專利名稱：：用于體內(nèi)生成、修復(fù)和/或維護(hù)結(jié)締組織的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于在受治療者中生成、修復(fù)和/或維護(hù)結(jié)締組織的方法。本發(fā)明還涉及一種在受治療者中治療和/或預(yù)防由結(jié)締組織的退變(變性)和炎癥引起的疾病的方法。
背景技術(shù)：
：存在于體內(nèi)并產(chǎn)生多能細(xì)胞的非造血祖細(xì)胞(progenitorcells)，當(dāng)被分離時(shí)，稱作間充質(zhì)前體細(xì)胞(MesenchymalPrecursorCells)(MPC)。更具體地說，純化的MPC能夠形成大量的多能細(xì)胞集落。Simmons等人(1994)描述了通過選擇表達(dá)STR0-1細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞而從新收獲的骨髓細(xì)胞來富集MPC。如作者在第272-273頁所解釋的，已知骨髓細(xì)胞包含一定比例的能夠產(chǎn)生CFU-F的MPC。這些CFU-F又能夠在適當(dāng)?shù)臈l件下產(chǎn)生各種完全分化的結(jié)締組織，包括軟骨、骨、脂肪組織、纖維組織以及骨髓支持基質(zhì)(myelosupportivestroma)0MPC和CFU-F通常以非常低的發(fā)生率存在于骨髓細(xì)胞中(通常在0.05%到0.001%之間)并且這種稀有已是過去對(duì)它們的研究的主要限制。由Simmons等人(1994)討論的一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是確定了，在某種程度上，通過選擇STR0-1陽性細(xì)胞這些MPC可以富集自新鮮分離的骨髓細(xì)胞。尤其是，STR0-1陽性細(xì)胞的選擇使得可以分離沒有污染造血祖細(xì)胞的MPC(以及所得的CFU-F)。WO01/04268提供了在富集MPC方面的另一重要進(jìn)展，其中通過在包含MPC的STR0-1陽性細(xì)胞的該部分中鑒定亞群。尤其是，WO01/04268描述了將STR0-1陽性細(xì)胞群體分為三個(gè)子集(亞型)STR0-1+bwe^STRO-I以及STR0-1we^在不同種類的亞群中，CFU-F的克隆測(cè)定說明了大多數(shù)的MPC包含在STR0-1^^部分中。WO2004/085630首次披露了，MPC存在于血管周組織(perivasculartissue)中。該發(fā)現(xiàn)的好處之一在于，它大大地?cái)U(kuò)大了源組織的范圍，從該源組織可以分離或富集MPC并且不再將MPC的來源有效的限制于骨髓。根據(jù)在WO2004/085630中描述的方法從其可以分離MPC的組織包括人骨髓、牙髓、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝以及心臟。分離自血管周組織的MPC對(duì)于細(xì)胞表面標(biāo)志3G5是陽性的。因而它們可以通過富集攜帶3G5標(biāo)記的細(xì)胞，或通過富集存在于血管周細(xì)胞上的早期發(fā)育表面標(biāo)志如CD146(MUC18)、VCAM_1，或通過富集細(xì)胞表面標(biāo)志STR0-1的高水平表達(dá)來分離。無血管結(jié)締組織通常位于肌骨骼系統(tǒng)(其需要明顯的運(yùn)動(dòng))內(nèi)的解剖部位。這些可自由移動(dòng)的關(guān)節(jié)負(fù)責(zé)哺乳動(dòng)物中的大多數(shù)鉸接(關(guān)節(jié)聯(lián)接，articulations)。在滑膜關(guān)節(jié)中，兩個(gè)相反骨(相對(duì)骨)的接觸面被透明軟骨覆蓋，該透明軟骨毫不費(fèi)力地彼此滑動(dòng)，這是由于在由細(xì)胞產(chǎn)生的滑液中存在低摩擦潤(rùn)滑劑，其中上述細(xì)胞對(duì)覆蓋和連接長(zhǎng)骨的關(guān)節(jié)囊進(jìn)行加襯。在脊柱中，鉸接是借助于包封水合凝膠物質(zhì)(髓核)的柔性纖維軟骨環(huán)(flexiblefibrocartilagenousring)(纖維環(huán))通過剛性椎骨的連接來實(shí)現(xiàn)的，通過軟骨細(xì)胞樣細(xì)胞(類似于在透明軟骨中存在的那些細(xì)胞)加以遷移。與這些無血管結(jié)締組織的類型和位置無關(guān)，它們都包含合成細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞，其中細(xì)胞外基質(zhì)富含高度帶負(fù)電荷的蛋白聚糖(蛋白多糖)，其吸入水分子以及纖維蛋白、II型膠原，這賦予高拉伸強(qiáng)度。無血管結(jié)締組織如透明軟骨，半月板(關(guān)節(jié)盤，meniscus)和椎間盤的內(nèi)部三分之二具有有限的修復(fù)能力，并且當(dāng)受傷時(shí)可以通過產(chǎn)生功能較差的纖維軟骨疤痕組織加以反應(yīng)。通過多種受老化、遺傳學(xué)、激素狀態(tài)以及身體傷害支配的因素，這些無血管結(jié)締組織經(jīng)常導(dǎo)致盤退變(discdegeneration)、背部疼痛以及骨關(guān)節(jié)炎的廣泛的臨床問題。目前通常用來治療由這些結(jié)締組織的衰竭引起的癥狀的療法，通過向下調(diào)節(jié)居民細(xì)胞(residentcell)合成組織細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)成分的能力，大部分幾乎沒有糾正負(fù)責(zé)產(chǎn)生癥狀的病理基礎(chǔ)(潛在病理，underlyingpathology)，并且在許多情況下甚至可以加劇問題。理想地，治療處理(therapeutictreatments)應(yīng)至少是軟骨保護(hù)的，甚至提供這樣的條件，其可以增強(qiáng)基質(zhì)生物合成并實(shí)施受傷結(jié)締組織的修復(fù)和恢復(fù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在已經(jīng)獲得了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)內(nèi)給予MPC可以在預(yù)先存在的骨關(guān)節(jié)炎的關(guān)節(jié)中提供軟骨保護(hù)效應(yīng)，并導(dǎo)致在滑膜關(guān)節(jié)中和在椎間盤的髓核中軟骨組織的生成和生長(zhǎng)。該發(fā)現(xiàn)表明，MPC或它們的后代、或來自這些MPC的上清液或可溶性因子，可以用來保護(hù)或修復(fù)受損的結(jié)締組織以及在變性或損傷部位生成新的功能性組織。因此，本發(fā)明提供了一種治療和/或預(yù)防在受治療者中由結(jié)締組織的退變和/或炎癥引起的疾病的方法，該方法包括給予受治療者M(jìn)PC和/或其后代細(xì)胞和/或從其衍生的可溶性因子。在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，結(jié)締組織富含蛋白聚糖。結(jié)締組織可以是軟骨，例如，透明軟骨。在另一種實(shí)施方式中，疾病導(dǎo)致軟骨缺陷。在另一種實(shí)施方式中，上述方法包括給予受治療者M(jìn)PC和/或其后代細(xì)胞和/或從其衍生的可溶性因子，其中MPC和/或后代細(xì)胞和/或可溶性因子并不直接給予到缺陷中。例如，可以給予到關(guān)節(jié)間隙(jointspace)中以便治療或預(yù)防在形成關(guān)節(jié)的骨的關(guān)節(jié)表面上軟骨中的缺陷。類似地，可以給予到椎間盤間隙中以便治療或預(yù)防周圍盤(surroundingdiscs)中的缺陷。在另一個(gè)實(shí)施例中，在軟骨缺陷附近的部位進(jìn)行靜脈內(nèi)給予?？梢酝ㄟ^關(guān)節(jié)內(nèi)注射來給予MPC和/或后代細(xì)胞和/或可溶性因子?？梢躁P(guān)節(jié)內(nèi)注射到身體的在軟骨缺陷或潛在軟骨缺陷部位的附近的任何關(guān)節(jié)中。例如，可以在膝關(guān)節(jié)、髖關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)、肩關(guān)節(jié)、肘關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、手或手指關(guān)節(jié)或足關(guān)節(jié)、或椎間盤關(guān)節(jié)中進(jìn)行關(guān)節(jié)內(nèi)注射。在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，MPC和/或后代細(xì)胞和/或可溶性因子的給予導(dǎo)致軟骨的保持或生成，其中軟骨富含蛋白聚糖和II型膠原。富含蛋白聚糖和II型膠原的軟骨的一個(gè)實(shí)例是透明軟骨。優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法保持或生成的軟骨不是纖維軟骨，其富含I型膠原，但I(xiàn)I型膠原非常低，并且比透明軟骨包含更少的蛋白聚糖。“由結(jié)締組織的退變和/或炎癥所引起的”疾病的實(shí)例包括但不限于腱炎、背部疼痛、肩部回旋肌腱退變(rotarycufftendondegradation)、腕管綜合癥、DeQuervain綜合癥、退變性頸椎間盤(degenerativecervical)和/或腰椎間盤(lumberdiscs)、交叉綜合癥、反射性交感營(yíng)養(yǎng)不良綜合癥(reflexsympatheticdystrophysyndrome)(RSDS)、狹窄性腱鞘炎(stenosingtenosynovitis)、上髁炎、腱鞘炎、胸出口綜合癥、尺神經(jīng)壓迫性損害(ulnarnerveentrapment)、燒管綜合癥(radialtunnelsyndrome)、重復(fù)性壓迫損傷(重復(fù)性勞損，r印etitivestraininjury)(RSI)。與透明軟骨的退變和/或炎癥相關(guān)的疾病的實(shí)例包括但不限于關(guān)節(jié)炎如骨關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，銀屑病關(guān)節(jié)炎，以及血清反應(yīng)陰性關(guān)節(jié)炎，與炎性腸病相關(guān)的關(guān)節(jié)炎，或強(qiáng)直性脊柱炎和變性椎間盤疾病(degenerateinvertebraldiscdisorders)0在另一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，該方法進(jìn)一步包括給予透明質(zhì)酸(HA)?？梢栽谂c細(xì)胞、上清液和/或因子相同或不同的組合物中給予HA。本發(fā)明還提供了一種組合物，該組合物包括MPC和/或其后代細(xì)胞以及透明質(zhì)酸。本文提供的結(jié)果首次表明，植入培養(yǎng)的MPC釋放的可溶性因子支持結(jié)締組織的保護(hù)、生成和生長(zhǎng)。因此，本發(fā)明還提供了一種組合物，包括i)上清液、或一種或多種可溶性因子，其來自間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)和/或其后代細(xì)胞，以及ii)透明質(zhì)酸。在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供了來自間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)和/或其后代細(xì)胞的上清液、或一種或多種可溶性因子在用于治療和/或預(yù)防在受治療者中由結(jié)締組織的退變和/或炎癥所引起的疾病中的應(yīng)用。本發(fā)明可應(yīng)用于各種動(dòng)物。例如，受治療者可以是哺乳動(dòng)物如人、狗、貓、馬、牛、或羊。在一種實(shí)施方式中，受治療者是人。在該整個(gè)說明書中，詞語“包括”、或變型如“包含”將理解成意味著包括所述的要素(element)、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的組，但不排除任何其它要素、整數(shù)或步驟，或要素、整數(shù)或步驟的組。在下文中將通過以下非限制性實(shí)施例并參照附圖來描述本發(fā)明。圖1.半月板切除術(shù)后12周，注射有透明質(zhì)酸(HA)或HA加上不同劑量的間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的關(guān)節(jié)的股骨和脛骨軟骨形態(tài)學(xué)評(píng)分的平均值士SD。圖2.半月板切除術(shù)后12周，注射有透明質(zhì)酸(HA)或HA加上不同劑量的間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的關(guān)節(jié)的股骨和脛骨骨贅評(píng)分的平均值士SD。圖3.注射有不同劑量的間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的動(dòng)物的軟骨形態(tài)學(xué)關(guān)節(jié)評(píng)分的比率[HA/(MPC+HA)]。