專(zhuān)利名稱(chēng)：用于治療癌癥的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
概括而言，本發(fā)明涉及抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的方法和治療癌癥的方法。

背景技術(shù)：
Hh信號(hào)通路在現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)得到充分確認(rèn)(參見(jiàn)例如，Nybakken等，Curr.Opin.Genet.Dev.2002，12503-511；和Lum等，Science 2003，2992039-2045)。簡(jiǎn)而言之，在hedgehog配體不存在的情況下，跨膜受體Patched(Ptch)與Smoothened(Smo)結(jié)合，阻斷Smo的功能。該抑制在配體存在的情況下解除，這就使得Smo能夠啟動(dòng)信號(hào)級(jí)聯(lián)，該級(jí)聯(lián)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Glis自細(xì)胞質(zhì)融合蛋白(Fu)和融合蛋白抑制劑(Suppressor of Fused)(SuFu)釋放。在非活性狀態(tài)下，SuFu能夠防止Glis移位至細(xì)胞核。在活性狀態(tài)下，F(xiàn)u能夠抑制SuFu，從而釋放Glis。Gli蛋白能夠移位到細(xì)胞核中，并且能夠控制靶基因的轉(zhuǎn)錄。
BCR-ABL致癌基因是Philadelphia染色體(Ph)22q的產(chǎn)物，它能夠編碼嵌合BCR-ABL蛋白，該蛋白具有結(jié)構(gòu)性激活的ABL酪氨酸激酶活性。(Lugo等，Science 1990，2471079-1082)。BCR-ABL是慢性髓性白血病的主要原因。盡管210kDa BCR-ABL蛋白在CML患者中表達(dá)，而源自BCR基因中可選擇斷點(diǎn)的190kDa BCR-ABL蛋白在Ph陽(yáng)性(Ph+)急性成淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者中表達(dá)。(Bartram等，Nature 1983，306277-280；Chan等，Nature 1987，325635-637)。
BCR-ABL能夠通過(guò)各種機(jī)制在相關(guān)(committed)骨髓或淋巴祖細(xì)胞或3T3成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)增殖和對(duì)抗細(xì)胞凋亡。(Pendergast等，Cell 1993，75175-85；Ilaria等，J.Biol.Chem.1996，27131704-10；Chai等，J.Immunol.1997，1594720-8；和Skorski等，EMBO J.1997，166151-61)。然而，幾乎無(wú)人知道BCR-ABL對(duì)造血干細(xì)胞(HSC)群的作用。近期的出版物表明，發(fā)育通路如Wnt信號(hào)通路或Polycomb基因BMI1可能與白血病干細(xì)胞的調(diào)節(jié)和擴(kuò)張有關(guān)(Mohty等，Blood，2007；Hosen等，Stem細(xì)胞，2007)。BMI1和β-聯(lián)蛋白在CML急變期上調(diào)，其表達(dá)與疾病的進(jìn)展有關(guān)。已獲得β-聯(lián)蛋白表達(dá)的BCR-ABL陽(yáng)性粒細(xì)胞-巨嗜細(xì)胞祖細(xì)胞在急變期CML中為候選白血病干細(xì)胞。與慢性期BCR-ABL陽(yáng)性白血病干細(xì)胞(它導(dǎo)致惡性集落開(kāi)始擴(kuò)張)擴(kuò)張有關(guān)的自我更新通路目前還沒(méi)有很好的理解。


發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了組合物及其藥用組合物，它們可以用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和治療各種癌癥。
一方面，本發(fā)明提供了組合物，它包含了能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分和能夠抑制BCR-ABL的第二種成分。另一方面，本發(fā)明提供了藥用組合物，它包含治療有效量的能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分、能夠抑制BCR-ABL的第二種成分和可藥用載體。
本發(fā)明也提供了治療癌癥、特別是BCR-ABL陽(yáng)性白血病的方法，它包括給予系統(tǒng)或個(gè)體治療有效量的組合物，該組合物包含能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分和能夠抑制BCR-ABL的第二種成分或其可藥用的鹽或藥用組合物，從而治療所述BCR-ABL陽(yáng)性白血病。例如，本發(fā)明組合物可以用于治療慢性髓性白血病或急性淋巴細(xì)胞白血病。
另外，本發(fā)明提供了治療有效量的組合物在生產(chǎn)用于治療細(xì)胞增生性疾病、特別是BCR-ABL陽(yáng)性白血病的藥物中的用途，所述組合物包含能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分和能夠抑制BCR-ABL的第二種成分或其可藥用的鹽或藥用組合物。
在本發(fā)明組合物中使用的組合物和方法中，本發(fā)明組合物中的第一種成分可以與Smo結(jié)合。在具體的實(shí)施例中，第一種成分為環(huán)巴胺或佛司可林(forskolin)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物中的第二種成分為ABL抑制劑、ABL/Scr抑制劑、Aurora激酶抑制劑或BCR-ABL非-ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。例如，第二種成分可以選自下列成分

在本發(fā)明組合物使用的組合物和方法中，本發(fā)明組合物可以給藥于包含細(xì)胞或組織在內(nèi)的系統(tǒng)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物可以給藥于人類(lèi)或動(dòng)物個(gè)體。



圖1A顯示Gli1和Ptch1在純化的CD34+細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平，所述細(xì)胞獲自健康患者和處于慢性期或急變期的CML患者(標(biāo)準(zhǔn)化為CD34+細(xì)胞的值)。圖1B顯示Gli1和Ptch1在BCR-ABL陽(yáng)性和陰性全骨髓或干細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)。
圖2A顯示采用環(huán)巴胺對(duì)混合的骨髓培養(yǎng)物處理72小時(shí)后BCR-ABL(GFP)陽(yáng)性骨髓祖細(xì)胞(Lin-，Kit+，Sca-)和HSCs(Lin-，Kit+，Sca+)的百分比。圖2B顯示采用環(huán)巴胺對(duì)白血病小鼠骨髓處理后Gli1的表達(dá)。圖2C顯示采用環(huán)巴胺處理的混合骨髓培養(yǎng)物涂板后10天計(jì)數(shù)的集落總數(shù)。
圖3A顯示移植到PepC-Ly5.1小鼠中后Ly5.2(胚胎)陽(yáng)性細(xì)胞在外周血中的數(shù)量。圖3B顯示移植到外周血中后10周Ly5.2陽(yáng)性細(xì)胞中的細(xì)胞分布。圖3C顯示采用5-FU處理(150mg/kg)后Ly5.2陽(yáng)性細(xì)胞在外周血中的再生。圖3D顯示在采用含有10％GFP陽(yáng)性細(xì)胞、10％Smo GFP陽(yáng)性細(xì)胞或10％SMOW535E GFP陽(yáng)性細(xì)胞的骨髓移植60周后GFP陽(yáng)性細(xì)胞小鼠外周血中的百分比。圖3E顯示骨髓的相對(duì)GLI1轉(zhuǎn)錄水平，該骨髓采用pMSCV對(duì)照載體感染或Smo GFP或SMOW535E GFP載體感染。
圖4A顯示(Tx)移植后20天BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞在移植小鼠外周血中的數(shù)量。圖4B顯示Tx后28天移植小鼠的脾臟重量。圖4C顯示采用BCR-ABL感染的胎肝細(xì)胞移植小鼠的存活。圖4D顯示采用2＊10E5BCR-ABL(GFP)陽(yáng)性骨髓細(xì)胞再移植的小鼠的存活。
圖5A顯示BCR-ABL+小鼠一側(cè)股骨中GFP陽(yáng)性骨髓集落的相對(duì)數(shù)量，所述小鼠采用AMN107或AMN107和環(huán)巴胺的組合治療。圖5B顯示治療結(jié)束后8天脾臟和肝臟的重量。圖5C顯示單獨(dú)采用AMN107治療或采用AMN107和環(huán)巴胺組合治療結(jié)束后的存活天數(shù)。
定義 除非另外定義，本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的意義。下列文獻(xiàn)為技術(shù)人員提供了本發(fā)明中使用的多個(gè)術(shù)語(yǔ)的通用定義Oxford Dictionary of Biochemistry and MolecularBiology(牛津生物化學(xué)和分子生物學(xué)詞典)，Smith等(編輯.)，牛津大學(xué)出版社(再版，2000)；Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(微生物學(xué)和分子生物學(xué)詞典)，Singleton等(編輯)，John Wiley&Sons(第三版，2002)；和A Dictionary of Biology(生物學(xué)詞典)(Oxford Paperback Reference)，Martin和Hine(編輯)，牛津大學(xué)出版社(第四版，2000)。另外，下列定義有助于讀者實(shí)施本發(fā)明。
術(shù)語(yǔ)“成分”或“實(shí)驗(yàn)成分”包括任何物質(zhì)、分子、元素、化合物、實(shí)體或其組合。它包括但不限于例如蛋白、多肽、小有機(jī)分子、多糖、聚核苷酸等。它可以是天然產(chǎn)物、合成化合物、化學(xué)化合物或兩種或多種物質(zhì)的組合。除非另外說(shuō)明，術(shù)語(yǔ)“成分”、“物質(zhì)”和“化合物”可以交換使用。
本文中使用的術(shù)語(yǔ)“類(lèi)似物”是指在結(jié)構(gòu)上類(lèi)似于參照分子的分子，但是通過(guò)采用選擇的取代基代替參照分子的特定取代基，以定向和可控的模式對(duì)其進(jìn)行了修飾。與參照分子相比，本領(lǐng)域技術(shù)人員期望類(lèi)似物能夠具有相同、類(lèi)似或提高的效能。用于鑒別具有改善的性能(例如對(duì)靶分子的結(jié)合親和性提高)的已知化合物的改變的類(lèi)似物的合成和篩選是藥物化學(xué)中眾所周知的方法。
本文中使用的“接觸”具有常規(guī)意義，是指使得兩種或多種分子(例如，小分子有機(jī)化合物和多肽)混合，或者使得分子和細(xì)胞(例如，化合物和細(xì)胞)混合。接觸可以在體外發(fā)生，例如在試管或其它容器中，使得兩種或多種成分混合，或者使得化合物和細(xì)胞或細(xì)胞裂解產(chǎn)物混合。接觸也可以在細(xì)胞中或在位發(fā)生，例如通過(guò)在編碼兩種多肽的重組體多核苷酸的細(xì)胞中的共同表達(dá)使得兩種多肽在細(xì)胞中接觸，或在細(xì)胞裂解液中接觸。
