專利名稱：一種混合酶、酶切修飾試劑盒及構(gòu)建載體的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種混合酶、酶切修飾試劑盒及構(gòu)建載體的方法。
背景技術：
限制性內(nèi)切酶是一種能識別特定核苷酸序列，并在特定位置水解雙鏈DNA的內(nèi)切酶。按照限制性內(nèi)切酶在特殊核苷酸序列處進行切割時的切割方式，限制性內(nèi)切酶可分為平末端限制性內(nèi)切酶和粘性末端限制性內(nèi)切酶。其中，平末端限制性內(nèi)切酶在雙鏈DNA的兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個無粘性末端的平口，即平末端；而粘性末端限制性內(nèi)切酶則是在雙鏈DNA的兩條鏈的特定序列的不同部位切割，形成粘性末端。因為平末端雙鏈DNA進行連接時，其有兩個不可回避的問題，其一是連接的非定向性，即DNA片段 可以不同的方向連接，僅從連接形成的片段大小無法區(qū)分方向；其二是連接效率低，為了提高連接效率，往往通過提高底物的濃度來實現(xiàn)，但是濃度稍高則極易形成自連和多拷貝重復連接。而粘性末端雙鏈DNA在進行連接時，既可保證DNA片段連接的方向性，連接效率也較平末端高。因此，在基因工程領域，粘性末端限制性內(nèi)切酶得到了廣泛的應用，而平末端限制性內(nèi)切酶的應用則受到限制。末端轉(zhuǎn)移酶(Terminaltransferase, TdT)是一種無需模板的DNA聚合酶,它能催化脫氧核苷酸結(jié)合到DNA分子的3’羥基端。帶有突出、凹陷或平滑末端的單雙鏈DNA分子均可作為TdT的底物。現(xiàn)有技術中，一種構(gòu)建T載體的方法包括，I)利用Sma I或EcoR V對質(zhì)粒pUC57進行酶切，產(chǎn)生平末端酶切產(chǎn)物；2)利用末端轉(zhuǎn)移酶和dTTP或ddTTP，在平末端酶切產(chǎn)物兩端實現(xiàn)T的添加，從而獲得T載體。該方法中，對質(zhì)粒pUC57的酶切和對酶切產(chǎn)物3’羥基端的加尾是在兩個不同的步驟中進行的，中間往往還需要對酶切產(chǎn)物進行純化，步驟繁雜，實驗效率低。另外，而在純化過程中，因為回收效率的問題，會損失一部分的酶切產(chǎn)物，所以需要較大量的質(zhì)粒PUC57進行酶切。此外，現(xiàn)有的構(gòu)建與T載體相類似的載體的方法中，同樣存在上述問題。因此需要一種混合酶、酶切修飾試劑盒，利用該混合酶或酶切修飾試劑盒能同時實現(xiàn)對底物的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，簡化實驗步驟，提高實驗效率，并進一步降低對底物的需求量；還需要一種利用混合酶構(gòu)建載體的方法，能同時實現(xiàn)對底物的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，簡化實驗步驟，提高實驗效率，并能進一步降低對底物的需求量。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種混合酶、酶切修飾試劑盒及構(gòu)建載體的方法，旨在解決現(xiàn)有技術中實驗步驟繁雜，實驗效率低的問題。為了實現(xiàn)發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種混合酶，包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。其中，所述末端轉(zhuǎn)移酶可為野生型末端轉(zhuǎn)移酶或重組型末端轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選的，所述重組型末端轉(zhuǎn)移酶為牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶，所述牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶與牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶相比，其N端被截去100至160個氨基酸。上述任一方案中，所述平末端限制性內(nèi)切酶可為Afe I ,Ale I、Alu I、BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I >CviKI-KDpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HF 、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I ,Msl I、MspAl I、Nae I >Nla IV>Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu II >Pvu II _HF 、Rsa I、Sca I、Sca I -HF 、Sfo I、Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和Zra I中的至少一種。上述任一方案中，所述混合酶還可包括末端轉(zhuǎn)移酶作用因子I。本發(fā)明還提供了一種酶切修飾試劑盒，所述試劑盒包括混合酶；所述混合酶包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。其中，所述末端轉(zhuǎn)移酶可為野生型末端轉(zhuǎn)移酶或重組型末端轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選的，所述重組型末端轉(zhuǎn)移酶為牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶，所述牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶與牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶相比，其N端被截去100至160個氨基酸。上述任一方案中，所述平末端限制性內(nèi)切酶可為Afe I ,Ale I、Alu I、BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I >CviKI-KDpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HF 、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I ,Msl I、MspAl I、Nae I、NI a IV、Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu II >Pvu II _HF 、Rsa I、Sca I、Sca I -HF 、Sfo I、Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和Zra I中的至少一種。上述任一方案中，所述混合酶還可包括末端轉(zhuǎn)移酶作用因子I。上述任一方案中，所述試劑盒還可包括反應緩沖液，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。上述任一方案中，所述試劑盒還可包括氯化鈷溶液。上述任一方案中，所述試劑盒還可包括修飾物，所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。本發(fā)明還提供了一種基于上述的任一種混合酶構(gòu)建載體的方法，包括以下步驟
A.利用混合酶和修飾物，在第一酶切修飾體系中對前體核酸分子進行酶切和修飾，得
到3’端含有突出末端的載體；