當(dāng)比率=1時(shí)，兩種治療同樣有效。比率>1表明MPC+HA優(yōu)于HA。圖4.相對(duì)于單獨(dú)HA，注射有不同劑量的MPC+HA的動(dòng)物的骨贅評(píng)分的比率[HA/(MPC+HA)]。當(dāng)比率=1時(shí)，兩種治療同樣有效。比率>1表明MPC+HA優(yōu)于HA。圖5.半月板切除術(shù)后12周，注射有透明質(zhì)酸(HA)或100兆MPC+HA的關(guān)節(jié)軟骨的組織形態(tài)測(cè)量確定的區(qū)域厚度評(píng)分的平均值士SE。結(jié)合所有脛骨軟骨區(qū)，HA+100兆MPC>HA(p<0.05)。圖6.注射有不同劑量的間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的動(dòng)物的總Mankin改進(jìn)關(guān)節(jié)組織病理學(xué)評(píng)分的平均值士SE的比率[HA/(MPC+HA)]。當(dāng)比率=1時(shí)，兩種治療同樣有效。比率>1表明MPC+HA優(yōu)于HA。圖7.半月板切除術(shù)后12、24以及52周，HA和HA+100兆MPC注射關(guān)節(jié)的股骨和脛骨軟骨形態(tài)學(xué)評(píng)分的平均值士SD。圖8.半月板切除術(shù)后12、24以及52周，HA和HA+100兆MPC注射關(guān)節(jié)的股骨和脛骨骨贅評(píng)分的平均值士SD。圖9.半月板切除術(shù)后12、24以及52周，注射有間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的動(dòng)物的軟骨形態(tài)學(xué)關(guān)節(jié)評(píng)分(cartilagemorphologyjointscores)的比率[HA/(MPC+HA)]。當(dāng)比率=1時(shí)，兩種治療同樣有效。比率>1表明MPC+HA優(yōu)于HA。圖10.半月板切除術(shù)后12、24以及52周，注射有間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的動(dòng)物的骨贅關(guān)節(jié)評(píng)分的比率[HA/(MPC+HA)]。當(dāng)比率=1時(shí)，兩種治療同樣有效。比率>1表明MPC+HA優(yōu)于HA。圖11.半月板切除術(shù)后12、24以及52周，注射有間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的動(dòng)物的改進(jìn)Mankins關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)評(píng)分的平均值士SE的比率[HA/(MPC+HA)]。當(dāng)比率=1時(shí)，兩種治療同樣有效。比率>1表明MPC+HA優(yōu)于HA。圖12.來自注射有透明質(zhì)酸(HA)或HA+不同劑量的間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的關(guān)節(jié)的髕骨軟骨剛度的平均值+/-SE。*=ρ<0.05、**=ρ<0.01、***=ρ<0.001、****=ρ<0.0001。圖13.來自注射有透明質(zhì)酸(HA)或100兆間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)+HA并在半月板切除術(shù)后12、24和52周處死的關(guān)節(jié)的髕骨軟骨剛度的平均值+/-SE。*=ρ<0.05、**=ρ<0.01、氺氺氺=ρ<0.001、氺氺氺氺=ρ<0.0001。圖14.來自注射有透明質(zhì)酸(HA)或HA+不同劑量的間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)的關(guān)節(jié)的髕骨軟骨相位滯后(patellacartilagephaselag)的平均值+/_SE。*=ρ<0.05、氺氺=ρ<0.01、氺氺氺=ρ<0.001、氺氺氺氺=ρ<0.0001。圖15.來自注射有透明質(zhì)酸(HA)或ΗΑ+100兆間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)并在半月板切除術(shù)后12、24和52周處死的關(guān)節(jié)的髕骨軟骨相位滯后的平均值+/-SE。*=ρ<0.05、氺氺=ρ<0.01、氺氺氺=ρ<0.001、氺氺氺氺=ρ<0.0001。圖16.半月板切除術(shù)后12周，未治療去勢(shì)的雄性羊和切除卵巢的母羊的關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)評(píng)分的比較，其在雌性組中顯示出顯著更嚴(yán)重的OA病變。圖17.半月板切除術(shù)后12周，未治療去勢(shì)的雄性羊和切除卵巢的母羊的關(guān)節(jié)骨贅評(píng)分的比較，其在雌性組中顯示出顯著更高的評(píng)分。圖18.半月板切除術(shù)后36周，來自注射有透明質(zhì)酸(HA)或ΗΑ+100兆間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)(半月板切除術(shù)后12周)的切除卵巢的母羊的關(guān)節(jié)的軟骨改進(jìn)Mankin組織病理學(xué)評(píng)分的平均值士SD。P值=HA與MPC+HA。這些結(jié)果表明，與脛骨軟骨相比，單次MPC注射可以在更大程度上減小股骨透明軟骨的異常組織病理學(xué)評(píng)分超過6個(gè)月。圖19.半月板切除術(shù)后36周，半月板切除術(shù)后12周給予關(guān)節(jié)內(nèi)注射的切除卵巢的母羊的關(guān)節(jié)的軟骨總改進(jìn)Mankin組織病理學(xué)評(píng)分的比率(HA/HA+MPC)。當(dāng)比率=1時(shí)，MPC+HA相當(dāng)于HA。比率>1，表明MPC+HA比單獨(dú)的HA更具保護(hù)作用。數(shù)據(jù)=平均值士SEM。這些結(jié)果表明，與脛骨軟骨相比，單次MPC注射可以在更大程度上減小股骨透明軟骨的異常組織病理學(xué)評(píng)分超過6個(gè)月。圖20.半月板切除術(shù)(MX)后24和36周，與在MX后12周沒有注射的關(guān)節(jié)相比，來自MX后12周注射有透明質(zhì)酸(HA)或100兆間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)+HA的切除卵巢的母羊的關(guān)節(jié)的股骨軟骨改進(jìn)Mankin組織病理學(xué)評(píng)分的平均值士SD。P值是關(guān)于12周NIL與治療。這些結(jié)果表明，單次MPC注射減小了異常組織病理學(xué)評(píng)分超過6個(gè)月。圖21.半月板切除術(shù)后36周，來自半月板切除術(shù)后12周注射有透明質(zhì)酸(HA)或100兆間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)+HA的切除卵巢的母羊的關(guān)節(jié)的股骨軟骨組織形態(tài)測(cè)定數(shù)據(jù)。示出的數(shù)據(jù)=平均值士SEM。P值=HA與MPC+HA。這些結(jié)果表明，與透明質(zhì)酸相比，單次MPC注射可以產(chǎn)生更大的透明軟骨超過6個(gè)月。圖22.來自未經(jīng)治療的母羊的關(guān)節(jié)的組織形態(tài)測(cè)量確定的股骨軟骨厚度的平均值士SEM，其中上述未經(jīng)治療的母羊在半月板切除術(shù)(Mx)后12周被處死或在Mx以后12周被注射透明質(zhì)酸(HA)或間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)+HA，然后在12或24周以后被處死。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。P值是相對(duì)于12周NIL治療。這些結(jié)果表明，單次MPC注射會(huì)增加透明軟骨厚度超過6個(gè)月。圖23.來自未經(jīng)治療的母羊的關(guān)節(jié)的組織形態(tài)測(cè)量確定的股骨軟骨區(qū)，其中上述未經(jīng)治療的母羊在半月板切除術(shù)(Mx)后12周被處死或在Mx以后12周被注射透明質(zhì)酸(HA)或間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)+HA，然后在12或24周以后被處死。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。P值是相對(duì)于12周NIL治療。這些結(jié)果表明，單次MPC注射可以增加透明軟骨區(qū)超過6個(gè)月。圖24.組織形態(tài)測(cè)量確定的綜合灰度密度(IntegratedGrey-scaleDensity)(IGD)作為來自未經(jīng)治療的母羊的關(guān)節(jié)的股骨軟骨的總蛋白聚糖(PG)含量的度量，其中上述未經(jīng)治療的母羊在半月板切除術(shù)(Mx)后12周被處死或在Mx以后12周被注射透明質(zhì)酸(HA)或間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)+HA，然后在12或24周以后被處死。數(shù)據(jù)表示為平均值士SEM。P值是相對(duì)于12周NIL治療。這些結(jié)果表明，與透明質(zhì)酸注射相比，單次MPC注射產(chǎn)生顯著更多的包含蛋白聚糖的軟骨超過6個(gè)月。圖25.在所有羊組中，用間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)治療的腰椎水平(lumberspinallevels)的示意圖。圖26.在MPC和HA注射到變性羊盤(degeneratesheepdiscs)的髓核中以后3和6個(gè)月盤高度的平均恢復(fù)。具體實(shí)施例方式通用技術(shù)和選擇的定義除非另有明確規(guī)定，否則本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語將具有如本領(lǐng)域(例如，在細(xì)胞培養(yǎng)、干細(xì)胞生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、免疫組織化學(xué)、蛋白質(zhì)化學(xué)、以及生物化學(xué))普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。除非另有說明，否則在本發(fā)明中采用的重組蛋白、細(xì)胞培養(yǎng)(細(xì)胞培養(yǎng)物，cellculture)、以及免疫學(xué)技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)程序。這樣的技術(shù)描述和說明在在諸如，J.Perbal,APracticalGuidetoMolecularCloning,JohnWileyandSons(1984),J.Sambrooketal.,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratoryPress(1989)，T.A.Brown(editor),EssentialMolecularBiologyAPracticalApproach，Volumes1and2，IRLPress(1991)，D.M.GloverandB.D.Hames(editors),DNACloning:APracticalApproach,Volumes1-4,IRLPress(1995and1996)，andF.M.Ausubeletal.(editors)，CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePub.AssociatesandWiley-Interscience(1988，包括直至Ij目前的所有更新)，EdHarlowandDavidLane(editors)Antibodies:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbourLaboratory,(1988),andJ.E.Coliganetal.(editors)CurrentProtocolsinImmunology,JohnWiley&Sons(包括直到目前的所有更新)的來源的文獻(xiàn)中。如在本文中所使用的，術(shù)語“治療”、“處理”包括給予治療有效量的如本文所定義的上清液、可溶性因子和/或細(xì)胞，其足以減少或消除指定病癥中的至少一種癥狀。如在本文中所使用的，術(shù)語“預(yù)防”包括給予治療有效量的如本文所定義的上清液、可溶性因子和/或細(xì)胞，其足以停止或阻止指定病癥中的至少一種癥狀的發(fā)展。如在本文中所使用的，術(shù)語“來自間充質(zhì)前體細(xì)胞”是指由間充質(zhì)前體細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞的體外培養(yǎng)而產(chǎn)生的上清液、和/或一種或多種可溶性因子。