專利名稱：評估和治療癌癥的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及基于分子標記檢測和或基因表達分析來診斷、預測和治療癌癥。
背景技術：
一些與癌癥有關的分子，如Ras，必須被法尼基轉(zhuǎn)移酶法尼基化從而與細胞質(zhì)膜的內(nèi)小葉相互作用，并從而涉及各種信號通路。然而，Ras不是唯一具有異戊二烯化的CAAX盒的與癌癥有關的蛋白。法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)是抑制碳法尼基部分與各種蛋白的C-末端CAAX基序共價連結(jié)的治療劑。其在治療癌癥和增殖疾病如血液惡性腫瘤中具有作用。血液惡性腫瘤如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤(例如急性骨髓白血??；AML)都屬于經(jīng)FITs治療可獲得最佳效果的疾病。實體瘤如乳腺癌和惡性膠質(zhì)瘤也可以采用FTI治療。
在許多治療方案中的事實是，一些病人對FTI治療發(fā)生應答而另一些則不發(fā)生。對不太可能發(fā)生應答的病人給予該治療是不合乎需要的。因此，在給藥前就預知病人對這種治療將如何應答是十分有用的，從而無應答者將不必接受治療，同時那些具有最大可能從藥物中受益的病人將接受正確的治療和監(jiān)測。此外，在那些對治療有應答的病人中也存在各種程度的應答。采用除了FTI以外的治療劑治療或采用治療劑和FTI來治療可能對那些對FTI無應答或?qū)为毷褂肍TI應答不理想的病人有益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為一種采用FTI治療癌癥病人的方法。在一種這類方法中，分子標記的存在與否是該病人是否有可能對FTI產(chǎn)生應答的決定因素。如果病人有可能產(chǎn)生應答，則用FTI治療該病人。如果病人不太可能對FTI的治療產(chǎn)生應答，則放棄該治療。在本發(fā)明的一方面，獲得預測FTI應答的一組基因的基因表達分布型。在本發(fā)明的另一方面，分子標記的出現(xiàn)和基因表達分布型將聯(lián)合用于確定對FTI治療應答的可能性。在本發(fā)明的又一方面，表達分布型與白血病胚細胞計數(shù)和/或白血病細胞抗原表達被聯(lián)合使用來確定對FTI治療應答的可能性。在本發(fā)明的還一方面，用于檢測的樣品獲自骨髓。
在本發(fā)明的另一方面，對癌癥病人進行FTI治療的監(jiān)測，其中分析病人的基因表達分布型和/或分子標記的存在從而確定該病人是否對FTI產(chǎn)生應答，并且如果其有可能以一種理想的方式應答，則采用FTI治療該病人。
在本發(fā)明的又一方面，如果基因表達分布型顯示對一個或多個指示FTI應答的特定基因具有調(diào)節(jié)作用則對病人進行治療。
在本發(fā)明的還一方面，如果基因表達分布型顯示對一個或多個指示FTI應答的特定基因具有調(diào)節(jié)作用，和0-60％的骨髓胚細胞計數(shù)，或存在少于60％的呈CD33細胞表面抗原陽性表達的細胞和/或出現(xiàn)少于10％的呈CD34細胞表面抗原陽性表達的細胞，則對病人進行治療。
在本發(fā)明的又一方面，分子標記是如下的一個或多個lbc致癌基因、AHR、DKFZp667G2110、IDS、GPR105、TEM6、TNFSF13、SVIL、KIAA0680、FRAG1、DKFZp566B213、KIAA1036、BTG3、MAPK8IP3、ARHH、NPTX2。該標記還可以是OPN3和/或IL3RA與上述的一個或多個的組合。
在本發(fā)明的另一方面，F(xiàn)TI為喹啉或喹啉衍生物。
在本發(fā)明的另一方面，F(xiàn)TI為(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
實施該方法中用到的制品也是本發(fā)明的一個方面。這些制品包括基因表達分布型或其表示物。該表示物可被固定于計算機可讀介質(zhì)上。根據(jù)本發(fā)明的其他制品包括用于確定本發(fā)明基因表達分布型的核酸陣列和實施其他核酸檢測技術的裝置和元件。
試劑盒也是本發(fā)明的一個方面。這種試劑盒包括用于對基因表達和/或從對FTI治療無應答者中區(qū)分應答者的分子標記的存在進行檢測的試劑。該試劑盒可包括使用說明書。
在本發(fā)明的另一方面，治療癌癥病人的方法包括進行FTI和調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路、TGFβ、WNT、Rho或細胞程序死亡途徑的治療組合物的給藥。
在本發(fā)明的另一方面，采用FTI和治療組合物治療病人，該治療組合物選自酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、細胞程序死亡調(diào)節(jié)劑及其組合。
在本發(fā)明的另一方面，分析基因表達分布型和/或病人的分子標記的存在或缺失從而確定病人是否有可能得益于FTI和另一藥物的組合。隨后采用這種組合來治療該病人，或如果病人不可能對FTI產(chǎn)生應答，則采用如選自酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、細胞程序死亡調(diào)節(jié)劑及其組合的另一種藥物來治療該病人。
在本發(fā)明的另一方面，分析病人的基因表達分布型和/或分子標記的存在從而確定病人是否有可能得益于FTI和另一治療形式的組合。隨后采用這種組合治療，或如果病人不太可能對FTI產(chǎn)生應答，則采用另一種不包括FTI的治療方法來治療該病人。
附圖簡述

圖1為對具有高和低CD33抗原表達的病人進行的Kaplan-Meier分析的圖解描述。
圖2為對具有高和低胚細胞計數(shù)的病人進行的Kaplan-Meier分析的圖解描述。
圖3A為對采用臨床應答分類的病人進行Kaplan-Meier存活分析的圖解描述。
圖3B為對采用致癌LBC基因表達分類病人的病人進行的Kaplan-Meier存活分析的圖解描述。
圖3C為對采用致癌LBC基因和AHR基因表達分類病人的病人進行的Kaplan-Meier存活分析的圖解描述。
詳細描述本說明書所指的治療劑是FTI。它們表現(xiàn)為多種形式，但其共同具有阻礙或減輕與癌癥和增殖疾病有關的蛋白質(zhì)的法尼基化的基本抑制功能。FTI優(yōu)選地顯示為用于治療實體瘤，如惡性膠質(zhì)瘤和乳腺癌。更優(yōu)選地，F(xiàn)TI顯示為用于治療血液惡性腫瘤，如白血病、淋巴瘤和骨髓瘤。最優(yōu)選地，F(xiàn)TI被計劃用于AML、脊髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)、慢性骨髓白血病(CML)、慢性骨髓單核細胞白血病(CMML)和多重骨髓瘤(MM)。在血液惡性腫瘤的情況中，對FTI應答的病人是其中在FTI治療后在骨髓中觀察到胚細胞減少多于50％的個體。在實體瘤中，對FTI應答的病人是其中腫瘤停止生長的個體。在患有實體瘤的病人中的應答備選地，可根據(jù)RECIST(實體瘤中的應答評價標準)標準來測量，因為這些術語在腫瘤學中普遍使用。
多種FTI都在本發(fā)明范圍內(nèi)，并且包括在美國專利中所描述的Brown等人的5,976,851；Anthony等人的5,972,984；deSolms的5,972,966；Dinsmore等人的5,968,965；Venet等人的5,968,952；Venet等人的6,187,786；Venet等人的6,169,096；Venet等人的6,037,350；Angibaud等人的6,177,432；Graham等人的5,965,578；Sebti等人的5,965,539；Afonso等人的5,958,939；Anthony等人的5,939,557；Commercon等人的5,936,097；Anthony等人的5,891,889；Baudin等人的5,889,053；Anthony的5,880,140；deSolms的5,872,135；deSolms的5,869,682；Baudoin的5,861,529；Graham等人的5,859,015；Clerc的5,856,439；Anthony等人的5,856,326；Graham等人的5,852,010；Marsters等人的5,843,941；Doll的5,807,852；Dinsmore等人的5,780,492；Dong等人的5,773,455；Kim等人的5,767,274；Anthony等人的5,756,528；Baudoin等人的5,750,567；Bishop等人的5,721,236；Doll等人的5,700,806；Anthony等人的5,661,161；Sebti等人的5,602,098；Breslin等人的5,585,359；Ciccarone等人的5,57,8629；Ciccarone等人的5,534,537；Marsters等人的5,532,359；Patel等人的5,523,430；deSolms等人的5,504,212；deSolms等人的5,491,164；Brown等人的5,420,245；和Graham等人的5,238,922。其中的每一篇都在此通過參考文獻并入。非肽的，稱為“小分子”的治療劑是優(yōu)選的。更優(yōu)選FTI是喹啉或喹啉衍生物，例如7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮，7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮，8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮，和8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-氯苯基)-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹啉-5-酮。
最優(yōu)選的FTI為(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮，其在Venet等人的美國專利6,420,387中作為(+)對映體而被描述。
另一優(yōu)選的FTI為(-)-5-(3-氯苯基)-α-(4-氯苯基)-α-(1-甲基-1H-咪唑-5-基)四唑并[1，5-a]喹唑啉-7-甲胺和其藥學上可接受的酸加鹽，其記載于WO01/98302中。
