑9個(gè)小時(shí)，然后分析。
D.結(jié)果發(fā)現(xiàn)緩沖離子的種類改變了AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的效率。如下面的表5所示，降低的離子強(qiáng)度增加了AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基。在50mM濃度時(shí)，相同pH值的Tris-HCl比咪唑、Pipes或Hepes促進(jìn)了更高的AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基(表5)。因此，可以測(cè)試緩沖離子的類型以及緩沖液的離子強(qiáng)度以發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)AID的胞嘧啶脫氨酶活性的條件。
表5緩沖液離子和濃度影響AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基

實(shí)施例8通過增加反應(yīng)時(shí)間增強(qiáng)AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基A.底物的制備如實(shí)施例7所示制備用于本研究的底物。
B.底物的AID修飾AID反應(yīng)混和物含有10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、10mMMgCl2、24pmol Trap DNA(T1/T2序列，如實(shí)施例4所制備)、4pmol Ecad80、200ng RNase A和100nM野生型AID。將反應(yīng)物在37℃下溫育5分鐘或30分鐘。如實(shí)施例3所示的進(jìn)行循環(huán)測(cè)序引物延伸和聚丙烯酰胺凝膠分析，不同之處在于將聚丙烯酰胺凝膠在9W下電泳9個(gè)小時(shí)，并在分析前干燥1個(gè)小時(shí)。
C.結(jié)果如表6所示，發(fā)現(xiàn)增加AID反應(yīng)物的溫育時(shí)間增加了AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的量。例如，通過將溫育時(shí)間從5分鐘延長到30分鐘，AID介導(dǎo)的對(duì)Ecad80的胞嘧啶脫氨基幾乎從24％加倍到44％。
表6反應(yīng)時(shí)間對(duì)AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的作用

實(shí)施例9通過增加反應(yīng)物中的AID的量增強(qiáng)AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基A.底物的制備如實(shí)施例7所示制備本研究的底物B.底物的AID修飾AID反應(yīng)混和物含有10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、10mMMgCl2、24pmol Trap DNA(T1/T2序列，如實(shí)施例4所制備)、4pmol Ecad80、200ng RNase A和100nM或200nM AID。將酶反應(yīng)物在37℃下溫育20分鐘或30分鐘。如實(shí)施例3所示的進(jìn)行循環(huán)測(cè)序引物延伸和聚丙烯酰胺凝膠分析，不同之處在于將聚丙烯酰胺凝膠在9W下電泳9個(gè)小時(shí)，并在分析前干燥1個(gè)小時(shí)。
C.結(jié)果如表7所示，發(fā)現(xiàn)增加AID的濃度增加了AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的量。
表7增加AID濃度對(duì)AID介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的作用

實(shí)施例10利用APOBEC3G、野生型和AID突變體R35E/R36D的酶介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基用天然的酶包括AID和APOBEC同源物可以產(chǎn)生胞嘧啶脫氨酶活性。通過隨機(jī)或有序的突變也可以生成這些蛋白的突變版本，篩選突變體以發(fā)現(xiàn)具有更高的脫氨基及區(qū)分胞嘧啶及5-甲基胞嘧啶的效率的蛋白。
A.底物的制備如實(shí)施例7所示制備本研究的底物。
B.底物的AID修飾AID反應(yīng)混和物含有10mM Tris-HCl(pH 7.5)、1mM DTT、10mMMgCl2、24pmol Trap DNA(T1/T2序列，如實(shí)施例2所制備)、4pmol底物、500ng RNase A以及或100nM野生型AID、或100nM APOBEC3G或100nM AID突變體R35E/R36D(由美國南加州大學(xué)分子生物學(xué)和化學(xué)系Myron Goodman教授提供)。將反應(yīng)物在37℃下溫育15分鐘。
C.循環(huán)測(cè)序引物延伸和聚丙烯酰胺凝膠分析如實(shí)施例4的用下面的熱循環(huán)方案進(jìn)行循環(huán)測(cè)序引物延伸20個(gè)循環(huán)(95℃2分鐘，55℃30秒、72℃2分鐘)。將聚丙烯酰胺凝膠在9W下電泳9個(gè)小時(shí)，然后在干燥1個(gè)小時(shí)并分析。