所述前體核酸分子為含有至少一個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈核酸分子；所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。其中，所述第一酶切修飾體系包括反應緩沖液，所述反應緩沖液可為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。進一步的，所述第一酶切修飾體系還可包括氯化鈷溶液。更進一步的，所述第一酶切修飾體系可為在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇、0. 25mM的氯化鈷的水溶液。上述任一方案中，步驟A中所述的修飾物與前體核酸分子的摩爾數(shù)比大于等于100 :1。上述任一方案中，所述修飾物可為雙脫氧核糖核苷酸。進一步的，所述修飾物可為雙脫氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。上述任一方案中，所述構(gòu)建載體的方法還可包括以下步驟
B.將3’端含有突出末端的靶核酸片段與步驟A的產(chǎn)物連接，得到含有靶核酸片段的重組載體； 所述靶核酸片段的3’端的突出末端與步驟A得到的雙鏈核酸分子的3’端的突出末端互補。其中，步驟B所述靶核酸片段的3’突出末端可為脫氧腺嘌呤核糖核苷酸。優(yōu)選的，步驟B所述靶核酸片段是基于特異性引物，利用Taq酶擴增得到的。上述任一方案中，所述前體核酸分子可為pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript II KS (-)、pBluescript II KS (+)、pBluescript II SK (-)、pBluescriptII SK ( + )、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R 中的任一種。本發(fā)明還提供了另一種基于上述任一種混合酶構(gòu)建載體的方法，包括以下步驟
A.利用混合酶和修飾物，在第二酶切修飾體系中對目標片段進行酶切和修飾，得到3’端含單堿基突出末端的酶切產(chǎn)物；
B.將3’端含有單堿基突出末端的酶切產(chǎn)物與3’端含有單堿基突出末端的載體連接環(huán)化，得到含有目標片段的載體；
所述目標片段為含有至少一個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈DNA分子；
所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。優(yōu)選的，所述修飾物為雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸，所述3’端含有單堿基突出末端的載體為T載體。上述任一方案中，所述第二酶切修飾體系包括反應緩沖液，所述反應緩沖液可為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。進一步的，所述第二酶切修飾體系還可包括氯化鈷溶液。更進一步的，所述第二酶切修飾體系可為在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇、0. 25mM的氯化鈷的水溶液。上述任一方案中，步驟A中所述的修飾物與前體核酸分子的摩爾數(shù)比大于等于100 :1。由上可知，本發(fā)明的混合酶、酶切修飾試劑盒及構(gòu)建載體的方法能通過一步反應實現(xiàn)對底物的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，簡化實驗步驟，提高實驗效率，并能進一步解決因分步反應導致的損失問題，降低對底物的需求量，本發(fā)明的混合酶還大大擴大了平末端限制性內(nèi)切酶在實際應用中的使用范圍。


圖I是本發(fā)明第一具體實施例中各實驗組的反應終產(chǎn)物在15%的PAGE膠上的電泳圖。圖2本發(fā)明第二具體實施例中實驗組和對照組的反應終產(chǎn)物在0. 8%的瓊脂糖凝膠上的電泳圖。圖3是本發(fā)明第三具體實施例中I至4號白斑的菌落PCR產(chǎn)物和I至4號白斑擴大培養(yǎng)后的質(zhì)粒抽提產(chǎn)物在0. 8%的瓊脂糖凝膠上的電泳圖。 圖4是本發(fā)明第四具體實施例中5至8號白斑的菌落PCR產(chǎn)物和5至8號白斑擴大培養(yǎng)后的質(zhì)粒抽提產(chǎn)物在0. 8%的瓊脂糖凝膠上的電泳圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。本發(fā)明提出第一典型實施例，一種混合酶，包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。針對本典型實施例，需要說明的有以下幾點。所述平末端限制性內(nèi)切酶是能在雙鏈DNA的兩條鏈的特定序列的相同部位切割，形成一個無粘性末端的平口的限制性內(nèi)切酶。所述末端轉(zhuǎn)移酶是一種無需模板的DNA聚合酶，能催化脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物結(jié)合到DNA分子的3’羥基端。所述平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶均可從市場上直接購買獲得，如NEB，Invitrogen、Sigma-Aldrich、Promega、Roche等，也可利用常規(guī)的蛋白質(zhì)表達技術,通過克隆構(gòu)建、蛋白誘導、純化等步驟自行制備。本方案的混合酶能夠在一步反應中同時實現(xiàn)對底物(雙鏈DNA分子)的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，將現(xiàn)有技術中的至少兩步反應(酶切、延伸)簡化成一步反應，簡化了實驗步驟，提聞了實驗效率。此外，經(jīng)本方案的混合酶處理的底物，含有粘性末端，具有與粘性末端限制性內(nèi)切酶處理同樣的技術效果，防止了處理后的底物自連現(xiàn)象的發(fā)生，提高了連接效率。因此，本方案打破了平末端限制性內(nèi)切酶在基因工程領域的應用限制，可被廣泛的應用。此外，現(xiàn)有技術中，為了保證延伸步驟的效果，往往在酶切步驟后需要增加一個純化步驟，而純化步驟必然造成目標物的損失，目前的各種核酸純化方法，其純化回收率一般在50%-90%之間。因此，本方案還能進一步的降低對底物的需要量?；诘谝坏湫蛯嵤├?，所述末端轉(zhuǎn)移酶可為野生型末端轉(zhuǎn)移酶或重組型末端轉(zhuǎn)移酶。所述末端轉(zhuǎn)移酶可為人末端轉(zhuǎn)移酶、牛末端轉(zhuǎn)移酶、鼠末端轉(zhuǎn)移酶、豬末端轉(zhuǎn)移酶或兔末端轉(zhuǎn)移酶。優(yōu)選的，所述重組型末端轉(zhuǎn)移酶為牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶。所述牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶，其氨基酸序列是牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶氨基酸序列中的某一段或多段被截去，使得其活性相對于牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶得到提高。更優(yōu)選的，所述牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶與牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶相比，其N端被截去100至160個氨基酸。更優(yōu)選的，所述牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶與牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶相比，其N端被截去138個氨基酸。N端被截去100至160個氨基酸，或138個氨基酸的牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶，在含有Co2+離子的溶液中，其活性是野生型的20至30倍，相關實驗詳見US20040043396，在此不再贅述。