專(zhuān)利名稱(chēng)：帶有修飾堿基的寡核苷酸作為抗病毒劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用含有特異修飾的核苷酸堿基的寡核苷酸類(lèi)似物，來(lái)抑制病毒的基 因表達(dá)和/或復(fù)制。寡核苷酸任選地與具有高選擇性人工核酸酶活性的鑭系元素有機(jī)復(fù)合 物結(jié)合。
背景技術(shù)：
寡核苷酸和修飾的寡核苷酸的應(yīng)用在現(xiàn)代療法中是極為重要的，并已有詳盡 記錄(Uhlmann 等，Antisense oligonucleotides :A newtherapeutic principle.(反 義寡核苷酸新的治療原理)Chemical Reviewsl990,90 :543_584 ；Crooke等《反義研 究禾口應(yīng)用》(Antisense Researchand Applications), CRC Press (1993) ；Mesmaekar 等，“Antisenseoligonucleotides “(反義寡核苷酸)，Ace. Chem. Res. 1995, 28 366-374 ；Stein. “ The experimental use of antisense oligonucleotides :a guide for theperplexed.“(反義寡核苷酸的實(shí)驗(yàn)應(yīng)用困惑指南)J. Clin. Invest. 2001，108， 641-644)。反義多核苷酸與DNA或RNA靶的特異性結(jié)合，可以使核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄或翻譯失 活，從而提供了用于控制疾病例如癌癥和病毒感染的機(jī)制。因此，反義寡核苷酸與靶的結(jié)合 可用于在各種不同的情況下改變基因的表達(dá)，例如干擾病毒的生命周期或癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。許多侵害人類(lèi)的重要傳染病由病毒引起。這些疾病中的許多，包括肝炎、免疫缺陷 和各種不同腦炎疾病，通常是致命的。其他這類(lèi)疾病的重要性在于它們是高度傳染性的，引 起急性不適，例如流感、麻疹、流行性腮腺炎和水痘，以及呼吸道或胃腸道疾病。其他例如風(fēng) 疹和巨細(xì)胞病毒能引起先天性畸形。最后，還有被稱(chēng)為致癌病毒的病毒(包括人類(lèi)乳頭瘤 病毒)，能夠在人類(lèi)和動(dòng)物中引起癌癥。病毒基因組可以由DNA或RNA構(gòu)成。此外，已知有兩類(lèi)病毒，在它們的復(fù)制周期中 使用DNA和RNA兩種階段。病毒的基因組DNA可以是雙鏈或單鏈的，環(huán)狀或線(xiàn)性的。DNA的 尺寸可以小至4. 5kb，或大至1.2Mbp ；基因的數(shù)量在3到高達(dá)911個(gè)之間變化。DNA基因組 不用作建議的抗病毒的靶。代替病毒編碼的mRNAs，可以使用對(duì)于病毒感染來(lái)說(shuō)關(guān)鍵的微小 RNAs以及編碼宿主因子的mRNAs，作為反義靶。因此，這種方法不導(dǎo)致病毒基因組的直接破 壞，而是能夠抑制病毒復(fù)制和/或基因表達(dá)，并最終導(dǎo)致病毒基因組從細(xì)胞中清除。此外， 靶向編碼抑制宿主免疫應(yīng)答所必需的蛋白的病毒mRNAs，可以通過(guò)宿主免疫系統(tǒng)增強(qiáng)病毒 的消除。靶向抑制宿主細(xì)胞凋亡所必需的病毒基因產(chǎn)物，可以導(dǎo)致被感染細(xì)胞的提前死亡 并因此消除病毒感染，而靶向潛伏病毒的維持所必需的病毒基因產(chǎn)物(mRNAs，或在某些情 況下微小RNAs)，可以導(dǎo)致消除被潛伏感染的細(xì)胞，并從被感染生物體中除去潛伏病毒。反轉(zhuǎn)錄病毒不具有DNA基因組，但是在它們感染的第一階段，它們合成了它們的 基因組RNA的cDNA拷貝，然后將其整合到細(xì)胞DNA中，從而變成了宿主基因組的一部分(所謂的原病毒DNA)。該DNA通常在轉(zhuǎn)錄上是沉默的，攜帶這些原病毒的細(xì)胞不能被常規(guī)的抗 病毒劑或系統(tǒng)被靶向(這是抗HIV療法中的最大難題之一)。盡管原病毒不能通過(guò)反義技 術(shù)被靶向或消除，但感染過(guò)程的某些步驟卻能。這些步驟包括在反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)發(fā)生之前，靶 向新被感染細(xì)胞中的病毒基因組——在該階段中基因組RNA被病毒蛋白包封在“核心”粒 子中；靶向病毒受體或共同受體(在HIV的情況中是趨化因子受體)以阻止病毒進(jìn)入；靶向 病毒cDNA核運(yùn)輸和整合到宿主基因組中所必需的細(xì)胞輔因子(對(duì)于HIV-I來(lái)說(shuō)許多這樣 的因子是已知的)；靶向從原病毒表達(dá)的mRNAs，從而抑制反轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制周期；在病毒基 因組RNAs包衣殼之前靶向它們，并阻止新的病毒粒子的形成。這些策略對(duì)于抑制HIV基因 組可能是有效的，該基因組編碼了多個(gè)調(diào)控蛋白，它們的表達(dá)可以被阻斷。核糖核酸病毒(具有RNA基因組的病毒)的基因組可以用序列特異性抗RNA藥劑 直接靶向。因此由核糖核酸病毒引起的感染可以通過(guò)單獨(dú)使用這些種類(lèi)的藥物完全消除。 但是，在實(shí)踐中，基因組的靶向可能是復(fù)雜的，因?yàn)椴《净蚪M通常是受保護(hù)的；但即使這 樣，病毒mRNAs和病毒所必需的細(xì)胞輔因子的mRNAs，仍然可以被靶向。具有雙鏈RNA基因組的病毒的基因組RNA，總是包裝在蛋白粒子(病毒核心)中， 從不釋放到被感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此，很可能只有mRNAs和宿主因子可以用抗RNA藥 劑靶向。具有單鏈負(fù)鏈RNA基因組的病毒的基因組，總是受到病毒核蛋白的保護(hù)，但是它不 形成特定的核心-粒子。因此，靶向病毒基因組以及它們的必需mRNAs 二者，將是可能的。具有單鏈正鏈RNA基因組的病毒，是其中基因組RNA被直接用作mRNA，并且至少在 感染的某些階段采取裸露(未受保護(hù))形式的唯一類(lèi)型的病毒。但是，在復(fù)制過(guò)程中，基因 組及其互補(bǔ)鏈通常包裝在膜狀結(jié)構(gòu)中。因此，可能感染的初始階段(在復(fù)制酶復(fù)合物形成 之前)可能對(duì)RNA降解劑更敏感。除了病毒靶的本性(基因組，mRNA，或二者)之外，其他 因素也可能具有非常重要的作用。如果抗病毒劑局限于單一作用，例如阻斷一種RNA分子(反義寡核苷酸)或切開(kāi) 僅僅一種RNA分子(使用抗病毒核酶時(shí)通常是這種情況)，那么靶RNA的豐度是特別重要 的。病毒RNA的豐度隨著病毒的類(lèi)型和感染階段變化極大。據(jù)假定，在病毒RNA(基因組或 mRNAs)的拷貝數(shù)低的感染階段(這典型對(duì)應(yīng)于感染的早期階段)，反義劑更加有效。靶的極性對(duì)于正義核糖核酸病毒的抑制是重要的，這些病毒具有高度不對(duì)稱(chēng)的 RNA合成，例如，這些病毒的正(基因組)鏈數(shù)量通常比負(fù)鏈數(shù)量高100倍或以上。這將使負(fù) 鏈成為優(yōu)選的靶，但是，已知這些病毒的負(fù)鏈通常(可能總是)以雙鏈RNA中間體的形式存 在，并隱藏在膜狀復(fù)制復(fù)合物中。因此，重要的是確定所提出的抗病毒劑是否也結(jié)合dsRNA 復(fù)合物(在使用RNAi的實(shí)驗(yàn)中已報(bào)道了負(fù)鏈的特異性降解)。病毒在受感染細(xì)胞內(nèi)部的復(fù)制位點(diǎn)取決于病毒的類(lèi)型，可以在核(反轉(zhuǎn)錄病毒， 大多數(shù)DNA病毒和流感病毒)或細(xì)胞質(zhì)(除了流感病毒、玻納病毒屬和胞核彈狀病毒屬以 及DNA基因組的痘病毒之外的所有核糖核酸病毒)中進(jìn)行。對(duì)于在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)復(fù)制的病毒來(lái) 說(shuō)，觀(guān)察到了不同的病毒特異性結(jié)構(gòu)(通常稱(chēng)為“病毒工廠(chǎng)”或“病毒發(fā)生基質(zhì)”)。在理論 上，特定位點(diǎn)(例如核、膜復(fù)合物和“病毒工廠(chǎng)”)的用處可以保護(hù)病毒基因組不受治療藥劑 影響；然而，已報(bào)道至少RNAi具有抗核RNA分子的活性。因此，病毒復(fù)制復(fù)合物的細(xì)胞內(nèi)定 位的重要性可能具有相對(duì)次要的影響，特別是如果納入以下考慮因素所有病毒使用游離 mRNAs來(lái)表達(dá)它們的基因，因此具有能夠被RNA降解劑靶向的分子，并且所有的正鏈RNA病毒(其基因組可以被容易地靶向的唯一類(lèi)型的病毒)都在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。病毒在受感染生物體內(nèi)復(fù)制的位點(diǎn)可能具有大得多的影響。同樣，復(fù)制位點(diǎn)取決 于病毒的類(lèi)型。大多數(shù)病毒具有一定的組織特異性——某些病毒感染上皮細(xì)胞，某些病毒 感染肝細(xì)胞等。許多病毒感染不同的細(xì)胞類(lèi)型。感染可以從外周組織(侵入口)開(kāi)始，但 是疾病由在其他細(xì)胞類(lèi)型(靶細(xì)胞)中的復(fù)制引起。有許多病毒這兩種細(xì)胞是完全不同的 (麻疹病毒等)，但是也有許多例子這些細(xì)胞是相同的(流感病毒)。生物體內(nèi)不同復(fù)制位點(diǎn)的結(jié)果是不同的。如果病毒在上皮組織(腸上皮細(xì)胞，呼 吸道)中復(fù)制，藥物投送方法可以相對(duì)簡(jiǎn)單。這意味著有效但高度不穩(wěn)定的化合物例如 siRNAs，可用于在體內(nèi)治療這些感染。如果病毒在上皮之外的組織中復(fù)制，至少對(duì)于siRNA 技術(shù)來(lái)說(shuō)需要特殊的藥物投送系統(tǒng)。在HCV感染的情況下，治療藥劑理論上可以是表達(dá) siRNA前體(shRNA)的肝特異性納米粒子或肝特異性病毒粒子。