其他有用的FTI包括記載于WO-98/28303中的Arglabin(即1(R)-10-環(huán)氧基-5(S)，7(S)-愈創(chuàng)木脂-3(4)，11(13)-二烯-6，12-交酯)；記載于WO-99/45912中的perrilyl醇；記載于美國專利No.5874442中的SCH-66336，即(+)-(R)-4-[2-[4-(3，10-二溴-8-氯-5，6-二氫-11H-苯并[5，6]環(huán)庚并[1，2-b]吡啶-11-基)哌啶-1-基]-2-氧乙基]哌啶-1-甲酰胺；記載于WO-00/01691中的L778123，即1-(3-氯苯基)-4-[1-(4-氰芐基)-5-咪唑基甲基]-2-哌嗪酮；記載于WO-94/10138中的化合物2(S)-[2(S)-[2(R)-氨基-3-巰基]丙氨基-3(S)-甲基]-戊氧基-3-苯基丙?；?甲硫氨酸砜；以及記載于WO 97/30992中的BMS 214662，即(R)-2，3，4，5-四氫-1-(1H-咪唑-4-基甲基)-3-(苯甲基)-4-(2-噻吩基磺酸基)-1H-1，4-苯并二氮雜-7-腈；記載于美國專利5,747,498中的CP 609754，即N-(3-乙炔基苯基)-6，7-雙(2-甲氧基乙氧基)-4-喹唑啉胺；和記載于WO-00/12499中的6-[氨基-(4-氯苯基)-(3-甲基-3H-咪唑-4-基)-甲基]-4-(3-乙炔基苯基)-1-甲基-1H-喹啉-2-酮 基因組內(nèi)僅存在潛在表達蛋白質(zhì)或肽的核酸序列(“基因”)不能決定蛋白質(zhì)或肽是否就在給定的細胞中表達。給定的基因是否能夠表達蛋白質(zhì)或肽或轉(zhuǎn)錄成RNA，以及，如果存在這種表達或轉(zhuǎn)錄，它在什么程度上發(fā)生，由多種復雜的因素決定。然而，分析基因表達可提供有關對給定的刺激，如導入藥物或其他治療劑的細胞應答的有用信息。可在這種基因表達的分布型中發(fā)現(xiàn)基因活化或失活的程度的相關指示。在一些例子中，分子標記的存在也可以通過其本身或通過使用基因表達信息，提供關于治療效率的有用信息。使用本發(fā)明的基因表達分布型和分子標記來鑒定和治療有可能從FTI治療中受益的病人，或從FTI治療中排除有可能對藥物和治療產(chǎn)生很少或無效應答的病人。
癌癥，包括血液惡性腫瘤，一般由多種基因的突變引起。相同類型的癌癥可以是由不同于另一患有相同類型癌癥的病人的一種或多種突變引起的，或與一種或多種突變同時發(fā)生而引起的。相同類型的癌癥通常具有多重分子基礎的事實與觀察到的對一位病人有效的一些治療并不一定對另一患有相同類型癌癥的病人有相等效果的現(xiàn)象相一致。此外，從診斷的角度而言，特定突變的出現(xiàn)，如易位，缺失或SNP可具有重要的含義。在一些例子中，這種分子標記其本身是有用的診斷、預后或治療應答確定的指示劑。分子突變可與特定治療的應答相關是特定的事實。在本發(fā)明中，與缺失lbc致癌基因(淋巴胚細胞關鍵致癌基因)巧合的癌癥對FTI治療產(chǎn)生應答。因此，該基因的表達、該基因表達的缺乏存在或及其缺失在實際給予這種治療前對預測FTI治療的抗藥性十分有用。
lbc致癌基因(Seq.ID No.2)是衍生于位于染色體15q上的lbc原一致癌基因(Seq.ID No.23-27)與起源于染色體7q的無關序列融合的嵌合體。原一致癌基因在C-末端序列的截短導致該基因獲得轉(zhuǎn)化能力。該截短也可由除了易位外的其他機制引起。例如，異常剪接可導致具有C-末端截短的RNA轉(zhuǎn)錄本。該基因具有許多包括mRNA和蛋白質(zhì)(Seq.ID No.29人LBC蛋白，基因庫登記號GI29791897)在內(nèi)的表達產(chǎn)物。雖然lbc致癌基因作用的確切方式還不完全了解，但十分明確的是，其可出現(xiàn)在包括骨骼肌、心臟、肺、前列腺、卵巢、小腸和造血細胞的組織范圍內(nèi)。對起源于其中致癌基因可顯現(xiàn)的(但不是)組織中的癌癥的治療是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。
在格式化本發(fā)明的測定方面有很大的靈活適用性，因為基因是截短的產(chǎn)物，且因為其產(chǎn)生了可識別的表達產(chǎn)物。不僅可使用基因的缺失或其產(chǎn)物，還可以檢測該基因的調(diào)節(jié)表達。因此，基因表達分布型可包括該基因。優(yōu)選的，使用基因的缺失和調(diào)節(jié)作為血液惡性腫瘤，更優(yōu)選在白血病中，最優(yōu)選在AML中中FTI治療應答的指示劑。
在采用lbc致癌基因作為分子標記的鑒定中，也可使用任何合適的檢測方法。分子標記的存在指示對FTI治療產(chǎn)生差的預后，同時其缺失指示了對這種治療產(chǎn)生應答的更大可能性。用于檢測lbc致癌基因存在的有用方法包括用于檢測已知突變基因或序列的任何方法，包括，但不限于單鏈構(gòu)象多形性技術、化學和熱變性梯度分析、化學和酶切方法、質(zhì)譜分析法、RFLP和等位基因特異性擴增、比率制PCR，基于小珠的和基于微陣列的系統(tǒng)以及原位雜交、異源雙鏈分析和微陣列分析、ELIS、Awestem、FACS、基于抗體的技術、基于甲基化的PCR和SNP檢測。
檢測lbc致癌基因的存在或缺失的最優(yōu)選方法是通過PCR。在該方法中，首先根據(jù)常規(guī)的樣品制備方法從病人獲取細胞。當惡性腫瘤是血液腫瘤時，優(yōu)選單外周血樣品或骨髓樣品。然后根據(jù)廣泛接受的程序提取RNA并如下擴增。靶序列采用例如，250nM的引物和250nM于ABI Taqman緩沖液中的Taqman探針進行擴增。熱循環(huán)如下進行50℃2分鐘，95℃ 10分鐘，隨后50個95℃15分鐘和62℃1分鐘的循環(huán)。
引物和探針的實例如表1中所示。
該技術測量了樣品中存在的LBC轉(zhuǎn)錄本的量。測量的數(shù)量可通過進行相似的RT-PCR實驗標準化，其中使用同一樣品擴增內(nèi)源對照基因，如HPRT。
表1名稱 序列(5’-3’)LBC正向 GGTCAGATGTTTGCCAAGGAALBC反向 TCTTCAGAAACACACTCCCATCACLBC TaqMan探針 TGAAACGGAAGAAGCTTGTA另一種確定lbc致癌基因存在或缺失的方法是檢測RNA轉(zhuǎn)錄本的長度。由于LBC致癌基因具有3’易位，因此其轉(zhuǎn)錄本的長度短于LBC原一致癌基因轉(zhuǎn)錄本。該末端點有利于診斷。為了診斷轉(zhuǎn)錄本的大小，聯(lián)合使用與原癌一和致癌LBC轉(zhuǎn)錄本都同源的正向引物(例如，上表1中的LBC正向引物)和與RNA轉(zhuǎn)錄本的通用poly A尾同源的反向引物。優(yōu)選在起始的cDNA合成中加入附加的polyA序列的3’獨特序列標簽從而賦予PCR反應附加的特異性。
如果已測量了基因組易位，則可采用標準技術和特異用于lbc致癌基因的PCR引物分離將基因組DNA。例如，與致癌-和原癌-LBC基因都同源的正向引物可以與上文所述的polyA序列聯(lián)合使用。備選地，反向引物可與3’易位序列同源。讀框?qū)閿U增子的大小，其中致癌基因的存在與短于原致癌基因的產(chǎn)物相一致，或與致癌LBC-特異性擴增子的存在或缺失相一致。
可采用如免疫組織化學分析(IHC)的技術測定細胞的lbc致癌基因的狀況來確定正常/異常組織的分布以達到診斷的目的。例如，lbc蛋白的抗體可與制備出來用于免疫組織化學(IHC)研究的新鮮冰凍的和甲醛固定、石蠟包埋的組織塊聯(lián)合使用。每一組織塊可由50mg殘留的“粉碎”的腫瘤組成。
簡而言之，冷凍切片可通過下列方法制備在室溫下，在小塑料膠囊中在PBS中水化50ng冰凍粉碎的腫瘤；通過離心使顆粒粒化；將其重懸于粘性包埋介質(zhì)(OCT)中；倒置膠囊并通過離心再次?；辉?70℃的異戊烷中快速冷凍；切開塑料膠囊并移出組織的冷凍圓柱體；將組織圓柱體固定于低溫恒溫顯微切片機的卡盤上；并切成20-50個含有完整腫瘤細胞的連續(xù)切片。
永久切片可通過包括下列步驟的類似方法來制備在塑料微離心管中水化50mg樣品；?；恢貞矣?0％甲醛溶液中固定4小時；洗滌/?；?；重懸于2.5％的溫熱的瓊脂中；?；?；在冰水中冷卻使瓊脂硬化；從試管中移出該組織/瓊脂塊；將該組織塊浸潤和包埋于石蠟中；并切成50個連續(xù)的永久切片。
為了進行免疫組織化學分析，用含有3％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封閉溶液或其他封閉試劑覆蓋切片。封閉試劑包括非特異性的血清或于奶。封閉處理在室溫下持續(xù)1小時。將抗-lbc蛋白的抗體用含有3％BSA、0.1％TRITONX.TM.-100、叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇的PBS溶液，以1∶100的比例稀釋。通常將樣品切片用抗體溶液在4℃下覆蓋16小時。持續(xù)時間和溫度條件可根據(jù)所選擇的抗體和測試的物質(zhì)而變化。最適條件應根據(jù)經(jīng)驗確定。然后將經(jīng)抗體處理的切片在PBS中洗滌3次，每次15分鐘，每次都用于除去未結(jié)合的抗體，并隨后用含有3％BSA和以1∶2000稀釋的第二抗體的PBS溶液覆蓋。第二抗體可與生色酶，例如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、熒光素異硫氰酸鹽或其他合適的酶偶聯(lián)。備選地，第二抗體可與生物素軛合并與生色團標記的抗生物素蛋白聯(lián)合使用。
另一檢測lbc致癌基因存在的示例性方法是通過原位雜交。一般地，原位雜交包括如下主要步驟(1)固定待分析的組織或生物結(jié)構(gòu)；(2)預雜交處理生物結(jié)構(gòu)以增加目標DNA的可及性，并減少非特異性結(jié)合；(3)將核酸混合物與生物結(jié)構(gòu)或組織中的核酸雜交；(4)雜交后洗滌以除去雜交中未結(jié)合的核酸片段和(5)檢測雜交的核酸片段。每一個這些步騾中使用的試劑和條件根據(jù)特定的應用而變化。
在本情況下，將包括至少一種能與lbc致癌基因雜交(在其染色體基因座)的可檢測核酸探針的雜交溶液與細胞在雜交條件下接觸。然后檢測任何的雜交并將其與來源于正?；?qū)φ占毎念A先確定的雜交模式相比較。優(yōu)選的，探針為α-著絲點的探針。這種探針可從許多來源商業(yè)化購得(例如，從Visys Inc.，Downers Grove，IL)。在一優(yōu)選的實施方案中，雜交溶液含有多重探針，其特異于與組成嵌合體的序列易位相應的染色體上的區(qū)域(例如，15q24-25)。