上述任任一方案中，所述平末端限制性內(nèi)切酶可為Afe I ,Ale I、Alu I ,BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I >CviKI-KDpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HF 、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I ,Msl I、MspAl I、Nae I >Nla IV>Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu II >Pvu II _HF 、Rsa I、Sca I、Sca I -HF 、Sfo I、Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和Zra I中的至少一種。優(yōu)選的，所述平末端限制性內(nèi)切酶為Afe I、Ale I、Alu I、BmgB I、BsrB I、BstZ17 I、Cac8 I ,CviKI-UDpn I ,Dra I、Eco53K I ,EcoR V ,EcoRV-HF ,Fsp I ,Hae IILHinc II、Hpa I、HpyCH4 V >Mly I、Msc I、Msl I、MspAl I、Nae I、NlaIV、Nru I、Pme I、Pml I ,PshA I ,Psi I、Pvu II、Pvu II -HF 、Rsa I ,Sca I、Sca I -HF , Sfo I ,Sma I、SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和 Zra I 中的至少一種。因為上述平末端限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度為37°C或25°C，與末端轉(zhuǎn)移酶的最適反應溫度相同或更低，能保證混合酶中的兩種酶在進行反應時，均能在各自的最佳反應溫度下進行，而不影響另一種酶的活性。例如，當所述平末端限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度與末端轉(zhuǎn)移酶相同時，它們可在同一溫度進行反應，簡化了實驗條件；當所述平末端限制性內(nèi)切酶的最適反應溫度為25°C時，可先在25°C條件下進行酶切，然后再將溫度提高至37 °C進行延伸加尾反應。優(yōu)選的，所述平末端限制性內(nèi)切酶為Afe I ,Ale I、Alu I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I、CviKI-U Dpn I , Dra I、Eco53K I、EcoRV-HF , Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V >Mly I、Msc I、Msl I、MspAl I、Nae I、Nla IV、Pme I、PshA I ,Psi I、Pvu IKPvu II -HF 、Rsa I ,Sca I、Sca I -HF , Sfo I ,Sma I ,SnaB I、Ssp I -HF、Stu I、Xmn I 和 Zra I 中的至少一種。因為經(jīng)本發(fā)明人實驗證明，上述平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶均能在特定反應緩沖液(該反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液)中具[Cl]，相關實驗證明參見第一具體實施例。上述任一方案中，所述混合酶還包括末端轉(zhuǎn)移酶作用因子I (TdT interactingfactor I, TdIFD0因為，TdIFl能與TdT直接結(jié)合，并將TdT的活性提高4倍，相關證明實驗詳見 Terminal deoxynuc Ieot idyl transferase directly interacts with a novelnuclear protein that is homologous to p65, Nobuyuki Yamashita et al, Genes toCells, 2011, 6，641-652，在此不再贅述。本發(fā)明提出第二典型實施例，一種酶切修飾試劑盒，包括混合酶，所述混合酶包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。針對本典型實施例，需要說明的有以下幾點。本方案中的混合酶可采用[c2]第一典型實施例中的任一種混合酶。本方案的酶切修飾試劑盒能夠在一步反應中同時實現(xiàn)對底物(雙鏈DNA分子)的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，將現(xiàn)有技術中的至少兩步反應(酶切、延伸)簡化成一步反應，簡化了實驗步驟，提高了實驗效率。現(xiàn)有技術中，將多種酶進行混合時，往往是根據(jù)酶的活性單位進行混合的。在本發(fā)明中，不同來源的平末端限制性內(nèi)切酶或末端轉(zhuǎn)移酶的活性單位定義可能不同，平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶的活性單位定義也可能不同。市場上購買的末端轉(zhuǎn)移酶的活性單位定義通常是在一定溫度條件下(例如37°C ),—定時間內(nèi)(例如lh), —定的反應體系中，將單位修飾物(例如=Inmol dATP)添加至某一特定底物上所需的酶的量。例如，NEB的TdT的活性單位定義是在ImL反應體系中，在37°C條件下，在Ih內(nèi)能將lnmol dATP添加至引物d (八)18的3，端所需的TdT的量；所述反應體系為d(A)18,0. 2mM dATP，和I u Ci [3H]-dATP每50 y L總反應體積。而市場上購買的平末端限制性內(nèi)切酶的活性單位定義通常是在一定的溫度條件下(例如37°C)，一定時間內(nèi)(例如lh)，一定的反應體系中，將一定量的底物(例如1 y g)完全酶切所需的酶的量。例如NEB的Pvu II的活性單位定義就是在37°C條件下，在50 L總反應體積中將Iug入DNA完全酶切所需的酶的量；該反應體系為IXNEBuffer 2。上述的例子顯示，末端轉(zhuǎn)移酶的活性單位是在一定時間、溫度和反應條件下，基于 特定底物，根據(jù)所需的修飾物的物質(zhì)的量來定義的；而平末端限制性內(nèi)切酶是在一定時間、溫度和反應條件下，根據(jù)對一定量的底物(以質(zhì)量計算)進行處理所需的酶的量來定義的。因此，本發(fā)明的混合酶中的平末端限制性內(nèi)切酶或末端轉(zhuǎn)移酶在進行混合時，如果要達到最佳的使用效果，并不能簡單的根據(jù)活性單位的定義進行混合，往往是需根據(jù)具體的作用底物進行相應的調(diào)整。總的原則是根據(jù)具體的作用底物的摩爾數(shù)，計算出對該摩爾數(shù)的底物進行酶切所需的平末端限制性內(nèi)切酶的酶量(以活性單位定義)，和對該摩爾數(shù)的底物被酶切后進行修飾所需的末端轉(zhuǎn)移酶的酶量(以活性單位定義)，然后根據(jù)計算結(jié)果，按比例配置混合酶。當然，以其他比例配置的混合酶也還是能夠在一步反應中實現(xiàn)對底物的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，只是在效果和/或成本上未實現(xiàn)最佳配置?；诘诙湫蛯嵤├?，優(yōu)選的，所述平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶均為從市場上購買所得。更優(yōu)選的，所述平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶購自同一生產(chǎn)商。因為不同生產(chǎn)商生產(chǎn)的同一種酶可能在活性和最適反應條件上有些微的差異。更優(yōu)選的，所述平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶均購自NEB。當將多種不同的酶置于同一反應步驟中進行反應時，最重要的是找到所述多種不同的酶均能發(fā)揮活性的反應條件，尤其是反應體系。這些反應條件或反應體系對于所述多種不同的酶來說，可能都不是最佳的反應條件，也可能只是其中一種酶的最佳反應條件?；诘诙湫蛯嵤├鲈噭┖羞€可包括反應緩沖液。