在瞬態(tài)模型(transient models)中，將編碼shRNA的質(zhì)粒DNA直接注射到血流中，也已經(jīng)產(chǎn)生了良好結(jié)果，但由于缺 乏投送特異性，這種技術(shù)的治療性應(yīng)用將很可能受限。在這些病毒中，穩(wěn)定得足以通過(guò)血液 投送并且安全無(wú)毒的化合物(例如短的寡核苷酸不能整合到宿主DNA中，一般不引起副作 用)，可能比siRNA技術(shù)更有優(yōu)勢(shì)。如果病毒在特定組織例如神經(jīng)元組織中復(fù)制，可能需要另一種類(lèi)型的特異性投送 系統(tǒng)。如果病毒的靶組織是CNS，那么也需要穿過(guò)血腦屏障的方法，例如抗病毒劑的腦內(nèi)投 送。感染人類(lèi)和動(dòng)物的病毒一般采用幾種感染策略之一。在“一打即跑(hit and rim)”策略(急性感染)中，病毒進(jìn)入宿主，快速活躍地復(fù)制，并最終被宿主的免疫應(yīng)答消 除；唯一的替代結(jié)果是感染宿主的死亡。感染時(shí)間典型較短(最多幾周)，急性感染過(guò)程中 病毒量非常高。這種策略被許多“經(jīng)典”病毒(例如流感病毒)采用。在“一打即躲(hit and hide) ”策略(潛伏感染)中，感染以上述的情景開(kāi)始和發(fā) 展，但是代替被完全消除的是，病毒建立起了終生的潛伏感染。在潛伏期間，病毒的基因表 達(dá)最小化，不產(chǎn)生感染性病毒。但是，在某些條件下，病毒重新激活并引起新的疾病(與最 初的疾病相同或不同)。這些類(lèi)型的病毒非常常見(jiàn)，包括例如單純性皰疹病毒(HSV)。在許 多情況下，由于傾向于在免疫受損患者(例如AIDS患者)中導(dǎo)致嚴(yán)重或致命疾病，這些病 毒引起了嚴(yán)重問(wèn)題?！奥浴被颉俺掷m(xù)性”感染一般以短的急性階段開(kāi)始。該階段可以是無(wú)癥狀的，可 以以病毒的完全消除作為結(jié)束。但是結(jié)果取決于病毒和宿主兩者高達(dá)95%的乙肝病毒 (HBV)感染在成年人中以病毒的消除作為結(jié)束?；蛘?，病毒可能建立起慢性感染(例如高達(dá) 70%的HCV感染和可能100%的HIV感染)。在慢性感染過(guò)程中，病毒復(fù)制保持活性(與潛 伏感染中相反)，可以產(chǎn)生大量病毒粒子(HCV典型地每天形成多達(dá)1012個(gè)粒子)。但是， 免疫系統(tǒng)不能消除感染。慢性病毒代表了主要的健康護(hù)理問(wèn)題，因?yàn)楦哌_(dá)5億人感染有HBV 或HCV，大約4千萬(wàn)人感染有HIV-I。消除不同類(lèi)型感染需要的條件可能極為不同。對(duì)于急性疾病來(lái)說(shuō)，治療必須盡可 能早地進(jìn)行，并很可能相當(dāng)短。在這種情況下，治療具有明確的目標(biāo)，減緩病毒的感染，給免 疫系統(tǒng)時(shí)間來(lái)消除病毒(通過(guò)治療完全抑制病毒可能是不可能的，在許多情況下可能也是 不必要的)。還不清楚使用藥劑的最低效率應(yīng)該如何——在某些情況下少量抑制復(fù)制就可以提供相當(dāng)大的保護(hù)，而在其他情況下可能需要幾乎徹底的抑制。對(duì)于潛伏病毒來(lái)說(shuō)，主要問(wèn)題是消除被被潛伏感染的細(xì)胞——儲(chǔ)存庫(kù)，新的感染 可能由此開(kāi)始。目前，對(duì)病毒潛伏的機(jī)制了解得很少，這是為什么目前的療法不能消除潛伏 病毒的原因之一。理論上，這些病毒和潛伏細(xì)胞可以用針對(duì)病毒輔因子(如果它們已知的 話(huà))或針對(duì)病毒的必需基因產(chǎn)物的序列特異性RNA降解劑來(lái)靶向。例如，在HSV的研究中， 最近已證實(shí)病毒編碼的微小RNA可能是造成潛伏感染的主要因子，這可以為病毒復(fù)制的抑 制提供理想的靶。對(duì)于慢性病毒來(lái)說(shuō)，治療可以旨在防止感染的擴(kuò)散(例如在向HCV患者進(jìn)行肝臟 移植的情況下)，以在所有或在許多細(xì)胞中消除感染，或至少將病毒的復(fù)制保持在某種控制 之下。一般來(lái)說(shuō)，慢性感染的治療是長(zhǎng)期的過(guò)程——目前對(duì)于HIV患者來(lái)說(shuō)是終生的，對(duì)于 HBV和HCV患者來(lái)說(shuō)需要許多月。由于這個(gè)事實(shí)，治療的副作用是非常重要的，正如在使用 抗HIV、HCV和HBV治療的長(zhǎng)期效應(yīng)中看到的。所有類(lèi)型的抗病毒劑的主要問(wèn)題之一是對(duì)藥物具有抗性的病毒變異體的出現(xiàn)。這 個(gè)現(xiàn)象背后的一般分子機(jī)制包括靶序列的缺失和靶序列的修飾(點(diǎn)突變，小的缺失)。在許 多情況下，完整的基因或其功能可能丟失(使用阿昔洛韋的抗HSV療法通常引起病毒TK基 因的丟失)。但是，這種抗性機(jī)制只有當(dāng)靶基因編碼的功能對(duì)于病毒存活來(lái)說(shuō)不是必需的情 況下才有可能。在實(shí)際的靶之外的序列的修飾，使得它們補(bǔ)償了失去的功能，促進(jìn)了 RNA構(gòu) 象的變化等，是抗病毒治療一貫的問(wèn)題。另一個(gè)問(wèn)題是許多重要病原體在遺傳上極為可變 這一事實(shí)?，F(xiàn)有的HIV-I基因組序列的變異性，與整個(gè)小核糖核酸病毒科中的變異性相當(dāng)； HCV基因型之間的同源性，能夠低至60%。本質(zhì)上，這表明HIV-I和HCV都不代表單一的病 原體；相反，它們是用于(主要由于歷史原因)相關(guān)病原體類(lèi)群的名稱(chēng)。這種巨大的多樣性 已經(jīng)嚴(yán)重地阻礙了針對(duì)任何這些病毒的有效疫苗的構(gòu)建。此外，HCV、HIV以及其他核糖核 酸病毒不具有這樣固定的基因組序列，相反，它們具有一種共有序列(因此個(gè)體基因組一 般不同)，并因此作為準(zhǔn)種(quasi-species)存在。已經(jīng)顯示，即使在單一患者內(nèi)，每個(gè)HCV RNAs的序列彼此之間在1-3%的核苷酸位置上存在差異。因此，在任何慢性感染患者中，已 經(jīng)存在相當(dāng)大的序列變異性。這些序列變異性通常來(lái)自于病毒復(fù)制和重組事件中發(fā)生的突變。病毒復(fù)制過(guò)程 中發(fā)生的突變主要是由于缺乏校讀功能——反轉(zhuǎn)錄酶(HIV-I)和RNA依賴(lài)性RNA聚合酶 (HCV)都不能校正在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)生的錯(cuò)誤(錯(cuò)誤率估計(jì)為每個(gè)周期每個(gè)核苷酸10_4 變化，在HIV和HCV的情況下意味著每個(gè)基因組一個(gè)變化)。與這些病毒合成的大量基因組 合在一起考慮，HIV和HCV能夠極快地突變(據(jù)報(bào)道HCV的突變率比HIV高100倍)。實(shí)質(zhì) 上，這意味著這些病毒可以在短時(shí)間內(nèi)克服任何序列特異性治療藥劑的效應(yīng)。對(duì)于HIV來(lái) 說(shuō)，這種現(xiàn)象已經(jīng)進(jìn)行了最深入的研究，因?yàn)榭笻IV療法已經(jīng)使用了將近20年。結(jié)果表明， 為了獲得任何長(zhǎng)期效果，應(yīng)該組合使用具有不同靶特異性的抑制劑(這是目前的高效抗反 轉(zhuǎn)錄病毒療法(Highly Active Anti RetrovirusTherapy) :HAART 的原理)。但即使是這 種策略，也沒(méi)有阻止新的藥物抗性HIV變異株的出現(xiàn)。病毒對(duì)基于核酸的療法(反義寡核苷酸，核酶，SiRNA和shRNA)的抗性現(xiàn)象，對(duì)于 RNAi系統(tǒng)來(lái)說(shuō)研究得最多。已經(jīng)證實(shí)，反轉(zhuǎn)錄病毒(HIV)和核糖核酸病毒(HCV，脊髓灰質(zhì) 炎病毒)都對(duì)RNAi敏感，但是它們通過(guò)在siRNA靶位點(diǎn)和/或周?chē)蛄兄幸胪蛔?，快?br> 9發(fā)展出了對(duì)任何特異性SiRNA的抗性。也已顯示，抗性總是與特異性靶序列相關(guān)，而不是與 對(duì)RNAi本身的不敏感性相關(guān)。發(fā)展出對(duì)siRNAs的抗性顯然相當(dāng)容易，因?yàn)閟iRNA應(yīng)當(dāng)與 靶具有100%的匹配(微小RNA耐受幾個(gè)改變，但是是效率低得多的沉默子)。此外，由于 遺傳密碼的冗余性，核酸序列可以改變而不影響編碼的蛋白的序列。病毒蛋白具有相當(dāng)大 的可塑性——可以耐受許多氨基酸的改變(這也可以從關(guān)于抗HIV藥物抗性的數(shù)據(jù)中找到 證據(jù))。改變不僅能夠影響RNA序列，而且能夠影響其二級(jí)結(jié)構(gòu)，從而抑制了它被siRNA識(shí) 別。有兩種通用方法可用于避免(或最小化)抗性病毒基因組的出現(xiàn)。與HAART療法 相似，可以使用幾種siRNAs (或siRNAs與其他抑制劑例如核酶的組合)來(lái)治療病毒感染。 已經(jīng)顯示，這種治療比使用單一 siRNA的治療更為有效，并顯著減少了抗性突變株的出現(xiàn)。 因此，對(duì)于其他基于核酸的治療性藥劑，也應(yīng)該強(qiáng)烈推薦類(lèi)似的策略?？梢詫iRNAs靶向高度保守的序列或具有多個(gè)重疊功能的序列。這樣的序列不 容易被改變而不影響關(guān)鍵功能。這種序列的例子是HIV-I基因組中的引物結(jié)合區(qū)，或HCV 基因組中帶有IRES元件的5，UTR區(qū)。發(fā)明_既述本發(fā)明涉及含有寡核苷酸的組合物，其中所述寡核苷酸含有修飾的核堿基和任選 的螯合性部分，這增加了它們與互補(bǔ)核酸的結(jié)合能力，并表現(xiàn)出抗病毒活性。一方面，本發(fā)明提供了在對(duì)象中抑制病毒復(fù)制的方法，包括向?qū)ο笫┯?到150個(gè) 核堿基的寡核苷酸，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿 基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。