適用于本發(fā)明方法的雜交方法記載于例如，Albertson(1984)EMBOJ.31227-1234；Pinkel(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.美國859138-9142；EPO Pub.No.430，420；分子生物學方法，33卷原位雜交技術方法，Choo，ed.，Humana Press，Totowa，N.J.(1994)，等。在一特定優(yōu)選的實施方案中，采用了Pinkel等人(1998)自然遺傳學20207-211或Kallioniemi(1992)Proc.Natl Acad Sci美國895321-5325(1992)中的雜交方法。優(yōu)化雜交條件的方法是公知的(參見，例如，Tijssen(1993)生物化學和分子生物學實驗室技術，Vol.24采用核酸探針雜交，Elsevier，紐約)。
在優(yōu)選的實施方案中，背景信號是通過在雜交過程中采用去垢劑(例如，C-TAB)或封閉試劑(例如，精子DNA，cot-1 DNA等)減少非特異性雜交而降低的。在特別優(yōu)選的實施方案中，雜交在存在大約0.1至大約0.5mg/ml DNA(例如，cot-1 DNA)的條件下進行。
探針可采用本領域已知的任何方法，包括合成或在生物宿主中生長的方法來制備。合成的方法包括寡核苷酸合成、核糖探針和PCR。
探針可通過本領域已知的任何方法用可檢測的標記物來進行標記。標記探針的方法包括隨機引物法、末端標記法、PCR和缺口平移法。酶標記是在存在核酸聚合酶、3種未標記的核苷酸和第四種核苷酸時進行，其中該第四種核苷酸既可是直接標記的，含有用于附著標記的連接臂，又可附著于可能結(jié)合標記的結(jié)合分子的半抗原或其他分子上。合適的直接標記包括放射性標記如32P、3H和35S，以及非放射性標記例如熒光標記，如熒光素、德克薩斯紅、AMCA藍、熒光黃、羅丹明等；可用可見光檢測的花青染料；酶及其類似物。標記還可以通過重硫酸鹽介導的氨基轉(zhuǎn)移或直接在寡核苷酸合成過程中以化學的方式摻入DNA探針。
熒光標記可很容易地附著于具有已被摻入探針的活化連接臂的核苷酸上。探針可采用上述公開的方法通過摻入與半抗原或如生物素或地高辛的其他分子共價連接的核酸而非直接標記，并與靶向半抗原或其他分子的標記的抗體進行雜交，或在生物素的情況下與跟可檢測的標記軛合的抗生物蛋白進行三明治雜交?？贵w和抗生物素蛋白可與熒光標記或如堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶的酶標記軛合以使其可被檢測。軛合的抗生物素蛋白和抗體可以從公司如VetorLaboratories(Burlingame，Calif.)和Boehringer Mannheim(Indianapolis，Ind.)商業(yè)化購買。
酶可通過提供酶的底物，經(jīng)比色反應而進行檢測。在存在多種底物時，反應產(chǎn)生不同的顏色，而這些顏色是可見的用于分別檢測多重探針。可使用本領域已知的任何底物。堿性磷酸酶的優(yōu)選底物包括5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸(BCIP)和硝基藍四氮唑(NBT)。辣根過氧化物酶的優(yōu)選底物為二氨基苯甲酸鹽(DAB)。
適合用于本發(fā)明的原位雜交方法的熒光標記探針優(yōu)選在150-500核苷酸的長度范圍內(nèi)。探針可以是DNA或RNA，優(yōu)選DNA。
檢測探針與細胞的雜交在0.1-500ng/.mu.l，優(yōu)選5-250ng/.mu.l的探針濃度下進行。雜交混合物優(yōu)選含有變性劑如甲酰胺。一般地，雜交在25℃-45℃下進行，更優(yōu)選在32℃-40℃，以及最優(yōu)選在37℃-38℃下進行。雜交所需的時間為0.25-96小時，更優(yōu)選1-72小時，以及最優(yōu)選4-24小時。雜交時間根據(jù)探針濃度和可含有的如hnRNP結(jié)合蛋白、三烷基銨鹽、內(nèi)酰胺等加速劑的雜交溶液內(nèi)含物而變化。然后將玻片用含有如甲酰胺的變性劑和濃度日益降低的氯化鈉溶液或在可除去未結(jié)合和錯配探針的任何溶液中洗滌。
鹽的溫度和濃度根據(jù)所需的雜交嚴謹度而變化。例如，高嚴謹?shù)南礈炜稍?2℃-68℃下進行，而中等嚴謹可在37℃-55℃的范圍內(nèi)進行，以及低嚴謹可在30℃-37℃的范圍內(nèi)進行。高嚴謹洗滌的鹽濃度為0.5-1倍的SSC(0.15M NaCl，0.015M檸檬酸鈉)，而中等嚴謹可以為1-4倍，以及低嚴謹可以是2-6倍的SSC。
如果需要檢測培養(yǎng)步驟，應優(yōu)選在濕潤的箱內(nèi)于23℃-42℃進行，更優(yōu)選在25℃-38℃，以及最優(yōu)選在37℃-38℃進行。標記試劑應優(yōu)選用含有封閉試劑，如牛血清白蛋白、脫脂干奶等的溶液稀釋。稀釋度可在1∶10-1∶10,000的范圍內(nèi)，更優(yōu)選為1∶50-1∶5,000，以及最優(yōu)選為1∶100-1∶1,000。玻片或其他固體支持物應當在每一培養(yǎng)步驟之間洗滌以除去多余的試劑。
然后將切片制成標本并當采用可見的檢測標記時，用顯微鏡分析，或當采用放射性標記時，將其暴露于放射自顯影膠片下。當采用熒光標記時，切片優(yōu)選在含有抗衰變劑的溶液中制成標本，并用熒光顯微鏡分析?？蓹z測多種核以提高檢測的準確度。
此外，lbc致癌基因表達產(chǎn)物的分析也可用于確定lbc致癌基因是否發(fā)生突變。最優(yōu)選，這種分析為免疫測定。免疫測定，在其最簡單和直接的意義上來說，是結(jié)合測定。某些優(yōu)選的免疫測定為本領域已知的各種類型的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISAs)和放射性免疫測定(RIA)。采用組織切片的免疫組織化學檢測也特別有效。
在一示例性的ELISA中，抗致癌lbc蛋白-特異性抗體被固定于具有蛋白親和力的所選擇的表面上，如聚苯乙烯微量滴定板上的孔。然后，一含有如臨床樣本的所需抗原的測試組分被加入孔中。在結(jié)合和洗滌以除去非特異性結(jié)合的免疫復合物后，可檢測結(jié)合的抗原。檢測通常通過添加另一種特異于所需抗原，并與檢測標記相連的抗體來實現(xiàn)。這種類型的ELISA是簡單的“三明治ELISA”。檢測還可以通過加入特異于所需抗原的第二抗體，并隨后加入對第二抗體具有結(jié)合親和力且與可檢測標記相連的第三抗體而實現(xiàn)。
ELISA技術的變化是公知的。在一種這樣的變化中，含有所需抗原的樣品被固定于孔的表面并隨后與本發(fā)明的抗體接觸。在結(jié)合以及適當?shù)南礈旌?，檢測結(jié)合的免疫復合物。其中起始抗原的特異性抗體與檢測標記相連，該免疫復合物可直接檢測。另外，免疫復合物可使用對第一抗原的特異抗體具有結(jié)合親和力且與檢測標記相連的第二抗體來檢測。
競爭性ELISA也是可能的，其中測試樣品與已知量的標記抗原或抗體競爭性結(jié)合。未知樣品中反應物質(zhì)的量通過在與覆蓋孔孵育之前或過程中將樣品與已知的標記物質(zhì)混合來確定。樣品中反應物質(zhì)的存在將減少適于結(jié)合到孔上的標記物質(zhì)的量并因此降低了最終的信號。
抗原或抗體也可以與固體支持物相連，如與板、小珠、浸潤條、薄膜或柱狀基質(zhì)的形式的支持物相連，而待分析的樣品被加入到固定的抗原或抗體上。在采用抗原或抗體覆蓋平板時，一般地將采用抗原或抗體的溶液來孵育平板上的孔，孵育過夜或特定的時間段。然后洗滌平板上的孔以除去不完全吸附的物質(zhì)。隨后任何孔上剩下的可用表面用能與測試抗血清發(fā)生抗原中和的非特異性蛋白“覆蓋”。這些包括牛血清白蛋白(BSA)、酪蛋白和奶粉溶液。所述的覆蓋允許封閉固定化表面上的非特異性吸附位點，并因此減少由于抗血清對表面的非特異性結(jié)合而造成的背景。
在ELISA中，除了直接法外，習慣采用第二或第三檢測途徑。因此，在抗原或抗體結(jié)合到孔上后，其中采用非反應性物質(zhì)覆蓋孔從而減少背景，并洗滌以除去未結(jié)合的物質(zhì)，固定化的表面在有利于允許免疫復合物(抗原/抗體)產(chǎn)生的條件下與待檢測的臨床或生物樣品接觸。這可包括用溶液如BSA、牛丙種球蛋白(BGG)和磷酸緩沖鹽水溶液(PBS)/Tween來稀釋抗原和抗體。這些加入的試劑也傾向于幫助非特異性背景的降低。然后免疫復合物的檢測需要標記的第二結(jié)合配體或抗體，或與標記的第三抗體或第三結(jié)合配體相連的第二結(jié)合配體或抗體。
在ELISA中的所有孵育步驟后，洗滌接觸的表面以除去非復合的物質(zhì)。洗滌通常包括采用PBS/Tween溶液或硼酸鹽緩沖液洗滌。在測試樣品和原始結(jié)合物質(zhì)之間形成特異的免疫復合物后，就隨之進行洗滌，即使出現(xiàn)微量的免疫復合物也可檢測到。
為了提供檢測途徑，第二或第三抗體具有相關的際記以用于檢測。優(yōu)選的，這可以是與合適的生色底物孵育能發(fā)生顯色的酶。因此，例如，理想地可以采用與脲酶、葡萄糖氧化酶、堿性磷酸酶或過氧化氫酶綴合的抗體與第一或第二免疫復合物接觸和培養(yǎng)一段時間，并在有利于進一步形成免疫復合物的條件下進行，例如，于室溫下，在含有PBS的溶液如PBS-Tween中培養(yǎng)2小時。
用標記的抗體孵育后，并隨后洗滌除去未結(jié)合的物質(zhì)后，定量標記的量，例如，在過氧化物酶作為酶標記的情況下，與生色底物如尿素和溴甲酚紅紫和H2O2一起孵育。然后通過測定顏色產(chǎn)生的程度來達到定量的目的，例如，采用可見光譜分光光度計。備選地，標記可以是化學發(fā)光物質(zhì)。這種標記的使用記載于美國專利Nos.5,310,687，5,238,808和5,221,605中。
在本發(fā)明的實施方案中，檢測基因表達以確定對FTI的應答，采用基因表達庫是最優(yōu)選的?；驇鞛槌山M的基因集合，以便于從其獲得表達的信息，為作出例如診斷、預后或治療選擇的臨床相關判斷提供基礎。在該情況下，可形成基因表達庫從而有助于作出關于將FTI應用于癌癥病人的治療決定。
最優(yōu)選地，將lbc致癌基因的表達作為基因表達分布型的一部分來檢測，其中一個或多個基因的差異表達表示對FTI治療的應答的可能性。在本發(fā)明的這一方面，基因表達分布型由lbc致癌基因(也稱為AKAP13)組成。也可使用如下基因中的一個或多個，最優(yōu)選，與lbc致癌基因組合 AHR、DKFZp667G2110、IDS、OPN3、GPR105、TEM6、TNFSF13、SVIL、IL3RA、KIAA0680、FRAG1、DKFZp566B213、KIAA1036、BTG3、MAPK8IP3、ARHH、NPTX2(Seq ID No.1，3-18)。OPN3和IL3RA與一個或多個其他基因聯(lián)合使用，以及優(yōu)選地，分布型包括兩個或多個任意的基因。最優(yōu)選基因表達分布型檢測lbc致癌基因和AHR的差異表達。前述基因的變異體，例如拼接變異體，也可用在本申請中。