所述反應緩沖液用于提供混合酶中兩種酶發(fā)揮酶活性所需的離子濃度和PH值。所述反應緩沖液所含的離子濃度可以是混合酶中兩種酶發(fā)揮酶活性所需的離子濃度的2倍、5倍、10倍、20倍或更多，以利于后續(xù)配置酶切反應體系時計算所需的反應緩沖液，并能夠以合適的體積進行取用，以減少誤差。優(yōu)選的，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值為7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。更優(yōu)選的，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸鉀、IOmM醋酸鎂、ImM 二硫蘇糖醇的水溶液。本方案的反應緩沖液在使用過程中是作為IOX緩沖液，用于配置成含IX緩沖液的反應體系。在此反應體系中，混合酶中的平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶的穩(wěn)定性和反應活性均處于較佳狀態(tài)。針對用于配置酶切反應體系的反應緩沖液，本發(fā)明將通過第一具體實施例來進一步說明其對混合酶作用的影響。以完全互補的雙鏈核苷酸A (其中一條鏈的序列如SEQ ID NO: I所示)為底物，所述雙鏈核苷酸A大小為lOObp，其在序列中間含有Pvu II和Pvu II -HF 酶的酶切識別位點(CAGCTG)。以 Pvu II -HF (NEB, Cat# R3151S, 20U/ u L)和 TdT (NEB, Cat# M0315L, 20U/ u L)作為混合酶的原材料，Pvu II -HF 與TdT的體積比為3 :2，得到的混合酶中的Sma I和TdT的活性濃度分別為12U/ii L、8U/y L。以dATP作為修飾物。配置以下一系列的IOX反應緩沖液。A. pH值為7. 0 (25°C)，含有30mM的Tris-醋酸、45mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂的
水溶液。B. pH值為7. 6 (25°C)，含有21mM的Tris-醋酸、38mM的醋酸鉀、18mM的醋酸鎂的水溶液。C. pH值為7. 8 (25°C)，含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇、0. 4mM氯化鈷的水溶液。D.pH值為7. I (25°C)，含有30mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂的
水溶液。E. pH值為7. 4 (25°C)，含有27mM的Tris-醋酸、30mM的醋酸鉀、15mM的醋酸鎂的水溶液。F. pH值為7. 5 (25°C )，含有23mM的Tris-醋酸、40mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、
0.IOmM氯化鈷的水溶液。G. pH值為7. 9 (25°C )，含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇、0. 25mM氯化鈷的水溶液。按下述配比配置酶切修飾反應體系雙鏈核苷酸A，l. g ;混合酶，I. 25UL ；IOX 反應緩沖液，5 i! L ; IOmM ddATP，0. 5 y L ;ddH20，加至 50 y L。反應條件37°C反應 4h，80°C 滅活 20min。將上述幾組反應的終產(chǎn)物在15%的含尿素的PAGE膠中進行電泳，結(jié)果如圖I所示。其中，泳道“對”的點樣樣品是雙鏈核苷酸A ;泳道I對應A系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物；泳道2對應B系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物；泳道3對應C系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物；泳道4對應D系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物；泳道5對應E系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物；泳道6對應F系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物；泳道7對應G系列的反應緩沖液組的反應終產(chǎn)物。如果各組酶切反應體系中的酶的活性越高，所得的酶切修飾產(chǎn)物的分子量就越大，酶切修飾產(chǎn)物的量也越多，而酶切產(chǎn)物的量就越少；反映在電泳圖中，即為酶切修飾產(chǎn)物的條帶更粗、更亮，而酶切產(chǎn)物的條帶更細、更淡。如圖I顯示，各泳道的酶切修飾效果由好到差依次排列為3、7、6、2、5、1、4。即，用于配置酶切反應體系的反應緩沖液優(yōu)選為在、25°C條件下pH值為7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液；更優(yōu)選為在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸鉀、IOmM醋酸鎂、ImM 二硫蘇糖醇的水溶液。更優(yōu)選的，所述反應緩沖液為 在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸鉀、IOmM醋酸鎂、ImM 二硫蘇糖醇的水溶液應當說明的是，本具體實施例僅是針對反應緩沖液的不同，來判斷對混合酶酶切和修飾效果影響的一個具體實施例，并不用于限制本發(fā)明，且當相應的更換混合酶作用底物、混合酶等時，其實驗結(jié)果與本具體實施例基本—致。上述任一方案中，所述試劑盒還可包括氯化鈷溶液。優(yōu)選的，所述氯化鈷溶液為濃度為2. 5mM的氯化鈷水溶液。因為TdT在含有鈷離子的溶液中的活性比在只含有鎂離子、錳離子或鋅離子的溶液中的活性更高。鈷離子的終濃度可選擇的范圍較大,至少從0. OlmM至IOmM之間均可以使 TdT 達到較高的活性，例如0. 05mM、0. lmM、0. 2mM、0. 3mM、0. 7mM、lmM、2mM、3mM、4mM、5mM、8mM。優(yōu)選的，鈷離子的終濃度為0. 25mM。上述任一方案中，所述試劑盒還可包括修飾物。需要說明的是，所述修飾物是能夠在TdT的作用下，結(jié)合至DNA分子的3’羥基端的核苷酸。優(yōu)選的，所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。其中，上述的三種帶標記的核苷酸所攜帶的標記可有多種形式，包括但不限于生物素標記、熒光標記、鏈霉親和素標記、親和素標記、抗原標記、抗體標記或大基團標記(用于酶切修飾后的分離純化或使得在底物的3’羥基端只能延伸一個堿基，可具體采用的大基團可參考CN201010155269. 9，在此不再進行贅述)。這些標記可有多種作用，包括但不限于使得被混合酶處理后帶上標記物的底物更容易提純；使得底物被混合酶酶切后能夠延伸的核苷酸數(shù)為1，形成含有單堿基突出末端的底物。上述的6種修飾物中，除第I種外，其余5種修飾物均可能使底物在被混合酶處理后形成含有單堿基突出末端的底物；尤其是雙脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸和雙脫氧核苷酸類似物。更優(yōu)選的，所述修飾物為雙脫氧核苷酸或帶生物素標記的雙脫氧核苷酸。本發(fā)明還提出第三典型實施例，一種構(gòu)建載體的方法，包括以下步驟
SI.利用混合酶和修飾物，在第一酶切修飾體系中對前體核酸分子進行酶切和修飾，得到3’端含有突出末端的載體。所述前體核酸分子為含有至少一個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈核酸分子。所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。所述混合酶包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。所述第一酶切修飾體系是對前體核酸分子進行酶切和修飾的反應體系。針對本典型實施例，應當說明的有以下幾點。