如在本文中所使用的，術(shù)語“上清液”是指在適宜的培養(yǎng)基，優(yōu)選液體培養(yǎng)基中體外培養(yǎng)間充質(zhì)前體細(xì)胞和/或其后代細(xì)胞以后所產(chǎn)生的非細(xì)胞物質(zhì)。通常，通過在適當(dāng)?shù)臈l件和時(shí)間下在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，接著通過諸如離心的工藝(方法)除去細(xì)胞物質(zhì)來產(chǎn)生上清液。在給予以前，上清液可以或可以不進(jìn)一步經(jīng)受純化步驟。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，上清液包括少于IO5個(gè)，更優(yōu)選少于IO4個(gè)，更優(yōu)選少于IO3個(gè)以及甚至更優(yōu)選沒有活細(xì)胞。如在本文中所使用的，術(shù)語“一種或多種可溶性”因子是指在培養(yǎng)期間由MPC和/或其后代細(xì)胞所分泌的分子，通常為蛋白質(zhì)。_2]丨旬充Jlifr體細(xì)朐,(MPC)或后代細(xì)朐,、IU及來自的JJ青液或一種或多種可溶+牛因如在本文中所使用的，“MPC”是能夠形成大量的多能細(xì)胞集落的非造血STRO-Γ祖細(xì)胞。間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)是這樣的細(xì)胞，其存在于骨髓、血液、牙髓細(xì)胞、脂肪組織、皮膚、脾、胰、腦、腎、肝、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、淋巴結(jié)、胸腺、骨、韌帶、腱、骨骼肌、真皮、以及骨膜中；并且能夠分化成不同的種系如中胚層、內(nèi)胚層以及外胚層。因此，MPC能夠分化成大量的細(xì)胞類型，其包括但不限于脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、彈性細(xì)胞、肌細(xì)胞、以及纖維結(jié)締組織細(xì)胞。這些細(xì)胞進(jìn)入的具體譜系定型(lineage-commitment)和分化途徑取決于來自以下的各種影響機(jī)械影響和/或內(nèi)源性生物活性因子，如生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、和/或由宿主組織建立的局部微環(huán)境條件。間充質(zhì)前體細(xì)胞因而非造血祖細(xì)胞，其分化以產(chǎn)生子細(xì)胞，這些子細(xì)胞是干細(xì)胞或是前體細(xì)胞(precursorcell)，其將適時(shí)地不可逆地分化以產(chǎn)生表型細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，MPC富集自由受治療者獲得的樣品。術(shù)語‘富集的’、‘富集’或其變體在本文中用來描述細(xì)胞的群體，其中當(dāng)與未處理群體相比時(shí)，一種特定細(xì)胞類型的比例或許多細(xì)胞類型的比例會(huì)增加。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，在本發(fā)明中使用的細(xì)胞還是TNAP+、VCAM-1+、ΤΗΥ_Γ、STR0-2+、CD45+、CD146+、3G5+或它們的任何組合。優(yōu)選地，STRO-Γ細(xì)胞是STR0-1_Μ。優(yōu)選地，STR0-1明亮的細(xì)胞另外是VCAM-1+、ΤΗΥ-Γ、STR0-2+和/或CD146+中的一種或多種。在一種實(shí)施方式中，間充質(zhì)前體細(xì)胞是如在WO2004/85630中所定義的血管周圍間充質(zhì)前體細(xì)胞。當(dāng)我們稱細(xì)胞對(duì)于給定的標(biāo)記為“陽性的”時(shí)，它可以是所述標(biāo)記的低(Io或暗淡的(dim))或高(明亮的(bright)，bri)表達(dá)子，其取決于標(biāo)記存在于細(xì)胞表面上的程度，其中該術(shù)語涉及在細(xì)胞的顏色分類過程(方法)中所使用的熒光或其它顏色的強(qiáng)度。Lo(或暗淡的或不明亮的)和bri的區(qū)別將在用于待分選的特定細(xì)胞群體上的標(biāo)記的范圍內(nèi)加以理解。當(dāng)我們?cè)诒疚闹蟹Q細(xì)胞對(duì)于給定標(biāo)記為“陰性的”時(shí)，它并不是指，上述細(xì)胞根本不表達(dá)所述標(biāo)記。它是指，所述細(xì)胞以相對(duì)較低水平表達(dá)所述標(biāo)記，以及當(dāng)可檢測(cè)地加以標(biāo)記時(shí)它產(chǎn)生非常低的信號(hào)。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“明亮的”是指在細(xì)胞表面上的標(biāo)記，當(dāng)可檢測(cè)地加以標(biāo)記時(shí)，其產(chǎn)生相對(duì)高信號(hào)。雖然不希望受理論限制，但提出“明亮的”細(xì)胞比在樣品中的其它細(xì)胞表達(dá)更多的目標(biāo)標(biāo)記蛋白(例如由STR0-1識(shí)別的抗原)。例如，與非明亮的細(xì)胞(STR0-1+W^/bmw)相比，當(dāng)標(biāo)記有FITC共軛^肌-丨抗體時(shí)，STRO-Ibri細(xì)胞產(chǎn)生更大的熒光信號(hào)，如通過FACS分析確定的。優(yōu)選地，“明亮的”細(xì)胞構(gòu)成包含在起始樣品中的至少約0.的最明亮的標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞。在其它實(shí)施方式中，“明亮的”細(xì)胞構(gòu)成包含在起始樣品中的至少約0.1%、至少約0.5%、至少約1%、至少約1.5%、或至少約2%的最明亮標(biāo)記的骨髓單核細(xì)胞。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，STR0-1b^w細(xì)胞具有STR0-1表面表達(dá)的2對(duì)數(shù)(21og)大小更高的表達(dá)。這是相對(duì)于“背景”加以計(jì)算的，即為STRO-Γ的細(xì)胞。相比之下，STR0-1和/或STR0-1細(xì)胞具有STR0-1表面表達(dá)的小于2對(duì)數(shù)大小更高的表達(dá)，通常約1對(duì)數(shù)或小于“背景”。當(dāng)在本文中使用時(shí)，術(shù)語“ΤΝΑΡ”用來包括組織非特異性堿性磷酸酶的所有變異體。例如，該術(shù)語包括肝變異體(LAP)、骨變異體(BAP)以及腎變異體(KAP)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，TNAP是BAP。在一種特別優(yōu)選的實(shí)施方式中，如在本文中所使用的，TNAP是指一種分子，其可以結(jié)合由雜交瘤細(xì)胞系(在布達(dá)佩斯條約(BudapestTreaty)的規(guī)定下，在2005年12月19日保藏在ATCC，保藏登錄號(hào)為PTA-7282)產(chǎn)生的STR0-3抗體。另外，在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，MPC能夠產(chǎn)生克隆原性CFU-F。優(yōu)選的是，大部分的多能細(xì)胞能夠分化成至少兩種不同的種系。多能細(xì)胞可以被定向的譜系的非限制性實(shí)例包括骨前體細(xì)胞；肝細(xì)胞祖細(xì)胞，其對(duì)于膽管上皮細(xì)胞和肝細(xì)胞是多能的；神經(jīng)限制性細(xì)胞(neuralrestrictedcells)，這些細(xì)胞可以產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞前體，其演變成少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形細(xì)胞；神經(jīng)元前體，其演變成神經(jīng)元；用于心肌和心肌細(xì)胞的前體，葡萄糖反應(yīng)胰島分泌胰腺β細(xì)胞系。其它譜系包括但不限于成牙本質(zhì)細(xì)胞，產(chǎn)生牙本質(zhì)的細(xì)胞和軟骨細(xì)胞，以及下述的前體細(xì)胞視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，皮膚細(xì)胞如角質(zhì)細(xì)胞，樹突狀細(xì)胞，毛囊細(xì)胞，輸尿管上皮細(xì)胞，平滑和骨骼肌細(xì)胞，睪丸祖細(xì)胞，血管內(nèi)皮細(xì)胞，腱細(xì)胞，韌帶細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，脂肪細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，骨髓基質(zhì)(marrowstroma)細(xì)胞，心肌細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，骨骼肌細(xì)胞，周細(xì)胞，血管細(xì)胞，上皮細(xì)胞，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，神經(jīng)元細(xì)胞，星形細(xì)胞以及少突膠質(zhì)細(xì)胞。在另一種實(shí)施方式中，在培養(yǎng)以后，MPC不能產(chǎn)生造血細(xì)胞。本發(fā)明還涉及由MPC和/或其后代細(xì)胞(后者還被稱作擴(kuò)大細(xì)胞(擴(kuò)增細(xì)胞，expandedcells))獲得的上清液或可溶性因子的應(yīng)用，其產(chǎn)生自體外培養(yǎng)。本發(fā)明的擴(kuò)大細(xì)胞可以具有各種各樣的表型，其取決于培養(yǎng)條件(包括在培養(yǎng)基中刺激因子的數(shù)目和/或類型)、傳代培養(yǎng)的數(shù)目等。在某些實(shí)施方式中，在約2、約3、約4、約5、約6、約7、約8、約9、或約10次傳代培養(yǎng)以后，后代細(xì)胞獲自親代種群(parentalpopulation)。然而，后代細(xì)胞可以在任何數(shù)目的傳代培養(yǎng)以后獲自親代種群?？梢酝ㄟ^在任何適宜的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)來獲得后代細(xì)胞。如相對(duì)于細(xì)胞培養(yǎng)所使用的，術(shù)語“培養(yǎng)基”包括細(xì)胞周邊環(huán)境的成分。培養(yǎng)基可以是固相、液相、氣相或相和物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基包括液體生長(zhǎng)培養(yǎng)基以及并不維持細(xì)胞生長(zhǎng)的液體培養(yǎng)基。培養(yǎng)基還包括膠質(zhì)培養(yǎng)基如瓊脂、瓊脂糖、明膠以及膠原基質(zhì)。示例性的氣體培養(yǎng)基包括氣相，生長(zhǎng)在平皿或其它固體或半固體載體上的細(xì)胞暴露于上述氣相。術(shù)語“培養(yǎng)基”還指用于細(xì)胞培養(yǎng)的物質(zhì)，即使它還沒有與細(xì)胞接觸。換句話說，制備用于細(xì)菌培養(yǎng)的富含營(yíng)養(yǎng)物的液體是一種培養(yǎng)基。類似地，當(dāng)與水或其它液體混合時(shí)變得適用于細(xì)胞培養(yǎng)的粉末混合物可以稱作“粉狀培養(yǎng)基”。在一種實(shí)施方式中，可用于本發(fā)明的方法的后代細(xì)胞通過利用標(biāo)記有STR0-3抗體的磁珠從骨髓分離TNAP+MPC，然后培養(yǎng)擴(kuò)大分離的細(xì)胞來獲得(參見Gronthosetal.(1995)，適宜培養(yǎng)條件的一個(gè)實(shí)例)。在一種實(shí)施方式中，這樣的擴(kuò)大細(xì)胞(后代)(至少5次傳代培養(yǎng)以后)可以是TNAP-,CC9\HLA類Γ、HLA類ΙΓ、CD14\CD19\CD3\CDlla-cT、CD31\CD86XD34"和/或CD80—。然而，在與本文描述的培養(yǎng)條件不同的培養(yǎng)條件下，可以變化不同標(biāo)記的表達(dá)。此夕卜，雖然這些表型的細(xì)胞在消耗的細(xì)胞群體中可能占優(yōu)勢(shì)，但它并不意味著存在較小群體的細(xì)胞，其并不具有這種表型(例如，小百分比的擴(kuò)大細(xì)胞可以是CC9-)。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，擴(kuò)大細(xì)胞仍具有分化成不同細(xì)胞類型的能力。在一種實(shí)施方式中，用來獲得上清液或可溶性因子、或細(xì)胞本身的消耗的細(xì)胞群體(expendedcellpopulation)包括這樣的細(xì)胞，其中至少25%、更優(yōu)選至少50%的上述細(xì)胞是CC9+。在另一種實(shí)施方式中，用來獲得上清液或可溶性因子、或細(xì)胞本身的消耗的細(xì)胞群體包括這樣的細(xì)胞，其中至少40%、更優(yōu)選至少45%的上述細(xì)胞是STR0-1+。