優(yōu)選用于建立基因表達分布型的方法(包括用于達到對相關生物途徑作出解釋的那些)包括確定由可編碼蛋白質(zhì)或肽或轉(zhuǎn)錄成RNA的基因產(chǎn)生的RNA的量。這最好通過逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)、競爭性RT-PCR、實時RT-PCR、差異顯示RT-PCR、RNA印跡分析和其他相關實驗來實現(xiàn)。雖然可以采用單獨的PCR反應來實施這些技術，但通常需要擴增從mRNA產(chǎn)生的DNA拷貝(cDNA)或RNA拷貝(cRNA)并通過微陣列來分析。許多不同的陣列構(gòu)象和其生產(chǎn)方法是本領域的熟練技術人員所公知的，并在美國專利，例如5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734；和5,700,637中有描述；其所公開的內(nèi)容在此通過參考文獻并入。
微陣列技術允許同時測量成千的基因的穩(wěn)定狀態(tài)的mRNA水平，因此為鑒定FTI對細胞生物學的效果和基于這種效果分析的治療的可能效果提供了有力的工具。目前，廣泛使用兩種微陣列技術。第一種是cDNA陣列，第二種是寡核苷酸陣列。雖然這些芯片的結(jié)構(gòu)存在差異，但實質(zhì)上所有的下游數(shù)據(jù)分析和輸出都是相同的。這些分析的產(chǎn)物一般是從用于與微陣列上已知位置的核酸序列雜交的樣品中檢測cDNA序列的標記探針接受到的信號強度的測量值。一般信號的強度與cDNA的量成比例，并因此與樣品細胞中表達的mRNA的量成比例。大量的這類技術是可利用的且是十分有用的。確定基因表達的優(yōu)選方法可見于美國專利Linsley等人的6,271,002；Friend等人的6,218,122；Peck等人的6,218,144；Wang等人的6,004,755，每個專利所公開的內(nèi)容在此引入作為參考。
通過比較這些強度進行表達水平的分析。這最好通過在測試樣品中相對于在對照樣品中形成的基因表達強度的比例矩陣來完成。例如，可將已接受藥物治療的組織中的基因表達強度與未接受藥物治療的相同組織中產(chǎn)生的表達強度相比較。這些表達強度的比例表明了測試和對照樣品間基因表達的倍數(shù)變化。
基因表達分布型也可以許多方式來表現(xiàn)。常用的方法是將比例矩陣排列成圖解統(tǒng)計圖，其中列表示測試樣品而行表示基因。排列數(shù)據(jù)使具有相似表達分布型的基因相互接近。每一基因的表達比例用顏色呈現(xiàn)。例如，小于1的比例(指示下調(diào))可呈現(xiàn)為波譜的藍色部分，而大于1的比例(指示上調(diào))可呈現(xiàn)為波譜紅色部分的顏色。商業(yè)化可購得的計算機軟件程序適用于顯示這些數(shù)據(jù)，包括Silicon Genetics有限公司的“GENESPRINT”，和Partek有限公司的“DISCOVERY”和“INFER”軟件。
差異表達的基因在用FTI治療后的疾病細胞中，或在治療前的應答者與非應答者中上調(diào)或下調(diào)，正如上述基因表達評估所推導的。上調(diào)和下調(diào)是相對的術語，指在基因表達的量中相對于某基線發(fā)現(xiàn)可檢測到的差異(超過用于測量的系統(tǒng)中的噪音的貢獻)。在該情況下，基線為測量的未治療的疾病細胞的基因表達。受治療的疾病細胞中的感興趣的基因相對于采用相同測量方法得到的基線水平是上調(diào)或下調(diào)。優(yōu)選的上調(diào)和下調(diào)的水平是基于雜交微陣列探針強度測量值的倍數(shù)變化而區(qū)分的。優(yōu)選1.5倍的差別用于作出這種區(qū)別判斷。即，在判斷基因在受治療的疾病細胞中與未受治療的細胞中的差異表達之前，發(fā)現(xiàn)受治療的細胞比未受治療的細胞產(chǎn)生至少增加1.5倍或減少1.5倍的強度。在基因表達的測量中更優(yōu)選1.7倍的差異，并且最優(yōu)選2倍或更多倍的差異。
本發(fā)明的一種方法包括比較各種基因的基因表達分布型，從而確定個體是否有可能對治療藥劑的使用產(chǎn)生應答。一旦建立了區(qū)分應答者和非應答者的基因表達分布型，每一基因的表達分布型如下文所述，被固定于如計算機可讀介質(zhì)的介質(zhì)上。獲取含有疾病細胞(例如AML情況下的造血胚細胞)的病人樣品。最優(yōu)選地，樣品為骨髓，并在病人接受藥物治療前，根據(jù)常規(guī)方法從病人胸骨或髂嵴中提取。優(yōu)選的，骨髓吸取物用常規(guī)方法處理以富集白血病胚細胞。然后RNA樣品從患病的病人細胞中提取和擴增，并獲得基因表達分布型，優(yōu)選地(在大基因文庫的情況下)通過微陣列獲得，因為基因在適當?shù)奈膸熘小Ｈ缓髮悠返谋磉_分布型與先前已被確定為應答者和非應答者的樣品相比較。如果樣品的表達模式與FTI應答者的表達模式相一致，則可指示采用FTI治療(不作藥物補償?shù)目紤])。如果樣品的表達模式與FTI非應答者的表達模式相一致，則不指示采用FTI治療。當在文庫中使用少量的基因時，例如使用單個基因，淋巴胚細胞的關鍵致癌基因(致癌LBC，Seq.ID No.2)時，簡單的核酸擴增和檢測方案是測量基因調(diào)節(jié)的最優(yōu)選方法。在這種情況下，PCR、NASBA、滾動循環(huán)LCR和本領域熟練技術人員已知的其他擴增方案可與最優(yōu)選的PCR一起使用。當文庫包括大量的基因或希望測量許多其他基因的表達時，優(yōu)選地基于上述的微陣列的強度測量值來評估表達模式。
在類似的情況下，可進行基因表達分布型分析以監(jiān)測治療的應答。在本方法的一個方面中，如上所述的基因表達分析在用FTI治療的病人的整個治療過程的各個階段進行。如果基因表達模式與應答者一致，則病人的治療繼續(xù)。否則改變治療方式，如添加治療劑如酪氨酸激酶抑制劑、改變劑量或停止FTI治療。這種分析允許在可檢測的臨床標志前或面對另外的模糊的臨床標志時進行干預和治療調(diào)整。
關于本發(fā)明的分子標記，許多其他的方式和手段也適用于診斷應用。基因組區(qū)域的甲基化可影響基因表達的水平。例如，基因啟動子區(qū)域的超甲基化可結(jié)構(gòu)性地下調(diào)基因表達，盡管超甲基化可導致穩(wěn)定狀態(tài)的mRNA水平上升。同樣，與預測藥物反應的基因相關的甲基化區(qū)域的檢測可用作診斷基因表達水平的備選方法。這種方法是本領域的熟練技術人員公知的?？蛇x地，存在于啟動子區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)也可影響基因的轉(zhuǎn)錄活性。因此，通過本領域熟練技術人員已知的方法檢測這些SNPs也可用作檢測基因在應答者和非應答者間差異表達的診斷方法。
對治療前存在的骨髓白血病胚細胞的比例和/或如CD33和/或CD34的細胞表面抗原存在的比例的附加分析也可有利于應答者和非應答者之間的區(qū)分。CD33和CD34表面抗原的低表達表明增加了對FTI治療應答的可能性。這是最方便的測量，因為應答者樣品中表達這類抗原的細胞的百分比約為60％或更少的細胞表達CD33，以及大約15％或更少的細胞表達CD34。表達CD33抗原的這類細胞超過60％或表達CD34抗原的細胞超過15％的百分比表示該病人有可能是FTI治療的非應答者。此外，采用上述方法制備的其中胚細胞的百分比少于60％的樣品有可能對FTI治療產(chǎn)生應答，而胚細胞計數(shù)超過該百分比的樣品則不太可能產(chǎn)生應答。CD33+、CD34+和胚細胞計數(shù)的百分比的確定，可根據(jù)任何已知的方法進行，并且可采用大多數(shù)臨床實驗室的標準病理實驗和制備來最有效地實施。
本發(fā)明的制品是用于治療、診斷、預后、分級和其他評估疾病的基因表達分布型的表示物。優(yōu)選的其歸納為可自動閱讀的介質(zhì)，如計算機可讀介質(zhì)(磁性的、光學的等)。該制品還可包括在這種介質(zhì)中的評估基因表達分布型的指令。例如，該制品可包括具有用于比較上述基因庫的基因表達分布型的計算機指令的CD ROM。該制品還可在其中具有數(shù)字記錄的基因表達分布型，以使得其可與來自病人樣品的基因表達數(shù)據(jù)相比較?？蛇x地，分布型可采用不同的表現(xiàn)格式來記錄。例如整合于上文提到的Partek有限公司的“DISCOVERY”和“INFER”軟件中的聚類算法可最好地幫助這類數(shù)據(jù)的形象化。
根據(jù)本發(fā)明的附加制品是實施上述測定的試劑盒。每種試劑盒優(yōu)選地包括人或機器的可讀形式的使用說明，以及一般用于所述測定類型的試劑。這些可包括，例如，如上所述，設計用于辨別本發(fā)明的基因表達分布型的核酸陣列(例如，cDNA或寡核苷酸陣列)。它們還可含有用于進行核酸擴增和檢測的試劑，包括例如，逆轉(zhuǎn)錄酶、逆轉(zhuǎn)錄酶引物、相應的PCR引物組、熱穩(wěn)定的DNA聚合酶，例如Taq聚合酶，以及合適的檢測試劑，例如但不限于，蝎探針、用于熒光5’核酸測定的探針、分子信標探針、單染色引物或特異于雙鏈DNA的熒光染料，例如溴化乙錠。用于檢測表面抗原的試劑盒含有染色物質(zhì)或根據(jù)抗體的情況包括組分例如，緩沖液、抗抗原的抗體、檢測酶和底物，如以辣根過氧化物酶或生物素-抗生物素蛋白為基礎的試劑。用于檢測胚細胞的試劑盒組分通常包括用于實施流式細胞術、胚細胞粘附測定、和其他通常用于進行胚細胞測定的試劑。
如發(fā)明人于2002年10月30日申請的(序列號10/283975)，名稱為“評估和治療白血病的方法”的待決申請中所描述的，除了優(yōu)選的FTI外，本發(fā)明優(yōu)選的藥物是調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路、TGFβ、WNT或細胞程序死亡途徑的藥物。這些包括但不限于，酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3K激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、細胞程序死亡調(diào)節(jié)劑及其組合。這其中最優(yōu)選的示范性的藥物是Novartis的“GLEEVEC”酪氨酸激酶抑制劑、U-0126 MAP激酶抑制劑、PD-098059 MAP激酶抑制劑、SB-203580 MAP激酶抑制劑、和反義的、核酶和DNA酶、Bcl-XL和抗細胞程序死亡劑。其他有用的藥物的實例包括，但不限于，美國專利6,306,897中的calanolides；美國專利6,284,764中的取代二環(huán)；美國專利6,133,305中的二氫吲哚；和美國專利6,271,210中的反義寡核苷酸。