術(shù)語(yǔ)“hedgehog”概括是指hedgehog家族的任何成員，包括sonic、indian、desert和tiggy winkle。該術(shù)語(yǔ)可用于表明蛋白或基因。該術(shù)語(yǔ)也用于描述不同動(dòng)物種屬中的同源/直系同源序列。
術(shù)語(yǔ)“hedgehog(Hh)信號(hào)通路”和“hedgehog(Hh)信號(hào)”可以交換使用，是指通常由信號(hào)級(jí)聯(lián)各成員所介導(dǎo)的事件鏈，例如hedgehog、patched(Ptch)、smoothened(Smo)和Gli。Hedgehog通路甚至可以在hedgehog蛋白不存在的情況下通過(guò)激活下游成分而激活。例如，Smo的過(guò)度表達(dá)可以在hedgehog不存在的情況下激活該通路。
Hh信號(hào)成分或Hh信號(hào)通路的成員是指參與Hh信號(hào)通路的基因產(chǎn)物。Hh信號(hào)成分經(jīng)常影響Hh信號(hào)在細(xì)胞/組織中的傳送，從而導(dǎo)致下游基因表達(dá)水平程度的改變和/或表型的改變。根據(jù)其生物學(xué)功能以及對(duì)下游基因激活/表達(dá)最終結(jié)果的作用，Hh信號(hào)成分可以分為正性和負(fù)性調(diào)節(jié)劑。正性調(diào)節(jié)劑為對(duì)Hh信號(hào)傳送具有正向作用的Hh信號(hào)成分，即當(dāng)Hh存在時(shí)能夠刺激下游生物學(xué)事件。實(shí)例包括hedgehog、Smo和Gli。負(fù)性調(diào)節(jié)劑為對(duì)Hh信號(hào)傳送具有負(fù)向作用的Hh信號(hào)成分，即當(dāng)Hh存在時(shí)能夠抑制下游生物學(xué)事件。實(shí)例包括(但不限于)Ptch和SuFu。
Hedgehog信號(hào)拮抗劑、Hh信號(hào)拮抗劑或Hh信號(hào)通路抑制劑是指能夠抑制陽(yáng)性Hh信號(hào)成分(例如hedgehog、Ptch或Gli)生物活性的成分，或者能夠下調(diào)Hh信號(hào)成分表達(dá)的成分。它們也包括能夠上調(diào)Hh信號(hào)成分的負(fù)性調(diào)節(jié)劑的成分。hedgehog信號(hào)拮抗劑可能涉及由hedgehog通路中任何基因編碼的蛋白，包括(但不限于)sonic、indian或desert hedgehog、smoothened、ptch-1、ptch-2、gli-1、gli-2、gli-3等。
本文中使用的“異源序列”或“異源核酸”是不同于特定宿主細(xì)胞來(lái)源的序列或核酸，或者，如果源自相同來(lái)源，它是采用其最初形式修飾而成。所以，宿主細(xì)胞中的異源基因包括已經(jīng)被修飾的基因，盡管它是特定宿主細(xì)胞的內(nèi)源性基因。通過(guò)例如采用限制性?xún)?nèi)切酶處理DNA產(chǎn)生DNA片段，異源序列可以發(fā)生改變，所述片段能夠可操作性地與啟動(dòng)子連接。技術(shù)(例如定點(diǎn)變異)也可以用于修飾異源核酸。
當(dāng)涉及蛋白和/或蛋白序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“同源”是指它們天然或人工的源自共同祖先的蛋白或蛋白序列。同樣，當(dāng)它們天然或人工的源自共同祖先的核酸或核酸序列時(shí)，則核酸和/或核酸序列為同源的。同源通常通過(guò)兩種或多種核酸或蛋白(或其序列)之間的序列相似性而推斷。用于確定同源的序列之間的相似性的準(zhǔn)確率取決于組織中的核酸和蛋白，但是通常需要至少25％的序列相似性才能確定同源。較高水平的序列相似性例如30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或更高也可以用于確定同源。
“宿主細(xì)胞”是指可以向其中引入異源多核苷酸的原核細(xì)胞或真核細(xì)胞。多核苷酸可以通過(guò)各種方法引入細(xì)胞中，例如電穿孔、磷酸鈣沉淀、顯微注射、轉(zhuǎn)化、病毒感染和/或類(lèi)似方法。
在描述腫瘤生長(zhǎng)或腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)所用的術(shù)語(yǔ)“抑制”是指原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤的延遲出現(xiàn)，原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤的緩慢發(fā)展，原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤的出現(xiàn)減少，疾病繼發(fā)作用的嚴(yán)重性降低或減小，或者腫瘤生長(zhǎng)中止和腫瘤衰退。術(shù)語(yǔ)“防止”是指原發(fā)性或繼發(fā)性腫瘤的發(fā)展或者疾病的任何繼發(fā)作用的完全抑制。在酶活性調(diào)節(jié)中，抑制是指酶活性的可逆性抑制或降低，包括競(jìng)爭(zhēng)性、無(wú)競(jìng)爭(zhēng)性和非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。這可以通過(guò)抑制劑對(duì)酶的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的作用而進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性區(qū)別，它可以根據(jù)基礎(chǔ)Michaelis-Menten速率方程進(jìn)行分析。當(dāng)抑制劑與游離酶結(jié)合從而與底物競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合在活性位點(diǎn)時(shí)，發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制。競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與酶進(jìn)行可逆性反應(yīng)從而形成酶-抑制劑復(fù)合物[EI]，類(lèi)似于酶-底物復(fù)合物。
在兩種核酸序列或氨基酸序列時(shí)，術(shù)語(yǔ)“序列同源性”是指當(dāng)在特定的比較窗口排列用于比較最大相應(yīng)性時(shí)，兩個(gè)序列中相同的殘基。“比較窗口”是指至少約20個(gè)鄰近位置的片段，通常約50至約200個(gè)，更通常約100至約150個(gè)，兩個(gè)序列最佳排列后，其中一個(gè)序列可以與鄰近位置的相同數(shù)量的參照序列進(jìn)行比較。用于比較的序列排列方法在本領(lǐng)域中是已知的。用于比較的最佳序列排列可以通過(guò)Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.1981，2482的局部同源運(yùn)算法則進(jìn)行；或者通過(guò)Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.1970，48443的排列運(yùn)算法則進(jìn)行；或者通過(guò)Pearson和Lipman，Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.1988，852444的相似性方法進(jìn)行；或這些運(yùn)算法則的計(jì)算機(jī)工具進(jìn)行(包括但不限于Intelligentics，Mountain View，CA的PC/Gene程序中的CLUSTAL；和Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA或TFASTA，Genetics Computer Group(GCG)，575Science Dr.，Madin，Wis.，U.S.A.)。CLUSTAL程序很好地描述于下列文獻(xiàn)Higgins和Sharp，Gene 1988，73237-244；Higgins和Sharp，CABIOS1989，5151-153；Corpet等，Nucleic Acids Res.1988，1610881-10890；Huang等，Computer Applications in the Biosciences 1992，8155-165；和Pearson等，Methods in Molecular Biology 1994，24307-331。排列也經(jīng)常通過(guò)檢查和手工排列進(jìn)行。在一類(lèi)實(shí)施方案中，多肽與參照多肽(例如hedgehog分子，例如通過(guò)BLASTP或CLUSTAL或任何其它可用排列軟件采用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定)具有至少70％、通常至少75％、任選至少80％、85％、90％、95％或99％或更高的相同。同樣，核酸也可以參考起始核酸進(jìn)行描述，例如，它們與參照核酸(例如通過(guò)BLASTN或CLUSTAL或任何其它可用排列軟件采用默認(rèn)參數(shù)測(cè)定)具有50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更高的相同。
“基本相同的”核酸或氨基酸序列是指通過(guò)上述程序(優(yōu)選BLAST)采用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)測(cè)定，包括與參照序列具有至少90％序列同源性的序列的核酸或氨基酸序列。序列同源性可以是至少95％、更特別至少98％，在某些實(shí)例中，至少為99％。例如，BLASTN程序(用于核苷酸序列)采用下列默認(rèn)參數(shù)字長(zhǎng)(W)為11，期望值(E)為10，M＝5，N＝-4，兩股比較。對(duì)于氨基酸序列而言，BLASTP程序采用下列默認(rèn)參數(shù)字長(zhǎng)(W)為3，期望值(E)為10，BLOSUM62記分矩陣(參見(jiàn)Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1989，8910915)。序列同源性的百分率通過(guò)比較窗口比較兩種最佳排列的序列進(jìn)行測(cè)定，其中比較窗口中的多核苷酸序列部分與兩種序列最佳排列的參照序列(不包含增加或缺失)相比可能包含增加或缺失(即缺口)。通過(guò)測(cè)定位置的數(shù)目計(jì)算百分率，在此位置上出現(xiàn)兩種序列中相同核酸堿或氨基酸殘基，從而獲得匹配位置的數(shù)目，用匹配位置的數(shù)目除以比較窗口中位置的總數(shù)目，結(jié)果再乘以100，得到序列同源性的百分率。實(shí)質(zhì)同源性可以具有超過(guò)至少約50個(gè)殘基長(zhǎng)度的序列區(qū)域，更特別具有超過(guò)至少約100個(gè)殘基的區(qū)域。在某些實(shí)例中，序列至少約150個(gè)殘基基本上是相同的，或者序列在編碼區(qū)域的全長(zhǎng)內(nèi)基本上是相同的。