D.結(jié)果表8所示的結(jié)果證實(shí)AID突變體R35E/R36D在使Ecad80的#52核苷酸堿基脫氨基上具有比野生型AID更高的活性。與野生型蛋白相比，AID突變體R35E/R36D使得幾乎兩倍多的底物脫氨基。APOBEC3G表現(xiàn)出較低量的胞嘧啶脫氨基活性，但進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件(例如緩沖離子、緩沖液濃度、pH和酶濃度)可以提高APOBEC3G介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基的效率。這個(gè)實(shí)施例還證實(shí)評(píng)價(jià)具有胞嘧啶脫氨酶活性的酶的突變體和天然變體的有用性。
表8酶介導(dǎo)的胞嘧啶脫氨基

盡管在此之前參照優(yōu)選的實(shí)施方式已經(jīng)描述了本發(fā)明，但是本領(lǐng)域人員要明白不脫離本發(fā)明的精神或范圍的許多變化和修飾都是可能的。因此，所示的這些實(shí)施方式在任何方面都被認(rèn)為是舉例說明的而不是限制性的。
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權(quán)利要求
1.一種用于檢測(cè)來自個(gè)體的基因組或線粒體雙鏈DNA樣品中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平的方法，所述方法包括(a)獲得來自個(gè)體的雙鏈DNA樣品；(b)將雙鏈DNA的至少一個(gè)區(qū)域轉(zhuǎn)化為單鏈DNA；(c)將來自步驟(b)的單鏈DNA的靶區(qū)域與至少一種酶反應(yīng)，所述酶能有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶和胞嘧啶；以及(d)確定酶對(duì)靶區(qū)域的酶修飾的水平。
2.權(quán)利要求1的方法，其中單鏈DNA與酶在使得酶基本上只與單鏈DNA中的烷基化胞嘧啶或胞嘧啶反應(yīng)而不是與兩者都反應(yīng)的條件下反應(yīng)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中酶能夠基本上只與單鏈DNA中的烷基化胞嘧啶或胞嘧啶之一反應(yīng)。
4.權(quán)利要求1到3中任一項(xiàng)的方法，其中將雙鏈DNA的區(qū)域轉(zhuǎn)化為單鏈DNA的轉(zhuǎn)化包括至少部分地分離雙鏈DNA的兩條鏈。
5.權(quán)利要求4的方法，其中利用一種或多種鏈置換探針至少部分地分離雙鏈DNA的兩條鏈。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述鏈置換探針或每種鏈置換探針獨(dú)立地選自由核酸類似物探針、含PNA探針、含LNA探針、PNA探針和LNA探針?biāo)鶚?gòu)成的組。
7.權(quán)利要求4的方法，還包括抑制已經(jīng)分離的雙鏈DNA的兩條鏈之間發(fā)生退火，以利于所述酶接近靶區(qū)域。
8.權(quán)利要求7的方法，還包括在雙鏈DNA的兩條鏈分離之后以至少一種探針與雙鏈DNA的一條鏈雜交，由此抑制所述兩條鏈之間發(fā)生退火。
9.權(quán)利要求8的方法，其中所述至少一種探針獨(dú)立地選自由有義探針、環(huán)型探針、反義探針及其混和物所構(gòu)成的組。
10.權(quán)利要求8的方法，其中至少兩種所述的探針與雙鏈DNA的鏈雜交，其中一種探針與所述鏈的位于靶區(qū)域下游的區(qū)域雜交，而另一種探針與所述鏈的位于靶區(qū)域上游的區(qū)域雜交。
11.權(quán)利要求8的方法，其中該探針與所述鏈的位于靶區(qū)域側(cè)翼的上游區(qū)域和下游區(qū)域雜交，使得在所述鏈上形成包括所述靶區(qū)域的環(huán)型或泡狀結(jié)構(gòu)。
12.權(quán)利要求8的方法，其中該探針與位于靶區(qū)域的每一側(cè)的所述雙鏈DNA的所述鏈雜交，并且該探針具有不與所述靶區(qū)域雜交的非互補(bǔ)序列的中間區(qū)域，使得在所述鏈上形成包括所述靶區(qū)域的環(huán)型或泡狀結(jié)構(gòu)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中該探針的所述中間區(qū)域包括反向重復(fù)序列，在該探針與雙鏈DNA的所述鏈雜交之后，所述反向重復(fù)序列之間發(fā)生雜交。
14.權(quán)利要求1到13中任一項(xiàng)的方法，其中確定所述單鏈DNA的酶修飾水平包括分析由酶對(duì)所述單鏈DNA的靶區(qū)域的酶修飾所引起的序列變異。
15.權(quán)利要求14的方法，其中確定酶修飾水平包括對(duì)所述單鏈DNA的靶區(qū)域進(jìn)行包含熱循環(huán)及引物的擴(kuò)增過程以得到擴(kuò)增產(chǎn)物，并分析擴(kuò)增產(chǎn)物的序列變異。
16.權(quán)利要求15的方法，其中分析擴(kuò)增產(chǎn)物包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行選自由核酸測(cè)序、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)、限制性內(nèi)切酶消化和包含使用與特異性核酸序列結(jié)合的探針的技術(shù)所構(gòu)成的組的一種技術(shù)。