FTI也可與其他傳統(tǒng)的抗癌劑聯(lián)合使用，例如選自鉑配位化合物如順式鉑氨或碳鉑，紫杉烷化合物如紫杉醇或多西他賽，喜樹堿化合物如伊立替康或拓撲替康，抗腫瘤長春花生物堿如長春花堿、長春新堿或維諾利賓，抗腫瘤核苷衍生物如5-氟尿嘧啶、吉西他濱或卡培他濱，芥子氮或亞硝基脲烷化劑例如環(huán)磷酰胺、苯丁酸氮芥、卡氮芥或羅氮芥，抗腫瘤蒽環(huán)霉素衍生物如柔紅霉素、阿霉素或去甲柔毛霉素；HER2抗體例如司徒曼布；和抗腫瘤鬼臼毒素衍生物例如依托泊苷或替尼泊苷；和抗雌激素藥劑，包括雌激素受體拮抗劑或選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)分子，優(yōu)選三苯氧胺或可選的托米芬、著洛西芬、faslodex和雷洛西芬，或芳香酶抑制劑如依西美坦、阿那曲唑、來曲唑和伏羅唑。
FTI可伴隨照射如上述對病人給藥；這種治療可以特別有效，因為法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑可用作照射敏化劑，例如如國際專利說明書WO 00/01411中所描述的，增強了這種照射的治療效果。照射指電離輻射，并特指伽馬輻射，特別地通過直線加速器或目前常用的放射性核素來發(fā)射。采用放射性核素對腫瘤的照射可以是外部的或內(nèi)部的。
優(yōu)選地，法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的給藥開始于腫瘤放射前的一個月，特別為10天或一周。此外，分部進行腫瘤放射，并在首次和末次放射期之間的間隔中保持法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑的給藥是十分有益的。法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑的量、照射的劑量和照射劑量的間隔將根據(jù)一系列的參數(shù)，如腫瘤的類型、其位置、病人對化學或放射療法的反應來決定，并且最終在每一個案中將由主治醫(yī)師和放射治療師來決定。因此，根據(jù)本發(fā)明方法的癌癥治療還包括，對于患有腫瘤的宿主，在對所述宿主近腫瘤部位給予照射之前、期間或之后，進行根據(jù)本發(fā)明的輻射敏感有效量的法尼基蛋白轉(zhuǎn)移酶抑制劑的給藥。
已注意到，本發(fā)明的藥物可以是靶向基因治療或反義治療或RNA干擾的治療藥劑。序列互補于mRNA序列的寡核苷酸可以被導入細胞以阻斷mRNA的翻譯，從而阻斷編碼mRNA的基因的功能。已有應用寡核苷酸阻斷基因表達的記載，例如，在Strachan和Read，人類分子遺傳學，1996中有記載，在此引入作為參考。
這些反義分子可以是DNA、DNA的穩(wěn)定衍生物如硫代磷酸鹽或甲基膦酸鹽、RNA、RNA的穩(wěn)定衍生物如2’-O-烷基RNA、或其他反義寡核苷酸模擬物。反義分子可通過顯微注射、脂質(zhì)體包裹或通過表達含有反義序列的載體來導入細胞。
在基因治療的情況中，感興趣的基因可被連接至通過感染感受態(tài)宿主細胞而介導治療性的DNA轉(zhuǎn)移的病毒載體中。合適的病毒載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等?？蛇x地，治療性的DNA可通過非病毒技術轉(zhuǎn)移到細胞中以用于基因治療，該非病毒技術包括采用配體-DNA綴合物或腺病毒-配體-DNA綴合物的受體介導的靶向的DNA轉(zhuǎn)移、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染膜融合或直接顯微注射。這些操作及其改變適合于來自體內(nèi)和體內(nèi)的基因治療。適合基因使用的基因治療分子方法學的方案在基因治療方法(Gene Therapy Protocols)，Paul D.Robbins編輯，Human Press，Totawa NJ，1996中有描述。
FTI可用于治療各種類型的癌癥，包括肺癌(例如，腺癌和包括非小細胞肺癌)、胰腺癌(例如胰腺癌，如，例如外分泌胰腺癌)、結(jié)腸癌(例如結(jié)腸癌，如，例如結(jié)腸腺癌和結(jié)腸腺瘤)、包括深度疾病的前列腺癌、淋巴系的血管生成腫瘤(例如急性淋巴細胞白血病、B細胞淋巴瘤、Burkitts淋巴瘤)、骨髓白血病(例如，急性骨髓白血病(AML))、甲狀腺濾泡癌、脊髓發(fā)育不良綜合癥(MDS)、間質(zhì)起源的腫瘤(例如，纖維肉瘤和橫紋肌肉瘤)、黑色素瘤、畸形癌、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、皮膚的良性腫瘤(例如角化棘皮瘤)、乳腺癌(例如深度乳腺癌)、腎癌、卵巢癌、膀胱癌和上皮癌。
包括本發(fā)明藥物的藥用組合物可根據(jù)已知的方法配制，例如通過與藥學上可接受的載體混合。這種載體和配制的方法的實例可從Remington的藥物科學上查到。為了形成適于有效給藥的藥學上可接受的組合物，該組合物含有有效量的所述藥物。藥物的有效量根據(jù)各種因素如個體的狀況、重量、性別和年齡而變化。其他的因素包括給藥模式。藥物組合物可通過各種途徑提供給個體，例如皮下的、局部的、口服和肌內(nèi)的給藥。
本發(fā)明的藥物包括藥物基本分子的化學衍生物。即，它們可含有通常不是基本分子的一部分的附加的化學部分。該部分可以提高基本分子的溶解性、半衰期、吸收性等?？蛇x地，該部分可減弱基本分子不理想的負面效果或減少基本分子的毒性。這種部分的實例記載于各類文本中，如Remington的藥物科學。
可以根據(jù)常規(guī)測試定義的合適劑量單獨使用根據(jù)在此公開的方法鑒定的化合物以獲得最佳的抑制性或活性，同時使任何潛在的毒性最小化。此外，其他藥劑的共同給藥或按序給藥也是需要的。
本發(fā)明的藥物可以以用于給藥的傳統(tǒng)賦形劑的廣泛變化的治療藥劑形式來給藥。例如，該藥物可以口服劑量的形式，如片劑、膠囊(每個包括定時釋放和持續(xù)釋放的制劑)、丸劑、粉劑、粒劑、酏劑、酊劑、溶液、懸浮液、糖漿劑和乳化劑，或通過注射方式給藥。同樣地，它們也可通過靜脈內(nèi)的(大丸劑和浸劑)、腹膜內(nèi)的、皮下的、局部封閉或不封閉的、或肌內(nèi)形式給藥，所有采用的形式都是藥學領域普通技術人員所公知的?？梢圆捎盟杌衔锏挠行У嵌拘缘牧孔鳛檎{(diào)節(jié)劑。
產(chǎn)物的每日劑量可在每病人/每天0.01-1,000mg的較寬范圍內(nèi)變化。對于口服給藥，組合物優(yōu)選以含有0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、25.0，和50.0mmg活性成分的評分或未評分的片劑形式提供，以根據(jù)癥狀調(diào)整給予受治療病人的劑量。藥物的有效量通常為每天大約0.0001mg/kg至大約100mg/kg體重的劑量水平。該范圍更特別地為每天大約0.001mg/kg至10mg/kg體重。為了組合獲得理想的效果，可調(diào)整劑量。另一方面，這些各種藥劑的劑量可以獨立地優(yōu)化并組合使用以獲得協(xié)同結(jié)果，組合使用中病癥減輕的情況多于單獨采用任何試劑的情況。
有利地，本發(fā)明中使用的化合物和調(diào)節(jié)劑可以單一的每日劑量給藥，或每日總劑量可以每天兩次、三次或四次的分開劑量給藥。此外，本發(fā)明的化合物或調(diào)節(jié)劑可通過局部施用合適的鼻內(nèi)賦形劑以鼻內(nèi)的形式給藥，或采用本領域普通技術人員熟知的透皮貼的形式通過經(jīng)皮膚的途徑給藥。以經(jīng)過皮膚的傳遞系統(tǒng)的方式給藥，劑量的給藥在整個劑量服法中應是連續(xù)的而不是間歇的。
對于采用多于一種活性藥劑的聯(lián)合治療，其中該活性藥劑是呈分開劑量的制劑，所述活性藥劑可以同時給藥，或其每一種可以交錯的時間分開給藥。
利用本發(fā)明的化合物或調(diào)節(jié)劑的劑量處方根據(jù)各種因素包括類型、種類、年齡、重量、性別和病人的醫(yī)療條件；待治療的疾病的嚴重性；給藥途徑；病人的肝腎功能；和所采用的特定藥物來選擇。具有普通技能的醫(yī)師或獸醫(yī)可以很容易地確定和開出預防、逆反或阻止病情發(fā)展所需要的有效量的藥物。在產(chǎn)生療效且無毒性的范圍內(nèi)獲得藥物濃度的最適精度需要以藥物對靶位點的有效性的動力學為基礎的處方。這涉及對藥物的分布、平衡和消除的考慮。
本發(fā)明的藥物可以形成活性成分，并且一般以與合適的藥物稀釋劑、賦形劑或載體(在此合稱為“載體”物質(zhì))混合來給藥，該載體物質(zhì)針對所需的給藥形式即，口服片劑、膠囊、酏劑、糖漿劑等，并與傳統(tǒng)的藥物學慣例相一致而作出合適的選擇。
例如，為了以片劑或膠囊的形式進行口服給藥，活性藥物組分可與口服的、非毒性的藥學可接受的惰性載體，例如乙醇、甘油、水等結(jié)合。此外，如果需要或必須，合適的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑也可被加入到混合物中。合適的粘合劑包括但不限于，淀粉、明膠、天然糖如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味劑、天然或合成膠如阿拉伯膠、黃芪膠或藻酸鈉、羧基甲基纖維素、聚乙二醇、蠟等。這種劑量形式中采用的潤滑劑包括但不限于，油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、醋酸鈉、氯化鈉等。崩解劑包括但不限于，淀粉、甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。
對于液體形式，活性藥物組分可以與適當調(diào)味的懸浮劑或分散劑，如合成膠和天然膠，例如黃芪膠、阿拉伯膠、甲基纖維素等組合。其他可采用的分散劑包括甘油等。對于非腸胃給藥，無菌懸浮液和溶液是所需要的。當需要靜脈內(nèi)給藥時，采用通常含有合適的防腐劑的等滲制劑。
本發(fā)明的藥物還可以脂質(zhì)體傳遞系統(tǒng)的形式，例如小單層泡、大單層泡和多層泡給藥。脂質(zhì)體可以由各種磷脂，如膽固醇、硬脂酰胺或卵磷脂形成。
本發(fā)明的藥物也可以采用單克隆抗體作為偶聯(lián)有化合物分子的單獨載體來遞送。本發(fā)明的藥物還可以與作為目標藥物載體的可溶性聚合物偶聯(lián)。這種聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基丙基甲基丙烯酰胺苯酚、多羥基乙基門冬酰胺苯酚或用棕櫚酰基殘基取代的聚氧化乙烯聚賴氨酸。此外，本發(fā)明的藥物可以與用于達到控制藥物釋放的生物可降解大分子類偶聯(lián)，例如，與聚乳酸、聚ε己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)或兩親性封閉的水凝膠共聚物偶聯(lián)。