在描述參照蛋白(例如，hedgehog通路成員)或其片段的生物學(xué)活性時(shí)，術(shù)語(yǔ)“調(diào)節(jié)”是指蛋白表達(dá)水平或其它生物學(xué)活性的改變。例如，調(diào)節(jié)可能引起參照蛋白的表達(dá)水平、蛋白的酶修飾(例如磷酸化)、參照蛋白的結(jié)合特性(例如，與其它分子的結(jié)合)或任何其它生物學(xué)(例如，酶的)功能或免疫特性的增強(qiáng)或降低?；钚缘母淖兛赡芷鹨蛴诶缫换蚨鄠€(gè)編碼參照蛋白的基因表達(dá)的增加或減少，起因于編碼蛋白的mRNA的穩(wěn)定性的增強(qiáng)或降低，或者起因于參照蛋白生物學(xué)活性的改變。這種改變也可能是由于調(diào)節(jié)參照蛋白(例如，能夠磷酸化參照蛋白的激酶)的其它分子的活性。
參照蛋白的調(diào)節(jié)可以是上調(diào)(即激活或刺激)或下調(diào)(即抑制或阻止)。參照蛋白調(diào)節(jié)劑的作用模式可能是直接的，例如通過(guò)與蛋白結(jié)合或與編碼蛋白的基因結(jié)合，或者是間接的，例如通過(guò)與其它分子結(jié)合和/或修飾(例如，酶修飾)其它分子，所述其它分子能夠調(diào)節(jié)參照蛋白。
術(shù)語(yǔ)“個(gè)體”包括哺乳動(dòng)物，特別是人類(lèi)。它也包括其它非人類(lèi)動(dòng)物，例如牛、馬、羊、豬、貓、犬、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、猴。
術(shù)語(yǔ)“治療”是指中止腫瘤生長(zhǎng)并使得腫瘤部分或完全消退。術(shù)語(yǔ)“治療”包括給予化合物或成分以預(yù)防或延遲疾病(例如白血病)的癥狀、并發(fā)癥或生化指標(biāo)發(fā)作，緩解疾病、病癥或不適的癥狀或者中止或抑制其進(jìn)一步的發(fā)展。治療可以是預(yù)防性(防止或延遲疾病的發(fā)作，或者防止其臨床或亞臨床癥狀的顯現(xiàn))或者是疾病顯現(xiàn)后治療性的抑制或緩解癥狀。
參照分子的“變體”是指與完整參照分子或其片段的結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性基本相似的分子。因此，只要兩種分子具有相似的活性，則即使組合物或分子之一的二級(jí)、三級(jí)或四級(jí)結(jié)構(gòu)與另一種不同，或者即使氨基酸殘基的序列不同，也認(rèn)為它們是變體。

具體實(shí)施例方式 本發(fā)明提供了組合物及其藥用組合物，它們可以用于抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和治療各種癌癥。
更特別的是，本發(fā)明提供了組合物，它包含能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分和能夠抑制BCR-ABL的第二種成分。該組合物可以用于抑制淋巴和骨髓造血腫瘤的生長(zhǎng)和繁殖，用于治療已知與蛋白酪氨酸激酶(例如Src、BCR-ABL和c-kit)有關(guān)的癌癥。在特別的實(shí)施方案中，組合物用于治療BCR-ABL-陽(yáng)性慢性髓性白血病(CML)和急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)。
慢性髓性白血病特征在于攜有Philadelphia易位的白血病干細(xì)胞克隆的擴(kuò)張，超過(guò)了非惡性造血干細(xì)胞。根據(jù)該發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明基本斷定，通過(guò)上調(diào)Smo激活hedgehog信號(hào)通路，BCR-ABL直接增加了造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞的自我更新。BCR-ABL能夠在小鼠和人HSCs中上調(diào)Smo表達(dá)并激活hedgehog信號(hào)通路。
BCR-ABL陽(yáng)性骨髓培養(yǎng)物中Smo活性的藥理學(xué)抑制能夠在體外抑制BCR-ABL正性自我更新細(xì)胞的集落形成性能。采用AMN107(Abl抑制劑)和環(huán)巴胺(Smo抑制劑)聯(lián)合治療白血病小鼠導(dǎo)致體內(nèi)BCR-ABL正性自我更新細(xì)胞的減少，與單獨(dú)采用AMN107治療的小鼠相比，復(fù)發(fā)時(shí)間增加了3倍。因此，通過(guò)上調(diào)Smo使得hedgehog信號(hào)內(nèi)在激活，BCR-ABL能夠增加白血病干細(xì)胞的自我更新。因此，單獨(dú)抑制Hh通路或者聯(lián)合使用Abl抑制劑可以作為減少BCR-ABL陽(yáng)性白血病中惡性干細(xì)胞匯集的有效治療策略。
本發(fā)明的治療方法采用能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的成分并聯(lián)合應(yīng)用能夠抑制BCR-ABL的成分，用于抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和繁殖，特別是血液和淋巴系統(tǒng)癌癥，例如白血病和骨髓瘤。這些方法包括使得此腫瘤細(xì)胞(在體外或者在體內(nèi))與組合物接觸，所述組合物包含Hh信號(hào)通路抑制劑和BCR-ABL抑制劑。
A.抑制Hedgehog信號(hào)的成分 本領(lǐng)域中已知的能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的各種成分可以用于實(shí)施本發(fā)明。這些成分包括能夠直接或間接調(diào)節(jié)hedgehog信號(hào)通路成員的生物學(xué)活性(例如，酶活性)的有機(jī)化合物。它們也包括能夠特異性地靶向編碼hedgehog信號(hào)通路成員的基因或mRNA的成分。hedgehog信號(hào)通路ma的其它拮抗劑也用于實(shí)施本方法，包括抗體或能夠靶向hedgehog信號(hào)通路成員(例如，跨膜受體)的其它結(jié)合成分。
Hh信號(hào)通路為發(fā)育性通路，它在胎兒和成人造血干細(xì)胞(HSCs)中起作用。(Trowbridge等，Proc Natl Acad Sci USA 2006，10314134-9)。由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的Hedgehog配體(Shh，Ihh和Dhh)與七-跨膜受體Ptch結(jié)合。與Ptch結(jié)合的配體釋放與Smo結(jié)合的Ptch，第二種七-跨膜受體。這導(dǎo)致Smo的構(gòu)象改變，使得下游信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)Gli轉(zhuǎn)錄因子(Gli1，Gli2，Gli3)，使靶基因如Gli1、Ptch1、cyclin D1和Bcl2轉(zhuǎn)錄(Duman-Scheel等，Nature2002，417299-304)。在胚胎形成的早期階段，內(nèi)臟內(nèi)胚葉分泌的Indianhedgehog誘導(dǎo)了小鼠胚胎卵黃囊中早期造血細(xì)胞的形成。在Smo中有缺陷突變的或者采用Hh信號(hào)抑制劑環(huán)巴胺處理的斑馬魚(yú)胚胎在成熟HSC形成中顯示有缺陷(Gering等，Dev.Cell.2005，8389-400)。最近的出版物表明hedgehog信號(hào)在成熟HSCs的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)中具有作用(Trowbridge等，supra)。
為了實(shí)施本發(fā)明的治療方法，可以調(diào)節(jié)數(shù)種Hh信號(hào)通路成分。這些包括Hh信號(hào)的正性調(diào)節(jié)劑(可以被拮抗)和負(fù)性調(diào)節(jié)劑(可以被激動(dòng))。Hedgehog(Hh)(包括例如Ihh、Shh和Dhh)、Smoothened(Smo)和Gli是正性調(diào)節(jié)劑的實(shí)例，而Patched(Ptch)和稠合蛋白(Fu)抑制劑為負(fù)性調(diào)節(jié)劑的實(shí)例。各種屬的所有Hh信號(hào)通路基因易于根據(jù)獲自公共和私有數(shù)據(jù)庫(kù)(例如GenBank、EMBL或FlyBase)的序列被克隆。
hedgehog信號(hào)通路的多種抑制劑在本領(lǐng)域中是已知的，可以容易地用于hedgehog信號(hào)通路的實(shí)施。某些Hh信號(hào)拮抗劑為小分子化合物，它靶向Hh通路的關(guān)鍵成員(例如Smo)，例如環(huán)巴胺、SANT1和Cur61414(Katoh等，Maycer Biol Ther.2005，41050-4；Williams等，Proc Natl Acad Sci USA.2003，1004616-21)。例如，環(huán)巴胺能夠通過(guò)直接與Smo結(jié)合而抑制hedgehog信號(hào)通路。Hh信號(hào)的其它拮抗劑通過(guò)作用于其它分子能夠間接抑制Hh通路，所述分子能夠影響Hh信號(hào)。例如，佛司可林能夠激活蛋白激酶A，而該激酶又能夠阻斷Smo下游Hh信號(hào)(參見(jiàn)例如，Yao等，DevBiol.2002，246356-65)。Hh信號(hào)的其它有機(jī)化合物抑制劑描述于例如美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)US20060063779(Gunzner等，2006)、US20050222087(Beachy，2005)和US 20010034337(Dudek等，2001)。這些Hh信號(hào)拮抗劑的任一種都可以用于實(shí)施本發(fā)明的治療方法。某些化合物可以獲自商業(yè)(例如，環(huán)巴胺或SANT-1)。其它可以采用有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域中的常規(guī)方法容易地合成。
在某些實(shí)施方案中，采用的Hh信號(hào)拮抗劑可以與能夠特異性地抑制Hh信號(hào)通路激活的成分結(jié)合。例如，當(dāng)沒(méi)有與其配體結(jié)合時(shí)，跨膜受體Ptch能夠與Smo結(jié)合并阻斷其功能。因此，可以抑制或阻斷hedgehog與Ptch結(jié)合的結(jié)合成分可以用于拮抗Hh信號(hào)?？梢允褂棉卓箘┛贵w或抗體同系物以及其它分子，例如hedgehog的天然結(jié)合蛋白的可溶形式。例如，單克隆抗體如抗-hedgehog或抗-patched抗體同系物可以用于實(shí)施本發(fā)明方法。這些抗體能夠阻斷hedgehog與Ptch的結(jié)合，但不能激活Hh信號(hào)。
在某些方法中，可以采用能夠與hedgehog多肽特異性結(jié)合的抗體。采用中和hedgehog的抗體從而抑制Hh信號(hào)的技術(shù)是眾所周知的并在本領(lǐng)域中常規(guī)應(yīng)用。參見(jiàn)例如，Ahlgren等，Curr Biol.1999，91304-14；Cobourne等，J Dent Res.2001，801974-9；Hall等，Dev Biol.2003，255263-77；Berman等，Nature 2003，425846-51。此類(lèi)hedgehog中和抗體的實(shí)例為單克隆抗體克隆5E1。該抗體可以獲自Developmental Studies HybridomaBank，University of Iowa。