在另一種實(shí)施方式中，擴(kuò)大細(xì)胞可以表達(dá)這樣的標(biāo)記，其選自由LFA-3、THY-UVCAM-I、ICAM-I、PECAM-I、P-選擇蛋白、L-選擇蛋白、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整聯(lián)蛋白β、6_19、血栓調(diào)節(jié)蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦素(致輕素)-R、(STR0-2=瘦素-R)、RANKL、STR0_1^^以及⑶146或這些標(biāo)記的任何組合組成的組。在一種實(shí)施方式中，后代細(xì)胞是多能的擴(kuò)大(expanded)的MPC后代(MEMP)，如在TO2006/032092中所定義的。用于制備MPC(從其可以衍生后代)的富集群體的方法描述在W001/04268和WO2004/085630中。在體外范圍內(nèi)，MPC將很少作為絕對(duì)純的制劑(preparation)存在并且將通常與其它細(xì)胞一起存在，其中上述其它細(xì)胞是組織特異性定向細(xì)胞(定型細(xì)胞)(TSCC)。WO01/04268涉及以約0.至90%的純度水平從骨髓收獲這樣的細(xì)胞。包括MPC(從其衍生后代)的群體可以直接收獲自組織來源，或可替換地它可以是已體外擴(kuò)大的群體。例如，后代可以獲自收獲的、未擴(kuò)大的、基本上純化的MPC的群體，其包括至少約0.1、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80或95%的群體(它們存在于其中)的總細(xì)胞。這種水平例如可以通過選擇這樣的細(xì)胞來實(shí)現(xiàn)，所述細(xì)胞對(duì)于選自由TNAP、STR0-1MS6\3G5\VCAM-I、THY-I、⑶146以及STR0-2組成的組中的至少一種標(biāo)記是陽性的。MEMPS可以區(qū)別于剛收獲的MPC，因?yàn)樗鼈儗?duì)于標(biāo)記STRO-Itoi是陽性的并且對(duì)于標(biāo)記堿性磷酸酶(ALP)是陰性的。相反，新鮮分離的MPC對(duì)于STRO-Itoi和ALP均是陽性的。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，至少15%,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,90%或95%的給予的細(xì)胞具有表型STR0-ltoi、ALP-。在另外的優(yōu)選的實(shí)施方式中，MEMPS對(duì)于標(biāo)記Ki67、CD44和/或⑶49c/⑶29、VLA-3、α3β1中的一種或多種是陽性的。在又一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，MEMP并不呈現(xiàn)TERT活性和/或?qū)τ跇?biāo)記⑶18是陰性的。MPC起始群體可以來自在WO01/04268或WO2004/085630中闡述的任何一種或多種組織類型，即骨髓、牙髓細(xì)胞、脂肪組織和皮膚，或也許更廣泛地來自脂肪組織、牙齒、牙髓、皮膚、肝、腎、心臟、視網(wǎng)膜、腦、毛囊、腸、肺、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胰、骨、韌帶、骨髓、腱以及骨骼肌。應(yīng)當(dāng)明了，在實(shí)施本發(fā)明中，攜帶任何給定細(xì)胞表面標(biāo)志的細(xì)胞的分離可以通過許多不同的方法來實(shí)現(xiàn)，然而，優(yōu)選的方法依賴于將結(jié)合劑結(jié)合于關(guān)注的標(biāo)記，接著分離那些呈現(xiàn)結(jié)合的標(biāo)記，不管是高水平結(jié)合、或低水平結(jié)合或沒有結(jié)合。最方便的結(jié)合劑是抗體或基于抗體的分子，優(yōu)選為單克隆抗體或基于單克隆抗體，這是由于這些后者藥劑的特異性?？贵w可以用于兩個(gè)步驟，然而，也可以使用其它藥劑，因而用于這些標(biāo)記的配體也可以用來富集攜帶它們或缺少它們的細(xì)胞?？梢詫⒖贵w或配體連接于載體(固相支持體，solidsupport)以便于粗分離。分離技術(shù)優(yōu)選最大化保持待收集部分的生存能力。不同功效的各種技術(shù)可以用來獲得相對(duì)粗分離。采用的特定技術(shù)將取決于分離效率、伴隨的細(xì)胞毒性、進(jìn)行的容易程度和速度、以及對(duì)復(fù)雜設(shè)備和/或技術(shù)技能的需要。用于分離的程序可以包括但不限于磁力分離、利用涂布有抗體的磁珠、親和層析以及“淘選”(借助于連接于固體基質(zhì)的抗體)。提供準(zhǔn)確分離的技術(shù)包括但不限于FACS。優(yōu)選的是，用于分離MPC的方法，例如，包括第一步驟，為固相分選步驟，其利用例如識(shí)別STR0-1的高水平表達(dá)的MACS。如果需要的話，可以接著是第二分選步驟，應(yīng)當(dāng)期望導(dǎo)致更高水平的前體細(xì)胞表達(dá)，如在專利說明書WO01/14268中所描述的。這種第二分選步驟可以涉及使用兩種或更多種標(biāo)記。獲得MPC的方法還可以包括在第一富集步驟以前利用已知技術(shù)來收獲細(xì)胞來源。因此將手術(shù)切除組織。然后將包括源組織的細(xì)胞分離成所謂的單細(xì)胞懸浮液?？梢酝ㄟ^物理和/或酶促方式來實(shí)現(xiàn)這種分離。在獲得適宜的MPC群體以后，可以通過任何適宜的方式來對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)或擴(kuò)大，以獲得MEMP。在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞獲自待治療的受治療者，利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)體外培養(yǎng)并用來獲得上清液或可溶性因子或擴(kuò)大細(xì)胞，用于作為自體或同種異體組合物給予受治療者。在一種可替換的實(shí)施方式中，一種或多種已建立的人細(xì)胞系的細(xì)胞用來獲得上清液或可溶性因子。在本發(fā)明的另一種有利的實(shí)施方式中，非人動(dòng)物(或如果患者不是人，來自另一物種)的細(xì)胞用來獲得上清液或可溶性因子。本發(fā)明可以利用來自任何非人動(dòng)物物種的細(xì)胞來實(shí)施，所述細(xì)胞包括但不限于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞、有蹄類動(dòng)物細(xì)胞、犬細(xì)胞、貓科動(dòng)物細(xì)胞、兔形目動(dòng)物細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞、以及魚類細(xì)胞。利用其可以實(shí)施本發(fā)明的靈長(zhǎng)類動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于黑猩猩、狒狒、食蟹猴、以及任何其它新或舊世界猴的細(xì)胞。利用其可以實(shí)施本發(fā)明的有蹄類動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于牛、豬、綿羊、山羊、馬、水牛以及野牛的細(xì)胞。利用其可以實(shí)施本發(fā)明的嚙齒動(dòng)物細(xì)胞包括但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠以及沙鼠的細(xì)胞。利用其可以實(shí)施本發(fā)明的兔形目動(dòng)物物種的實(shí)例包括家養(yǎng)兔、長(zhǎng)腿大野兔、野兔、棉尾兔、雪靴兔、以及鼠兔。雞(紅原雞(GallusgalIus))是利用其可以實(shí)施本發(fā)明的鳥物種的實(shí)例。可用于本發(fā)明的方法的細(xì)胞可以在使用前、或在獲得上清液或可溶性因子以前加以存儲(chǔ)。用于保存和存儲(chǔ)真核細(xì)胞、尤其是哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法和方案在本領(lǐng)域中是眾所周知的(參照，例如，Pollard,J.W.andWalker,J.Μ.(1997)BasicCellCultureProtocols,SecondEdition,HumanaPress,Totowa,N.J.；Freshney,R.I.(2000)CultureofAnimalCells,FourthEdition,ffiley-Liss,Hoboken,N.J.)本發(fā)明可以采用任何方法來維持分離的干細(xì)胞如間充質(zhì)干/祖細(xì)胞、或其后代的生物活性。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，通過利用冷凍保存來保存(維持)和存儲(chǔ)細(xì)胞。給予(給藥)和組合物上清液或可溶性因子本發(fā)明的方法可以涉及局部、全身、或局部性地如在植入物或裝置內(nèi)，給予來自MPC的上清液或可溶性因子。在一種具體實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及系統(tǒng)地將來自MPC的上清液或可溶性因子給予受治療者。例如，可以通過皮下或肌內(nèi)注射來給予上清液或可溶性因子。本發(fā)明的該實(shí)施方式可以用于治療系統(tǒng)性變性疾病(systemicdegenerativediseases)，其中期望產(chǎn)生或修復(fù)特定組織。可以以這種方式治療的系統(tǒng)性變性疾病的實(shí)例包括骨質(zhì)疏松癥或骨折、或軟骨的變性疾病。來自MPC的上清液或可溶性因子還可以用來治療這樣的患者，所述患者需要修復(fù)或替換軟骨組織(由組織的疾病或創(chuàng)傷或衰竭引起)以正常發(fā)展，或用來提供化妝功能，如用來增加身體的面部或其它特點(diǎn)。治療可以需要使用上清液或可溶性因子以產(chǎn)生新的軟骨組織和/或維持現(xiàn)有的軟骨組織。例如，來自MPC的上清液或可溶性因子可以用來治療軟骨病癥，例如，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎或骨關(guān)節(jié)炎或?qū)浌堑膭?chuàng)傷或手術(shù)損傷。包括來自MPC的上清液或可溶性因子的懸浮液可以被制備成適當(dāng)?shù)挠糜谧⑸涞挠托詰腋∫?。適宜的親油性溶劑或載體包括脂肪油如麻油；或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯；或脂質(zhì)體。用于注射的懸浮液還可以包含增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇、或葡聚糖。可選地，懸浮液還可以包含適宜的穩(wěn)定劑或用來增加化合物的溶解度的藥劑，以便于制備高濃縮溶液。根據(jù)需要，可以通過將所需量的上清液或可溶性因子加入到包含以上所列舉組分中的一種或組分的組合的適當(dāng)溶劑中，接著過濾滅菌，來制備無菌注射液。通常，通過將上清液或可溶性因子加入到無菌載體中來制備分散體，其中無菌載體包含基本分散介質(zhì)以及所需要的來自上面列舉的其它組分。在無菌粉末用于制備無菌注射液的情況下，制備的優(yōu)選方法是真空干燥和冷凍干燥，其產(chǎn)生活性組分加上任何另外的所期望的組分(來自其先前無菌過濾溶液)的粉末。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)可替換方面，可以用一種或更多種另外的化合物(其增強(qiáng)它的溶解度)來配制上清液或可溶性因子。細(xì)胞組合物在一種實(shí)施方式中，作為未分化細(xì)胞，S卩，作為在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)的未分化細(xì)胞，給予本發(fā)明的細(xì)胞組合物。可替換地，可以在培養(yǎng)以后給予細(xì)胞組合物?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)胞組合物可以單獨(dú)給予或作為與其它細(xì)胞的混合物給予?？梢赃B同本發(fā)明的組合物一起給予的細(xì)胞包括但不限于其他多能細(xì)胞或軟骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、骨襯細(xì)胞、干細(xì)胞、或骨髓細(xì)胞?？梢粤⒓椿蛟诮o予以前不久，將不同類型的細(xì)胞與本發(fā)明的組合物混合，或可以在給予以前一起共培養(yǎng)它們一段時(shí)間。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，在開始治療以前，可以無必要或不期望用細(xì)胞組合物對(duì)患者進(jìn)行免疫抑制。因此，在某些情況下，可以耐受用同種異體、或甚至異種MPC或其后代進(jìn)行的移植。然而，在其它情況下，在開始細(xì)胞療法以前，對(duì)患者進(jìn)行藥理免疫抑制可以是期望的或適當(dāng)?shù)?。這可以通過使用全身或局部免疫抑制劑來完成，或可以通過遞送在包封裝置中的細(xì)胞來完成。細(xì)胞可以被包封在膠囊中，該膠囊對(duì)于細(xì)胞和治療因子所需要的營(yíng)養(yǎng)物和氧是可滲透的，而細(xì)胞對(duì)于免疫體液因子和細(xì)胞則是不可滲透的。優(yōu)選地，膠囊密封材料(密封劑，encapsulant)是低變應(yīng)原的、容易且穩(wěn)定位于靶組織中，并且為植入結(jié)構(gòu)提供另外的保護(hù)。