另一方面，本發(fā)明考慮到了抑制靶核酸的翻譯的方法，包括將靶核酸與含有具有 5到150個(gè)核堿基的寡核苷酸的組合物，在允許寡核苷酸與靶核酸雜交的條件下接觸，其 中雜交的寡核苷酸抑制了靶核酸的翻譯，其中靶核酸與病毒復(fù)制相關(guān)，并且其中寡核苷酸 含有至少一個(gè)修飾的核堿基，所述堿基選自巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿 基)和羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。另一方面，本發(fā)明提供了在對(duì)象或病毒病原體中抑制病毒基因組的復(fù)制的方法， 包括預(yù)測(cè)或測(cè)定對(duì)象中靶核酸的核苷酸序列，其中靶核酸與病毒復(fù)制相關(guān)，以及向?qū)ο笫?用含有5到150個(gè)核堿基的寡核苷酸的組合物，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異 構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)，并且 其中在對(duì)象的生理?xiàng)l件下，所述化合物與靶序列的核苷酸序列充分互補(bǔ)，以便在對(duì)象中與 其雜交并抑制病毒復(fù)制。本發(fā)明還考慮到了使用寡核苷酸在對(duì)象中抑制病毒復(fù)制，其中寡核苷酸被配制成 用于向?qū)ο笫┯?，并含?到150個(gè)核堿基，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或 離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。在相關(guān)方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸在制造抑制靶核酸翻譯的藥物中的應(yīng)用，其 中將靶核酸與含有寡核苷酸的組合物在允許寡核苷酸與靶核酸雜交的條件下接觸，其中雜 交的寡核苷酸抑制了靶核酸的翻譯，其中靶核酸與病毒復(fù)制相關(guān)，并且其中寡核苷酸含有 至少一個(gè)修飾的核堿基，所述核堿基選自巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿 基)和羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。
另一方面，本發(fā)明提供了寡核苷酸在制造在對(duì)象中抑制病毒基因組復(fù)制的藥物中 的應(yīng)用，所述應(yīng)用包括預(yù)測(cè)或測(cè)定對(duì)象或病毒病原體中靶核酸的核苷酸序列，其中靶核酸 與病毒復(fù)制相關(guān)，以及向?qū)ο笫┯煤芯哂?到150個(gè)核堿基的寡核苷酸的藥物，其中至少 一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或 離子型堿基(羥基核堿基)，并且其中在對(duì)象的生理?xiàng)l件下，所述化合物與靶序列的核苷酸 序列充分互補(bǔ)，以便在對(duì)象中與其雜交并抑制病毒復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施方案中，可用于本發(fā)明的方法或應(yīng)用或化合物中的寡核苷酸包含至少 一個(gè)巰基核堿基。在相關(guān)實(shí)施方案中，巰基核堿基選自5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰 基鳥(niǎo)嘌呤和8-巰基腺嘌呤。在相關(guān)實(shí)施方案中，本發(fā)明包含至少一個(gè)羥基核堿基。在其他 實(shí)施方案中，羥基核堿基選自5-羥基胞嘧啶、5-羥基尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥(niǎo)嘌 呤。一方面，寡核苷酸還包含與其連接的有機(jī)核酸酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，有機(jī)核酸酶 包含與鑭系金屬?gòu)?fù)合的螯合性有機(jī)部分。在優(yōu)選實(shí)施方案中，鑭系金屬選自鑭、鈰、鐠、釹、 钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥。另一方面，本文描述的寡核苷酸可用于抑制各種不同病毒株的復(fù)制。在一個(gè)實(shí)施 方案中，病毒是正鏈RNA病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，病毒是DNA病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是快速急性病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，快速急性病毒是 甲病毒。 在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是慢性病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，慢性病毒是丙型肝炎 病毒。在另一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是乳頭瘤病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，乳頭瘤病毒選自1 型牛乳頭瘤病毒和人乳頭瘤病毒。在上面考慮到的方法或應(yīng)用的一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與編碼轉(zhuǎn)錄或調(diào)控因子 的病毒基因雜交，抑制了具有DNA基因組的病毒的復(fù)制。在相關(guān)實(shí)施方案中，寡核苷酸與病 毒復(fù)制因子雜交，抑制了具有DNA基因組的病毒的復(fù)制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與在其復(fù)制周期中使用反轉(zhuǎn)錄的病毒雜交。在另 一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸與編碼轉(zhuǎn)錄或調(diào)控因子的病毒基因雜交，抑制了利用反轉(zhuǎn)錄進(jìn) 行復(fù)制的病毒的復(fù)制。在優(yōu)選實(shí)施方案中，使用反轉(zhuǎn)錄的病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒。在更優(yōu)選實(shí) 施方案中，反轉(zhuǎn)錄病毒是人類(lèi)1型免疫缺陷病毒。在相關(guān)實(shí)施方案中，寡核苷酸與宿主的與病毒復(fù)制相關(guān)的因子雜交并抑制病毒復(fù) 制。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸可用于處理未被感染的細(xì)胞，以便在這些細(xì)胞中減少病 毒基因的表達(dá)和復(fù)制。考慮到了可用于本發(fā)明方法的寡核苷酸，其長(zhǎng)度為5到150個(gè)核堿基，長(zhǎng)度為10 到100個(gè)核堿基，長(zhǎng)度為10到50個(gè)核堿基，長(zhǎng)度為10到30個(gè)核堿基，長(zhǎng)度為20到30個(gè) 核堿基，長(zhǎng)度為或21到23個(gè)核堿基。對(duì)于本發(fā)明的實(shí)踐來(lái)說(shuō)，從5到150個(gè)核堿基內(nèi)所有 的整數(shù)長(zhǎng)度，以及5到150個(gè)核堿基內(nèi)的子范圍，都被具體地考慮到了。此外，考慮到了在修飾的寡核苷酸中到100%的核堿基是修飾的核堿基。在一 個(gè)實(shí)施方案中，10 %到90 %的核堿基是修飾的核堿基。在相關(guān)實(shí)施方案中，20 %到80 %的 核堿基是修飾的核堿基。在其他實(shí)施方案中，30%到70%、40%到60%或50%的核堿基是修飾的核堿基。在其他實(shí)施方案中，10、20、30、40、50、60、70、80或90 %的核堿基是修飾的
核堿基。在相關(guān)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、 17、18、19、20、多達(dá)30、多達(dá)40、多達(dá)50、多達(dá)100個(gè)或以上修飾的核堿基，其中修飾的核堿
基是羥基核堿基或巰基核堿基。例如，考慮到了 150個(gè)堿基的寡核苷酸整體可以全部包含 修飾的寡核苷酸。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，寡核苷酸與病毒基因組的非編碼區(qū)雜交，或與病毒基因 組的編碼區(qū)雜交。在相關(guān)實(shí)施方案中，寡核苷酸與RNA病毒的編碼區(qū)雜交。一方面，本發(fā)明的方法或應(yīng)用或化合物還提供了將至少兩種具有不同序列的寡核 苷酸施用于對(duì)象，其中所述寡核苷酸與不同的靶序列雜交。本發(fā)明還提供了使用至少兩種 具有不同序列的寡核苷酸來(lái)制造用于向?qū)ο笫┯玫乃幬铮渲兴龉押塑账崤c不同的靶序 列雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，兩種不同的寡核苷酸被施用于對(duì)象。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所 述寡核苷酸特異性針對(duì)同一個(gè)病毒基因組中的不同靶序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷 酸特異性針對(duì)同一個(gè)功能單位中的靶序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸特異性針對(duì)不 同功能單位中的靶序列。 還考慮到了組合物還含有本文描述的藥物載體或賦形劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)象是哺乳動(dòng)物。在相關(guān)實(shí)施方案中，對(duì)象是人類(lèi)。一方面，用于本發(fā)明的方法或應(yīng)用或化合物的組合物在脂質(zhì)體中施用。在相關(guān)實(shí) 施方案中，組合物可以在納米顆粒藥物中施用，例如微膠粒或納米粒子?？