在某些其它實(shí)施方案中，可以采用衍生自Ptch的結(jié)合成分的可溶形式。這些包括可溶性Ptch肽、Ptch融合蛋白或雙功能化的Ptch/Ig融合蛋白。這些可溶性成分中的某些含有多肽片段，其序列與攜有其配體結(jié)合位點(diǎn)的Ptch片段序列相同或基本相同。例如，能夠與hedgehog結(jié)合的Ptch或其片段的可溶形式可以用于與Ptch在細(xì)胞上競(jìng)爭(zhēng)與hedgehog的結(jié)合，從而阻斷Hh信號(hào)的激活。另外，能夠與Ptch結(jié)合但是不能誘導(dǎo)hedgehog依賴(lài)性信號(hào)的可溶性hedgehog突變體也可以用于實(shí)施本發(fā)明。
涉及人類(lèi)患者的某些治療應(yīng)用可以采用人類(lèi)來(lái)源的Hh通路的抗體拮抗劑。這些包括人抗體、人源化抗體、嵌合抗體、Fab、Fab′、F(ab′)2或F(v)抗體片段，以及抗體重鏈或輕鏈的單聚體或二聚體或其混合物。嵌合抗體為抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈、重鏈或者兩個(gè)鏈的所有的或部分鉸鏈區(qū)和恒定區(qū)都可以被人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的相應(yīng)域所替代。人源化抗體為抗體同系物，除具有人恒定區(qū)序列外，它在可變區(qū)也具有某些或所有其非-CDR氨基酸殘基被人免疫球蛋白的相應(yīng)氨基酸所替代。人抗體為抗體同系物，其中免疫球蛋白輕鏈和重鏈的所有的氨基酸均衍生自人類(lèi)。
抗體同系物包括完整抗體，由通過(guò)二硫鍵連接的免疫球蛋白輕鏈和重鏈構(gòu)成。它也包含有一或多個(gè)多肽組成的蛋白，所述多肽選自免疫球蛋白輕鏈、免疫球蛋白重鏈及其抗原-結(jié)合片段，它們能夠與一或多個(gè)抗原(即hedgehog或patched)結(jié)合。由一個(gè)以上多肽組成的抗體同系物的成分多肽可以任選為二硫化物結(jié)合的或者共價(jià)交聯(lián)的?？贵w同系物也包括部分完整的抗體，它保留了抗原-結(jié)合特異性，例如，F(xiàn)ab片段、Fab′片段、F(ab′)2片段、F(v)片段、重鏈單聚體或二聚體、輕鏈單聚體或二聚體、由一個(gè)重鏈和一個(gè)輕鏈構(gòu)成的二聚體等。因此，衍生自上述抗體的抗原結(jié)合片段以及全長(zhǎng)的二聚體或三聚體多肽也可以用于實(shí)施本發(fā)明。
抗-hedgehog和抗-Patched抗體同系物可以根據(jù)本領(lǐng)域中已知的方法生產(chǎn)，例如，Monoclonal Antibodies--Production，Engineering and ClinicalApplications(單克隆抗體的生產(chǎn)、設(shè)計(jì)及臨床應(yīng)用)，Ritter等，Eds.，Cambridge University Press，Cambridge，UK，1995；和Harlow和Lane，Antibodies，A Laboratory Manua(抗體，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè))l，Cold Spring Harb或Press，3rd ed.，2000。對(duì)抗hedgehog或patched的人單克隆抗體同系物可以采用體外-致敏的人脾細(xì)胞制備，如下列文獻(xiàn)所述Boemer等，J.Immunol.1991，14786-95?；蛘?，它們可以根據(jù)下列文獻(xiàn)中所述方法制備例如，Persson等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1991，882432-2436；Huang和Stollar，J.Immunol.Methods 1991，141227-236；美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)10/778,726(Publication No.20050008625)；和美國(guó)專(zhuān)利號(hào)5,798,230和5,789,650。能夠與hedgehog或patched蛋白結(jié)合的人源化重組體抗體同系物采用下列文獻(xiàn)中描述的方法產(chǎn)生例如，Riechmann等，Nature 1988，332323-327；Verhoeyen等，Science1988，2391534-1536；Queen等，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 1989，8610029；和Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA1989，863833。
本發(fā)明的某些治療方法采用能夠拮抗hedgehog信號(hào)通路的核酸成分。一般而言，這些成分能夠下調(diào)一或多個(gè)編碼陽(yáng)性Hh信號(hào)成分的基因的表達(dá)，例如hedgehog、Smo或Gli。這些包括雙鏈RNAs，例如短干擾RNA(siRNA)和短發(fā)夾RNA(shRNAs)、微小RNA(miRNA)、反義核酸和互補(bǔ)DNA(cDNA)。雙鏈RNAs對(duì)內(nèi)源性基因功能和表達(dá)的干擾在各種有機(jī)體內(nèi)均有顯示，例如線蟲(chóng)(C.elegans)，如Fire等在Nature 1998，391806-811中描述；果蠅(drosophilia)，如Kennerdell等在Cell 1998，951017-1026中描述；鼠胚胎，如Wianni等在Nat.Cell Biol.2000，270-75中描述。此類(lèi)雙鏈RNA可以通過(guò)單鏈RNA的體外轉(zhuǎn)錄合成，自模板的雙方向閱讀并在體外進(jìn)行正義和反義RNA鏈的退火(annealing)。雙鏈RNA也可以自cDNA載體建構(gòu)物合成，其中靶基因在通過(guò)反向重復(fù)方法分離的相反方向克隆。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)錄，互補(bǔ)鏈再退火。在本發(fā)明中，為了拮抗Hh信號(hào)，通過(guò)適當(dāng)構(gòu)建物的轉(zhuǎn)染可以將靶向Hh信號(hào)通路的正性調(diào)節(jié)劑的雙鏈RNA引入細(xì)胞(例如淋巴瘤細(xì)胞)中。
在某些實(shí)施方案中，Hh信號(hào)的siRNAs拮抗劑可以用于實(shí)施本發(fā)明。siRNA拮抗劑可以在hedgehog信號(hào)通路的任何位點(diǎn)調(diào)節(jié)hedgehog信。例如，它們可以通過(guò)拮抗hedgehog自身來(lái)調(diào)節(jié)Hh信號(hào)，或任何其它正性Hh信號(hào)成分，例如Smo或Gli。SiRNAs通常為約19-30個(gè)核苷酸長(zhǎng)度，優(yōu)選21-23個(gè)核苷酸長(zhǎng)度。它們?yōu)殡p鏈，可以在每一端包括短突出段(shortoverhangs)。SiRNAs可以化學(xué)合成，或者采用本領(lǐng)域已知的方法以重組的方法生產(chǎn)。siRNAs的重組生產(chǎn)通常包括短發(fā)夾RNAs(shRNAs)的轉(zhuǎn)錄，它們可以高效進(jìn)行加工，從而在細(xì)胞中形成siRNAs。參見(jiàn)例如Paddison等Proc Natl Acad Sci USA 2002，991443-1448；Paddison等Genes&Dev.2002，16948-958；Sui等Proc Natl Acad Sci USA 2002，85515-5520；Brummelkamp等Science 2002，296550-553；Caplen等，Proc Natl AcadSci USA 2001，989742-9747；和Elbashir等，EMBO J.2001，206877-88。
在某些實(shí)施方案中，Hh信號(hào)的核酸拮抗劑可以是雙鏈發(fā)夾RNA。發(fā)夾RNAs可以在外源性合成，或者可以通過(guò)RNA聚合酶III啟動(dòng)子在體內(nèi)轉(zhuǎn)錄形成。制備和使用此類(lèi)用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中基因沉默的發(fā)夾RNAs的實(shí)例描述于例如Paddison等，Genes Dev.2002，16948-58；McCaffrey等，Nature 2002，41838-9；McManus等，RNA 2002，8842-50；和Yu等，ProcNatl Acad Sci USA 2002，996047-52。優(yōu)選此類(lèi)發(fā)夾RNAs在細(xì)胞或動(dòng)物中制備，從而保證需要基因的連續(xù)和穩(wěn)定抑制。本領(lǐng)域中已知的是，siRNAs可以通過(guò)在細(xì)胞中處理發(fā)夾RNA而產(chǎn)生。
B.抑制BCR-ABL的成分 本領(lǐng)域中已知的各種BCR-ABL抑制劑可以用于實(shí)施本發(fā)明，包括但不限于ABL抑制劑、ABL和Src-家族激酶抑制劑、Aurora激酶抑制劑和BCR-ABL的非-ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
酪氨酸激酶的Src家族能夠調(diào)節(jié)參與細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、遷移和生存的多重細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它們中的多種與腫瘤形成、腫瘤轉(zhuǎn)移和血管生成有關(guān)。(Weisberg等，Nat.Rev.Cancer 2007，7345-356)。源自Src家族的激酶可以在造血細(xì)胞中表達(dá)(Blk，F(xiàn)gr，F(xiàn)yn，Hck，Lck，Lyn，c-Src和Yes)。另外，BCR-ABL能夠通過(guò)磷酸化和通過(guò)結(jié)合Src蛋白激活Src激酶，或者僅通過(guò)與Src蛋白結(jié)合激活Src激酶。另外，發(fā)現(xiàn)獲自伊馬替尼抗性患者的細(xì)胞裂解物可以過(guò)度表達(dá)Lyn激酶，選擇的對(duì)伊馬替尼有抗性的人CMLK562細(xì)胞(也能夠過(guò)度表達(dá)Lyn)的繁殖可以通過(guò)Abl/Src抑制劑(PD180970)抑制。因?yàn)镾rc家族激酶能夠調(diào)節(jié)BCR-ABL信號(hào)級(jí)聯(lián)的下游成分，因此，這些激酶的抑制能夠提供與BCR-ABL抑制的協(xié)同作用，可能對(duì)抗選擇性生存通路的有效性，在該通路中CML細(xì)胞能夠在BCR-ABL抑制存在下使用。因此，采用BCR-ABL和Src-家族激酶抑制劑的聯(lián)合治療也可以在CML和/或ALL中對(duì)抗BCR-ABL的耐藥性突變體的致癌潛力。(Manley等，Biochim.Biophys.Acta 2005，17543-13)。達(dá)沙替尼(BMS-354825)、博舒替尼(SKI-606)、INNO-404(NS-187)和AZD05030為雙重ABL-Src抑制劑的實(shí)例。