對于口服給藥，藥物可以膠囊、片劑、或大丸劑形式給藥，或備選地其可與食物混合。該膠囊、片劑和大丸劑由活性成分與合適的載體賦形劑例如淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂或磷酸二鈣組合組成。這些單位劑量的形式通過最初將活性成分與合適的細粉末狀的惰性成分，包括稀釋劑、填充劑、崩解劑和/或結(jié)合物混合，從而獲得均一的混合物。惰性成分是一種不與藥物反應且對受治療的動物無毒性的成分。合適的惰性成分包括淀粉、乳糖、滑石粉、硬脂酸鎂、植物膠和油等。這些制劑可根據(jù)多種因素例如受治療動物種類的大小和類型以及感染的嚴重性而包含廣泛變化的活性和非活性成分的量?；钚猿煞诌€可通過簡單地將化合物與食物混合或通過將化合物施加于食物表面的方式給藥。
該化合物或調(diào)節(jié)劑可備選地經(jīng)注射由溶解于惰性液體載體的活性成分組成的制劑以非腸道方式給藥。注射可以是肌內(nèi)的、瘤胃內(nèi)的、氣管內(nèi)或皮下的。注射制劑由與合適的惰性液體載體混合的活性成分組成?？山邮艿囊后w載體包括植物油例如花生油、棉籽油、芝麻油等，以及有機溶劑例如solketal、環(huán)亞甲基甘油醚等。植物油是優(yōu)選的液體載體。該制劑通過將活性成分溶解或懸浮于液體載體中而制備，從而最終制劑中含有0.005至10％重量比的活性成分。
本發(fā)明通過下述非限制性的實施例作進一步說明。
實施例在非預示性的實施例中，向AML病人給藥600mg的(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)(稱為Zamestra)，AML中每28天循環(huán)的頭21天以初始口服劑量600mg每日兩次給藥。受治療者被分為兩組，患有復發(fā)的AML的組和患有難治的AML的組?？偣?57位病人(135位復發(fā)的和117位難治的)接受治療。
對Zamestra治療的應答定義為具有如表2所示的目標應答(CR，CRp，或PR)的病人，或通過中心復查或臨床位點確定的證實為疾病穩(wěn)定和抗白血病活性(減少量＞50％的白血病胚細胞)的病人?？拱籽』钚远x為任何骨髓胚細胞計數(shù)小于5％或骨髓胚細胞至少減少一半。
表2

實施例1.微陣列分析從接受Zamestra FTI(活性或分，(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)治療前和治療后的病人中經(jīng)同意后收集骨髓樣品，用PBS稀釋并用菲可-泛影酸(1.077g/ml)離心。用PBS洗滌白細胞兩次，重懸于含有10％DMSO的FBS中，并立即置于-80℃冷凍。將樣品置于37℃，解凍在5分鐘內(nèi)逐滴加入含有20％FBS的10倍體積的RPMI。將細胞以500g離心10分鐘，并重懸于含有2mM EDTA和0.5％BSA的10ml PBS中。隨后將樣品通過70μM的濾器(Becton Dickinson Labware，F(xiàn)ranklin lakes，NJ)以除去任何細胞塊。通過臺盼藍染色排除試驗確定細胞活力。解凍后骨髓樣品的平均活力為35％(0-96％范圍內(nèi))。由于存在相對低數(shù)量的存活細胞，樣不再進一步富集品中骨髓細胞。將大約2×105的細胞用CD33-FITC和CD34-PE抗體(Becton Dickinson Biosciences Pharmingen，San Diego，CA)雙重標記，并進行FACS分析。
用RNeasy試劑盒(Qiagen，Santa Clarita，CA)從細胞樣品中提取總RNA。根據(jù)Affymetrix(Santa Clara，CA)的方法進行cDNA和cRNA的合成。由于幾個樣品中的RNA產(chǎn)量小于1μg，因此進行兩輪線性擴增。為了進行雜交，通過在40mM的Tris-乙酸、pH 8.1、100mM乙酸鉀和30mM乙酸鎂溶液中，于94℃下孵育35分鐘使11μg的cRNA隨機片段化。片段化的cDNA在轉(zhuǎn)速設定為60rpm的烘烤轉(zhuǎn)爐中，于45℃下經(jīng)過16小時雜交到U133A陣列上。雜交后，洗滌陣列(用6×SSPE和含有Triton X-100(0.005％)的0.5×SSPE)，并用鏈霉抗生物素蛋白-藻紅蛋白(SAPE；分子探針，Eugene，OR)染色。采用Agilent G2500A基因陣列掃描儀(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)對結(jié)合的標記探針進行定量。
每一陣列的總熒光強度用均一值600來衡量。通過計算信噪比(原始平均信號/噪音)來定量芯片的性能。如果信噪比小于5，則該芯片從進一步的分析中除去。僅當基因被認為“出現(xiàn)”在至少10％的芯片中時，其才被包括在進一步的分析中。經(jīng)過這種篩除后，剩下大約12,000的Affymetrix探針組。通過基于主要組分的分析鑒定異常值和通過分析基因強度的正常分布來進一步控制基因表達數(shù)據(jù)的質(zhì)量。
采用卡方檢驗和斯徒登特t-檢驗來鑒定病人應答與病人共變量、突變狀況、CD33和CD34抗原表達、白血病胚細胞計數(shù)和基因表達間的相關性。為了鑒定能以高靈敏度預測應答的基因，采用百分率分析。例如，鑒定與至少40％的非應答者相比在所有應答者中上調(diào)或下調(diào)的基因?；陔p尾斯徒登特t-檢驗(不等方差)得到的不顯示顯著p-值(P＜0.05)的基因被除去。通過排一交叉驗證的方法分析最高基因的預測值。在此，從數(shù)據(jù)組中除去一種樣品，同時從12,000的基因中重新選擇標記。然后通過線性判別分析在除去的樣品中檢驗該基因的預測值。計算靈敏度，表示為真實陽性除以真實陽性加假陰性的和的數(shù)值。計算特異性，表示為真實陰性除以真實陰性和假陽性的和的數(shù)值。計算陽性預測值，表示為真實陽性除以真實陽性和假陽性的和的數(shù)值。計算陰性預測值，表示為真實陰性除以假陰性和真實陰性的和的數(shù)值。
使用單變量考克斯比例風險模型評估每一參數(shù)(基因或胚細胞計數(shù))與病人存活結(jié)果的相關性。來源于考克斯模型的每一參數(shù)的系數(shù)估計值測量了這種相關性的強度。當采用多于一個的基因時，采用多變量風險模型。將從非應答者中區(qū)分應答者的分類定義為b1*x1+b2*x2+b3*x3+...
其中b1，b2，b3為來源于考克斯模型的系數(shù)估計值，而x2，x2，x3為標準參數(shù)值(胚細胞計數(shù)或基因表達值的log10)。
使用受試者作業(yè)曲線(ROC)為每一分類挑選合適的域值，要求靈敏度至少為90％。ROC診斷計算了每一參數(shù)的靈敏度和特異性。此外，采用由隨機挑選的29個樣品組成的訓練組，根據(jù)其從差的結(jié)果中分層好結(jié)果的能力，首先對基因標記進行分等。然后在剩下的29個樣品中對每一基因的預測值進行檢驗。這允許鑒定出具有最強預測值的基因。
實施例2；白血病細胞抗原的表達已知白血病胚細胞表達表面抗原CD33和CD34。95％和55％的病人骨髓白血病細胞分別呈CD33和CD34陽性。每一樣品中表達該抗原的細胞的平均百分比為13％的CD34和43％的CD33。使用卡方分析調(diào)查抗原表達水平和病人結(jié)果之間的相關性。分別挑選CD34和CD33水平為15％和60％的截止值。CD33和CD34的低表達(小于約15％的CD34細胞群陽性和小于約60％的CD33細胞群陽性)與病人對ZamestraTM應答相關(分別地p＝0.137，p＝0.052)。兩種抗原的高表達(大于約15％的CD34細胞群陽性和少于約60％的CD33細胞群陽性)也與高的胚細胞計數(shù)正相關。Kaplan Meier分析還表明CD33的高表達與低的整體存活性相關(圖1)。
實施例3白血病胚細胞計數(shù)分析CD33和CD34抗原表達的分析表明，白血病胚細胞的水平與病人的應答相關。計算位點和DCL胚細胞計數(shù)測量值的平均值并進行斯徒登特t-檢驗以調(diào)查胚細胞計數(shù)是否與AML病人中的患者應答相關。在總數(shù)為199的可評估病人中，其中24位呈CR、CRp、PR、或SD，胚細胞的百分比與病人結(jié)果顯著相關(p＝0.0006)。應答者比那些疾病發(fā)展的病人(平均51％)具有較低數(shù)目的胚細胞(平均34％)?？偣?4位應答者(定義為呈SD)中只有1位的胚細胞計數(shù)高于60％。對所有可評估病人的卡方分析也發(fā)現(xiàn)在高胚細胞計數(shù)和抗治療間存在顯著的相關性(x2＝9.53)。
Kaplan-Meier分析發(fā)現(xiàn)，那些具有低水平胚細胞計數(shù)(＜60％)的病人比具有高胚細胞計數(shù)的病人具有顯著好的整體存活性(圖2)。這些分析表明，具有高于大約60％的胚細胞計數(shù)的病人不太可能對ZarnestraTM產(chǎn)生應答。
實施例4應答者和非應答者間差異表達的基因的確定從藥物治療前的80位病人中獲得骨髓樣品用于進行基因表達分析。80份基線樣品中，14份由于其來自不可評估的病人而被從分析中除去。富集樣品中的骨髓細胞，處理信使RNA(編碼基因特異性蛋白質(zhì)的分子)，并雜交于Affymetrix U133A基因芯片上。雜交至U133A芯片上后，66份樣品中的58份經(jīng)過另外的質(zhì)量控制測量。將基因表達數(shù)據(jù)與臨床信息整合，并進行追溯分析以鑒定可從非應答者中分層出應答者且具有高水平靈敏度的基因。鑒定出幾個用于預測對ZarnestraTM應答的基因標記(表3)。在淋巴胚細胞疾病關鍵的致癌基因(致癌LBC)的情況中，將該基因的預測值用排一交叉驗證該計算數(shù)據(jù)組(表3)。致癌LBC基因的表達水平可捕集所有的臨床鑒定出的應答者，同時除去超過一半的非應答者。
表3應答者與非應答者中的基因差異表達

*比率表示應答者相比于非應答者的倍數(shù)變化表4用致癌LBC作為應答標記的排一交叉驗證法

總數(shù) 14 44靈敏度 ＝100％特異性 ＝55％陽性預測值 ＝41％陰性預測值 ＝100％存活分析顯示基于致癌LBC表達(圖3A，p＝0.00841)，被分類為應答者的病人顯著地超出了采用臨床數(shù)據(jù)的病人分類(圖3B，p＝0.0827)。這是由于致癌LBC標記鑒定了具有增加的整體存活性的非應答者子集?；诳伎怂癸L險模型，結(jié)合致癌LBC和第二基因標記，芳香烴受體(AHR)，分別將特異性和陽性預測值增加至75％和56％(圖3C)。這些結(jié)果表明，單獨采用致癌LBC，或與AHR基因聯(lián)合使用為預測對ZamestraTM治療的應答提供了有效的陣列。