用于減少或消除對(duì)移植細(xì)胞的免疫反應(yīng)的這些和其它方式在本領(lǐng)域中是已知的。作為一種備選方案，可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾以降低它們的免疫原性。概況“治療有效量”是指在所必要的劑量和時(shí)間下有效的達(dá)到期望效果的量。“預(yù)防有效量”是指在所必要的劑量和時(shí)間下有效的達(dá)到期望的預(yù)防性結(jié)果(如預(yù)防或抑制細(xì)胞凋亡或組織損傷)的量。待給予的上清液或可溶性因子、或MPC或其后代的量可以根據(jù)各種因素而變化，如個(gè)體的疾病狀態(tài)、年齡、性別、以及體重。可以對(duì)劑量方案(dosageregimens)進(jìn)行調(diào)節(jié)以提供最佳治療反應(yīng)。例如，可以給予單丸(單次，singlebolus)，可以隨時(shí)間給予多個(gè)分劑量，或按比例地減少或增加劑量，如治療情況的緊急狀態(tài)所表明的?？梢杂欣氖牵詥挝粍┬团渲莆改c道外組合物，以便于給予和獲得劑量的均勻性。如在本文中所使用的，“單位劑型”是指物理上分散的單位，其適合作為用于待治療受治療者的單位劑量；每個(gè)單位包含預(yù)定量的計(jì)算用來產(chǎn)生希望的治療效應(yīng)的活性化合物以及所需要的藥物載體。應(yīng)當(dāng)明了，可以以包括藥用載體或賦形劑的組合物的形式來給予上清液或可溶性因子或MPC或其后代。如在本文中所使用的，“藥用載體”或“賦形劑”包括任何和所有溶劑、分散介質(zhì)、涂層、抗菌藥以及抗真菌藥、等滲劑以及吸收延遲劑等，其是生理上相容的。在一種實(shí)施方式中，載體適用于胃腸道外給予。可替換地，載體可以適合于靜脈內(nèi)給予、腹腔內(nèi)給予、肌內(nèi)給予、舌下給予或口服給予。藥用載體包括無菌水溶液或分散體以及用于臨時(shí)制備無菌注射液或分散體的無菌粉末。這樣的介質(zhì)和藥劑用于藥物活性物質(zhì)在本領(lǐng)域中是眾所周知的。除非任何常規(guī)的介質(zhì)或藥劑與活性化合物不相容，否則可以期待其用于本發(fā)明的藥物組合物。輔助的活性化合物也可以加入到組合物中。在制備和儲(chǔ)存條件下，治療組合物通常應(yīng)當(dāng)是無菌和穩(wěn)定的。組合物可以被配制成溶液、微乳、脂質(zhì)體、或其它有序結(jié)構(gòu)。載體可以是溶劑或分散介質(zhì)，其包含，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇以及液體聚乙二醇等)、以及它們的適宜混合物。例如，可以通過使用涂層如卵磷脂，在分散體的情況下通過保持所需的顆粒大小，以及通過使用表面活性劑來保持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性。在許多情況下，優(yōu)選的是，在組合物中包括等滲劑，例如，糖，多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的藥劑，例如，單硬脂酸鹽和明膠，可以產(chǎn)生可注射組合物的長(zhǎng)期吸收。此外，在時(shí)間釋放劑型(配方，formulation)中，例如在包括緩釋聚合物的組合物中可以給予刺激因子?？梢赃B同載體一起來制備活性化合物，其中載體將保護(hù)化合物免受快速釋放，如控釋劑型，其包括植入物和微囊化遞送系統(tǒng)?？梢允褂每缮锝到狻⑸锵嗳菥酆衔?，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸以及聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PLG)。用于制備這樣的劑型的許多方法是專利性的或通常對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的?？梢赃B同適當(dāng)?shù)幕|(zhì)一起給予上清液或可溶性因子或細(xì)胞組合物，例如，以提供可溶性因子的緩釋?；|(zhì)材料的選擇是基于生物相容性、生物降解性、力學(xué)性能、美容外觀(cosmeticappearance)以及界面性能。用于組合物的潛在基質(zhì)可以是可生物降解的和化學(xué)定義的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、聚乳酸以及聚酸酐。其它潛在物質(zhì)(基質(zhì))是可生物降解的和生物上明確定義的，如骨或真皮膠原。另外的基質(zhì)由純蛋白或細(xì)胞外基質(zhì)成分構(gòu)成。其它潛在基質(zhì)是不可生物降解的和化學(xué)定義的，如燒結(jié)羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽、或其它陶瓷。基質(zhì)可以由任何上述類型的材料的組合，如聚乳酸和羥基磷灰石或膠原和磷酸三鈣構(gòu)成?？梢愿淖兩锾沾傻慕M成，如在鋁酸鈣磷酸鹽(calcium-aluminate-phosphate)中并加以處理以改變孔徑、顆粒大小、顆粒形狀、以及生物降解性。來自MPC的上清液或可溶性因子、MPC或其后代可以被手術(shù)移植、注射、遞送(例如，通過導(dǎo)管或注射器)，或以其它方式直接或間接地給予需要修復(fù)或增強(qiáng)的部位。來自MPC的上清液或可溶性因子的給予途徑包括肌內(nèi)給予、眼給予、胃腸道外給予(包括靜脈內(nèi)給予)、動(dòng)脈內(nèi)給予、皮下給予、口服給予以及鼻給予。胃腸道外給予的具體途徑包括但不限于肌內(nèi)給予途徑、皮下給予途徑、腹腔內(nèi)給予途徑、大腦內(nèi)給予途徑、心室內(nèi)給予途徑、腦室內(nèi)給予途徑(intracerebroventricular)、鞘內(nèi)給予途徑(intrathecal)、腦池內(nèi)給予途徑(intracisternal)、脊柱內(nèi)和/或脊柱周圍給予途徑。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，劑型包括原位可聚合凝膠，如例如在US2002/0022676；Ansethetal.(2002)和Wangetal.(2003)中所描述的。在一些實(shí)施方式中，聚合物至少部分可溶于水溶液，如水、緩沖鹽溶液、或含水醇溶液，其具有帶電荷的側(cè)基團(tuán)、或其單價(jià)離子鹽。具有可以與陽離子反應(yīng)的酸性側(cè)基團(tuán)的聚合物的實(shí)例是聚(磷腈)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、丙烯酸和甲基丙烯酸的共聚物、聚(乙酸乙烯酯)、以及磺化聚合物，如磺化聚苯乙烯。還可以使用這樣的共聚物，其具有通過丙烯酸或甲基丙烯酸和乙烯基醚單體或聚合物的反應(yīng)所形成的酸性側(cè)基團(tuán)。酸性基團(tuán)的實(shí)例是羧酸基團(tuán)、磺酸基團(tuán)、鹵化(優(yōu)選氟化)醇基團(tuán)、酚OH基團(tuán)、以及酸性O(shè)H基團(tuán)。具有可以與陰離子反應(yīng)的堿性側(cè)基團(tuán)的聚合物的實(shí)例是聚(乙烯胺)、聚(乙烯基吡啶)、聚(乙烯基咪唑)、以及一些亞氨基取代的聚磷腈。聚合物的銨鹽或季鹽還可以由主鏈氮或側(cè)亞氨基基團(tuán)來形成。堿性側(cè)基團(tuán)的實(shí)例是氨基和亞氨基基團(tuán)。在室溫下，在水中，藻酸鹽可以與二價(jià)陽離子離子鍵交聯(lián)，以形成水凝膠基質(zhì)。由于這些溫和條件，藻酸鹽已是最通常用于雜交瘤細(xì)胞膠囊化的聚合物，如例如在US4，352，883中所描述的。在US4，352，883中所描述的方法中，包含待包封的生物材料的水溶液被懸浮在水溶性聚合物的溶液中，使懸浮液形成為液滴，通過與多價(jià)陽離子接觸，其被配置到分離的微膠囊中，然后微膠囊的表面與聚氨基酸交聯(lián)以在包膠材料周圍形成半透膜。聚磷腈是具有主鏈的聚合物，其中主鏈由被交替的單鍵和雙鍵隔開的氮和磷組成。每個(gè)磷原子共價(jià)結(jié)合于兩個(gè)側(cè)鏈。適用于交聯(lián)的聚磷腈具有大部分側(cè)鏈基團(tuán)，其是酸性的并且能夠與二價(jià)或三價(jià)陽離子形成鹽橋。優(yōu)選的酸性側(cè)基團(tuán)的實(shí)例是羧酸基團(tuán)和磺酸基團(tuán)。水解穩(wěn)定的聚磷腈由具有羧酸側(cè)基團(tuán)的單體形成，其中羧酸側(cè)基團(tuán)通過二價(jià)或三價(jià)陽離子如Ca2+或Al3+加以交聯(lián)?？梢院铣删酆衔?，其通過水解降解，其中通過加入具有咪唑、氨基酸酯或甘油側(cè)基團(tuán)的單體。例如，可以合成聚陰離子聚[二(乙氧羰苯氧基(羰基苯氧基，carboxylatophenoxy))]磷腈(PCPP)，其在水介質(zhì)中在室溫以下與溶解的多價(jià)陽離子交聯(lián)以形成水凝膠基質(zhì)?？缮锝到獾木哿纂婢哂兄辽賰煞N不同類型的側(cè)鏈，能夠與多價(jià)陽離子形成鹽橋的酸性側(cè)基團(tuán)，以及在體內(nèi)條件下水解的側(cè)基團(tuán)，例如，咪唑基團(tuán)、氨基酸酯、甘油以及葡糖基。側(cè)鏈的水解導(dǎo)致聚合物的侵蝕。水解側(cè)鏈的實(shí)例是未取代和取代的咪唑和氨基酸酯，其中通過氨基鍵，基團(tuán)結(jié)合于磷原子(其中兩個(gè)R基團(tuán)均以這種方式加以連接的聚磷腈聚合物被稱作聚氨基磷腈)。對(duì)于聚咪唑磷腈，在聚磷腈主鏈上的一些“R”基團(tuán)是咪唑環(huán)，其通過環(huán)氮原子連接于主鏈上的磷。其它“R”基團(tuán)可以是有機(jī)殘基，其并不參與水解，如甲基苯氧基基團(tuán)或在Allcock等人(1977)的科學(xué)論文中所描述的其它基團(tuán)。水凝膠材料的合成方法、以及用于制備這樣的水凝膠的方法在本領(lǐng)域中是已知的?？梢耘c其它有益藥物或生物分子(生長(zhǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)因子)一起給予來自MPC的上清液或可溶性因子、MPC或其后代。當(dāng)與其它藥劑一起給予時(shí)，它們可以以單一藥物組合物一起給予，或以分開的藥物組合物，與其它藥劑同時(shí)或順序地(在給予其它藥劑以前或以后)給予?？梢怨餐o予的生物活性因子包括抗凋亡劑(例如，ΕΡ0、ΕΡ0模擬體(mimetibody)、TPO、IGF-1和IGF-II、HGF、半胱天冬酶抑制劑)；抗炎劑(例如，p38MAPK抑制劑、TGF-β抑制劑、斯達(dá)汀(抑制素)、IL-6和IL-I抑制劑、PEMIROLAST,TRANILAST,REMICADE、SIROLIMUS、以及NSAID(非甾體抗炎藥；例如，TEP0XALIN、T0LMETIN、SUPR0FEN)；免疫抑制/免疫調(diào)節(jié)劑(例如，鈣調(diào)磷酸酶(鈣神經(jīng)素)抑制劑，如環(huán)孢菌素、他克莫司(tacrolimus)；mTOR抑制劑(例如，SIROLIMUS,EVER0LIMUS)；抗增殖劑(例如，硫唑嘌呤(咪唑硫嘌呤，azathioprine)、麥考酚酸嗎乙酯(mycophenolatemofetil))；皮質(zhì)類固醇(例如，潑尼松龍、氫化可的松)；抗體如單克隆抗IL-2Ra受體抗體(例如，巴利昔單抗、達(dá)克珠單抗)、多克隆抗T細(xì)胞抗體(例如，抗胸腺細(xì)胞球蛋白(ATG)；抗淋巴細(xì)胞球蛋白(ALG)；單克隆抗T細(xì)胞抗體0KT3))；抗血栓發(fā)生劑(例如，肝素、肝素衍生物、尿激酶、PPack(右方寵苯丙氨酸月甫氨酸精氨酸氯甲基酮(dextrophenylalanineprolineargininechloromethylketone))、抗凝血酶化合物、血小板受體拮抗劑、抗凝血酶抗體、抗血小板受體抗體、阿司匹林、潘生丁、魚精蛋白、水蛭素、前列腺素抑制劑、以及血小板抑制劑)；和抗氧化劑(例如，普羅布考、維生素A、抗壞血酸、維生素E、輔酶Q-10、谷胱甘肽、L-半胱氨酸、N-乙酰基半胱氨酸)以及局部麻醉藥。作為另一個(gè)實(shí)例，如在US5，827，735中所描述的，可以連同瘢痕抑制因子一起共同給予來自MPC的上清液或可溶性因子、MPC或其后代。當(dāng)治療和/或預(yù)防由結(jié)締組織的退變和/或炎癥所引起的疾病時(shí)，優(yōu)選的是，與軟骨保護(hù)劑一起給予上清液、可溶性因子或細(xì)胞。實(shí)例包括但不限于戊聚糖聚硫酸酯(或鹽)(SP54和Cartrophen)、糖胺聚糖聚硫酸酯(Arteparon)、糖氨基-聚糖-肽復(fù)合物(Rumalon)以及透明質(zhì)酸(Hyalgan)。Verbruggen(2005)以及Richette和Bardin(2004)描述了另外的實(shí)例。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，軟骨保護(hù)劑是透明質(zhì)酸。纖維蛋白膠纖維蛋白膠是一類外科密封劑，其已用于各種臨床環(huán)境(clinicalsettings)。當(dāng)技術(shù)人員將明了的，許多密封劑可用于本文定義的方法。然而，本發(fā)明的一種優(yōu)選實(shí)施方式涉及纖維蛋白膠的應(yīng)用。當(dāng)本文中使用時(shí)，術(shù)語“纖維蛋白膠”是指在有鈣離子存在的情況下通過交聯(lián)纖維蛋白聚合物而形成的不溶性基質(zhì)。