絲氨酸/蘇氨酸激酶的Aurora家族對(duì)有絲分裂進(jìn)程是重要的。有報(bào)道顯示，Aurora-A在各種人類(lèi)癌癥中均過(guò)度表達(dá)，其過(guò)度表達(dá)能夠在培養(yǎng)的人類(lèi)和嚙齒動(dòng)物細(xì)胞中誘導(dǎo)非整倍性、中心體擴(kuò)增和致癌性轉(zhuǎn)化。(Zhang等，Oncogene 2004，238720-30)。MK-0457(Merck；最初由VertexPharmaceuticals以VX-680的名稱(chēng)研發(fā))，它在納摩爾濃度范圍是所有三種Aurora激酶和FLT3的有效抑制劑，是ABL和JAK2(它們是髓性增生性疾病的相關(guān)靶點(diǎn))的中度至強(qiáng)度抑制劑。MK-0457也能夠在轉(zhuǎn)化的Ba/F3細(xì)胞中抑制T315I突變體BCR-ABL的自體磷酸化，其IC50為～5μM，盡管它也能夠以亞微摩爾濃度抑制細(xì)胞增殖。
ATP-競(jìng)爭(zhēng)性BCR-ABL抑制的潛在備選方法是采用能夠通過(guò)非-ATP競(jìng)爭(zhēng)性別構(gòu)機(jī)制或者通過(guò)阻止底物與激酶的結(jié)合而抑制激酶活性的分子。該策略的優(yōu)點(diǎn)在于由于作用于不同的結(jié)合位點(diǎn)，所以伊馬替尼抗性突變體對(duì)此類(lèi)抑制劑不可能具有抗性。BCR-ABL-依賴(lài)性細(xì)胞增殖抑制劑的高通量篩選使得作為原型抑制劑的3-[6-[[4-(三氟甲氧基)苯基]氨基]-4-嘧啶基]苯甲酰胺(GNF-2)的鑒定得以實(shí)現(xiàn)，該抑制劑能夠與BCR-ABL的十四酰結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，導(dǎo)致ABL酪氨酸激酶活性的變構(gòu)抑制。GNF-2能夠抑制Ba/F3細(xì)胞的增殖，所述細(xì)胞采用p210非突變BCR-ABL以及酶的E255V和M351T突變體轉(zhuǎn)染。(Weisberg等，Nat.Rev.Cancer 2007，同上)。
表1顯示了可以用于實(shí)施本發(fā)明的實(shí)例性BCR-ABL抑制劑，包括尼羅替尼(AMN107)、伊馬替尼(STI571)、2，6，9-三取代的嘌呤類(lèi)似物(例如，AP23464)、AZD-0530、博舒替尼、CPG070603、吡啶并[2，3-d]嘧啶化合物(例如，達(dá)沙替尼)、PD166326、PD173955、PD180970)、ON012380、3-取代的苯甲酰胺衍生物(例如，INNO-406)、MK-0457、PHA-739358和GNF-2。(參見(jiàn)例如，Weisberg等，Nat.Rev.Cancer 2007，同上；Tauchi等，Int.J.Hematology 2006，83294-300；Manley等，Biochim.Biophys.Acta 2005，同上；Ge等，J.Med.Chem.2006，494606-4615；Adrian等，Nat.Chem.Biol.2006，295-102；Asaki等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2006，161421-1425，它們每一篇文獻(xiàn)均引入本文作為參考)。

表1
表1 C.待治療的疾病和病癥 本發(fā)明的組合產(chǎn)品可以用于治療各種癌癥。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的成分，它可以與能夠抑制BCR-ABL成分組合使用，用于抑制下列譜系的造血腫瘤的生長(zhǎng)和增殖淋巴系統(tǒng)，包括白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)、急性成淋巴細(xì)胞白血病、B-細(xì)胞淋巴瘤、T-細(xì)胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、毛發(fā)細(xì)胞淋巴瘤、組織細(xì)胞淋巴瘤和Burkitts淋巴瘤；髓性系統(tǒng)，包括急性和慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生異常綜合征、髓性白血病和原髓細(xì)胞白血病。
本發(fā)明的組合產(chǎn)品也可以用于治療已知與蛋白酪氨酸激酶有關(guān)的癌癥，所述激酶例如Src、BCR-ABL和c-kit。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合產(chǎn)品可以用于治療對(duì)化療成分敏感和抗性的癌癥，所述成分靶向BCR-ABL和c-kit。在具體的實(shí)施方案中，本發(fā)明的組合產(chǎn)品可以用于治療BCR-ABL-陽(yáng)性CML和ALL。
慢性髓性白血病(CML)為骨髓癌癥，其特征在于在骨髓中占優(yōu)勢(shì)的髓性細(xì)胞的克隆增生增加和失調(diào)。其年發(fā)生率為每100,000人中1-2人，對(duì)男人的影響略高于女人。CML在西方人群中約為所有成人白血病的15-20％，在美國(guó)或歐洲每年有4,500個(gè)新病例發(fā)生。(Faderl等，N.Engl.J.Med.1999，341164-72)。
CML為克隆疾病，它源自單一轉(zhuǎn)化的造血干細(xì)胞(HSC)或多功能祖細(xì)胞(MPP)，所述細(xì)胞攜有Philadelphia易位t(9/22)。該易位的基因產(chǎn)物(融合致癌基因BCR-ABL)的表達(dá)誘導(dǎo)了分子改變，這種改變導(dǎo)致了惡性造血作用的擴(kuò)張，包括白血病干細(xì)胞(LSC)匯集以及非惡性造血作用的過(guò)度增長(zhǎng)和抑制(Stam等，Mol Cell Biol.1987，71955-60)。髓性細(xì)胞(粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞、紅細(xì)胞)也包括B-和T-細(xì)胞均能夠表達(dá)BCR-ABL，這說(shuō)明MPP或HSC是疾病的起始點(diǎn)。(Fialkow等，J.Clin.Invest.1978，62815-23；Takahashi等，Blood 1998，924758-63)。與引起AML的致癌基因如MOZ-TIF2或MLL-ENL相反，BCR-ABL不會(huì)使得定向祖細(xì)胞具有自我更新性能，相反能夠利用和提高具有自我更新能力的細(xì)胞的自我更新性能，如HSCs或MPPs。在疾病期間，白血病干細(xì)胞匯集增加，在后期，急變期，幾乎所有CD34+CD38-細(xì)胞均攜有Philadelphia易位。
伊馬替尼甲磺酸鹽(STI571，

)成為CML的標(biāo)準(zhǔn)療法，其響應(yīng)率超過(guò)96％，通過(guò)抑制BCR-ABL活性而起作用。然而，盡管最初能夠獲得成功，但是由于在BCR-ABL中產(chǎn)生了點(diǎn)突變，患者最終會(huì)對(duì)伊馬替尼甲磺酸鹽產(chǎn)生抗性。因此考慮到伊馬替尼甲磺酸鹽的局限性，需要治療CML的改善方法。
另外，預(yù)期本發(fā)明的組合產(chǎn)品可以用于治療癌癥，包括膀胱癌(包括加重的和轉(zhuǎn)移性膀胱癌)、乳癌、結(jié)腸癌(包括結(jié)直腸癌)、腎癌、肝癌、肺癌(包括小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌以及肺腺癌)、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、泌尿生殖道癌、淋巴系統(tǒng)癌、直腸癌、喉癌、胰腺癌(包括外分泌胰腺癌)、食道癌、胃癌、膽囊癌、宮頸癌、甲狀腺癌和皮膚癌(包括鱗狀細(xì)胞癌)；中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和神經(jīng)鞘瘤；間質(zhì)起源的腫瘤，包括纖維肉瘤、橫紋肌肉瘤和骨肉瘤；其它腫瘤，包括黑素瘤、著色性干皮病、角化棘皮瘤、精原細(xì)胞瘤、濾泡性甲狀腺癌和畸胎癌。也預(yù)期本發(fā)明組合產(chǎn)品可以用于治療肥大細(xì)胞增多癥、生殖細(xì)胞腫瘤、兒童肉瘤和其它癌癥。
本文中上述治療方法可以與其它癌癥療法聯(lián)合應(yīng)用。例如Hh拮抗劑可以與BCR-ABL抑制劑聯(lián)合給藥，可以輔助以任何治療方式，例如化療、放療和/或手術(shù)療法。例如，它們可以與一或多種化療藥物或免疫治療藥物聯(lián)合使用；可以在其它治療方案結(jié)束后使用?？梢栽诒景l(fā)明組合物和方法中使用的化療藥物的實(shí)例包括但不限于蒽環(huán)類(lèi)、烷化劑(例如，絲裂霉素C)、烷基磺酸酯類(lèi)、氮雜環(huán)丙烷類(lèi)、乙基亞胺類(lèi)、甲基三聚氰胺類(lèi)(methylmelamines)、氮芥類(lèi)、亞硝基脲類(lèi)、抗生素類(lèi)、抗代謝物類(lèi)、葉酸類(lèi)似物(例如，二氫葉酸還原酶抑制劑，如甲氨蝶呤)、嘌呤類(lèi)似物、嘧啶類(lèi)似物、酶類(lèi)、鬼臼毒素類(lèi)(podophyllotoxins)、含鉑藥物、干擾素類(lèi)和白介素類(lèi)。
可以在本發(fā)明組合物和方法中使用的已知化療藥物的具體實(shí)例包括但不限于白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯佐替派、諾家霉素、美烏替派、尿烷亞胺、六甲蜜胺、三亞乙基三聚氰胺、三亞乙基磷酰胺、三亞乙基三磷酰胺、三羥甲蜜胺、苯丁酸氮芥、萘氮芥、環(huán)磷酰胺、雌氮芥、異環(huán)磷酰胺、氮芥、鹽酸氮芥氧化物、美法侖、新氮芥、苯芥膽甾醇、潑尼莫司汀、曲磷胺、烏拉莫司汀、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、達(dá)卡巴嗪、甘露氮芥、二溴甘露醇、二溴衛(wèi)矛醇、哌泊溴烷、aclacinomycins、放線菌素F(1)、氨曲霉素、重氮絲氨酸、博來(lái)霉素、放線菌素C、卡柔必星、嗜癌素、色霉素、放線菌素D、柔紅霉素、柔毛霉素、6-二偶氮-5-氧代-1-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、絲裂霉素C、麥考酚酸、諾加霉素、橄欖霉素、培洛霉素、普卡霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、鏈黑菌素、鏈脲霉素、殺結(jié)核菌素、烏苯美司、凈司它丁、佐柔比星、二甲葉酸、甲氨蝶呤、碟羅呤、曲美沙特、氟達(dá)拉濱、6-巰基嘌呤、硫醚嘌呤、硫鳥(niǎo)嘌呤、安西它濱、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脫氧尿苷、去氧氟尿苷、依諾它濱、氟尿苷、氟尿嘧啶、替加氟、L-天冬酰胺酶、阿法鏈道酶(pulmozyme)、醋葡醛內(nèi)酯、醛磷酰胺苷(aldophosphamide glycoside)、氨基酮戊酸、安吖啶、bestrabucil、比山群、卡鉑、順鉑、defofamide、地美可辛、地吖醌、elfornithine、依利醋銨、乙環(huán)氧啶、依托泊苷、氟它胺、硝酸鎵、羥基脲、干擾素-α、干擾素-β、干擾素-γ、白介素-2、香菇多糖、氯尼達(dá)明、潑尼松、地塞米松、亞葉酸、丙脒腙、單哌潘生丁、二胺硝吖啶、噴司它丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、鬼臼酸、2-乙基酰肼、丙卡巴肼、雷佐生、西佐喃、螺旋鍺、紫杉醇、它莫昔芬、替尼泊苷、細(xì)交鏈孢菌酮酸、三乙撐亞胺苯醌、2，2′，2″-三氯代三乙胺、尿烷、長(zhǎng)春堿、長(zhǎng)春新堿和長(zhǎng)春地辛。