所述混合酶可采用前述的任一種混合酶。本方案能夠在一步反應中同時實現(xiàn)對底物(雙鏈DNA分子)的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，將現(xiàn)有技術中的至少兩步反應(酶切、延伸)簡化成一步反應，簡化了實驗步驟，提聞了實驗效率。基于第三典型實施例，所述第一酶切修飾體系可包括反應緩沖液。所述反應緩沖液用于提供混合酶中兩種酶發(fā)揮酶活性所需的離子濃度和pH值。所述反應緩沖液所含的離子濃度可以是混合酶中兩種酶發(fā)揮酶活性所需的離子濃度的2倍、5倍、10倍、20倍或更多，以利于后續(xù)配置酶切反應體系時計算所需的反應緩沖液，并能夠以合適的體積進行取用，以減少誤差。優(yōu)選的，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有TriS-醋酸、 醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。在此條件下，混合酶中的購于NEB的平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶均具有較高的活性。更優(yōu)選的，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸鉀、IOmM醋酸鎂、ImM 二硫蘇糖醇的水溶液。上述任一方案中，所述修飾物為雙脫氧核糖核苷酸。本方案中，所述修飾物使得經(jīng)步驟SI得到的產(chǎn)物均為3’端含單堿基突出末端的載體，保證了步驟SI產(chǎn)物的同一性，有利于其在基因工程領域的進一步應用。需要說明的是，當修飾物為帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物，且上述的四種修飾物的3’羥基端均因為相關標記或修飾(相關標記或修飾可在3’羥基上或不在3’羥基上)的緣故不能進一步延伸時，也可實現(xiàn)類似雙脫氧核苷酸的功能。更優(yōu)選的，所述修飾物為雙脫氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。在本方案中，步驟SI的產(chǎn)物3’端含有單堿基突出末端的載體為T載體。本方案作為一種制備T載體的方法，其較現(xiàn)有技術中的制備T載體的方法步驟更簡單，實驗效率更高，并能進一步降低對底物的需求量。同樣的，所述修飾物分別為雙脫氧胞嘧啶核糖核苷酸、雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸、雙脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸時，步驟SI的產(chǎn)物3’端含有單堿基突出末端的載體分別為C載體、A載體、G載體，即它們的3’含有的單堿基突出末端分別為C、A、G0上述任一方案中，所述構(gòu)建載體的方法還可包括以下步驟
S2.將3’端含有突出末端的靶核酸片段與步驟SI的產(chǎn)物連接，得到含有靶核酸片段的重組載體。所述靶核酸片段的3’端的突出末端與步驟SI得到的雙鏈核酸分子的3’端的突出末端互補。優(yōu)選的，所述步驟S2中的靶核酸片段的3’突出末端為脫氧腺嘌呤核糖核苷酸。與之相對應的是，步驟SI中的修飾物為雙脫氧胸腺嘧啶脫氧核糖核酸。針對本方案，應當說明的有以下幾點。3’突出末端為單堿基(A)突出末端的靶核酸片段的形成方式有多種。包括但不限于
I)利用末端轉(zhuǎn)移酶，以雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸為修飾物，在平末端的靶核酸片段的兩個3’羥基端分別加上一個雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸，從而獲得3’突出末端為單堿基(A)突出末端的靶核酸片段；
2)通過特異性引物，利用Taq酶對含靶核酸片段的模板進行擴增，最終得到3’突出末端為單堿基(A)突出末端的靶核酸片段。同理，當所述步驟S2中的靶核酸片段的3’突出末端為脫氧胸腺嘧啶核糖核苷酸時，與之相對應的是，步驟SI中的修飾物為雙脫氧腺嘌呤脫氧核糖核酸；當所述步驟S2中的靶核酸片段的3’突出末端為脫氧胞嘧啶核糖核苷酸時，與之相對應的是，步驟SI中的修飾物為雙脫氧鳥嘌呤脫氧核糖核酸；當所述步驟S2中的靶核酸片段的3’突出末端為脫氧鳥嘌呤核糖核苷酸時，與之相對應的是，步驟SI中的修飾物為雙脫氧胞嘧啶脫氧核糖核 酸。本方案所得到的重組載體，在靶核酸片段與步驟SI的產(chǎn)物發(fā)生連接的地方，會形成兩個切口，當將該重組載體轉(zhuǎn)化入細菌后，這兩個切口可被修復。因此，通過對轉(zhuǎn)化后的細菌進行質(zhì)粒抽提，可得到無切口的重組載體。上述任一方案中，所述前體核酸分子優(yōu)選為pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript II KS (-)、pBluescript II KS (+)、pBluescript II SK (-)、pBluescriptII SK ( + )、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R中的任一種。上述11種前體核酸分子均可從市場上直接購買獲得，如Fermentas、Sigma-Aldrich、Promega、NEB等。本方案中，各前體核酸分子上均含有平末端限制性內(nèi)切酶的酶切位點，在含有相應的平末端限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶的混合酶的作用下，可將它們轉(zhuǎn)變成所需的載體，例如T載體。本發(fā)明還提出第四典型實施例，一種構(gòu)建載體方法，包括以下步驟
SI，.利用混合酶和修飾物，在第二酶切修飾體系中對目標片段進行酶切和修飾，得到3’端含單堿基突出末端的酶切產(chǎn)物；
S2’ .將3’端含有單堿基突出末端的酶切產(chǎn)物與3’端含有單堿基突出末端的載體連接環(huán)化，得到含有目標片段的載體。所述目標片段為含有至少一個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈核酸分子。所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。所述第二酶切修飾體系是對目標片段進行酶切和修飾的反應體系。針對本典型實施例，應當說明的有以下幾點。所述混合酶可采用第一實施例中的任一種混合酶。本方案能夠在一步反應中同時實現(xiàn)對底物(雙鏈DNA分子)的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，將現(xiàn)有技術中的至少兩步反應(酶切、延伸)簡化成一步反應，簡化了實驗步驟，提聞了實驗效率。本方案與第三典型實施例相比，不同點主要在于被混合酶處理的底物的不同。雖然，在第三典型實施例中的前體核酸分子和本方案中的目標片段一樣，都是含有至少一個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈核酸分子。但是，在第三典型實施例中的前體核酸分子是形成重組載體的骨干結(jié)構(gòu)，其須適用于各種大小的靶核酸片段。而為了保證重組載體(重組載體為雙鏈環(huán)狀核酸分子)的形成，即，前體核酸分子與靶核酸片段連接成環(huán)，前體核酸分子應大于等于150bp。優(yōu)選的，前體核酸分子大于等于400bp。而本方案中的目標片段的大小無具體的限制，其大小的變動范圍較大，可根據(jù)需研究的目標片段進行任意的選擇。例如，當目標片段為某個基因或某個基因的某一特定外顯子時，其大小可能在幾十bp至數(shù)十kb之間。綜上，若把基于第三典型實施例形成的重組載體類比為本方案的最終產(chǎn)物，含有目標片段的載體，那么，重組載體中的前體核酸分子就好比是本方案步驟B中的3’端含有單堿基突出末端的載體，而重組載體中的靶核酸片段就好比是本方案步驟A中的目標片段?；诘谒牡湫蛯嵤├?，所述第二酶切修飾體系可包括反應緩沖液。所述反應緩沖液用于提供混合酶中兩種酶發(fā)揮酶活性所需的離子濃度和PH值。