紤]到了寡核苷酸與靶序列的雜交誘導(dǎo)了靶核酸的切開(kāi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸表現(xiàn)出與靶核酸至少70%的同源性。在相關(guān)實(shí)施方 案中，寡核苷酸與靶核酸 75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%或99%同源。除了上述之外，作為附加的方面，本發(fā)明包括了以任何方式在范圍上比上面具體 提到的變體更窄的本發(fā)明的所有實(shí)施方案。例如，盡管出于簡(jiǎn)要的目的已經(jīng)參考類(lèi)屬或值 的范圍描述了本發(fā)明的方面，但應(yīng)該理解，類(lèi)屬的每個(gè)成員和范圍內(nèi)的每個(gè)值或子范圍，都 意圖作為本發(fā)明的方面。同樣地，本發(fā)明的各種不同方面和特點(diǎn)可以組合，產(chǎn)生的附加方面 也打算處于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。以不包括數(shù)量詞的單數(shù)形式描述的本發(fā)明的方面，應(yīng)該被理解為包括了包含一或 一以上的實(shí)施方案，除非上下文明顯需要較狹義的解釋。術(shù)語(yǔ)“包含”意在允許有附加的要 素或特點(diǎn)。盡管申請(qǐng)人發(fā)明了本文隨附的權(quán)利要求書(shū)的整個(gè)范圍，但本文隨附的權(quán)利要求書(shū) 不打算在其范圍內(nèi)包含其他人的現(xiàn)有技術(shù)的工作。因此，在專(zhuān)利局或其他團(tuán)體或個(gè)人就權(quán) 利要求范圍內(nèi)法定的現(xiàn)有技術(shù)提請(qǐng)申請(qǐng)人注意的情況下，申請(qǐng)人保留在可適用專(zhuān)利法規(guī)下 行使修改權(quán)來(lái)重新限定所述權(quán)利要求書(shū)的主題內(nèi)容，以便從這樣的權(quán)利要求的范圍內(nèi)具體 排除這些法定現(xiàn)有技術(shù)或法定現(xiàn)有技術(shù)的明顯變體的權(quán)利。由這樣的修改的權(quán)利要求書(shū)限 定的本發(fā)明的變體也打算作為本發(fā)明的方面。附圖簡(jiǎn)述

圖1顯示了通過(guò)靶向E2mRNA的反義修飾寡核苷酸抑制含有BPV原點(diǎn)的質(zhì)粒的E2依賴(lài)性復(fù)制。圖2描述了帶有修飾的5-0H-dC堿基的反義寡核苷酸對(duì)重組病毒的復(fù)制的影響。 重組病毒復(fù)制的抑制通過(guò)測(cè)量從病毒的基因組RNA表達(dá)的Rluc活性來(lái)監(jiān)測(cè)。LF-脂質(zhì)轉(zhuǎn)染 胺(lipofectamine)處理的對(duì)照細(xì)胞。圖中顯示了來(lái)自可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)之一的結(jié)果。圖3顯示了核酸酶復(fù)合物對(duì)帶有修飾的8-oxo-dG堿基的寡核苷酸的抗病毒效應(yīng) 的附加效應(yīng)。重組病毒復(fù)制的抑制通過(guò)測(cè)量從病毒的基因組RNA表達(dá)的Rluc活性來(lái)監(jiān)測(cè)。圖4證明了核酸酶(命名為HM0_9E的化合物)的存在引起的對(duì)HM0_9的有效劑 量50(EC50)的降低。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及含有一個(gè)或多個(gè)修飾堿基的寡核苷酸的應(yīng)用，所述寡核苷酸可以任選 地與有機(jī)核酸酶復(fù)合物連接，用于抑制對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物致病的病毒的復(fù)制和/或基因表達(dá)。本發(fā)明提供了含有螯合性部分和寡核苷酸的化合物，所述寡核苷酸具有用于反義 抑制病毒基因表達(dá)和/或復(fù)制的性質(zhì)。本發(fā)明的化合物包含反義寡核苷酸，所述反義寡核 苷酸具有(a) —個(gè)或多個(gè)與天然核堿基具有高結(jié)合效率的修飾的核堿基，以及任選的(b) 一個(gè)螯合性部分。這些化合物可以水解寡核苷酸、RNA和/或DNA的磷酸二酯鍵，可用于反 義療法中。病毒靶下面描述了重要的病毒病原體的例子，它們屬于不同的系統(tǒng)類(lèi)型、利用不同的復(fù) 制策略和不同的靶組織，并描述了針對(duì)這些病毒的抗病毒療法所具有的問(wèn)題。AIDS(獲得性免疫缺陷綜合征)由人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)弓丨起。通過(guò)殺死或損 傷身體免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，HIV逐步破壞身體對(duì)抗感染和某些癌癥的能力。目前，全世界大約 有四千二百萬(wàn)人攜帶HIV/AIDS。2002年，總共有三百一"h萬(wàn)人死于HIV/AIDS相關(guān)原因。抗 HIV藥物療法的最終目標(biāo)是阻止病毒增殖和破壞免疫系統(tǒng)。盡管在過(guò)去的15年，在對(duì)抗HIV 的戰(zhàn)斗中已經(jīng)取得了顯著的進(jìn)展，但醫(yī)學(xué)仍無(wú)法治愈。今天，醫(yī)生們已經(jīng)擁有屬于三種不同 藥物類(lèi)別的超過(guò)十幾種抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥劑用于控制疾病。典型情況下，來(lái)自?xún)煞N或三種類(lèi) 別的藥物以各種不同的組合開(kāi)出處方，這被稱(chēng)為HAART(高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療)。HAART 療法典型地包含兩種核苷反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑藥物以及第三種藥物，該第三種藥物是蛋白酶抑 制劑或非核苷類(lèi)反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑。臨床研究顯示，HAART是降低病毒載量和最小化藥物抗 性的可能性的最有效手段。對(duì)于開(kāi)發(fā)其他有效對(duì)抗HIV的抗病毒藥劑，這些藥劑通過(guò)病毒還未發(fā)展出抗性的 其他作用機(jī)制發(fā)揮作用，存在著極大的需求。這正變得尤其重要，因?yàn)樽罱臄?shù)據(jù)顯示，在 歐洲，在每10個(gè)新診斷出帶有HIV的患者中，就有1個(gè)感染有已經(jīng)對(duì)市場(chǎng)上至少一種批準(zhǔn) 的藥物具有抗性的HIV株。丙型肝炎病毒(HCV)感染是美國(guó)最常見(jiàn)的慢性血源性感染，受感染的患者數(shù)量可 能超過(guò)4百萬(wàn)，全世界可能超過(guò)1億5千萬(wàn)。這種常見(jiàn)的病毒感染是肝硬化和肝癌的主要 病因，目前在美國(guó)是肝臟移植的主要原因。從感染復(fù)原是罕見(jiàn)的，大約85%受感染的患者 變成病毒的慢性攜帶者，10到20%發(fā)展成肝硬化。據(jù)估計(jì)，目前全世界有1億7千萬(wàn)人是 慢性攜帶者。按照疾病控制和預(yù)防中心(Centers for DiseaseControl and Prevention) 的說(shuō)法，僅在美國(guó)，慢性丙型肝炎每年就引起8，000到10，000例死亡，并導(dǎo)致大約1，000例
13肝臟移植。丙型肝炎沒(méi)有疫苗可用。使用α-干擾素或干擾素與利巴偉林的組合的長(zhǎng)期療 法，僅在大約40%的患者中有效，并引起嚴(yán)重的副作用。在這個(gè)家族中存在一百多種人類(lèi)感染性病毒(人類(lèi)乳頭瘤病毒，HPVs)。HPV引起 良性皮膚疣，或乳頭瘤。許多HPVs通過(guò)性接觸傳播。生殖器HPV感染非常常見(jiàn)，估算推測(cè) 高達(dá)75%的女性在成年期的某些時(shí)間點(diǎn)，將被一種或多種性傳播類(lèi)型的HPV感染?！案唢L(fēng) 險(xiǎn)”性傳播HPVs(HPV-16、-18以及某些其他的HPVs)的持續(xù)感染，可能導(dǎo)致宮頸癌的發(fā)生。 因此HPVs在醫(yī)學(xué)上是重要的(高達(dá)500，000個(gè)癌癥病例/年)。在2006/2007年，針對(duì)四 種最流行的HPV種的有效疫苗已經(jīng)可用，但是許多HPV株和種沒(méi)有被這些疫苗覆蓋。甲病毒是主要引起急性感染的病毒的代表。該屬中有10個(gè)以上的成員是已知 的人類(lèi)病原體。它們通常分布廣泛，但它們的醫(yī)學(xué)重要性被認(rèn)為是中等的，因此，沒(méi)有有 效的用于人類(lèi)的抗甲病毒疫苗。在留尼汪島(Reunion Island)和印度的基孔肯雅病毒 (Chikungunya virus)的強(qiáng)烈爆發(fā)，徹底改變了這種觀(guān)點(diǎn)。據(jù)估計(jì)，僅在留尼汪島，由基孔肯 雅病毒引起的全部經(jīng)濟(jì)損失將超過(guò)1億歐元(235，000例感染，大約200個(gè)死亡病例)，而該 病毒在印度引起的損害，達(dá)到了國(guó)家醫(yī)療災(zāi)難的程度(據(jù)估計(jì)高達(dá)6百萬(wàn)例感染)。基孔肯 雅病毒仍在快速傳播，在2007年底，首次在歐洲(意大利)探查到了蚊媒性爆發(fā)?？紤]到 由甲病毒引起的爆發(fā)的不可預(yù)測(cè)性，大規(guī)模預(yù)防接種似乎是不現(xiàn)實(shí)的，因?yàn)闊o(wú)法預(yù)測(cè)哪些 病毒將出現(xiàn)，以及下次爆發(fā)將在何處發(fā)生。相反，理想地有效對(duì)抗許多種甲病毒的抗病毒療 法，將更為有用。上面列舉的病毒僅僅代表了已知的人類(lèi)和家畜病毒病原體的一部分，但是它們基 本上覆蓋了所有種類(lèi)的不同病毒基因組類(lèi)型(DNA、RNA、反轉(zhuǎn)錄病毒)；靶組織(上皮、免疫 系統(tǒng)、肝特異性和具有廣范圍靶細(xì)胞的病毒)和復(fù)制位點(diǎn)(細(xì)胞質(zhì)或核)，特異性和感染類(lèi) 型(急性、慢性或潛伏)。