本發(fā)明方法可以用于治療原發(fā)性、復(fù)發(fā)性、轉(zhuǎn)化性或頑固性癌癥。通常，復(fù)發(fā)性癌癥患者需要經(jīng)過(guò)一或多種治療，包括化療、放療、骨髓移植、激素療法、手術(shù)治療等。在對(duì)此類(lèi)治療有響應(yīng)的患者中，它們顯示穩(wěn)定的病情，部分響應(yīng)(即腫瘤或癌癥的標(biāo)志水平減少了至少50％)或完全響應(yīng)(即腫瘤以及標(biāo)志變得不可檢測(cè))。無(wú)論是哪種情況，如果癌癥隨后可能再現(xiàn)，均表示癌癥復(fù)發(fā)。
D.藥用組合物和給藥 本發(fā)明組合物可以在無(wú)菌條件下單獨(dú)給藥于需要治療的個(gè)體。在具體的實(shí)施方案中，它們可以作為藥用組合物的活性成分給藥。本發(fā)明的藥用組合物可以含有有效量的能夠抑制hedgehog信號(hào)通路的成分以及聯(lián)合使用的能夠抑制BCR-ABL的成分以及其一或多種可接受的載體。組合物也可以含有上述第三種治療成分，例如化療藥物或其它抗癌藥物。
藥用載體可以使得組合物改善或穩(wěn)定，或使得組合物易于制備?？伤幱幂d體可以根據(jù)待給藥的特定組合物(例如，核酸、蛋白或其它類(lèi)型的化合物)以及用于組合物給藥的特定方法而部分確定。它們也應(yīng)當(dāng)是藥學(xué)上和生理學(xué)上可接受的，即它們與其它成分是相容的，對(duì)患者無(wú)害。根據(jù)需要給藥制劑的形式，它們可以采用各種形式，例如口服、舌下、直腸、鼻腔或腸胃外形式。例如，抗腫瘤化合物可以與載體蛋白例如卵白蛋白或血清白蛋白在其給藥前絡(luò)合，從而提高穩(wěn)定性或藥理學(xué)性能。
有各種本發(fā)明藥用組合物的適當(dāng)制劑(參見(jiàn)例如，RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy(藥物科學(xué)與實(shí)踐)，Mack Publishing Co.，第20版.，2000)?？伤幱幂d體包括但不限于糖漿、水、等滲鹽水溶液、5％葡萄糖的水溶液或緩沖的乙酸鈉或乙酸銨溶液、油、甘油、醇類(lèi)、矯味劑、防腐劑、著色劑、淀粉類(lèi)、糖類(lèi)、稀釋劑、制粒劑、潤(rùn)滑劑和粘合劑等。載體也可以包括緩釋物質(zhì)，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，單獨(dú)使用或者與蠟一起使用。
藥用組合物可以制成各種形式，例如顆粒劑、片劑、丸劑、栓劑、膠囊、混懸液、膏藥、洗劑等。制劑中治療活性化合物的濃度可以在重量比為0.1-100％的范圍內(nèi)變動(dòng)。治療制劑可以根據(jù)制藥領(lǐng)域中眾所周知的任何方法制備。參見(jiàn)例如，Gilman等編輯的Goodman and Gilman′sThePharmacological Bases of Therapeutics，第8版，Pergamon Press，1990；RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy(藥物科學(xué)與實(shí)踐)，Mack Publishing Co.，第20版，2000；Avis等編輯的Pharmaceutical DosageFormsParenteral Medications(藥物劑型非腸道給藥)，Marcel Dekker出版，Inc.，N.Y.，1993；Lieberman等編輯的Pharmaceutical Dosage FormsTablets(藥物劑型片劑)，Marcel Dekker出版，Inc.，N.Y.，1990；和Lieberman等編輯的Pharmaceutical Dosage FormsDisperse Systems(藥物劑型分散體系)，Marcel Dekker出版，Inc.，N.Y.，1990。
治療制劑可以通過(guò)能夠用于治療的任何有效方法給藥。根據(jù)給予的具體抗腫瘤藥物的不同，適當(dāng)?shù)姆椒ò诜?、鼻腔、肺部給藥或腸胃外(包括皮下、肌肉、靜脈內(nèi)和皮層內(nèi))注入血液循環(huán)。對(duì)于腸胃外給藥而言，本發(fā)明的抗腫瘤成分可以制成各種形式。調(diào)節(jié)劑的水溶液可以在聚合物珠、脂質(zhì)體、納米顆?；蚱渌绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的可注射儲(chǔ)庫(kù)制劑中包囊。另外，本發(fā)明化合物也可以包囊在脂質(zhì)體中給藥。根據(jù)其溶解性，組合物可以存在于水層和脂層中，或者存在于所謂的脂質(zhì)體懸浮液中。疏水層通常含有(但不排除)磷脂(例如卵磷脂和鞘磷脂)、甾體(例如膽固醇)、或多或少的離子表面活性劑如二乙?；姿狨?、硬脂胺或磷脂酸和/或其它疏水性物質(zhì)。
治療制劑可以方便地以單位劑型提供，以適當(dāng)?shù)闹委焺┝拷o藥。適當(dāng)?shù)闹委焺┝靠梢杂扇魏伪娝苤姆椒ù_定，例如對(duì)哺乳動(dòng)物種屬的臨床研究以確定最大可耐受劑量，通過(guò)對(duì)正常人類(lèi)個(gè)體的臨床研究以確定安全劑量。除了在需要較高劑量的某些情況下，本發(fā)明抗腫瘤藥物的劑量通常在每日約0.001至約1000mg的范圍內(nèi)，更通常在每日約0.01至約500mg的范圍內(nèi)?？鼓[瘤藥物的給藥劑量和模式可以根據(jù)不同的個(gè)體而變化，取決于主治醫(yī)師對(duì)各項(xiàng)檢查的因素，例如待治療的疾病、給藥組合物包括給予的特定抗腫瘤藥物的選擇、各個(gè)個(gè)體的年齡、體重和響應(yīng)性、個(gè)體癥狀的嚴(yán)重性以及選擇的給藥途徑。一般而言，給予的抗腫瘤藥物的量是能夠有效和可靠地預(yù)防或最小化個(gè)體癥狀的最小劑量。因此，上述劑量范圍應(yīng)當(dāng)能夠?yàn)閷?shí)施本文提供一般性指導(dǎo)和支持，但是不應(yīng)當(dāng)限定本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例 下列實(shí)施例用于闡述但并非限定本發(fā)明。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)根據(jù)USNational Institutes of Health Statement of Compliance with Standards forhumane Care and Use of Laboratory Animals進(jìn)行。
實(shí)施例1 常規(guī)材料和方法 小鼠實(shí)驗(yàn) Ptch+/-小鼠(Jackson Laboratory)、Smo-/-小鼠(Deltagene)、C57BL/6小鼠(Jackson laboratory)和B6-Pep3b-Ly5.1(Pep)小鼠根據(jù)描述喂養(yǎng)和分型。為了進(jìn)行骨髓移植實(shí)驗(yàn)，向雄性C57BL/6經(jīng)腹膜內(nèi)注射5-FU(150mg/kg)，四天后處死。自腿骨取骨髓單核細(xì)胞，采用氯化銨裂解紅細(xì)胞，將骨髓在含有10％FBS、SCF、IL-6和IL-3的DMEM中培養(yǎng)。采用pMSCV/BCR-ABL/IRES/GFP逆轉(zhuǎn)錄酶病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，將5×105個(gè)單核細(xì)胞移植到接受致命性射線照射的C57BL/6小鼠中。移植后第7天，采用AMN10750mg/kg bid(Novartis，Basel)和環(huán)巴胺25mg/kgbid(Novartis，Cambridge)開(kāi)始治療，治療進(jìn)行14天。
為了采用Ptch和Smo造血細(xì)胞進(jìn)行移植實(shí)驗(yàn)，采用孕期為14.5天的胚胎。將胚胎在冰上冷凍并去頭。提取胚胎肝臟，將肝細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞濾器(BD Bioscience)過(guò)濾。將胚胎肝細(xì)胞直接移植至亞致死照射的B6-Pep3b-Ly5.1(Pep)小鼠中用于種群恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，或者在刺激培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后采用pMSCV/BCR-ABL/IRES/GFP逆轉(zhuǎn)錄酶病毒感染。感染后24小時(shí)，通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，感染率保持在4-6％以評(píng)價(jià)BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞的擴(kuò)張。然后將胚胎肝細(xì)胞移植至致命性照射的接受者中。通過(guò)每周測(cè)定體重、每?jī)芍軠y(cè)定血細(xì)胞數(shù)并測(cè)定外周血中的GFP陽(yáng)性細(xì)胞監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。
細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn) 將獲自患病小鼠的骨髓細(xì)胞在含有10％FBS(Gibco)、SCF(RDI)、IL-3和IL-6(R&D系統(tǒng))的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。為了進(jìn)行體外治療實(shí)驗(yàn)，將4×106個(gè)骨髓或脾細(xì)胞接種到6孔板的1個(gè)孔中。將環(huán)巴胺-KAAD(獲自Toronto Research Chemicals)溶于×1,000儲(chǔ)備液的DMSO溶液中。治療72小時(shí)后，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明，將細(xì)胞在獲自干細(xì)胞技術(shù)(M3434)的含有SCF、IL-6、IL-3和胰島素的甲基纖維素培養(yǎng)基中涂板。涂板后5天和10天對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。12天后，稀釋板中的細(xì)胞，用PBS洗滌，然后染色用于不同細(xì)胞類(lèi)型的分析，或者再涂板進(jìn)行第二輪或第三類(lèi)涂板實(shí)驗(yàn)。
免疫組織化學(xué) 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，將小鼠組織固化至少24小時(shí)，制備石蠟包埋組織。根據(jù)生產(chǎn)商的建議，采用Gli1(N-16，Santa Cruz Biotechnology)、Smo(H-300，Santa Cruz Biotechnology)和Hh(H-160，Santa Cruz Biotechnology)的抗體，在石蠟切片上進(jìn)行單色DAB-免疫過(guò)氧化物酶染色。
RT-PCR和定量PCR 根據(jù)生產(chǎn)商建議采用Qiagen RNA抽提試劑盒，自獲自慢性期或急變期CML患者的CD34+細(xì)胞、全骨髓或者自分類(lèi)的Lin-Kit+Sca+陽(yáng)性細(xì)胞抽提RNA。定量PCR通過(guò)Taqman PCR測(cè)定。引物和探針獲自AppliedBiosystems。