纖維蛋白膠可以形成自纖維蛋白原、或其衍生物或代謝物，纖維蛋白(可溶性單體或聚合物)和/或其來自生物組織或液體(其形成纖維蛋白基質(zhì))的復(fù)合物?？商鎿Q地，纖維蛋白膠可以由纖維蛋白原、或其衍生物或代謝物、或纖維蛋白(通過重組DNA技術(shù)產(chǎn)生)形成。還可以通過纖維蛋白原和纖維蛋白膠形成的催化劑(如凝血酶和/或因子XIII)的相互作用來形成纖維蛋白膠。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了的，纖維蛋白原在有催化劑(如凝血酶)存在的情況下被蛋白水解切割并被轉(zhuǎn)化成纖維蛋白單體。然后纖維蛋白單體可以形成聚合物，其可以交聯(lián)以形成纖維蛋白膠基質(zhì)?？梢酝ㄟ^催化劑如因子XIII的存在來增強(qiáng)纖維蛋白聚合物的交聯(lián)。纖維蛋白膠形成的催化劑可以來自血漿、冷凍沉淀物或其它血漿部分，其包含纖維蛋白原或凝血酶。可替換地，可以通過重組DNA技術(shù)來生產(chǎn)催化劑。血塊形成的速度取決于與纖維蛋白原混合的凝血酶的濃度。作為酶依賴性反應(yīng)，溫度越高(高達(dá)37°C)，血塊形成速度越快。血塊的拉伸強(qiáng)度取決于所使用的纖維蛋白原的濃度。Hirsh等人在美國(guó)專利第5，643，192號(hào)中描述了纖維蛋白膠的應(yīng)用以及其制備和應(yīng)用方法。Hirsh披露了纖維蛋白原和凝血酶成分從單一供體的提取，以及僅這些成分的組合用作纖維蛋白膠。Marx，美國(guó)專利第5，651，982號(hào)描述了纖維蛋白膠的另一種制備和應(yīng)用方法。Marx提供了一種纖維蛋白膠，其中脂質(zhì)體用作哺乳動(dòng)物中的局部密封劑。用于傷口愈合的局部纖維蛋白原復(fù)合物(TFC)的制備和應(yīng)用在本領(lǐng)域是已知的。美國(guó)紅十字會(huì)的國(guó)際專利公開第W096/17633號(hào)討論了TFC制劑，其包含纖維蛋白原、凝血酶、以及氯化鈣。多個(gè)出版物描述了纖維蛋白膠在用于遞送治療劑中的應(yīng)用。例如，美國(guó)專利4，983，393披露了一種用作陰道內(nèi)插入物的組合物，其包含瓊脂糖、瓊脂、糖胺聚糖鹽溶液(salinesolutionglycosaminoglycans)、膠原、纖維蛋白以及酶。另外，美國(guó)專利3，089，815披露了一種可注射藥物制劑，其由纖維蛋白原和凝血酶組成，而美國(guó)專利6，468，527披露了一種纖維蛋白膠，其可以促進(jìn)各種生物和非生物劑遞送到身體內(nèi)的特定部位。基因修飾細(xì)胞的牛產(chǎn)在一種實(shí)施方式中，在本發(fā)明的方法中所使用的細(xì)胞(包括用于上清液或可溶性因子的生產(chǎn))被基因修飾。優(yōu)選地，細(xì)胞被基因修飾以產(chǎn)生異源蛋白質(zhì)。通常，細(xì)胞將被基因修飾使得異源蛋白質(zhì)分泌自細(xì)胞。然而，在一種實(shí)施方式中，細(xì)胞可以被修飾以表達(dá)功能性非蛋白，其編碼多核苷酸如dsRNA(通常用于RNA沉默)，反義寡核苷酸或催化核酸(如核酶或脫氧核酶)?？梢栽诖嬖谥辽僖环N細(xì)胞因子(其量足以支持修飾細(xì)胞的生長(zhǎng))的情況下對(duì)基因修飾的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。由此獲得的基因修飾細(xì)胞可以立即使用(例如，在移植物中)，體外培養(yǎng)和擴(kuò)大，或存儲(chǔ)供以后使用?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域眾所周知的方法，例如，冷凍在液氮中，來存儲(chǔ)修飾細(xì)胞。如在本文中所使用的基因修飾包括任何基因修飾方法，其涉及將外源性或外源多核苷酸引入本文描述的細(xì)胞或涉及修飾細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源性基因。基因修飾包括但不限于轉(zhuǎn)導(dǎo)(病毒介導(dǎo)的宿主DNA從宿主或供體轉(zhuǎn)移到受體，體外或體內(nèi))、轉(zhuǎn)染(用分離的病毒DNA基因組轉(zhuǎn)化細(xì)胞)、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移、電穿孔、磷酸鈣轉(zhuǎn)染或共沉淀以及其它方式。轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法包括用生產(chǎn)細(xì)胞(producercells)直接共培養(yǎng)細(xì)胞(Bregnietal.,1992)或在有或沒有適當(dāng)生長(zhǎng)因子和聚陽離子的情況下單獨(dú)用病毒上清液加以培養(yǎng)。優(yōu)選在載體中將外源性多核苷酸引入細(xì)胞。載體優(yōu)選包括用于插入的編碼序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯的必要元件。用來構(gòu)造這樣的載體的方法在本領(lǐng)域是熟知的。例如，用于構(gòu)造適宜的表達(dá)載體的技術(shù)詳細(xì)地描述在Sambrooketal.，MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborPress,N.Y.(3rdEd.,2000)；以及Ausubeletal.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork(1999)中。載體可以包括但不限于病毒載體，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺相關(guān)病毒，以及單純皰疹病毒；粘粒；質(zhì)粒載體；合成載體；以及本領(lǐng)域中通常使用的重組載體。包含啟動(dòng)子和克隆位點(diǎn)(多核苷酸可以操作性地與其連接)的載體在本領(lǐng)域中是眾所周知的。這樣的載體能夠體外或體內(nèi)轉(zhuǎn)錄RNA，并且商業(yè)上可獲自多種來源如Stratagene(LaJolla,Calif.)和PromegaBiotech(Madison,Wis.)。具體實(shí)施包括來自Stratagene的pSG、pSV2CAT、pXtl；以及來自Pharmacia的pMSG、pSVL、pBPV以及pSVK3。優(yōu)選的載體包括逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(參見，Coffinetal.,"Retroviruses",Chapter9pp；437-473,ColdSpringsHarborLaboratoryPress，1997)?？捎糜诒景l(fā)明的載體可以由本領(lǐng)域眾所周知的生產(chǎn)商重組生產(chǎn)。例如，W094/29438、W097/21824以及W097/21825描述了逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝質(zhì)粒和包裝細(xì)胞系的構(gòu)建。示例性的載體包括pCMV哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，如pCMV6b和pCMV6c(ChironCorp.)、pSFFV_Neo、以及pBluescript-Sk+。有用的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的非限制性實(shí)例是那些來自鼠、鳥或靈長(zhǎng)類逆轉(zhuǎn)錄病毒的載體。常用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體包括那些基于莫洛尼鼠白血病病毒(Moloneymurinesarcomavirus)的載體(MoMLV載體)。其它來自MoMLV的載體包括Lmily、LINGFER、MINGFR以及MINT。另外的載體包括那些基于Gibbon猿白血病病毒(GALV)和莫洛尼鼠肉瘤病毒(MOMSV)以及脾臟病灶形成病毒(spleenfocusformingvirus)(SFFV)的載體。來自鼠干細(xì)胞病毒(MESV)的載體包括MESV-MiLy。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體還包括基于慢病毒的載體，并且非限制性實(shí)例包括基于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)的載體。在產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒載體構(gòu)建物(constructs)中，可以從病毒除去病毒gag、pol以及erw序列，從而為外源DNA序列的插入創(chuàng)造空間。由外源DNA編碼的基因通常在長(zhǎng)末端重復(fù)(LTR)中的強(qiáng)病毒啟動(dòng)子的控制下加以表達(dá)。適當(dāng)控制調(diào)節(jié)序列的選擇取決于所使用的宿主細(xì)胞并且選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員明了的。除了LTR的啟動(dòng)子以外，還已知許多啟動(dòng)子。非限制性實(shí)例包括噬菌體拉姆達(dá)U)PL啟動(dòng)子、人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期啟動(dòng)子；莫洛尼鼠肉瘤病毒(MMSV)、勞氏肉瘤病毒(RSV)、或脾臟病灶形成病毒(SFFV)的U3區(qū)啟動(dòng)子；顆粒酶A啟動(dòng)子；以及顆粒酶B啟動(dòng)子。另外可以使用可誘導(dǎo)的或多重控制元件。適宜啟動(dòng)子的選擇對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說將是顯而易見的。如果通過包裝細(xì)胞系反式(intrans)提供gag、pol以及env功能，則這樣的構(gòu)建物可以有效地被包裝到病毒顆粒中。因此，當(dāng)載體構(gòu)建物被引入到包裝細(xì)胞中時(shí)，由細(xì)胞產(chǎn)生的gag-pol和env蛋白，與載體RNA進(jìn)行組裝以產(chǎn)生傳染性病毒，其被分泌到培養(yǎng)基中。由此產(chǎn)生的病毒可以感染并整合到靶細(xì)胞的DNA中，但并不產(chǎn)生感染性病毒顆粒，因?yàn)樗狈Ρ匾陌b序列。目前使用的大多數(shù)包裝細(xì)胞系已用分開的質(zhì)粒加以轉(zhuǎn)染，所述質(zhì)粒各自包含必要的編碼序列之一，使得在可以產(chǎn)生有復(fù)制能力的病毒以前，多重重組事件是必要的?？商鎿Q地，包裝細(xì)胞系包括前病毒。前病毒已被損害，使得雖然它可以產(chǎn)生為組裝傳染性病毒所需的所有蛋白質(zhì)，但它本身的RNA不能被包裝到病毒中。相反包裝由重組病毒產(chǎn)生的RNA。因此，釋放自包裝細(xì)胞的病毒原液(virusstock)僅包含重組病毒。逆轉(zhuǎn)錄病毒包裝系的非限制性實(shí)例包括PA12、PA317、PE501、PG13、PSI.CRIP,RDI14、GP7C-tTA-G10、ProPak-A(PPA-6)、以及PT67。其它適宜的載體包括腺病毒載體(參見，WO95/27071)和腺相關(guān)病毒載體。這些載體在本領(lǐng)域都是熟知的，例如，如在StemCellBiologyandGeneTherapy,eds.Quesenberryetal.,JohnWiley&Sons，1998；以及美國(guó)專利第5，693，531和5，691，176號(hào)中所描述的。在某些情況下，使用來自腺病毒的載體可以是有利的，因?yàn)樗鼈儾荒芨腥痉欠至鸭?xì)胞。不同于逆轉(zhuǎn)錄病毒DNA，腺病毒DNA不會(huì)被整合到靶細(xì)胞的基因組中。另外，腺病毒載體攜帶外源DNA的能力要比逆轉(zhuǎn)錄病毒載體大得多。腺相關(guān)病毒載體是另一種有用的遞送系統(tǒng)。這種病毒的DNA可以被整合到非分裂細(xì)胞中，并且利用腺相關(guān)病毒載體，許多多核苷酸已成功地引入到不同的細(xì)胞類型中。在一些實(shí)施方式中，構(gòu)建物或載體將包括兩種或更多種異源多核苷酸序列。優(yōu)選地，另外的核酸序列是編碼選擇性標(biāo)記、結(jié)構(gòu)基因、治療基因、或細(xì)胞因子/趨化因子基因的多核苷酸。選擇性標(biāo)記可以包括在構(gòu)建物或載體中，用于監(jiān)測(cè)成功的基因修飾以及用于選擇DNA已被整合到其中的細(xì)胞。非限制性實(shí)例包括抗藥性標(biāo)記，如G148或潮霉素。另外，可以使用負(fù)選擇，例如，其中標(biāo)記是HSV-tk基因。該基因?qū)⑹辜?xì)胞對(duì)藥劑如阿昔洛韋和更昔洛韋變得敏感。通常使用NeoR(新霉素/G148抗性)基因，但可以使用任何方便的標(biāo)記基因，其基因序列并不已經(jīng)存在于靶細(xì)胞中。另外的非限制性實(shí)例包括低親和力神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGFR)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(EFGP)、二氫葉酸還原酶基因(DHFR)、細(xì)菌hisD基因、鼠CD24(HSA)、鼠CDSa(Iyt)、細(xì)菌基因，其賦予對(duì)嘌呤霉素或腐草霉素、以及β-半乳糖苷酶的抗性。