所述反應緩沖液所含的離子濃度可以是混合酶中兩種酶發(fā)揮酶活性所需的離子濃度的2倍、5倍、10倍、20倍或更多，以利于后續(xù)配置酶切反應體系時計算所需的反應緩沖液，并能夠以合適的體積進行取用，以減少誤差。優(yōu)選的，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。在此條件下，混合酶中的購于NEB的平末端限制性內(nèi)切酶和末端 轉(zhuǎn)移酶均具有較高的活性。更優(yōu)選的，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值為7. 9的含有20mM Tris-醋酸、50mM醋酸鉀、IOmM醋酸鎂、ImM 二硫蘇糖醇的水溶液。上述任一方案中，所述修飾物為雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸，所述3’端含有單堿基突出末端的載體為T載體。本方案中，所述修飾物使得經(jīng)步驟SI’得到的產(chǎn)物均為3’端含A突出末端的酶切產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與市場上最常見的單堿基突出末段載體——T載體進行高效的連接反應，從而得到含有目標片段的載體。需要說明的是，當修飾物為帶標記的腺嘌呤脫氧核糖核苷酸、帶標記的雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸、腺嘌呤脫氧核糖核苷酸類似物或雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸類似物，且上述的四種修飾物的3’羥基端均因為相關標記或修飾(相關標記或修飾可在3’羥基上或不在3’羥基上)的緣故不能進一步延伸時，也可像雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸一樣使用。下面將通過第二具體實施例對利用本發(fā)明的混合酶構(gòu)建T載體的方法進行進一步的說明。以從GenScript購買的pUC57 plasmid DNA (SD1176)為前體核酸分子，構(gòu)建T載體。以 Sma I (NEB, Cat# R0141S，20U/y L)和 TdT (NEB, Cat# M0315L，20U/y L)作為混合酶的原材料，Sma I與TdT的體積比為9 :1，得到的混合酶中的Sma I和TdT的活性濃度分別為 18 U/ u L>2 U/ u L0以ddATP作為修飾物。配置IOX反應緩沖液，該緩沖液在25°C條件下pH值為7. 9，是含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇、0. 25mM的氯化鈷的水溶液。一、實驗組。按下述配比配置酶切修飾反應體系pUC57 plasmid DNA, 2 U g ;混合酶，I. IluL ；IOX 反應緩沖液，5 ii L ;IOmM ddATP，0. 11 y L ;ddH20，加至 50 y L。反應條件25°C反應 4h，37°C反應 0. 5h，70°C滅活 15min。二、對照組。
I. Sma I 酶切。按下述配比配置酶切反應體系pUC57plasmid DNA,2. 5u g ；Sma I (20U/u L),
I.25u L ；10X NEBuf fer4, 5u L ；ddH20,加至 50 y L。反應條件25 °C 反應 4h，65 °C 滅活20mino2.純化回收。利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Cat# A9281)回收步驟I的產(chǎn)物，產(chǎn)物溶于25 ii L的ddH20中，并在Nanodrop 2000上測定回收產(chǎn)物濃度，回收產(chǎn)物濃度為92. lng/u L0相關操作詳見操作說明書，在此不再贅述。 3.加 A 尾。在TdT酶的作用下，對步驟2回收的產(chǎn)物加A尾。按下述配比配置反應體系步驟 2 產(chǎn)物，22 ii L (約 I. 3pmol) ;TdT (20U/u L),0. 13u L ；10mM ddATP，0. 13 y L ;ddH20，力口至50ii L。反應條件37°C反應0. 5h，70°C滅活lOmin。將實驗組和對照組的反應終產(chǎn)物在0. 8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳，結(jié)果如圖2所示。其中，泳道“PUC57”的點樣樣品是pUC57 plasmid DNA，泳道“實”的點樣樣品是實驗組的終產(chǎn)物，泳道“對”的點樣樣品是對照組的終產(chǎn)物。因為在同樣分子大小的情況下，環(huán)狀核酸分子的電泳速度較線狀核酸分子的電泳速度快，因此，如圖2所示，實驗組和對照組均能對pUC57 plasmid DNA徹底的酶切。綜上，利用混合酶能夠簡化T載體的構(gòu)建步驟，提高實驗效率，并因為省去了回收的步驟，降低了對起始材料的需求量。針對本具體實施例，需要說明的是，本具體實施例所使用的混合酶并不限于本實施例所述的這種，換用其它的限制性內(nèi)切酶，例如EcoR V ;或采用其他的比例混合限制性內(nèi)切酶和末端轉(zhuǎn)移酶；或更換前體核酸分子，例如pTZ57R、pUC19、pUC18、pBluescriptII KS (-)、pBluescript II KS ( + )、pBluescript II SK (-)、pBluescript II SK ( + )、pACYC184、pTZ19R ;或同時更換前體核酸分子和混合酶，例如采用pBR322作為前體核酸分子，混合酶包括Pvu II和末端轉(zhuǎn)移酶，或者包括Pvu II -HF 和末端轉(zhuǎn)移酶；或采用其它的反應緩沖液，例如含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇的水溶液；以上替換，均能像上述具體實施例一樣，實現(xiàn)T載體的成功構(gòu)建。為了進一步證明第二具體實施例構(gòu)建的T載體能夠被具體應用(構(gòu)建含有硫氧還蛋白基因的重組T載體)，本發(fā)明提出第三具體實施例。一、大腸桿菌DH5 a基因組DNA的抽提。米用基因組DNA提取試劑盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit,Promega,Cat# A1120)抽提大腸桿菌DH5a的基因組DNA，相關操作詳見說明書，在此不再贅述。二、靶核酸片段的擴增。以Fl (SEQ ID NO: 2)和Rl (SEQ ID NO: 3)作為引物，步驟一的產(chǎn)物，基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應體系如下F1 (10uM),2u L ；R1 (10 y M)，2 y L ;基因組 DNA，100ng ;10XEx Taq Buffer,5u L ；Ex Taq (5U/u L), I U L ；dNTP (各 2. 5mM)，4 ii L ;ddH20,加至 50 u L0PCR反應條件如下