細(xì)胞染色和分類(lèi) 根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)，采用獲自BD Pharmingen的抗體Sca-PE、Kit-APC、Lin標(biāo)記物CD3、Gr-1、CD11b、CD19、Ter119全PE-Cy7陽(yáng)性、CD4-PE、CD8-APC，進(jìn)行用于血細(xì)胞類(lèi)型分析的流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)染色。對(duì)于干細(xì)胞的細(xì)胞周期分析而言，將細(xì)胞采用環(huán)巴胺處理48小時(shí)，然后采用Lin標(biāo)記物、Kit-APC和Sca-PE染色。然后將染色的骨髓在2％福爾馬林中固化。細(xì)胞采用70％冷凍乙醇滲透至少1小時(shí)，然后采用碘化丙啶(5mg/ml)處理至少30分鐘。采用獲自Coulter的流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)器分析細(xì)胞。將骨髓與環(huán)巴胺混合培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后進(jìn)行膜聯(lián)蛋白(Annexin)染色。根據(jù)生產(chǎn)商說(shuō)明書(shū)，采用Annexin-PE抗體和7-AAD(BD Bioscience)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色。
實(shí)施例2 BCR-ABL對(duì)Hedgehog信號(hào)通路的激活 如本實(shí)施例所示，BCR-ABL通過(guò)對(duì)Smo的上調(diào)激活白血病干細(xì)胞中的hedgehog信號(hào)通路。為了評(píng)價(jià)BCR-ABL陽(yáng)性LSCs以及正常HSCs中hedgehog信號(hào)通路的活化狀態(tài)并對(duì)其進(jìn)行比較，對(duì)靶向人類(lèi)CD34+細(xì)胞(獲自健康供體)至CD34+細(xì)胞(分離自慢性期或急變期CML患者)中的基因Gli1和Ptch1的兩個(gè)Hh通路的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行比較。在所有CML病例中，觀察到多于4-倍誘導(dǎo)的Gli1和Ptch1轉(zhuǎn)錄水平，這說(shuō)明CML中通路的活化獨(dú)立于疾病期(圖1A)。在急變期以及慢性期的CML患者中評(píng)價(jià)Gli1和Ptch1轉(zhuǎn)錄水平。
為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)BCR-ABL對(duì)hedgehog通路激活的作用，在小鼠中誘導(dǎo)CML樣綜合征。將pMSCV/BCR-ABL/GFP病毒感染的骨髓移植至被輻射的受體小鼠中。與正常小鼠HSCs(Lin-Kit+Sca+)相比，獲自患病小鼠的BCR-ABL陽(yáng)性LSCs(Lin-Kit+Sca+GFP+)顯示Gli1和Ptch1轉(zhuǎn)錄水平提高。BCR-ABL逆轉(zhuǎn)錄酶病毒(pMSCV)感染的小鼠骨髓中hedgehog通路的激活不限于干細(xì)胞群，而是也存在于所有的BCR-ABL過(guò)度表達(dá)細(xì)胞(圖1B)。
在所有BCR-ABL/GFP陽(yáng)性骨髓細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)跨膜受體Smo的上調(diào)，而在相同小鼠的BCR-ABL陰性群中Smo水平要低得多。BCR-ABL陽(yáng)性群中Smo的上調(diào)可以通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)以及免疫組織化學(xué)測(cè)定。采用Smo-特異性抗體對(duì)患病小鼠的脾和骨髓進(jìn)行IHC染色顯示在BCR-ABL陽(yáng)性群中存在Smo表達(dá)的強(qiáng)力誘導(dǎo)。用于人類(lèi)CML病例中Smo和Gli1的IHC染色也揭示了在骨髓相應(yīng)區(qū)域中兩種基因的上調(diào)，特別是在目細(xì)胞群中(圖1C)。另外，淋巴瘤細(xì)胞中Smo的逆轉(zhuǎn)錄酶病毒表達(dá)顯示有助于在非淋巴器官(如皮膚)中的Eμ-Myc陽(yáng)性淋巴瘤異種移植物的生長(zhǎng)，甚至在缺乏配體刺激的情況下也提高Gli1的水平。
實(shí)施例3 體外Hedgehog信號(hào)的抑制 本實(shí)施例顯示體外hedgehog信號(hào)的抑制在BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞中誘導(dǎo)了凋亡，減少了白血病干細(xì)胞的數(shù)目。為了在體外研究hedgehog通路在BCR-ABL陽(yáng)性骨髓細(xì)胞和白血病干細(xì)胞中的作用，采用KAAD-環(huán)巴胺(一種能夠在其非活化構(gòu)形狀態(tài)阻斷Smo的生物堿)抑制hedgehog信號(hào)。采用獲自患有CML樣綜合征的小鼠的骨髓，它含有約50％BCR-ABL GFP陽(yáng)性細(xì)胞以及50％正常骨髓細(xì)胞。與GFP陰性群相比，混合骨髓培養(yǎng)物用環(huán)巴胺處理3天導(dǎo)致GFP/BCR-ABL陽(yáng)性群的劑量依賴(lài)性減少。在體外采用環(huán)巴胺(2μM或5μM)處理后，GFP陽(yáng)性細(xì)胞可以通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)分析測(cè)定。
不同細(xì)胞亞群的其它特征顯示BCR-ABL陽(yáng)性髓性祖細(xì)胞(Lin-Kit+Sca-)減少超過(guò)80％，Lin-Kit+Sca+白血病干細(xì)胞群減少約70％(圖2A)。通過(guò)膜聯(lián)蛋白V染色，環(huán)巴胺對(duì)BCR-ABL陽(yáng)性骨髓細(xì)胞抑制的主要作用是24小時(shí)內(nèi)的凋亡誘導(dǎo)。也可以測(cè)定在全骨髓中與S期和G2期相比，G1期相對(duì)增加的細(xì)胞周期的改變。白血病干細(xì)胞群的細(xì)胞周期分析顯示Hh通路抑制后這些細(xì)胞中的G2期完全消失。采用環(huán)巴胺處理后骨髓中Gli1轉(zhuǎn)錄水平下降，證明了化合物對(duì)這些細(xì)胞中hedgehog信號(hào)通路的抑制(圖2B)。在圖2B中，骨髓培養(yǎng)物僅僅采用DMSO處理，或者采用不同濃度的環(huán)巴胺(2μM或5μM)處理6小時(shí)。自處理的培養(yǎng)物中抽提RNA，通過(guò)Taqman PCT測(cè)定Gli1轉(zhuǎn)錄水平，并歸一化為GAPDH。分析一式三份進(jìn)行。
為了進(jìn)一步確證hedgehog通路抑制對(duì)自我更新祖細(xì)胞和白血病干細(xì)胞群的作用，將混合的骨髓和脾培養(yǎng)物采用不同濃度的環(huán)巴胺-KAAD(10、5、2.5、1和0uM)處理48小時(shí)。然后將細(xì)胞在沒(méi)有補(bǔ)充細(xì)胞活素的甲基纖維素板中涂板，從而使得只有BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞能夠存活。涂板后10天對(duì)集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。采用環(huán)巴胺預(yù)處理的骨髓和脾培養(yǎng)物顯示BCR-ABL陽(yáng)性集落的劑量依賴(lài)性減少，說(shuō)明BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞的集落形成能力依賴(lài)于hedgehog通路激活(圖2C)。
實(shí)施例4 Hedgehog通路激活 Hedgehog通路激活增強(qiáng)了集落形成能力以及造血祖細(xì)胞和干細(xì)胞的再生能力。為了評(píng)價(jià)hedgehog信號(hào)在正常造血作用中的作用，自孕期為14.5天的胚胎的肝臟分離胎兒HSCs。在移植實(shí)驗(yàn)中，對(duì)獲自Smo-/-、Smo+/-、Smo+/+、Ptch+/+和Ptch+/-胚胎的胎兒肝細(xì)胞進(jìn)行胎兒分析，分析胎兒HSCs數(shù)目、分化的造血細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)目以及集落形成能力和移植能力。發(fā)現(xiàn)不同基因型之間胎兒HSCs的數(shù)目沒(méi)有差異。在B-細(xì)胞(B220)、髓性細(xì)胞(CD11b)和類(lèi)紅祖細(xì)胞(Ter119))以及CD3陽(yáng)性T-細(xì)胞中也沒(méi)有顯著差異。
涂板后10天通過(guò)流動(dòng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定顯示，在含有補(bǔ)充細(xì)胞活素(IL-3、IL-6、SCF)的甲基纖維素瓊脂中的細(xì)胞涂板不會(huì)導(dǎo)致集落數(shù)目、集落類(lèi)型或不同細(xì)胞類(lèi)型百分率的任何差異。與第一輪涂板相比，發(fā)現(xiàn)在第二輪涂板中集落形成能力具有較大的差異。將Ptch和Smo wt造血細(xì)胞再涂板顯示，在第二輪涂板中只有非常有限的集落形成能力，Smo-/-造血細(xì)胞已經(jīng)完成喪失了集落形成能力。相反，Ptch+/-造血細(xì)胞在3輪以上的涂板中仍然保持了形成集落的能力，說(shuō)明hedgehog通路激活在Ptch+/-造血群中增加了再生細(xì)胞的數(shù)量(表2). 表2 胎兒肝細(xì)胞涂板后10天集落數(shù)目(涂板輪數(shù)P1-P3) 基因型P1P2P3 Smo-/-130 0 0 Smo+/-142 0 0 Smo+/+121 2 0 Ptch+/+ 128 3 0 Ptch+/- 136 4823 在第二次實(shí)驗(yàn)中，將Smo-/-、Smo+/-、Smo+/+、Ptch+/+和Ptch+/-胎兒肝細(xì)胞(Ly-5.2陽(yáng)性)移植到亞致死輻射的C57BL/6-Ly5.1-Pep 3b(B6 Ly-5.1)小鼠。與其它移植胎兒肝基因型相比，外周血中Ly5.2陽(yáng)性造血作用的再生顯示采用Ptch+/-胎兒肝細(xì)胞移植的小鼠具有顯著的優(yōu)勢(shì)。在超過(guò)3個(gè)月以上的時(shí)間內(nèi)，外周血中Ly5.2陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目約為wt和Smo-/-的二倍(圖3A)。Smo-/-骨髓的再生與wt相比沒(méi)有顯著差異，這說(shuō)明Smo-/-和Smo wtHSCs的再生能力沒(méi)有大的差異。外周血中細(xì)胞類(lèi)型其它分析顯示了Smo-/-與Smo wt胎兒肝細(xì)胞移植小鼠之間的細(xì)胞分布的差異。Smo-/-顯示CD8陽(yáng)性T-細(xì)胞超過(guò)90％的減少，而CD4+T-細(xì)胞的數(shù)目?jī)H減少了30％。這些結(jié)果顯示，hedgehog信號(hào)對(duì)T-細(xì)胞發(fā)展是重要的，說(shuō)明CD8+T-細(xì)胞的產(chǎn)生有賴(lài)于完整的hedgehog信號(hào)(圖3B)。