17.權(quán)利要求16的方法，其中分析擴(kuò)增產(chǎn)物包括對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)。
18.權(quán)利要求1到17中任一項(xiàng)的方法，其中所述至少一種酶使所述單鏈DNA的靶區(qū)域中的烷基化胞嘧啶或胞嘧啶脫氨基。
19.權(quán)利要求1到18中任一項(xiàng)的方法，其中采用不同的所述酶的組合以有區(qū)別地修飾所述靶區(qū)域中的烷基化胞嘧啶和胞嘧啶。
20.權(quán)利要求1到19中任一項(xiàng)的方法，其中所述酶或每一種酶獨(dú)立地是脫氨酶或其具有脫氨酶活性的催化片段、變體、同源物、或修飾形式或突變形式。
21.權(quán)利要求20的方法，其中所述酶選自由ApoBRe、AID和AID突變體R35E/R36D所構(gòu)成的組。
22.權(quán)利要求1到21中任一項(xiàng)的方法，包括檢測(cè)基因或基因的非編碼區(qū)、或它們的片段內(nèi)的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平。
23.權(quán)利要求22的方法，包括檢測(cè)基因的5’非翻譯區(qū)內(nèi)的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平。
24.權(quán)利要求23的方法，其中烷基化胞嘧啶的水平包括超甲基化。
25.權(quán)利要求23的方法，其中烷基化胞嘧啶的水平包括低甲基化。
26.權(quán)利要求23的方法，其中基因選自由p16、E-cadherin、VHL基因、BRCA1、p15、hMLH1、ER、HIC1、MDG1、GST-π、O6-MGMT、降鈣素、myo-D、尿激酶和S100A4所構(gòu)成的組。
27.權(quán)利要求1到26中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)到所述單鏈DNA的靶區(qū)域中的烷基化胞嘧啶的水平發(fā)生改變是疾病或病變的一種標(biāo)記物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中疾病或病變是癌癥。
29.權(quán)利要求28的方法，其中癌癥選自由肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌、腎細(xì)胞腫瘤、白血病、Burkitt淋巴瘤、腦腫瘤和癌癥所構(gòu)成的組。
30.權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)的方法，還包括根據(jù)烷基化胞嘧啶在所述單鏈DNA的靶區(qū)域中的存在情況或水平診斷個(gè)體的疾病或病變。
31.權(quán)利要求30的方法，其中疾病或病變包括選自由肺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌、腎細(xì)胞腫瘤、白血病、Burkitt淋巴瘤、腦腫瘤和癌癥所構(gòu)成的組的癌癥。
32.權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)烷基化胞嘧啶的存在情況或水平以說明是否存在胎兒DNA。
33.權(quán)利要求1到23中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)烷基化胞嘧啶的存在情況或水平以說明是否存在已改變的基因印跡狀態(tài)。
34.權(quán)利要求1到33中任一項(xiàng)的方法，其中檢測(cè)烷基化胞嘧啶的存在情況或水平以說明是否存在病原體或微生物。
35.權(quán)利要求1到34中任一項(xiàng)的方法，其中烷基化胞嘧啶是甲基化胞嘧啶。
36.權(quán)利要求35的方法，其中甲基化胞嘧啶是5-甲基胞嘧啶。
37.權(quán)利要求1到36中任一項(xiàng)的方法，其中雙鏈DNA是基因組DNA。
38.一種用于權(quán)利要求1到38中任一項(xiàng)所定義的檢測(cè)來自個(gè)體的基因組或線粒體雙鏈DNA樣品中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平的方法的試劑盒，其中試劑盒包括用于進(jìn)行所述方法的一種或多種試劑以及使用說明書。
全文摘要
本發(fā)明公開了采用一或多種能有區(qū)別地修飾烷基化胞嘧啶或胞嘧啶的酶來檢測(cè)雙鏈DNA中的烷基化胞嘧啶的方法。DNA的至少一個(gè)區(qū)域被轉(zhuǎn)化成單鏈DNA并將酶與單鏈DNA中的靶區(qū)域反應(yīng)。通過確定酶對(duì)靶區(qū)域的酶修飾的水平檢測(cè)出靶區(qū)域中的烷基化胞嘧啶的存在情況或水平。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1816635SQ200480018975
公開日2006年8月9日 申請(qǐng)日期2004年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月4日
發(fā)明者艾利森·韋爾伊恩·托德, 卡羅琳·簡·菲爾瑞, 坦亞·琳恩·阿普爾蓋特 申請(qǐng)人:強(qiáng)生研究有限公司