另外的多核苷酸序列可以被引入到在相同載體上的細(xì)胞中或可以被引入到在第二載體上的宿主細(xì)胞中。在一種優(yōu)選的實(shí)施方式中，選擇性標(biāo)記將包括在與多核苷酸相同的載體上。本發(fā)明還包括基因修飾內(nèi)源性基因的啟動(dòng)子區(qū)，使得內(nèi)源性基因的表達(dá)被正調(diào)節(jié)，從而，與野生型細(xì)胞相比，導(dǎo)致編碼蛋白的生產(chǎn)增加。實(shí)施例t施例ι免,瘡詵擇MpcΗ青液的收集骨髓(BM)收獲自小于兩歲的羊。簡(jiǎn)單地說，從髂嵴前部將40ml的BM抽吸到包含鋰-肝素抗凝劑的管中。利用Lymphopi^p(NycomedPharma,Oslo,Norway)通過密度梯度分離來制備BMMNC，如先前描述的(Zannettinoetal.，1998)。在4°C和400xg下離心30分鐘以后，用移液吸管移走血沉棕黃層并在“HHF”中洗滌三次，其中“HHF”由Hanks平衡鹽溶液(HBSS；LifeTechnologies，Gaithersburg，MD)構(gòu)成，并且包含胎牛血清(FCS，CSLLimited，Victoria，澳大利亞)。隨后通過磁性活化細(xì)胞分選來分離TNAP+，如先前描述的(Gronthosetal.,2003；Gronthosetal.，1995)。簡(jiǎn)單地說，在冰上在封阻緩沖液中溫育大約1_3XIO8BMMNC20分鐘，其中封阻緩沖液由HHF中的10%(ν/ν)正常兔血清組成。在冰上，在封阻緩沖液中，用200μ1的STR0-3mAb的10μg/ml溶液溫育細(xì)胞1小時(shí)。隨后，通過在400xg下離心，在HHF中洗滌細(xì)胞兩次。添加在HHF緩沖液中的1/50稀度的山羊抗小鼠γ-生物素(SouthernBiotechnologyAssociates,Birmingham,UK)，并在冰上溫育細(xì)胞1小時(shí)。如上述在MACS緩沖液(沒有Ca2+和Mn2+的PBS，補(bǔ)充有1%BSA、5mMEDTA以及0.01%疊氮化鈉)中洗滌細(xì)胞兩次，然后再懸浮在最終容積為0.9ml的MACS緩沖液中。將100μ1鏈霉親合素微珠(MiltenyiBiotec；BergischGladbach，德國(guó))加入到細(xì)胞懸浮液中并在冰上溫育15分鐘。洗滌細(xì)胞懸浮液兩次，并再懸浮在0.5ml的MACS緩沖液中，隨后加載到微型MACS柱(MSColumns,MiltenyiBiotec)上，接著用0.5ml的MACS緩沖液洗滌三次，以回收細(xì)胞，其并沒有結(jié)合STR0-3mAb(在2005年12月19日保藏在AmericanTypeCultureCollection(ATCC)，登錄號(hào)為PTA-7282，參見W0/2006/108229)。在添加另外的Iml的MACS緩沖液以后，將柱從磁體移開并通過正壓力來分離TNAP陽性細(xì)胞?？梢杂面溍褂H合素-FITC對(duì)來自每個(gè)部分的等分部分的細(xì)胞進(jìn)行染色，并通過流式細(xì)胞術(shù)評(píng)估純度。通過平板接種在α-MEM中，從MACS分離的TNAP+細(xì)胞建立原代培養(yǎng)，其中α-MEM補(bǔ)充有20%胎牛血清、2mML-谷氨酰胺以及100μmL-抗壞血酸-2-磷酸鹽，如先前描述的(Gronthosetal.，1995)。對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，達(dá)到傳代培養(yǎng)5次，其時(shí)可以收集經(jīng)調(diào)節(jié)的培養(yǎng)基(上清液)。實(shí)施例2:在成年去勢(shì)的雄性羊(閹羊)中，在由雙側(cè)全內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)(bilateraltotalmedialmeniscectomy)誘導(dǎo)的早期OA的模型中，同種異體免疫選擇的丨、曰充質(zhì)前體細(xì)朐,(MPC)對(duì)軟骨完牛的齊1丨量{衣1^牛關(guān)節(jié)內(nèi)景如向惱開窮t膝關(guān)節(jié)半月板(關(guān)節(jié)盤)或半月軟骨是重要的承重結(jié)構(gòu)，其還用來在關(guān)節(jié)鉸接期間改善關(guān)節(jié)軟骨潤(rùn)滑和提供橫向穩(wěn)定。撕裂或變性半月板(meniscus，關(guān)節(jié)盤)的手術(shù)切除，即，半月板切除術(shù)，是常見的矯形手術(shù)，但已知伴隨在晚年的骨關(guān)節(jié)炎(OA)的增加的風(fēng)險(xiǎn)(Englimd，2004)。在先前由手術(shù)切除半月板(關(guān)節(jié)盤)占據(jù)的空間中的關(guān)節(jié)滑膜的機(jī)械壓迫性損害已知會(huì)導(dǎo)致半月板仿制品(meniscusreplica)的部分再生(Moonetal.，1984)。然而，在狗中實(shí)驗(yàn)性半月板切除術(shù)研究的結(jié)果表明，這些更換結(jié)構(gòu)主要由纖維組織構(gòu)成，其生物力學(xué)性能遠(yuǎn)不如原來的半月板(menisci)(Ghoshetal.，1983)。此外，在半月板切除術(shù)6個(gè)月后，在這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的關(guān)節(jié)中OA發(fā)展的程度是相對(duì)嚴(yán)重的，這證實(shí)了由再生結(jié)構(gòu)提供的對(duì)關(guān)節(jié)軟骨的有限的功能保護(hù)(Ghoshetal.1983a)。OA的較大和較小動(dòng)物模型已允許在關(guān)節(jié)組織中空間和時(shí)間變化的縱向評(píng)價(jià)，其發(fā)生在該疾病的發(fā)展過程中，而這難以利用人類患者來獲得(SmithandGhosh,2001).在美利奴綿羊中，外側(cè)或內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)已表明可以可靠地重現(xiàn)OA的典型的生化、生物力學(xué)以及組織病理學(xué)改變(SmithandGhosh,2001)0綿羊OA模型也已廣泛用來研究手術(shù)后治療的各種模式的結(jié)果(Ghosh，1991；SmithandGhosh，2001)，但迄今為止還未用來評(píng)估半月板再生長(zhǎng)和OA的進(jìn)展以及這些事件如何可以受到關(guān)節(jié)內(nèi)間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)治療的影響。我們先前的研究已表明，在美利奴綿羊中雙側(cè)全內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)(BTM)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨(AC)、軟骨下骨以及滑膜組織中的病理變化，其是發(fā)展的并模擬早期人骨關(guān)節(jié)炎(OA)的發(fā)展。我們先前使用了這種動(dòng)物模型來評(píng)估潛在的改善疾病的OA藥物。方法用36只成年美利奴閹羊進(jìn)行BTM。BTM兩周后，對(duì)關(guān)節(jié)隨機(jī)注射2mL高麗透明質(zhì)酸(HA)或懸浮在2mLHA中的2mL同種異體Stro-3+MPC。研究了四種劑量的MPC=A組=10兆(mi1)MPC[η=6]；B組=25milMPC[η=6]；C組=100milMPC[η=18]；以及D組=150milMPC[n=6]。BTM以后12周處死A、B以及D組，并在BTM以后12周[η=6]、24周[η=6]以及52周[η=6]處死C組。在尸體檢剖時(shí)，由兩倍盲觀察員使用0-4等級(jí)對(duì)BTM關(guān)節(jié)的兩個(gè)內(nèi)側(cè)室的AC病變和骨贅(OP)進(jìn)行評(píng)分。從股骨和脛骨的中線除去滑膜組織和5mm寬的冠狀骨軟骨片并加以處理，然后利用引用的方法對(duì)組織病理變化(Littleetal.，1997)和組織形態(tài)測(cè)量分析(Cakeetal.，2003)進(jìn)行評(píng)分。對(duì)來自所有關(guān)節(jié)的完整的髕骨進(jìn)行拓?fù)渖锪W(xué)壓印研究，以確定關(guān)節(jié)軟骨的剛度和相位滯后(Appleyardetal.，2003)。利用Kruskal-Wallis非參數(shù)分析對(duì)治療效果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析并利用MannWhitneyU非參數(shù)分析對(duì)具體的組間比較進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中ρ<0.05被認(rèn)為是顯著的。利用等方差雙尾學(xué)生T檢驗(yàn)對(duì)每組注射有MPC+HA和注射有HA的關(guān)節(jié)進(jìn)行了組間平均值比較的統(tǒng)計(jì)分析，其中ρ<0.05被認(rèn)為是顯著的。利用獨(dú)立的T檢驗(yàn)，對(duì)來自每組注射有MPC+HA(經(jīng)治療的)和注射有HA的關(guān)節(jié)的髕骨軟骨之間的比較進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，其中ρ<0.05被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果BTM后12周，總的形態(tài)評(píng)分表明MPC對(duì)AC完整性和OP形成的劑量依賴效應(yīng)；100milMPC顯示為最有效的軟骨保護(hù)劑量，其是相對(duì)于單獨(dú)的HA(圖1和圖2)。總AC評(píng)分比率(HA+MPC)/(HA)表明100>150>25=10，而OP比率為100=25>10>150milMPC(圖3和圖4)。對(duì)于總股骨和脛骨AC，觀測(cè)到統(tǒng)計(jì)顯著的(SS)更低的評(píng)分(p=0.02)，而對(duì)于C組MPC股骨軟骨，與單獨(dú)的HA(圖1)相比，觀測(cè)到ρ=0.052。C組MPC+HA脛骨平臺(tái)的組織形態(tài)測(cè)量分析揭示了，在中區(qū)(ρ=0.057)和外區(qū)(ρ=0.028)、以及所有區(qū)(ρ=0.01)，AC比相應(yīng)的HA-AC更厚(圖5)。來自C組MPC+HA關(guān)節(jié)的AC切片的平均改進(jìn)Mankin評(píng)分小于相應(yīng)的HA切片，但不是SS。此外，當(dāng)對(duì)來自每組的注射有HA和對(duì)側(cè)注射有HA+MPC的關(guān)節(jié)的總Mankin評(píng)分的比率進(jìn)行計(jì)算和作圖時(shí)，顯而易見的是，100兆劑量的MPC是最有效的(圖6)。100兆MPC劑量在保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨的完整性方面的可持續(xù)性問題是通過研究在注射后22和50周，即半月板切除術(shù)后24和52周，組織的形態(tài)、組織學(xué)以及生物力學(xué)性能來解決的。如從圖7和圖8可以明顯看到的，對(duì)于HA和ΗΑ+100兆MPC的形態(tài)評(píng)分的平均值之間的差異隨時(shí)間減小，雖然在24周時(shí)仍然存在治療效果的某些證據(jù)。這種觀點(diǎn)得到HA/MPC+HA數(shù)據(jù)的支持，其表明細(xì)胞在抑制骨贅評(píng)分方面的強(qiáng)效應(yīng)長(zhǎng)達(dá)52周(圖10和圖11)。另一方面，Mankin組織病理學(xué)評(píng)分的類似作圖表明，到52周，MPC的保護(hù)作用會(huì)喪失(圖11)。對(duì)來自所有動(dòng)物組的關(guān)節(jié)的髕骨軟骨的生物力學(xué)壓印研究通常與形態(tài)和組織學(xué)數(shù)據(jù)一致。然而，軟骨的剛度受到軟骨厚度的影響，其在損傷的初期階段可以是肥大的但隨著時(shí)間會(huì)正?；＿@種情況可以發(fā)生在目前的模型中，因?yàn)獒槍?duì)25和100兆MPC組確定的髕骨軟骨剛度顯著小于10和150兆MPC組，根據(jù)其它研究，其呈現(xiàn)最多的損害組織(圖12和圖13)。這種解釋得到相位滯后數(shù)據(jù)的支持，對(duì)于來自100兆MPC組的髕骨，其顯著更低，這是相對(duì)于對(duì)應(yīng)的注射有HA的關(guān)節(jié)和150兆MPC劑量(圖14)。此外，發(fā)現(xiàn)，在12周時(shí)觀測(cè)到的平均相位滯后值在半月板切除術(shù)后24和52周會(huì)顯著增加，這證實(shí)了在超過6-12個(gè)月會(huì)喪失注射的MPC的有用的治療效果(圖15)。相位滯后反映了軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的分子組裝并且角度(相位)越低，彈性以及從變形恢復(fù)的能力越大(Cakeetal.，2005)。