為了進(jìn)一步研究hedgehog信號(hào)在HSCs中的作用，通過(guò)對(duì)小鼠注射5-氟尿嘧啶(5-FU)研究這些小鼠(開(kāi)始時(shí)采用胎兒肝細(xì)胞移植)的骨髓再生能力。在骨髓缺乏Smo的情況下，短期再生能力顯著降低。5-FU注射后10天，開(kāi)始采用Smo-/-胎兒肝細(xì)胞移植的小鼠中的Ly5.2陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目較其它基因型減少70％，這說(shuō)明了hedgehog信號(hào)通路在短期移植恢復(fù)細(xì)胞中的作用(圖3C)。這些結(jié)果顯示Ptch+/-小鼠在短期移植恢復(fù)細(xì)胞中具有較快的再生性能，能夠顯著提高干細(xì)胞匯集。該結(jié)果顯示由于Ptch+/-小鼠Ly5.2陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目在超過(guò)3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)顯著高于其它基因型，使得長(zhǎng)期移植恢復(fù)細(xì)胞從hedgehog通路激活中受益。兩步齡Ptch+/-小鼠的血細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示與Ptch wt小鼠相比，外周血細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有差異，這說(shuō)明即使經(jīng)過(guò)較長(zhǎng)的時(shí)間，這些小鼠中血細(xì)胞的產(chǎn)生也沒(méi)有明顯缺乏。
為了進(jìn)一步確證Smo上調(diào)在造血作用中的作用，將GFP對(duì)照載體、Smo wt和激活的突變體SmoW535E在5-FU預(yù)處理小鼠的骨髓中過(guò)度表達(dá)。將與90％GFP陰性骨髓細(xì)胞混合的10％GFP陽(yáng)性骨髓細(xì)胞移植到被輻射過(guò)的供體小鼠。通過(guò)血細(xì)胞計(jì)數(shù)監(jiān)測(cè)造血作用的再生，對(duì)外周血中GFP陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行評(píng)價(jià)。與對(duì)照骨髓細(xì)胞相比，過(guò)度表達(dá)Smo wt或SmoW535E的骨髓細(xì)胞中Gli1水平顯著提高(圖3D)。用表達(dá)GFP對(duì)照載體的骨髓移植的小鼠中，GFP陽(yáng)性細(xì)胞的百分率保持在10-12％之間。相反，采用Smo wt或SmoW535T感染骨髓移植的小鼠顯示GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目在一年內(nèi)顯著增加，最高達(dá)30％。GFP陽(yáng)性細(xì)胞類(lèi)型沒(méi)有顯著差異(圖3E)。這些數(shù)據(jù)說(shuō)明，通過(guò)Smo過(guò)度表達(dá)而導(dǎo)致的hedgehog信號(hào)的激活能夠增強(qiáng)干細(xì)胞匯集，隨著時(shí)間的推移能夠顯著增加移植恢復(fù)細(xì)胞的數(shù)目。
實(shí)施例5 在體內(nèi)通過(guò)Smo-/-抑制BCR-ABL陽(yáng)性白血病干細(xì)胞 如本實(shí)施例所示，Smo-/-能夠抑制BCR-ABL陽(yáng)性白血病干細(xì)胞的擴(kuò)增，中止了疾病的再可移植性。為了研究體內(nèi)hedgehog通路激活在BCR-ABL陽(yáng)性白血病發(fā)展中的作用，采用pMSCV/BCR-ABL/IRES/GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體將BCR-ABL在Smo-/-、Smo+/-、Smo+/+、Ptch+/+和Ptch+/-胚胎肝細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)。在所有實(shí)驗(yàn)胚胎造血細(xì)胞中感染率在3-4％之間。將感染細(xì)胞移植到被輻射的受體C57/Bl6小鼠中。移植后20天測(cè)定GFP陽(yáng)性細(xì)胞和血細(xì)胞計(jì)數(shù)。采用Ptch+/-/BCR-ABL/GFP胚胎肝細(xì)胞移植的小鼠的GFP水平較采用Ptch wt或Smo wt骨髓移植的小鼠高3倍，所述骨髓采用pMSCV/BCR-ABL/GFP感染。在該時(shí)間段中Smo-/-/BCR-ABL/GFP陽(yáng)性細(xì)胞沒(méi)有擴(kuò)增，甚至顯示低于起初感染率的數(shù)目(圖4A)。移植后28天，自每個(gè)移植組選取三只小鼠，比較不同組的脾臟重量。
采用Ptch+/-、Ptch wt、Smo wt或Smo+/-/BCR-ABL/GFP胚胎肝細(xì)胞移植的所有小鼠脾臟重量增加超過(guò)40％，說(shuō)明CML開(kāi)始發(fā)展，而采用Smo-/-胚胎肝細(xì)胞移植的所有小鼠脾臟大小正常，這說(shuō)明Smo對(duì)于BCR-ABL陽(yáng)性細(xì)胞的擴(kuò)增是重要的(圖4B)。采用Ptch+/-胚胎肝細(xì)胞移植的所有小鼠在移植后38天內(nèi)均形成致死性的白血病，隨后是采用Ptch wt、Smo wt或Smo+/-胎兒肝細(xì)胞移植的小鼠(圖4C)。采用Ptch+/-胎兒肝細(xì)胞移植的小鼠更趨向于形成BCR-ABL陽(yáng)性ALLs(80％)，而非CMLs(20％)，采用Smo+/-胎兒肝細(xì)胞移植的小鼠更趨向于形成CMLs，而非ALLs。只有60％的采用Smo-/-BCR-ABL陽(yáng)性胎兒肝細(xì)胞移植的小鼠在移植后超過(guò)3個(gè)月內(nèi)形成了致死性的疾病，其特征在于脾臟重量增加，但沒(méi)有一只小鼠顯示外周血中白血病數(shù)增加。40％的Smo-/-/BCR-ABL/GFP移植小鼠即使在移植后12月也沒(méi)有顯示任何疾病征象。
為了進(jìn)一步研究hedgehog信號(hào)通路對(duì)白血病干細(xì)胞群的激活情況，從第一輪感染開(kāi)始自患病小鼠收集骨髓和脾細(xì)胞，將2E5 GFP陽(yáng)性細(xì)胞移植到被輻射的二級(jí)受體中。自采用Ptch+/-、Ptch wt、Smo wt和Smo+/-BCR-ABL陽(yáng)性骨髓移植的小鼠的二級(jí)受體在移植后2個(gè)月內(nèi)形成白血病，而采用Smo-/-BCR-ABL wt骨髓移植的小鼠即使在移植后4個(gè)月也沒(méi)有一個(gè)出現(xiàn)任何疾病征象(圖4D)。這些結(jié)果說(shuō)明，BCR-ABL陽(yáng)性白血病干細(xì)胞的擴(kuò)增依賴(lài)于hedgehog通路激活，Smo可能是CML中白血病干細(xì)胞的靶點(diǎn)。
實(shí)施例6 體內(nèi)Abl抑制和Smo抑制的組合 如本實(shí)施例中所示，CML樣疾病小鼠中Abl抑制(例如，AMN107)和Smo抑制(例如，環(huán)巴胺)的組合能夠減少集落形成單位的數(shù)量，延長(zhǎng)復(fù)發(fā)時(shí)間，這說(shuō)明AMN107和環(huán)巴胺的組合在CML的治療中是有益的。
采用BCR-ABL陽(yáng)性骨髓移植的小鼠用亞最佳劑量的ABL抑制劑AMN107治療，或者采用AMN107(50mg/kg qd)和Smo拮抗劑環(huán)巴胺(25mg/kg bid)組合治療。移植后7天開(kāi)始治療，總共持續(xù)14天。在治療結(jié)束時(shí)，每組處死三只小鼠，將取自股骨的骨髓在甲基纖維素集落實(shí)驗(yàn)中涂板，不加入細(xì)胞活素，只測(cè)定BCR-ABL陽(yáng)性集落。與僅采用AMN107治療的組相比，在采用AMN107和環(huán)巴胺組合治療的小鼠中測(cè)定的集落的平均數(shù)目減少超過(guò)40％，這說(shuō)明組合治療可以減少BCR-ABL陽(yáng)性集落形成單位的數(shù)目(圖5A)。在該時(shí)間點(diǎn)，外周血細(xì)胞數(shù)、脾臟和肝臟重量是正常的，GFP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)低于5％。
治療結(jié)束后8天，處死每組的另外三只小鼠，通過(guò)比較肝臟和脾臟重量檢查復(fù)發(fā)跡象。與正常小鼠相比，所有小鼠中都發(fā)現(xiàn)了肝臟和脾臟重量的增加，但是單獨(dú)采用AMN107治療的小鼠的平均脾臟大小是AMN107和環(huán)巴胺組合治療小鼠的二倍，肝臟重量更大(圖4B)。監(jiān)測(cè)每組中剩余5只小鼠的疾病征象，當(dāng)垂死時(shí)處死。單獨(dú)采用AMN107的組治療結(jié)束后的平均存活時(shí)間為8天，而AMN107和環(huán)巴胺組合治療組的存活時(shí)間為24天(圖5C)。
應(yīng)當(dāng)理解，本文中所述實(shí)施例和實(shí)施方案僅用于說(shuō)明目的，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)其進(jìn)行各種修改或改變，并且這些修改或改變包括在本申請(qǐng)以及權(quán)利要求的精神和范圍內(nèi)。
本文中所引用的所有出版物、專(zhuān)利、專(zhuān)利申請(qǐng)、多核苷酸和多肽序列保藏號(hào)以及其它文獻(xiàn)均以其全部?jī)?nèi)容引入本文作為參考，如同這些文獻(xiàn)每一個(gè)單獨(dú)公開(kāi)一樣。
權(quán)利要求
1.組合物，該組合物包含抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分和抑制BCR-ABL的第二種成分。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一種成分與Smo結(jié)合。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第一種成分為環(huán)巴胺或佛司可林。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第二種成分為ABL抑制劑、ABL/Scr抑制劑、Aurora激酶抑制劑或BCR-ABL的非ATP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述第二種成分選自下列成分
6.藥用組合物，該組合物包含治療有效量的抑制hedgehog信號(hào)通路的第一種成分、抑制BCR-ABL的第二種成分和可藥用載體。
7.權(quán)利要求1-6中任一項(xiàng)的組合物在生產(chǎn)用于治療BCR-ABL陽(yáng)性白血病的藥物中的用途。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述BCR-ABL陽(yáng)性白血病為慢性髓性白血病或急性淋巴細(xì)胞白血病。
全文摘要
本發(fā)明提供了hedgehog信號(hào)通路拮抗劑與BCR-ABL抑制劑的組合產(chǎn)品。本發(fā)明的組合產(chǎn)品可以用于治療已知與蛋白酪氨酸激酶例如Src、BCR-ABL和c-kit有關(guān)的癌癥。
文檔編號(hào)A61K45/06GK101820915SQ200880102489
公開(kāi)日2010年9月1日 申請(qǐng)日期2008年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月16日
發(fā)明者C·德克斯, M·瓦爾穆特 申請(qǐng)人:Irm責(zé)任有限公司