還進行了使用致癌LBC和芳香烴受體(AHR)作為標記的排一交叉驗證。當采用截止值鑒定最高靈敏度和最好特異性時，PPV和靈敏度保持相同。采用其他基因組合的排一交叉驗證的結(jié)果示于表5。這例證了標記的組合可提高本方法的預測值。
表5

此外，用LBC和AHR分類對病人的分層表明，在采用致癌LBC基因或臨床應答定義的兩類病人群之間在中間存活時間方面存在類似的差異(圖4C)。這些結(jié)果表明單獨采用致癌LBC，或與AHR基因組合可用作有效的生物標記，用于在目前的數(shù)據(jù)組中預測對ZARNESTRA的應答。
使用考克斯風險模型分析其他標記的組合以區(qū)分不良存活者和良好存活者(表6)。在此，采用了來自51位病人的數(shù)據(jù)，因為只有該數(shù)量的病人樣品具有所測量的CD33和CD34抗原水平。使用大于90％的靈敏度確定際記的合適截止值。應用多重標記可提高2個存活組的中間存活時間的差異。
表6

實施例5抗體(預示性的)合成lbc致癌基因衍生的肽，并偶聯(lián)至匙孔血藍蛋白，并用于免疫兔子從而產(chǎn)生多克隆抗體。用ELISA測試血清與相應肽的反應性，而陽性組則進行親和純化。純化的抗體特異地檢測組織切片中具有該表位的肽。這通過當相應的肽與抗體同時加入時完全消除信號來驗證。除了這種在免疫組織化學中工作良好的多克隆抗體以外，還產(chǎn)生了可以檢測蛋白并以其天然折疊形式存在的單克隆抗體。為了生產(chǎn)單克隆抗體，產(chǎn)生了在哺乳動物細胞中生產(chǎn)的用以保證天然的折疊和翻譯后修飾的純化的抗原。該抗原，lbc致癌蛋白-IgG恒定區(qū)的融合蛋白，在小鼠骨髓瘤細胞中表達，且該蛋白用Fc片段作為誘餌分子來純化。這種純化的抗原在蛋白質(zhì)印跡中由多克隆抗體的C-末端識別。使用該抗原產(chǎn)生抗lbc肽的小鼠單克隆抗體，這是通過篩選出那些產(chǎn)生與lbc肽反應而不與IgG恒定區(qū)反應的抗體的陽性克隆來實現(xiàn)的。
采用這些及類似的抗體，可以很容易地制造出用于臨床鑒定lbc致癌基因的試劑盒。這種試劑盒可包括直接用于lbc肽鑒定的抗體(并因此，lbc致癌基因)、合適的指示試劑(例如，酶、標記及其類似物)和(任選的)這類試劑盒的臨床應用中十分有用的其他試劑，例如稀釋緩沖液、穩(wěn)定劑、和一般用于這類檢測的其他物質(zhì)。
實施例6原位雜交(預示性的)將甲醛溶液固定且石蠟包埋的組織樣品切至5-7μm厚的切片，封固于硅烷覆蓋的玻片中，并在37℃孵育過夜，且在脫蠟前在65℃下孵育30分鐘，置于二甲苯中脫蠟兩次，每次10分鐘。此后，樣品經(jīng)梯度系列的乙醇溶液(100至70％)再水化，置于磷酸緩沖鹽水溶液(PBS pH7.0)中漂洗2次，每次5分鐘，用含0.1mol/L甘氨酸的PBS處理2次，每次5分鐘，用含0.3％ Triton X-100的PBS滲透15分鐘。切片用蛋白酶K(Finnzymes，赫爾辛基，芬蘭)在37℃下處理(μg/ml，TE緩沖液中；100mmol/L Tris-HCl，50mmol/L EDTA，PH 8.0)30分鐘，在含3％低聚甲醛溶液的PBS中于4℃下固定5分鐘，并用PBS漂洗兩次。通過將玻片浸入0.25％(v/v)的乙酸酐、100mmol/L三乙醇胺，pH 8.0中兩次，每次5分鐘來阻斷正電荷。將玻片在4×SSC，50％(v/v)去離子甲酰胺中，37℃下平衡10分鐘。
探針采用TA克隆試劑盒(Ivitrogen，San Diego CA，美國)，通過連接PCR擴增的0.4kb的lbc致癌基因cDNA插入pCR-II載體制備得到。lbc致癌基因反義或正義RNA探針的模板通過將合適的載體構(gòu)建體線性化(分別從3’至5’方向或5’至3’方向)產(chǎn)生。使用RNA標記試劑盒(Boehringer-曼海姆)通過體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生地高辛標記的RNA探針。雜交于45℃進行過夜，所采用的雜交混合物含有1×Denhart’s溶液(0.2g/L 400型的Ficoll，Pharmacia)、0.2g/L聚乙烯吡咯烷酮、0.2g/L牛血清白蛋白(片段V；Sigma)、40％甲酰胺、10％葡萄糖硫酸鹽、4×SSC、10mmol/L二硫蘇糖醇、1mg/mL酵母tRNA、1mg/mL鯡精子DNA和300ng/mL地高辛標記的RNA探針。雜交后，將組織切片于2×SSC中37℃下洗滌2次5分鐘，并于60％甲酰胺、0.2×SSC中洗滌1次15分鐘；隨后在室溫下于2×SSC中漂洗兩次5分鐘，并在100mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，150mmol/L NaCl中洗滌2次10分鐘。信號檢測用1∶250堿性磷酸酶-連接的羊抗地高辛fab片段(Boehringer曼海姆)進行。通過將切片與NBT/BCIP原液(Boehringer曼海姆)孵育1.5小時而顯現(xiàn)信號。
在癌癥病人的腫瘤發(fā)生細胞中觀察到lbc致癌基因-陽性細胞表明不太可能對FTI產(chǎn)生應答。
實施例7免疫組織化學(預示性的)使用抗lbc致癌基因C-末端肽的親和純化的多克隆抗體進行免疫組織化學檢測和lbc致癌基因定位。將經(jīng)甲醛溶液固定和石蠟包埋的正常和腫瘤組織的4μm切片在3-氨基丙基-三乙氧基-硅烷(APES，Sigma，St.Louis，MO，美國)覆蓋的玻片上制成標本。該切片在梯度濃度的乙醇中脫蠟和再水化，并在室溫下用甲醛過氧化物(含0.5％過氧化氫的無水甲醇)處理30分鐘以阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性。抗原恢復通過在微波爐中處理2次5分鐘(650W)而進行。使用Elite ABC試劑盒(Vectastain，Vector laboratories，Burlingame，CA，美國)進行免疫過氧化物酶染色。以1∶2000的最適稀釋度使用Lbc肽抗體。生物素化的第二抗體和過氧化物酶標記的抗生物素蛋白-生物素復合體均在切片上孵育30分鐘。用PBS(pH 7.2)稀釋，且所有的孵育均于室溫在濕潤的小盒中進行。在不同的染色步驟之間，用PBS漂洗玻片3次。將過氧化物酶染色，用3-氨基-9-乙基咔唑(Sigma)溶液(0.2mg/ml的含有0.03％過氧化氫的0.05M的醋酸緩沖液，pH5.0)在室溫下顯色15分鐘。最后，將該切片用Mayer’s蘇木精輕微負染，并用含水固定介質(zhì)(Aquamount，BDH)固定。在對照實驗中，用正常兔血清的IgG片段代替原始抗體，或用lbc肽預先吸附原始抗體。這些染色表明lbc致癌基因存在于細胞子集中。
實施例8酶免疫測定(預示性的)對lbc蛋白或與lbc致癌基因相關的特征肽作免疫測定。采用包括結(jié)腸腫瘤樣品(通過免疫過氧化物酶染色顯示含有抗原)消化物的抗原標準。人白細胞來源于AML病人。收集樣品，并在10倍體積的pH7.4，含有0.2％(w/v)脫氧膽酸鈉的10mM Tris緩沖液中在4℃下進行勻化。將該勻漿迅速置于37℃，并一邊攪拌一邊加入下述試劑(終濃度)1mM半胱氨酸(Sigma)，1mM EDTA(Sigma)和木瓜蛋白酶(0.8單位/ml)(Boehringer-曼海姆，Indianmapolis，Ind.)。5分鐘后，加入5mM碘代乙酰胺(Sigma)終止消化。在4℃下勻漿以100,000xg離心1小時，然后用含有均為10mM的苯基甲磺酰氟和氨基己酸的pH 7.4的10mM Tris/0.9％NaCl溶液緩沖液大量透析。將勻漿以0.5mg蛋白/ml的濃度分小份冷凍。
免疫測定步驟測量lbc蛋白或肽產(chǎn)生的劑量應答曲線證實100ng至100μg/ml之間的抗原輸入是線性的。對于血清分析，范圍是1ng至1000ng/ml，因為這些樣品在測定前被稀釋了10倍。
上述實施例所描述的抗體的固相制備是采用CNBr-活化的瓊脂糖凝膠(pharmacia)制備的。微量滴定板(Nunc I免疫平板；格蘭德島生物公司，格蘭德島，紐約)用含抗體(200μl/孔)的50mM碳酸鹽-重碳酸鹽緩沖液，pH9.6在4℃下覆蓋18小時。在除去抗體溶液后，在塑料表面上殘余的蛋白質(zhì)結(jié)合位點通過加入200μl測試緩沖液(含有1％(v/v)兔血清和1％(w/v)牛白蛋白的PBS)封閉。在室溫下孵育1小時后，覆蓋后的平板立即用于測定步驟。
為了進行測定，加入用測試緩沖液稀釋的200μl樣品，于37℃保持1-5小時。用測定緩沖液洗滌3次后，將200μl與辣根過氧化物酶(Sigma，VI型)共價綴合的抗體加入每一孔中，于37℃保持1.5小時。將綴合物稀釋至含10％(v/v)鼠血清的每毫升PBS中含有0.5μg免疫球蛋白的濃度。在如上述的漂洗步驟后，向每孔中加入200μl底物，在室溫下保持0.5小時。底物溶液含有0.4mg鄰苯二胺/毫升pH 5.0的檸檬酸鹽緩沖液和0.003％過氧化氫。通過加入50μl 2N的硫酸終止反應，并用酶測定板讀數(shù)儀(Fisher Scientific Co.，Pittsburgh，Pa.)監(jiān)測488nm下的吸光度。
結(jié)合的酶綴合物的百分比用如下公式計算(B-B0)(Bt-B0)(100)其中B＝樣品的吸光度，Bt＝最大吸光度，以及B0＝空白對照的吸光度。每一測定均采用標準的消化和用測試緩沖液稀釋26倍的血清樣品重復3次。免疫測定的特異性通過替換固相上的各種抗體試劑，包括用不相關蛋白質(zhì)的抗體和非免疫的兔血清進行檢驗。在固相抗體中，只有根據(jù)上述實施例制備的抗體能在高稀釋度下與抗原結(jié)合。
檢測正常對照個體、患有良性和惡性血液紊亂的病人的血清lbc蛋白的水平。
從明顯健康個體獲得的血清顯示無lbc蛋白。只有5％的樣品在檢測極限或高于檢測極限時表達血清抗原，而該數(shù)值被選為提高血清水平的截止值。低于截止值的癌癥病人有可能對FTI治療產(chǎn)生應答。