95 °C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重復 30 個循環(huán)；72 °C 7min。對反應產(chǎn)物進行純化回收，得擴增產(chǎn)物。三、靶核酸片段和T載體的連接。分別以第二具體實施例中實驗組和對照組構(gòu)建的終產(chǎn)物作為T載體，反應體系如下步驟二得到的擴增產(chǎn)物，200ng ；T載體(實驗組或?qū)φ战M)，500ng ；10XT4 LigationBuffer,2u L ；T4 DNA ligase (400U/y L，NEB，Cat#M0202L)，2 y L ;ddH20，加至 20 y L。反應條件16°C反應過夜。四、將步驟三的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH 5a (天根生化科技(北京)有限公司CB101-01)中，并將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH 5a涂布至氨芐 抗性的LB平板上，進行藍白斑篩選。相關操作詳見說明書，在此不再贅述。五、菌落PCR驗證。通過菌落PCR驗證硫氧還蛋白基因(Thioredoxin)是否克隆成功，以F2 (SEQ IDNO: 4)和R2 (SEQ ID NO: 5)作為引物，以步驟四中的平板上的白斑作為模板。另外，對進行菌落PCR的白斑進行放大培養(yǎng)，并抽提質(zhì)粒。將菌落PCR的產(chǎn)物和相應的抽提實驗得到的質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。其中，泳道1、2的樣品分別是第二具體實施例中實驗組構(gòu)建的T載體與本發(fā)明的第三具體實施例中步驟I的產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化和藍白斑篩選得到的第1、2號白斑的菌落PCR產(chǎn)物；泳道3、4的樣品分別是第二具體實施例中對照組構(gòu)建的T載體與本發(fā)明的第三具體實施例中步驟I的產(chǎn)物進行連接，轉(zhuǎn)化和藍白斑篩選得到的第3、4號白斑的菌落PCR產(chǎn)物；泳道5、6的樣品則分別是第1、2號白斑放大培養(yǎng)后抽提得到的質(zhì)粒；泳道7、8的樣品則分別是第3、4號白斑放大培養(yǎng)后抽提得到的質(zhì)粒。結(jié)果顯示，泳道I至8中的條帶均符合預期，即1、2、3、4號白斑均為成功構(gòu)建的含有硫氧還蛋白基因的T載體克隆。將1、2、3、4號白斑的PCR產(chǎn)物及步驟二的擴增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)有限公司分別進行雙向全測序，對測序結(jié)果進行分析可知，步驟二的擴增產(chǎn)物測序結(jié)果為SEQ IDNO: 6，I號白斑的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果為SEQ ID NO: 6，2、3、4號白斑的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與I號白斑完全相同。經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO: 5能夠與SEQ ID NO: 7中的序列100%比對上，進一步證明了第二具體實施例中的實驗組和對照組的T載體均能用于成功構(gòu)建實現(xiàn)含有硫氧還蛋白基因的T載體克隆。下面將通過第四具體實施例對利用本發(fā)明的另一種利用混合酶構(gòu)建T載體的方法進行進一步的說明(構(gòu)建含有硫氧還蛋白基因的重組T載體)。HpGEM-T Easy Vector(Promega, Cat# A1360)作為 T 載體。以 EcoR V -HF (NEB, Cat# R3195L，20U/y L)和 TdT(NEB, Cat# M0315L, 20U/u L)作為混合酶的原材料，EcoR V -HF 與TdT的體積比為I : I，得到的混合酶中的EcoR V -HF 和TdT的活性濃度分別為10 U/u LUO U/u L0以ddATP作為修飾物。配置IOX反應緩沖液，該緩沖液在25°C條件下pH值為7. 9，是含有20mM的Tris-醋酸、50mM的醋酸鉀、IOmM的醋酸鎂、ImM的二硫蘇糖醇的水溶液。一、目標片段的獲得。利用第三具體實施例步驟I中抽提得到的基因組DNA為模板，以F3 (SEQ ID NO:8)和R3 (SEQ ID NO: 9)為進行PCR擴增，引物F3和R3上均含有EcoR V -HF 的酶切識別位點。PCR 反應體系如下F3 (10uM),2u L ；R3 (10 y M)，2 y L ;基因組 DNA，IOOng ;PfuDNA Polymerase 10 XBuffer with MgSO4, 5 u L ;dNTP(各 IOmM), I u L ;Pfu DNA Polymerase(Promega, Cat# M7741), 0. 5 y L ；ddH20,加至 50 u L。PCR反應條件如下
95 °C 3min ；
94°C 30s, 58°C 30s, 72°C 30s ;重復 30 個循環(huán)；
72 °C 7min。對反應產(chǎn)物進行純化回收，得目標片段。 二、目標片段的酶切修飾。I.實驗組。按下述配比配置酶切修飾反應體系目標片段，I U g ;混合酶，IuL5IOX反應緩沖液，5iiL;10mM ddATP，0. L ;ddH20，加至 50ii L。反應條件37 °C 反應 4h，80°C 滅活20mino2.對照組。I) EcoR V -HF 酶切。按下述配比配置酶切反應體系目標片段，1.5iig;EC0R V -HF (20U/uL),
0.75u L ；10X NEBuf fer4, 5u L ；ddH20,加至 50 y L。反應條件37 °C 反應 4h，80 °C 滅活20mino2).純化回收。利用Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Cat# A9281)回收步驟I的產(chǎn)物，產(chǎn)物溶于25 ii L的ddH20中，并在Nanodrop 2000上測定回收產(chǎn)物濃度，回收產(chǎn)物濃度為55. 8ng/u L0相關操作詳見操作說明書，在此不再贅述。3).加 A 尾。在TdT酶的作用下，對步驟2)回收的產(chǎn)物加A尾。按下述配比配置反應體系步驟 2)產(chǎn)物，17. L (約 4. 3pmol) ;TdT (20U/u L), 0. 5 u L ；10mM ddATP，0. 5 y L ;ddH20，力口至50ii L。反應條件37°C反應0. 5h，80°C滅活20min。三、目標片段酶切修飾產(chǎn)物與T載體的連接。分別以步驟二中實驗組和對照組得到的目標片段酶切修飾產(chǎn)物與T載體連接，反應體系如下目標片段酶切修飾產(chǎn)物(實驗組或?qū)φ战M)，95ng;pGEMz -T Easy Vector,200ng ；10XT4 Ligation Buffer,2u L ；T4 DNA ligase (400U/uL, NEB, Cat#M0202L),2iiL;ddH20，WM20iiL。反應條件16°C反應過夜。四、將步驟三的產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌DH5a (天根生化科技(北京)有限公司CB101-01)中，并將轉(zhuǎn)化后的大腸桿菌DH 5a涂布至氨芐抗性的LB平板上，進行藍白斑篩選。相關操作詳見說明書，在此不再贅述。五、菌落PCR驗證。通過菌落PCR驗證硫氧還蛋白基因(Thioredoxin)是否克隆成功，以F4 (SEQ IDNO: 10)和R4 (SEQ ID NO: 11)作為引物，以步驟四中的平板上的白斑作為模板。另外，對進行菌落PCR的白斑進行放大培養(yǎng)，并抽提質(zhì)粒。將菌落PCR的產(chǎn)物和相應的抽提實驗得到的質(zhì)粒進行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。其中，圖4A中的泳道1、2的樣品分別是第四具體實施例中實驗組藍白斑篩選得到的第5、6號白斑的菌落PCR產(chǎn)物；圖4B中的泳道1、2的樣品則分別是第5、6號白斑放大培養(yǎng)后抽提得到的質(zhì)粒；圖4八中的泳道3、4的樣品分別是第四具體實施例中對照組藍白斑篩選得到的第7、8號白斑的菌落PCR產(chǎn)物；圖4B中的泳道3、4的樣品則分別是第7、8號白斑放大培養(yǎng)后抽提得到的質(zhì)粒。結(jié)果顯示，各泳道的條帶均符合預期，即5、6、7、8號白斑均為成功構(gòu)建的含有硫氧還蛋白基因的T載體克隆。將5、6、7、8號白斑的PCR產(chǎn)物及步驟一的產(chǎn)物目標片段送生工生物工程(上海)有限公司分別進行雙向全測序，對測序結(jié)果進行分析可知，步驟一的產(chǎn)物目標片段的測序結(jié)果為SEQ ID NO: 12，5號白斑的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果為SEQ ID NO: 13，6、7、8號白斑的PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果與5號白斑完全相同。經(jīng)比對，發(fā)現(xiàn)SEQ ID NO: 11能夠與SEQ ID NO: 12中的序列100%比對上，進一步證明了第三具體實施例中的實驗組和對照組均能用于成功 構(gòu)建實現(xiàn)含有硫氧還蛋白基因的T載體克隆。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