這些病毒也代表了引起細(xì)胞死亡(甲病毒，HIV)、沒(méi)有明顯的細(xì) 胞損傷(HCV)或細(xì)胞轉(zhuǎn)化(乳頭瘤病毒)的典型病毒。因此，通過(guò)研究這些代表性病毒所 獲得的數(shù)據(jù)，能夠擴(kuò)展到所有已知類(lèi)型的人類(lèi)和動(dòng)物病毒病原體。顯然，對(duì)于任何正開(kāi)發(fā)的新出現(xiàn)的抗病毒藥物來(lái)說(shuō)，合并下列三個(gè)特點(diǎn)將是非常 理想的(1)改進(jìn)的功效；(2)降低的副作用風(fēng)險(xiǎn)，以及(3)病毒難以通過(guò)突變來(lái)克服的作 用機(jī)制。已經(jīng)進(jìn)行了通過(guò)各種不同的反義手段抑制特定病毒的嘗試。Zamecnik等已經(jīng)使用了特異性靶向反轉(zhuǎn)錄酶引物位點(diǎn)和剪接供體/受體位點(diǎn)的 寡核苷酸(ONs) (Zamecnik 等，(1986)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 :4143_) (Goodchild & Zamecnik (1989)，美國(guó)專(zhuān)利 No. 4，806, 463)。Anderson等(1997)(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，591，720)報(bào)道了靶向CMV(巨細(xì)胞病毒)編 碼IEl、IE2或DNA聚合酶的mRNAs的寡核苷酸或寡核苷酸類(lèi)似物。Hanecak等(1999)(美國(guó)專(zhuān)利No. 5，952，490)描述了具有保守的G四重體序列和 足夠數(shù)量的側(cè)翼核苷酸的修飾的寡核苷酸，它顯著抑制了病毒例如HSV-I (單純性皰疹病 毒)的活性。Qi 等(中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志(Zhonghua Shi Yan He LinChuang Bing Du Xue Za Zhi) (2000) 14 :253_256)報(bào)道了在科賽奇病毒B3中測(cè)試反義硫代磷酸酯寡核苷酸 (PS-ONs)。
國(guó)際公布WO 9203051 (Roizman和Maxwell)描述了與HSV病毒基因組的生命區(qū)域 或其mRNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的甲基膦酸酯反義寡聚體，它表現(xiàn)出抗病毒活性。已報(bào)道鳥(niǎo)苷/胸苷或富含鳥(niǎo)苷的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸(GT-PS-ONs)具有 抗病毒活性。該研究報(bào)道，“幾種長(zhǎng)度均為26或27nt的不同的含有PS的富含GT的 ONs (B106-140,1100-12 和 G106-57)，在降低 HIV-2 滴度方面與 36 個(gè)(B106-96, B106-97)或 45 個(gè)nt 組成的富含 GT 的 ONs 同樣有效(表 4)?！?Fennewald 等，Antiviral Res. (1995)26 37-54)。Cohen等(美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5，264，423和5，276，019)描述了 HIV復(fù)制的抑制，更具 體來(lái)說(shuō)涉及PS-0DN(寡脫氧核苷酸)類(lèi)似物，其能夠用于在正?；罴?xì)胞的存在下阻止外來(lái) 核酸的復(fù)制。Cohen等描述了特異性針對(duì)病毒序列的反義PS-ODNs的抗病毒活性。他們也 描述了 14、18、21和28-mers的polyA、polyT和polyC PS-0DN序列的試驗(yàn)，并顯示了這些 PS-ODNs的抗病毒效應(yīng)。Gao 等((1989) J Biol Chem 264:11521-11526)描述了通過(guò)對(duì)尺寸為 7、15、21 和 28個(gè)核苷酸的polyA、polyT和polyC PS-ODN序列進(jìn)行試驗(yàn)，用PS-ODNs抑制HSV-2的復(fù) 制。Stein 和 Cheng (Stein 等，(1993) Science 261 1004-1012)討論了 28 個(gè)核苷酸的 非特異性O(shè)DNs的抗病毒活性，指出了 “PS寡聚物的抗HIV性質(zhì)受到非序列特異性效應(yīng)的顯 著影響，也就是說(shuō)，抑制效應(yīng)不依賴(lài)于堿基序列。，，在綜述文章中，Lebedeva和 Stein (Lebedeva 等，(2001) Annul RevPharmacol 41: 403-419)報(bào)道了 PS-ODNs的各種非特異性蛋白結(jié)合活性，包括病毒蛋白。他們指出，“這些 分子具有高度生物活性，通常相當(dāng)容易地誤解成反義的假象。”Rein等(美國(guó)專(zhuān)利No. 6，316，190)報(bào)道了與融合配偶體相連并與HIV核衣殼結(jié)合 的富含GT的ON誘餌(decoy)，可用作抗病毒化合物。同樣地，Campbell等(Campbell等， (1999) J. Virol. 73 :2270_2279)報(bào)道了具有 TGTGT 基序的 P0-0DN，TGTGT 基序與 HIV 的核 衣殼特異性結(jié)合，但是沒(méi)有提到抗病毒活性。被開(kāi)發(fā)用作抗癌劑、抗病毒劑或用于治療其他疾病的反義ODNs，典型長(zhǎng)度為大約 20 個(gè)核苷酸。在綜述文章中(Stein, C A, (2001) J. Clin. Invest. 108 :641_644)，肯定了“反 義寡核苷酸的長(zhǎng)度必須被最適化如果反義寡核苷酸太長(zhǎng)或太短，將失去特異性的要素。目 前，反義寡核苷酸的最適長(zhǎng)度看來(lái)是大約16-20個(gè)核苷酸”。同樣地，在另一篇綜述文章中 (Crooke，S T (2000)Methods Enzymo 1. 313 :3_45)，指出 了“與 RNA 和 RNA 雙鏈體形成相比， 硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸具有每個(gè)單位低大約-2. 2°C的Tm。這意味著為了在體外有效，硫 代磷酸酯寡脫氧核苷酸的長(zhǎng)度典型必須為17-到-20-mer......”。Caruthers 和同事(Marshall 等，(1992)Proc. Natl. Acad. Sci. USA89 :6265_6269) 就 12-mer 的聚胞苷-PS2-0DN 和 14_mer 的 PS2-0DN 報(bào)道了二硫代磷酸酯 ODNs (PS2_0DNs) 的抗HIV活性。沒(méi)有試驗(yàn)其他尺寸的抗HIV活性。他們也報(bào)道了 12-、14-、20-和28-111吐 的聚胞苷-PS2-0DNs的抑制HIV反轉(zhuǎn)錄酶(RT)。后來(lái)，該團(tuán)隊(duì)(Marshal等，(1993) Science 259:1564-1570)報(bào)道的結(jié)果顯示了 HIV RT的序列特異性抑制。同一個(gè)團(tuán)隊(duì)在幾篇專(zhuān)利中 公布了 PS2-0DNs的數(shù)據(jù)。在美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5，218，103和5,684. 148中，描述了 PS2-0DN的 結(jié)構(gòu)和合成。在美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5，452，496,5, 278，302和5，695，979中，描述了不長(zhǎng)于15個(gè)堿基的PS2-0DNs對(duì)HIV RT的抑制。在美國(guó)專(zhuān)利Nos. 5，750，666和5，602，244中，描述了 PS2-0DNs的反義活性。所有出版物在此以其全文引為參考。已經(jīng)評(píng)估了在核糖的2’位處修飾的寡核苷酸及其在反義策略中的應(yīng)用，例如在下 面引用的參考文獻(xiàn)中描述的。Inoue 和同事(Inoue 等，(I985)Nucleic Acids Res. I6 :165168)描述了寡聚物 (2’-0_甲基核糖核苷酸)的合成和性質(zhì)。同一個(gè)團(tuán)隊(duì)(Inoue等，(1987)FEBS Letter 215 327-330)報(bào)道了當(dāng)寡核苷酸含有的全部是2’-0_甲基核糖核苷酸時(shí)，沒(méi)有發(fā)生RNAse H介 導(dǎo)的mRNA切開(kāi)。使用混合的寡核苷酸，即含有未修飾和2’ -0-甲基核糖核苷酸的寡核苷 酸，Inoue報(bào)道了由RNA和2’ -0-甲基核糖核苷酸形成的核酸復(fù)合物的序列特異性RNAse H水解。不支持RNase H介導(dǎo)的靶mRNA切開(kāi)的全2’ _0_甲基化和硫代磷酸酯化的寡核 苷酸，被用于確定活性反義寡核苷酸是否通過(guò)RNase H依賴(lài)性機(jī)制抑制ICAM-I的表達(dá) (Chiang等，(1991)J. Biol. Chem. 266 18162-18171)。他們指出，這些反義寡核苷酸可能可 用作治療藥劑。分析了具有2’ -糖修飾、包括2’ -0-甲基、2’ -0-丙基、2’ _0_戊基和2’ -氟的寡 核苷酸的反義活性。統(tǒng)一 2’ -修飾的寡核苷酸的反義活性評(píng)估，揭示出這些化合物對(duì)于抑 制基因表達(dá)來(lái)說(shuō)完全無(wú)效。如果化合物含有一段至少5個(gè)2’ -脫氧核糖核苷酸殘基，則活 性得到恢復(fù)。該最小脫氧核糖核苷酸長(zhǎng)度與體外RNase H有效活化所需的最小長(zhǎng)度全然相 關(guān)(Monia 等，1993，J. Biol. Chem. 268 14514.)。Yu 等((1996)Bioorganic. Med. Chem. 4 1685-1692)報(bào)道了具有硫代磷酸酯、磷酸 二酯或帶有一部分2’ -0甲基修飾的糖的混合骨架的雜合反義寡核苷酸，通過(guò)P24ELISA定 量來(lái)測(cè)量，具有特異性抗HIV活性。