序列表<110>Ortho-Clinical DiagnosticsRAPONI，MITCH<120>評估和治療癌癥的方法<130>ADS5001<160>28<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5496<212>DNA<213>人<400>1attcagccgg tgcgcgcggc ggcgggaggc agtggctggg gagtcccgtc gacgctctgt 60tccgagagcg tgccccggac cgccagctca gaacaggggc agccgtgtag ccgaacggaa120gctgggagca gccgggactg gtggcccgcg cccgagctcc gcaggcggga agcaccctgg180atttgggaag tcccgggagc agcgcggcgg cacctccctc acccaagggg ccgcggcgac240ggtcacgggg cgcggcgcca ccgtgagcga cccaggccag gattctaaat agacggccca300ggctcctcct ccgcccgggc cgcctcacct gcgggcattg ccgcgccgcc tccgccggtg360tagacggcac ctgcgccgcc ttgctcgcgg gtctccgccc ctcgcccacc ctcactgcgc420caggcccagg cagctcacct gtactggcgc gggctgcgga agcctgcgtg agccgaggcg480ttgaggcgcg gcgcccacgc cactgtcccg agaggacgca ggtggagcgg gcgcggcttc540gcggaacccg gcgccggccg ccgcagtggt cccagcctac accgggttcc ggggacccgg600ccgccagtgc ccggggagta gccgccgccg tcggctgggc accatgaaca gcagcagcgc660caacatcacc tacgccagtc gcaagcggcg gaagccggtg cagaaaacag taaagccaat720cccagctgaa ggaatcaagt caaatccttc caagcggcat agagaccgac ttaatacaga780
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Ser Leu Asp Gln Lys Ser Thr Val Ile Ser Leu Lys Lys Leu Ile Val355 360 365Arg Glu Val Ala His Glu Glu Lys Gly Leu Phe Leu Ile Ser Met Gly370 375 380Met Thr Asp Pro Glu Met Val Glu Val His Ala Ser Ser Lys Glu Glu385 390 395 400Arg Asn Ser Trp Ile Gln Ile Ile Gln Asp Thr Ile Asn Thr Leu Ser405 410 415Gly Asn Gly Trp Arg Cys Phe Asn420
權(quán)利要求
1.一種通過分析lbc致癌基因的存在或表達從而確定病人是否對FTI治療產(chǎn)生應答的方法。
2.權(quán)利要求1的方法，它進一步包括在FTI存在時對被差異調(diào)節(jié)的基因的表達進行分析。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述分析是除了針對lbc致癌基因外還針對多于一個基因的表達的分析。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述基因選自Seq.ID No 1-18。
5.權(quán)利要求1的方法，其中對被確定為體內(nèi)缺失或不表達lbc致癌基因的病人進行FTI治療。
6.權(quán)利要求1的方法，其中對被確定為體內(nèi)存在或表達lbc致癌基因的病人用除了FTI以外的藥物進行治療。
7.權(quán)利要求1的方法，它進一步包括確定用于測定對FTI應答的病人樣品是否包含選自CD33和CD34的細胞表面抗原的步驟。
8.權(quán)利要求7的方法，其中具有所述表面抗原的細胞的存在是對FTI治療應答的預兆。
9.權(quán)利要求1的方法，它進一步包括確定包括胚細胞在內(nèi)的用于確定對FTI應答的病人樣品中的細胞的百分比的步驟。
10.權(quán)利要求9的方法，其中在所述樣品中存在少于60％的胚細胞是對FTI產(chǎn)生應答的預兆。
11.一種通過分析lbc致癌基因的存在或表達來監(jiān)測采用FTI治療的病人的治療的方法。
12.權(quán)利要求11的方法，它進一步包括在FTI存在時對被差異調(diào)節(jié)的基因的表達進行分析。
13.權(quán)利要求11的方法，其中所述分析是除了針對lbc致癌基因外還針對多于一個基因的表達的分析。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述基因選自Seq.ID No.1和Seq.ID No.3-18。
15.權(quán)利要求11的方法，其中將被確定為體內(nèi)缺失或不表達lbc致癌基因的病人作為對FTI應答的病人來進行治療。
16.權(quán)利要求11的方法，它進一步包括確定用于測定對FTI應答的病人樣品是否包含選自CD33和CD34的細胞表面抗原的步驟。
17.權(quán)利要求16的方法，其中具有所述表面抗原的細胞的存在，在CD33的情況下包含少于15％或在CD34的情況下包含少于60％，是對FTI治療產(chǎn)生應答的標志。
18.權(quán)利要求16的方法，其中具有所述表面抗原的細胞的缺乏是對FTI治療產(chǎn)生應答的標志。
19.權(quán)利要求11的方法，它進一步包括確定包括胚細胞在內(nèi)的用于確定對FTI應答的病人樣品中的細胞的百分比的步驟。
20.權(quán)利要求19的方法，其中在所述樣品中存在少于或等于60％胚細胞是對FTI產(chǎn)生應答的標志。
21.權(quán)利要求20的方法，其中在所述樣品中存在多于60％胚細胞是對FTI不產(chǎn)生應答的標志。
22.權(quán)利要求11的方法，其中將被確定為體內(nèi)存在lbc致癌基因或lbc致癌基因表達量未減少的病人作為對FTI不應答的病人來治療。
23.權(quán)利要求1的方法，其中所述的FTI是(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
24.權(quán)利要求11的方法，其中所述的FTI是(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
25.一種治療病人的方法，包括a)分析所述病人中基因表達的分布型或lbc致癌基因的存在，從而確定病人是否對FTI治療產(chǎn)生應答，和b)如果分析表明病人產(chǎn)生應答，則采用FTI治療病人。
26.權(quán)利要求25的方法，其中所述的分析是對多于一個基因的表達的分析。
27.權(quán)利要求25的方法，其中所述的FTI選自喹啉或喹啉衍生物。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述的FTI選自7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮，7-(3-氯苯基)-9-[(4-氯苯基)-1H-咪唑-1-基甲基]-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮，8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)，甲基]-6-(3-氯苯基)-1，2-二氫-4H-吡咯并[3，2，1-ij]喹啉-4-酮，8-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-6-(3-氯苯基)-2，3-二氫-1H，5H-苯并[ij]喹嗪-5-酮，和(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述的FTI為(R)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮)。
30.權(quán)利要求26的方法，其中所述的基因與一個或多個具有Seq.ID No.1-18的核酸序列相關。
31.權(quán)利要求25的方法，其中所述的治療包括用FTI和另外的治療組合物給藥。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述的另外的治療組合物調(diào)節(jié)MAPK/ERK信號通路、TGFβ、WNT、Rho或細胞程序性死亡途徑。
33.權(quán)利要求31的方法，其中所述另外的治療組合物選自酪氨酸激酶抑制劑、MEK激酶抑制劑、PI3激酶抑制劑、MAP激酶抑制劑、細胞程序性死亡調(diào)節(jié)劑及其組合。
34.用以評估采用FTI治療病人的效力的制品，包括用于確定標志FTI應答的病人的基因表達分布型的介質(zhì)。
35.權(quán)利要求34的制品，其中所述的基因表達分布型從與多于一個的Seq.ID No 1-18的核酸序列相關的一組基因獲得。
36.權(quán)利要求34的制品，包括固定于介質(zhì)上的基因表達分布型的表示物。
37.包括用于確定對FTI治療產(chǎn)生應答的試劑的試劑盒。
38.權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述試劑用于檢測lbc致癌基因的存在或表達。
39.權(quán)利要求38的試劑盒，其中所述試劑用于檢測選自Seq.ID No.1-18及其變異體的基因的表達。
40.權(quán)利要求37的試劑盒，它進一步包括用于檢測選自CD33和CD34的細胞表面抗原的試劑。
41.權(quán)利要求37的試劑盒，它進一步包括用于檢測胚細胞的試劑。
42.權(quán)利要求37的試劑盒，其中所述試劑包括PCR引物。
43.權(quán)利要求43的試劑盒，它進一步包括探針。
44.FTI在制備用于治療已經(jīng)或隨后被確定為體內(nèi)缺乏lbc致癌基因或lbc致癌基因不表達的病人的藥物中的應用。
45.FTI在制備用于治療隨后對lbc致癌基因的存在或表達進行監(jiān)測的病人的藥物中的應用。
46.一種用于分析來自病人的樣品從而確定lbc致癌基因的存在或表達的診斷試劑盒。
47.一種用于治療病人的組合，包括確定所述病人的基因表達分布型或lbc致癌基因的存在從而確定病人是否對FTI治療產(chǎn)生應答的手段；以及FTI在制備用于治療所述病人的藥物組合物中的應用，如果分析表明病人產(chǎn)生應答的話。
全文摘要
治療癌癥，優(yōu)選治療血液惡性腫瘤病人的方法，包括分析病人的基因表達分布型和/或分子標記從而確定病人是否有可能對法尼基轉(zhuǎn)移酶抑制劑(FTI)，和任選的其他治療劑產(chǎn)生應答。該方法同樣用于監(jiān)測病人的治療和用于選擇治療的進程。提供在FTI治療的應答中受調(diào)節(jié)的基因并用于表示分布型。
文檔編號C12Q1/68GK1626679SQ20041006407
公開日2005年6月15日 申請日期2004年7月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年7月1日
發(fā)明者M·拉波尼 申請人:維里德克斯有限責任公司