權利要求
1.一種混合酶，其特征在于，包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。
2.根據(jù)權利要求I所述的混合酶，其特征在于，所述末端轉(zhuǎn)移酶為野生型末端轉(zhuǎn)移酶或重組型末端轉(zhuǎn)移酶。
3.根據(jù)權利要求2所述的混合酶，其特征在于，所述重組型末端轉(zhuǎn)移酶為牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶；所述牛截短型末端轉(zhuǎn)移酶與牛野生型末端轉(zhuǎn)移酶相比，其N端被截去100至160個氨基酸。
4.根據(jù)權利要求I所述的混合酶，其特征在于，所述平末端限制性內(nèi)切酶為AfeI、Ale I、Alu I、BmgB I、BsaB I、BsrB I、BstU I、BstZ17 I、Cac8 I > CviKI-I > Dpn I、Dra I、Eco53K I、EcoR V、EcoRV-HFTM、Fsp I、Hae III、Hinc II、Hpa I、HpyCH4 V、Mly I、Msc I > Msl I、MspAl I、Nae I > Nla IV> Nru I、Pho I、Pme I、Pml I、PshA I、Psi I、Pvu IKPvu II -HFTM、Rsa I、Sca I、Sca I _HFTM、Sfo I、Sma I ,SnaB I、Ssp I、Ssp I -HF、Stu I、Swa I、Xmn I 和 Zra I 中的至少一種。
5.根據(jù)權利要求I至4中任一項所述的混合酶，其特征在于，還包括末端轉(zhuǎn)移酶作用因子I。
6.一種酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括混合酶；所述混合酶包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。
7.根據(jù)權利要求6所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括反應緩沖液，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。
8.根據(jù)權利要求6所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述混合酶還包括末端轉(zhuǎn)移酶作用因子I。
9.根據(jù)權利要求6至8中任一項所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括氯化鈷溶液。
10.根據(jù)權利要求6至8中任一項所述的酶切修飾試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括修飾物，所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物。
11.一種構(gòu)建載體的方法，其特征在于，包括以下步驟 A.利用混合酶和修飾物，在第一酶切修飾體系中對前體核酸分子進行酶切和修飾，得到3’端含有突出末端的載體； 所述前體核酸分子為含有至少一個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈核酸分子； 所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物； 所述混合酶包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。
12.根據(jù)權利要求11所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，所述第一酶切修飾體系包括反應緩沖液，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。
13.根據(jù)權利要求11所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，所述修飾物為雙脫氧核糖核苷酸。
14.根據(jù)權利要求13所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，所述修飾物為雙脫氧胸腺嘧啶核糖核苷酸。
15.根據(jù)權利要求11至14中任一項所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，還包括以下步驟 B.將3’端含有突出末端的靶核酸片段與步驟A的產(chǎn)物連接，得到含有靶核酸片段的重組載體； 所述靶核酸片段的3’端的突出末端與步驟A的產(chǎn)物的3’端的突出末端互補。
16.根據(jù)權利要求15所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，步驟B所述靶核酸片段的3’突出末端為脫氧腺嘌呤核糖核苷酸。
17.根據(jù)權利要求11至14中任一項所述的混合酶構(gòu)建載體的方法，其特征在于，所述前體核酸分子為 pUC57、pUC19、pUC18、pBR322、pBluescript II KS (-)、pBluescript IIKS ( + )、pBluescript II SK (-)、pBluescript II SK ( + )、pTZ57R、pACYC184、pTZ19R 中的任ー種。
18.一種構(gòu)建載體的方法，其特征在于，包括以下步驟 A.利用混合酶和修飾物，在第二酶切修飾體系中對目標片段進行酶切和修飾，得到3’端含單堿基突出末端的酶切產(chǎn)物； B.將3’端含有單堿基突出末端的酶切產(chǎn)物與3’端含有單堿基突出末端的載體連接環(huán)化，得到含有目標片段的載體； 所述目標片段為含有至少ー個平末端限制性內(nèi)切酶識別位點的雙鏈DNA分子； 所述修飾物為脫氧核苷酸、雙脫氧核苷酸、帶標記的脫氧核苷酸、帶標記的雙脫氧核苷酸、脫氧核苷酸類似物或雙脫氧核苷酸類似物； 所述混合酶包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。
19.根據(jù)權利要求18所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，所述修飾物為雙脫氧腺嘌呤核糖核苷酸，所述3’端含有單堿基突出末端的載體為T載體。
20.根據(jù)權利要求18或19所述的構(gòu)建載體的方法，其特征在于，所述第二酶切修飾體系包括反應緩沖液，所述反應緩沖液為在25°C條件下pH值在7至8之間的含有Tris-醋酸、醋酸鉀、醋酸鎂的水溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領域，更具體地說，涉及一種混合酶、酶切修飾試劑盒及構(gòu)建載體的方法。本發(fā)明提供了一種混合酶，包括末端轉(zhuǎn)移酶和平末端限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明還提供了含有該混合酶的酶切修飾試劑盒，以及基于該混合酶構(gòu)建載體的方法。利用本發(fā)明的混合酶、酶切修飾試劑盒能同時實現(xiàn)對底物的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，簡化實驗步驟，提高實驗效率，并進一步降低對底物的需求量，本發(fā)明構(gòu)建載體的方法能夠?qū)崿F(xiàn)對底物的酶切和酶切產(chǎn)物3’羥基端的延伸，簡化實驗步驟，提高實驗效率，并能進一步降低對底物的需求量。
文檔編號C12N15/64GK102676469SQ20121015164
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月16日 優(yōu)先權日2012年5月16日
發(fā)明者盛司潼 申請人:盛司潼