Agrawal ((1999) Biochem. Biophys. Acta 1489:53-68)的綜述文章建議，為了優(yōu) 化活性，反義寡核苷酸應(yīng)該具有各種不同性質(zhì)的組合，而不只是對(duì)核酸酶的穩(wěn)定性增加 或?qū)Π蠷NA的高親和性。這樣的性質(zhì)包括RNAse H活化。在后來(lái)的綜述中，Agrawal和 KandimalIa ((2000)Mol. Med. Today 6 :72_81)敘述了包含2，-0_甲基修飾的混合骨架寡核 苷酸，由于它們的改進(jìn)的性質(zhì)、包括RNAse H活化，已經(jīng)成為第二代反義寡核苷酸的選擇。反 義寡聚物應(yīng)該具有某些重要的特性，例如與靶RNA結(jié)合后活化RNAse H的能力。(Agrawal 禾口 Kandimal la，2001，Current Cancer Drug Target 1:197—209)。對(duì)于大多數(shù)反義方法 來(lái)說(shuō)，為了增加反義效力，通過(guò)RNAse H的定向RNA切開(kāi)是理想的。(Kurreck，2003，Eur. J.Biochem. 270 1628-1644)。許多研究描述了在反義寡核苷酸中使用2’ -0-甲氧基乙基修飾。一個(gè)例子是在 Zellweger 等((2001)J. Pharmacol. Experimental Therapeutics298 934-940)中描述 的使用有缺口的2’ -修飾的寡核苷酸反義的研究。另一個(gè)例子顯示了使用RNase H不依 賴(lài)性2’-0-甲氧基乙基反義對(duì)形成翻譯起始復(fù)合物的抑制。(Baker等，(1997)J.Biol. Chem. 272 1994-2000)。Kuwasaki 等，(2003) J. Antimicrob. Chemother. 51 :813_819，描述 了高核酸酶抗 性的二聚發(fā)夾鳥(niǎo)苷四鏈體的設(shè)計(jì)，它在核苷上含有2’ -0-甲基基團(tuán)，在核苷間鍵上含有硫 基團(tuán)，并描述了它在培養(yǎng)細(xì)胞中的抗HIV-I活性。
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Mou 和 Gray(2002) (Nucleic Acids Res. 30 :749_758)指出，與典型的硫代 磷酸酯-DNA寡聚物相比，添加2’ -0-甲基修飾降低了非特異性蛋白結(jié)合性質(zhì)。對(duì)于 36-mer的寡核苷酸來(lái)說(shuō)，g5p的蛋白結(jié)合親和性按照dA36 < rA36 < 2’ -O-MeA36 < StA36 << S-2，-O-Me-A36 < S-dA36(其中 d =脫氧，r =核糖，2，-O-Me = 2，-0-甲基，S =硫 代磷酸酯)的次序增加。該次序與 Kandimalla 等((1998)Bioorganic Med Chem Lett. 8 2103-2108)中報(bào)道的這些寡聚物修飾對(duì)血漿蛋白例如人血清白蛋白、Y-球蛋白和纖維蛋 白原的非特異性結(jié)合的次序S-RNA << S-2’ -O-MeRNA < S-DNA相一致。在本技術(shù)領(lǐng)域中還存在著另外的知識(shí)，涉及與寡核苷酸類(lèi)似但是具有不同作用機(jī) 制的藥劑的使用，這些藥劑包括小干擾RNAs (siRNAs)、它們的前體和類(lèi)似物，以及被設(shè)計(jì)用 于特異性結(jié)合和切開(kāi)靶核酸的核酶?？紤]用于本發(fā)明的靶病毒包括但不限于引起急性感染的正鏈RNA病毒(例如塞姆 利基森林病毒(Semliki Forest virus), SFV,甲病毒屬，披膜病毒科(Togaviridae))、引起 慢性感染的正鏈RNA病毒(例如丙型肝炎病毒，HCV，丙型肝炎病毒屬(Hepacivirus)，黃病 毒科(Flaviviridae))、引起急性感染以及長(zhǎng)期持續(xù)的慢性疾病的反轉(zhuǎn)錄病毒(例如人類(lèi)1 型免疫缺陷病毒，HIV-I，慢病毒屬(Lentivirus)，反轉(zhuǎn)錄病毒科(Retroviridae))和具有 DNA基因組的病毒(例如牛1型乳頭瘤病毒，BPV-I，乳頭瘤病毒科(Papillomaviridae))。本公開(kāi)證明了向感染了這些病毒、用它們的基因組轉(zhuǎn)染或含有它們的基因表達(dá)單 元的細(xì)胞培養(yǎng)物單次施用修飾的寡核苷酸，導(dǎo)致了它們的基因表達(dá)和(在RNA病毒和乳頭 瘤病毒的情況下)復(fù)制的特異性抑制。這些效應(yīng)與寡核苷酸抑制劑的量成比例，被化合物 中存在的修飾堿基的存在所增強(qiáng)，并被有機(jī)核酸酶復(fù)合物的存在進(jìn)一步增強(qiáng)。本公開(kāi)還證明，如果修飾的堿基從羥基核堿基變成巰基核堿基，則抗病毒效應(yīng)增 加，抑制劑的有效濃度降低。寡核苷酸在本發(fā)明的背景中，術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指脫氧核糖核酸(DNA)的寡聚物或多聚 物，或其模擬物、嵌合體、類(lèi)似物和同系物。該術(shù)語(yǔ)包括由天然存在的核堿基、糖和共價(jià)的核 苷間(骨架)連鍵組成的寡核苷酸，以及具有非天然存在的部分的寡核苷酸，這些非天然存 在的部分在例如與靶核酸雜交或與互補(bǔ)寡核苷酸相互作用時(shí)，以與天然存在的寡核苷酸相 似的方式發(fā)揮作用。這樣的修飾的或取代的寡核苷酸與天然形式相比通常是優(yōu)選的，因?yàn)?它們具有理想的性質(zhì)，例如增強(qiáng)細(xì)胞攝入、增加對(duì)靶核酸的親和性和在核酸酶存在下的穩(wěn) 定性增加。本發(fā)明的化合物與生物學(xué)配對(duì)物(例如RNA和/或DNA)結(jié)合的效率，是通過(guò)摻入 修飾的核堿基或其他具有兩性離子或離子互變異構(gòu)體的類(lèi)似物來(lái)獲得的。本發(fā)明的化合物 有至少一個(gè)核堿基具有修飾的核堿基或其他具有兩性離子或離子互變異構(gòu)體的類(lèi)似物。在 優(yōu)選實(shí)施方案中，修飾的核堿基是選自5-羥基胞嘧啶和8-羥基鳥(niǎo)嘌呤的羥基核堿基，或選 自5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰基鳥(niǎo)嘌呤和8-巰基腺嘌呤的巰基核堿基。正如在 美國(guó)專(zhuān)利公布US 20070259830和W02007/125173中證明的，羥基核堿基或巰基核堿基與靶 核酸的核堿基之間可以發(fā)生更穩(wěn)定的氫鍵結(jié)合，因此可以被認(rèn)為與互補(bǔ)核酸鏈更有效地結(jié)
I=I O修飾的核堿基中酸性互變異構(gòu)基團(tuán)可以是任何其他的酸性基團(tuán)，例如-SH、-C00H、-SO3H 等。在一個(gè)實(shí)施方案中，寡核苷酸包含5-羥基尿嘧啶陰離子的一種或多種互變異構(gòu) 形式。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物包括羥基堿基5-羥基胞嘧啶。在另一個(gè)實(shí)施 方案中，羥基堿基是8-羥基腺嘌呤及其陰離子的互變異構(gòu)形式。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案 提供了由8-羥基鳥(niǎo)嘌呤及其陰離子的互變異構(gòu)形式修飾的本發(fā)明的化合物。這些核堿基 的互變異構(gòu)形式在WO 2007/125173中更詳細(xì)地描述。本文中考慮到的其他修飾的核堿基包括巰基修飾的核堿基。巰基修飾的嘧啶和 嘌呤的合成在本技術(shù)領(lǐng)域中是已知的(參見(jiàn)例如《雜環(huán)化合物化學(xué)嘧啶》，增補(bǔ)本1，第16 冊(cè)(Chemistry of HeterocyclicCompounds :The Pyrimidines, “ Supplement 1, Volume 16)，D. J. Brown 主編，John Wiley & Sons, Inc.，1970，pp. 202-229 ；以及 Khalyullin 等 "if ^ 白勺 B Πφ，， (Condensed purines), Pharmaceutical Chemistry Journal,1992,26 270-284)。考慮到的巰基核堿基包括5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿嘧啶、8-巰基鳥(niǎo)嘌呤和8-巰 基腺嘌呤。在共同擁有和共同待決的申請(qǐng)?zhí)朹(代理人案號(hào)28113/43435A)中，
以及美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)60/985，552中，也已考慮到了在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、核酸雜交和siRNA 介導(dǎo)的基因沉默中使用修飾的核堿基，這些申請(qǐng)?jiān)诖艘云淙囊秊閰⒖?。在本文中使用時(shí)，每個(gè)羥基核堿基當(dāng)與相對(duì)的核堿基穩(wěn)定地形成氫鍵時(shí)，被認(rèn)為 與該核堿基互補(bǔ)。因此，在某些情況下，5-羥基尿嘧啶與腺嘌呤互補(bǔ)，5-羥基胞嘧啶與鳥(niǎo)嘌 呤互補(bǔ)，8-羥基腺嘌呤與尿嘧啶和/或胸腺嘧啶互補(bǔ)，和8-羥基鳥(niǎo)嘌呤與胞嘧啶互補(bǔ)。羥 基核堿基與靶核酸的核堿基可以發(fā)生其他穩(wěn)定的氫鍵鍵合，因此羥基核堿基被認(rèn)為與發(fā)生 穩(wěn)定的氫鍵鍵合的靶核酸的核堿基互補(bǔ)。在本發(fā)明的給定化合物中，羥基核堿基和/或巰基核堿基的數(shù)量，是化合物寡核 苷酸部分的核堿基總數(shù)的至少直至100%。在本發(fā)明的化合物中存在一種以上羥基核 堿基或巰基核堿基的情況下，羥基核堿基或巰基核堿基可以是相同的或不同的(以不同堿 基和/或修飾類(lèi)型的任何組合)?？紤]到了在本文描述的寡核苷酸中，10%到90%、20%到 80%,30%到70%、40%到60%或50%的核堿基是修飾的核堿基。此外，考慮到了 10、20、 30、40、50、60、70、80、90、91、92、93、94、95、96、97、98 或 99% 的核堿基是修飾的核堿基。本發(fā)明的化合物優(yōu)選包含大約5到大約150個(gè)核堿基(即從大約5到大約150 個(gè)連接的核苷)。本技術(shù)領(lǐng)域的普通專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，本發(fā)明包含了長(zhǎng)度為5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、 35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、 60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、 85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、 108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、 127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、 146、147、148、149和150個(gè)核堿基的化合物。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物長(zhǎng)度為10到100個(gè)核堿基。本技術(shù)領(lǐng)域的普 通專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這包含了長(zhǎng)度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、 24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、
1849、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、 74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99 或100個(gè)核堿基的化合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物長(zhǎng)度為10到50個(gè)核堿基。本技術(shù)領(lǐng) 域的普通專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這包含了長(zhǎng)度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49或50個(gè)核堿基的化合物。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物長(zhǎng)度為20到30個(gè)核堿基。本技術(shù)領(lǐng) 域的普通專(zhuān)業(yè)人員將會(huì)認(rèn)識(shí)到，這包含了長(zhǎng)度為20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè) 核堿基的化合物。特別優(yōu)選的化合物是大約10到大約50個(gè)核堿基的寡核苷酸，更優(yōu)選是含有大約 20到大約30個(gè)核堿基的寡核苷酸，在樣品測(cè)試中用作抗病毒劑的化合物由21或23個(gè)核堿 基構(gòu)成。正如上面陳述的，寡核苷酸可以包含100%修飾的核堿基。照此，依賴(lài)于寡核苷酸 的長(zhǎng)度，寡核苷酸可以包含 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、 22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、 47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、 72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、 97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、 117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、 136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149 或 150 個(gè)修飾的核堿基， 其中修飾的堿基是巰基核堿基或羥基核堿基。本發(fā)明的化合物任選還包含螯合性部分。螯合性部分起到金屬配體的作用。它們 能夠穩(wěn)定地螯合金屬離子。某些金屬配體復(fù)合物已顯示出能夠有效地切開(kāi)磷酸二酯鍵。通 過(guò)在具有反義活性的寡核苷酸中引入螯合性部分，由于其降解或切開(kāi)靶核酸的一個(gè)或多個(gè) 磷酸二酯鍵的能力，增加了寡核苷酸抑制靶核酸的功效。因此，本發(fā)明的化合物進(jìn)一步包含 了能夠螯合金屬離子的螯合性部分。金屬離子選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、釓、鋱、鏑、鈥、 鉺、銩、鐿和镥。在一個(gè)方面，優(yōu)選的離子是銪或鑭離子。金屬離子可以是任何穩(wěn)定的離子， 例如 +1、+2、+3、+4 或 +5 離子。優(yōu)選的離子是 La(III)、Eu (III)、Ho (III)和 Ce (IV)。考慮到的螯合性部分包括由下面描述的式所表示的螯合性部分
權(quán)利要求
一種在對(duì)象中抑制病毒復(fù)制的方法，包括向?qū)ο笫┯?到150個(gè)核堿基的寡核苷酸，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。
2.寡核苷酸在對(duì)象中抑制病毒復(fù)制的應(yīng)用，其中所述寡核苷酸被配制用于向?qū)ο笫?用，并含有5到150個(gè)核堿基，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基 (巰基核堿基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。
3.一種抑制靶核酸的翻譯的方法，所述方法包括將靶核酸與含有寡核苷酸的組合物在 允許寡核苷酸與靶核酸雜交的條件下接觸，其中雜交的寡核苷酸抑制靶核酸的翻譯，其中 所述靶核酸與病毒復(fù)制相關(guān)，并且其中所述寡核苷酸含有至少一個(gè)修飾的核堿基，所述修 飾的核堿基選自巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)和羥基修飾的互變異構(gòu) 或離子型堿基(羥基核堿基)。
4.寡核苷酸在制造用于抑制靶核酸翻譯的藥物中的應(yīng)用，其中將靶核酸與含有寡核苷 酸的組合物在允許寡核苷酸與靶核酸雜交的條件下接觸，其中雜交的寡核苷酸抑制靶核酸 的翻譯，其中所述靶核酸與病毒復(fù)制相關(guān)，并且其中所述寡核苷酸含有至少一個(gè)修飾的核 堿基，所述修飾的核堿基選自巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)和羥基修 飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。
5.一種在對(duì)象中抑制病毒基因組復(fù)制的方法，所述方法包括預(yù)測(cè)或測(cè)定對(duì)象或病毒病原體中靶核酸的核苷酸序列，其中靶核酸與病毒復(fù)制相關(guān)，以及向?qū)ο笫┯煤?到150個(gè)核堿基的寡核苷酸的組合物，其中至少一個(gè)核堿基是巰基 修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基 核堿基)，并且其中在對(duì)象的生理?xiàng)l件下，所述化合物與靶序列的核苷酸序列充分互補(bǔ)，從 而在對(duì)象中與靶序列的核苷酸序列雜交并抑制病毒復(fù)制。
6.寡核苷酸在制造用于在對(duì)象中抑制病毒基因組復(fù)制的藥物中的應(yīng)用，所述病毒基因 組或?qū)ο蟀A(yù)測(cè)或測(cè)定的與病毒復(fù)制相關(guān)的靶核酸的核苷酸序列，其中所述寡核苷酸有 5到150個(gè)核堿基，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾 的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)，并且其中在對(duì)象的生理?xiàng)l件下，所述化合物與靶 序列的核苷酸序列充分互補(bǔ)，從而在對(duì)象中與靶序列的核苷酸序列雜交并抑制病毒復(fù)制。
7.一種化合物，其含有5到150個(gè)核堿基的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含與來(lái)自病毒的核苷酸序列至少80%互補(bǔ)的核苷酸序列，其中至少一個(gè)核堿基是巰基修飾的互變異構(gòu)或離子型堿基(巰基核堿基)或羥基修飾 的互變異構(gòu)或離子型堿基(羥基核堿基)。
8.權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸包含至少一個(gè)巰基核堿基。
9.權(quán)利要求8的方法或應(yīng)用或化合物，其中巰基核堿基選自5-巰基胞嘧啶、5-巰基尿 嘧啶、8-巰基鳥(niǎo)嘌呤和8-巰基腺嘌呤。
10.權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸包含至少一個(gè)羥基修 飾的互變異構(gòu)或離子型堿基。
11.權(quán)利要求10的方法或應(yīng)用或化合物，其中羥基核堿基選自5-羥基胞嘧啶、5-羥基 尿嘧啶、8-羥基腺嘌呤和8-羥基鳥(niǎo)嘌呤。
12.權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸還包含與其連接的有 機(jī)核酸酶。
13.權(quán)利要求12的方法或應(yīng)用或化合物，其中有機(jī)核酸酶包含與鑭系金屬?gòu)?fù)合的螯合 性有機(jī)部分。
14.權(quán)利要求13的方法或應(yīng)用或化合物，其中鑭系金屬選自鑭、鈰、鐠、釹、钷、釤、銪、 釓、鋱、鏑、鈥、鉺、銩、鐿和镥。
15.權(quán)利要求14的方法或應(yīng)用或化合物，其中金屬是銪。
16.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是快速急性病毒。
17.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是慢性病毒。
18.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是正鏈RNA病毒。
19.權(quán)利要求18的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是甲病毒。
20.權(quán)利要求18的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是塞姆利基森林病毒(SFV)。
21.權(quán)利要求18的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是丙型肝炎病毒。
22.權(quán)利要求1-15任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是DNA病毒。
23.權(quán)利要求22的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是乳頭瘤病毒。
24.權(quán)利要求23的方法或應(yīng)用或化合物，其中乳頭瘤病毒選自牛1型乳頭瘤病毒和人 乳頭瘤病毒。
25.權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與編碼轉(zhuǎn)錄或調(diào)控 因子的病毒基因雜交，并抑制具有DNA基因組的病毒的復(fù)制。
26.權(quán)利要求22-24任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與病毒復(fù)制因子雜 交，并抑制具有DNA基因組的病毒的復(fù)制。
27.權(quán)利要求1-21任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與在其復(fù)制周期中使 用反轉(zhuǎn)錄的病毒雜交。
28.權(quán)利要求27的方法或應(yīng)用或化合物，其中病毒是反轉(zhuǎn)錄病毒。
29.權(quán)利要求28的方法或應(yīng)用或化合物，其中反轉(zhuǎn)錄病毒是人類(lèi)1型免疫缺陷病毒。
30.權(quán)利要求27-29任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與編碼轉(zhuǎn)錄或調(diào)控 因子的病毒基因雜交，以抑制利用反轉(zhuǎn)錄進(jìn)行復(fù)制的病毒的復(fù)制。
31.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸長(zhǎng)度為10-100個(gè)核堿基。
32.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸長(zhǎng)度為10-50個(gè)核堿基。
33.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸長(zhǎng)度為10-30個(gè)核堿基。
34.權(quán)利要求1-30任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸長(zhǎng)度為20-30個(gè)核堿基。
35.權(quán)利要求34的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸長(zhǎng)度為21到23個(gè)核堿基。
36.權(quán)利要求1到35任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸中到100%的核堿基是修飾的核堿基。
37.權(quán)利要求36的方法或應(yīng)用或化合物，其中10%到90%的核堿基是巰基修飾的或羥 基修飾的核堿基。
38.權(quán)利要求36的方法或應(yīng)用或化合物，其中20%到80%的核堿基是巰基修飾的或羥 基修飾的核堿基。
39.權(quán)利要求36的方法或應(yīng)用或化合物，其中30%到70%的核堿基是巰基修飾的或羥 基修飾的核堿基。
40.權(quán)利要求36的方法或應(yīng)用或化合物，其中40%到60%的核堿基是巰基修飾的或羥 基修飾的核堿基。
41.權(quán)利要求36的方法或應(yīng)用或化合物，其中50%的核堿基是巰基修飾的或羥基修飾 的核堿基。
42.權(quán)利要求1到41任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸含有至少一個(gè)巰基 修飾的核堿基和至少一個(gè)羥基修飾的核堿基。
43.權(quán)利要求1到42任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與宿主的與病毒復(fù) 制相關(guān)的因子雜交并抑制病毒復(fù)制。
44.權(quán)利要求1到43任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與病毒基因組的非 編碼區(qū)雜交。
45.權(quán)利要求1到43任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與病毒基因組的編 碼區(qū)雜交。
46.權(quán)利要求45的方法或應(yīng)用或化合物，其中寡核苷酸與RNA病毒的編碼區(qū)雜交。
47.權(quán)利要求1、3、5和8-46任一項(xiàng)的方法，其中將至少兩種具有不同序列的寡核苷酸 施用于對(duì)象，其中所述寡核苷酸與不同的靶序列雜交。
48.權(quán)利要求2、4、6和8-46任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中使用至少兩種不同的所述寡核苷酸，其 中所述寡核苷酸與不同的靶序列雜交。
49.一種組合物，其包含權(quán)利要求7-45任一項(xiàng)的兩種化合物的混合物，其中寡核苷酸 與不同的靶序列雜交。
50.權(quán)利要求49的組合物，其還包含可藥用載體。
51.權(quán)利要求47-50任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或組合物，其中至少兩種寡核苷酸對(duì)同一個(gè) 病毒基因組中的不同靶序列是特異性的。
52.權(quán)利要求47-50任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或組合物，其中寡核苷酸對(duì)同一個(gè)功能單位 中的靶序列是特異性的。
53.權(quán)利要求47-50任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用或組合物，其中至少兩種寡核苷酸對(duì)不同功 能單位中的靶序列是特異性的。
54.權(quán)利要求1-6、8-48和51-53任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用，其中組合物還包含藥物載體或 賦形劑。
55.一種組合物，其包含權(quán)利要求7-45任一項(xiàng)的化合物和可藥用載體。
56.至少兩種具有不同序列的寡核苷酸在制造向?qū)ο笫┯玫乃幬镏械膽?yīng)用，其中所述 至少兩種寡核苷酸與不同的靶序列雜交。
57.權(quán)利要求56的應(yīng)用，其中兩種不同的寡核苷酸被施用于對(duì)象。
58.權(quán)利要求57的應(yīng)用，其中寡核苷酸對(duì)同一個(gè)病毒基因組中的不同靶序列是特異性的。
59.權(quán)利要求56的應(yīng)用，其中寡核苷酸對(duì)同一個(gè)功能單位中的靶序列是特異性的。
60.權(quán)利要求56的應(yīng)用，其中寡核苷酸對(duì)不同功能單位中的靶序列是特異性的。
61.權(quán)利要求56-60任一項(xiàng)的應(yīng)用，其中藥物還包含藥物載體或賦形劑。
62.權(quán)利要求1-6、8-48、51-54和56-61任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用，其中對(duì)象是哺乳動(dòng)物。
63.權(quán)利要求62的方法或應(yīng)用，其中對(duì)象是人類(lèi)。
64.權(quán)利要求1-63任一項(xiàng)的方法、應(yīng)用、化合物或組合物，其中寡核苷酸在脂質(zhì)體中。
65.權(quán)利要求1-6、8-48、51-54和56-64任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用，其中寡核苷酸與靶序列 的雜交誘導(dǎo)靶核酸的切開(kāi)。
66.權(quán)利要求1-6、8-48、51-54和56-65任一項(xiàng)的方法或應(yīng)用，其中寡核苷酸的序列表 現(xiàn)出與靶核酸或其互補(bǔ)體至少70%的序列同一性。
67.權(quán)利要求66的方法或應(yīng)用，其中寡核苷酸的序列表現(xiàn)出與靶核酸或其互補(bǔ)體至少 90%的序列同一性。
68.權(quán)利要求7、49-50、55和64任一項(xiàng)的化合物或組合物，其中寡核苷酸包含與來(lái)自病 毒的核苷酸序列至少90%互補(bǔ)的核苷酸序列。
全文摘要
本發(fā)明涉及使用具有修飾的核堿基的寡核苷酸在對(duì)象中抑制病毒的基因表達(dá)和/或復(fù)制。修飾的核堿基可以是巰基修飾的堿基或羥基修飾的核堿基?？紤]到了寡核苷酸還包含核酸酶復(fù)合物，其增強(qiáng)寡核苷酸的抗病毒活性。
文檔編號(hào)C12N15/113GK101970662SQ200880123455
公開(kāi)日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月5日
發(fā)明者安德烈斯·梅利茨, 馬特·薩爾瑪, 馬蒂·卡拉爾森 申請(qǐng)人:波羅的科技發(fā)展有限公司