針對(duì)注射有IOOmilMPC的關(guān)節(jié)所觀測(cè)到的軟骨保護(hù)效應(yīng)會(huì)隨時(shí)間而減小；在12和24周BTM觀測(cè)到的積極影響到52周時(shí)會(huì)喪失。不存在滑膜組織病理學(xué)調(diào)節(jié)的證據(jù)。對(duì)這些動(dòng)物進(jìn)行的臨床和肉眼可見器官病理學(xué)還沒有顯示MPC的全身不良影響的任何證據(jù)。結(jié)論據(jù)我們所知，這是首次報(bào)道在早期OA的模型中同種異體MPC對(duì)軟骨完整性的有益治療效果。已知MPC會(huì)釋放生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子并且還抑制其它細(xì)胞的TNF-α的生產(chǎn)，同時(shí)上調(diào)節(jié)抗炎細(xì)胞因子(例如，IL-4、IL-10)。MPC的這些旁分泌活性可以刺激新標(biāo)記的軟骨細(xì)胞生物合成，而且還減弱分解代謝介質(zhì)的局部生產(chǎn)和活性。在該研究中，100兆MPC是軟骨保護(hù)的發(fā)現(xiàn)與這樣的作用機(jī)制一致。在這些羊研究中產(chǎn)生的數(shù)據(jù)表明，由單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射100兆MPC所介導(dǎo)的軟骨保護(hù)效應(yīng)的持續(xù)時(shí)間是在治療后的6-12個(gè)月之間，這表明，對(duì)于OA患者的長(zhǎng)期管理來說，可能需要多次注射。雖然HA的關(guān)節(jié)內(nèi)注射廣泛用于治療膝骨關(guān)節(jié)炎，但存在有限的證據(jù)這種治療是軟骨保護(hù)的(Ghoshetal.，2002)。然而，關(guān)節(jié)內(nèi)HA治療報(bào)道可以提供OA的癥狀緩解，其緩慢發(fā)作，但比用關(guān)節(jié)內(nèi)皮質(zhì)類固醇更持久(Bellamyetal.，2006)。實(shí)施例3在由去勢(shì)母羊的后膝關(guān)節(jié)中的雙側(cè)全內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)所誘導(dǎo)的嚴(yán)重骨關(guān)節(jié)炎的It型中，關(guān)節(jié)內(nèi)灃射誘明質(zhì)酸(HA)或100兆間充質(zhì)前體細(xì)胞』(MPC)+HA對(duì)軟骨完整件的相對(duì)治療效果膝關(guān)節(jié)半月板(關(guān)節(jié)盤)在正常關(guān)節(jié)鉸接期間在保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨(AC)以避免損傷方面具有重要作用(Arnoczkyetal.，1988)。在人類中在損傷以后，全部或部分切除半月板(關(guān)節(jié)盤)通常會(huì)導(dǎo)致AC的過早變性以及發(fā)展成骨關(guān)節(jié)炎(OA)(Jorgensenetal.,1987；Roosetal.，1998andMcNicholasetal.,2000)實(shí)驗(yàn)研究已表明，在羊中單側(cè)或雙側(cè)總半月板切除術(shù)還導(dǎo)致AC的過早破裂和OA的早發(fā)(Ghoshetal,1990；Appleyardetal.，1999andGhoshetal.，1993c)。因?yàn)樵诎朐掳迩谐g(shù)的關(guān)節(jié)中AC的衰竭是對(duì)軟骨施加高集中和剪應(yīng)力的結(jié)果，所以發(fā)現(xiàn)雙側(cè)半月板切除術(shù)會(huì)誘導(dǎo)比單側(cè)半月板切除術(shù)更加快速的軟骨變性的進(jìn)展，其中通過使用對(duì)側(cè)非操作后肢可以完成支持的無疼痛負(fù)重(Ghoshetal.,1993aand1993b；Appleyardetal.，2003；Littleetal.，1997以及Oakleyetal.,2004)另外，進(jìn)行雙側(cè)半月板切除術(shù)的切除卵巢的母羊還已經(jīng)顯示會(huì)經(jīng)受比成年閹割雄性(閹羊)更快發(fā)展的0A，這主要是由于從它們的循環(huán)中消耗了軟骨保護(hù)激素，雌激素(Parkeretal.，2003)。由于這些原因，切除卵巢和雙側(cè)半月板切除術(shù)的母羊有利于作為0A的較大動(dòng)物模型來研究抗0A劑的疾病改善活性(Ghoshetal.,1993；Smithetal.,1997；Burkhardtetal.，2001；Hwaetal.，2001以及Cakeetal.，2000)。因此OA的切除卵巢/雙側(cè)半月板切除術(shù)的羊模型被選擇用于本研究，其目的是用來評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)內(nèi)(IA)給予的同種異體間充質(zhì)前體細(xì)胞(MPC)對(duì)富含蛋白聚糖的軟骨的生長(zhǎng)或再生的誘導(dǎo)的影響以及對(duì)軟骨保護(hù)的影響，其是相對(duì)于目前使用的抗0A治療，IA透明質(zhì)酸(HA)。方法對(duì)3個(gè)月以前已利用發(fā)表的方法(Cakeetal.,1004)經(jīng)受卵巢切除術(shù)的18只成年美利奴母羊進(jìn)行雙側(cè)全內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)(BTM)其中。用于BTM的外科手術(shù)和術(shù)后方案相同于在實(shí)施例2中描述的去勢(shì)雄性羊BTM研究中所用的外科手術(shù)和術(shù)后方案。BTM后12周，6只母羊被處死，而剩余12只半月板切除術(shù)的母羊的后膝(膝)關(guān)節(jié)被隨機(jī)注射有2mL高麗HA或懸浮在2mLProfreeze加2mLHA中的100兆MPC。在實(shí)施例2中，MPC+HA的這種劑量表明，在BTM雄性綿羊模型中可以提供最有利的軟骨保護(hù)效應(yīng)。半月板切除術(shù)和經(jīng)注射的母羊被分成兩組(每組6只)，其在BTM后24和36周，即HA或MPC+HA關(guān)節(jié)內(nèi)注射后12和24周被處死。為了確定性別對(duì)AC關(guān)節(jié)不穩(wěn)定的反應(yīng)的影響，還使6只未治療的去勢(shì)雄性羊經(jīng)受BTM并在半月板切除術(shù)后12周處死。在尸體檢剖中，打開關(guān)節(jié)，除去半月板(關(guān)節(jié)盤)并對(duì)內(nèi)側(cè)股骨和脛骨平臺(tái)進(jìn)行拍照。由兩倍盲觀察員使用0-4等級(jí)針對(duì)軟骨的總的形態(tài)變化對(duì)記錄的圖像進(jìn)行評(píng)分。從每個(gè)關(guān)節(jié)的股骨和脛骨的中線除去來自髕上襞(suprapatellarfold)和5mm寬冠狀骨軟骨片的滑膜，然后加以處理用于制備組織學(xué)切片。由兩位盲觀察員使用如先前所描述的改進(jìn)的Mankin評(píng)分系統(tǒng)(Littleetal.,1997)來評(píng)估軟骨組織病理學(xué)，。利用最近由Cakeetal.,2008描述的標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)滑膜組織病理學(xué)進(jìn)行評(píng)分。如用于Mankin評(píng)分的來自相同軟骨塊的組織學(xué)系列切片還用于組織形態(tài)測(cè)量分析，如先前描述的(Caketetal.,2000；Cakeetal.，2004)。這種技術(shù)采用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析(ImageProPlusv.3.0，MediaCybernetics)來產(chǎn)生關(guān)于甲苯胺藍(lán)染色AC的尺寸和蛋白聚糖含量的指數(shù)的定量數(shù)據(jù)?？傊?，染色切片圖像借助于MicrotekSlidescarmer35tplus(MicrotekModelNo.PTS-1950)以1300dpi的分辨率來獲取，然后在個(gè)人計(jì)算機(jī)上利用ImageJ軟件(http://rsb.info,nih.Rov/ii/)加以分析。股骨和脛骨切片的數(shù)字圖像細(xì)分為內(nèi)區(qū)、中區(qū)以及外區(qū)，每個(gè)區(qū)表示軟骨切片的總面積的大約三分之一。通過掃描10X10mm高精度標(biāo)線片來實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)的空間校準(zhǔn)。然后該等級(jí)(標(biāo)度)用來量化輸入圖像的每個(gè)區(qū)的長(zhǎng)度(mm)和面積(mm2)。切片的平均厚度通過用面積除以長(zhǎng)度來確定。獲得TB染色的軟骨切片的光密度(0D)作為平均灰度值(MGV)(灰度值總和/像素的數(shù)目)并作為蛋白聚糖(PG)含量的指數(shù)。整合的灰階密度(IGD)被計(jì)算為MGVX切片的區(qū)域面積。雖然所使用的灰階系統(tǒng)并不是相對(duì)于已知PG含量的TB染色切片獨(dú)立地加以校準(zhǔn)，但在相同切片機(jī)上切割的所有組織學(xué)切片具有相同厚度并作為一組加以處理，其中使用相同的染色方案。因而在軟骨染色方面的差異是相對(duì)的而非絕對(duì)的。在處死的1小時(shí)內(nèi)除去來自所有關(guān)節(jié)的完整的髕骨并在拓?fù)渖锪W(xué)壓印研究以前立即冷凍和存儲(chǔ)以確定關(guān)節(jié)軟骨的剛度和相位滯后(Appleyardetal.，2003)。用來確定BTM對(duì)照12周后在治療結(jié)果(HA與HA+MPC)或治療與未治療方面的差異的統(tǒng)計(jì)分析，如通過形態(tài)和組織學(xué)評(píng)分系統(tǒng)所評(píng)估的，是利用Kruskal-Wallis非參數(shù)分析來進(jìn)行的，并且對(duì)于組比較之間的差異則是利用MarmWhitneyU非參數(shù)分析來進(jìn)行，其中p<0.05被認(rèn)為是顯著的。通過數(shù)字化組織學(xué)切片的組織形態(tài)測(cè)量分析產(chǎn)生的數(shù)據(jù)利用等方差雙尾學(xué)生T檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，其中p<0.05被認(rèn)為是顯著的。利用獨(dú)立的T檢驗(yàn)來計(jì)算相對(duì)于不同治療和BTM后時(shí)間之間的髕骨軟骨生物力學(xué)參數(shù)的統(tǒng)計(jì)分析，其中p<0.05被認(rèn)為是顯著的。結(jié)果在來自BTM后12周的未治療的母羊的關(guān)節(jié)中軟骨侵蝕和骨贅形成的總的形態(tài)評(píng)估證實(shí)了，與進(jìn)行相同外科手術(shù)的半月板切除術(shù)的閹割雄性相比，0A的這種模型表示這種疾病的更加侵襲性和嚴(yán)重的形式。對(duì)于這種未治療的雌性對(duì)照組，相對(duì)于用來評(píng)估該參數(shù)的最高評(píng)分，股骨的平均軟骨形態(tài)評(píng)分為87%而對(duì)于脛骨則為75%。來自經(jīng)受相同外科手術(shù)的半月板切除術(shù)后未治療12周的閹割雄性的關(guān)節(jié)的總的形態(tài)學(xué)評(píng)分顯著小于切除卵巢的母羊(圖16和圖17)，此發(fā)現(xiàn)與利用雙側(cè)側(cè)向半月板切除術(shù)的先前的觀測(cè)結(jié)果一致(Parkeretal.，2003；Cakeetal.，2004)。雖然與半月板切除術(shù)后未治療12周的母羊基線(數(shù)據(jù)未示出)相比，在24和36周，兩種治療均導(dǎo)致更低的平均股骨形態(tài)軟骨評(píng)分，但在MPC和HA治療關(guān)節(jié)之間并沒有檢測(cè)到顯著差異。我們認(rèn)為，這意味著在嚴(yán)重0A的這種模型中，總的形態(tài)病變(侵蝕和骨贅評(píng)分)的嚴(yán)重性使這些參數(shù)太不敏感以致不能檢測(cè)治療性差異。發(fā)現(xiàn)來自BTM后未治療12周組的軟骨的改進(jìn)Mankin組織病理學(xué)評(píng)分與軟骨損傷的程度(如形態(tài)評(píng)估的)一致(圖16和圖17)。與形態(tài)參數(shù)相反，在36周，在切除卵巢的母羊(其接受MPC+HA)中股骨軟骨的總平均改進(jìn)的Mankin評(píng)分低于僅接受HA的關(guān)節(jié)的相應(yīng)評(píng)分并且與僅單獨(dú)HA相比，對(duì)于蛋白聚糖的更強(qiáng)區(qū)間甲苯胺藍(lán)(ITTB)染色顯示顯著更低的細(xì)胞數(shù)(P=0.01)和趨勢(shì)(p=0.06)(圖18)。對(duì)于脛骨軟骨來說，這些效應(yīng)不太明顯(圖18)。當(dāng)確定兩種關(guān)節(jié)內(nèi)治療的平均總改進(jìn)的Mankin評(píng)分的比率時(shí)，相對(duì)于注射HA的23關(guān)節(jié)，在半月板切除術(shù)后36周，針對(duì)MPC+HA注射所觀測(cè)到的更低改進(jìn)的Mankin組織病理學(xué)軟骨評(píng)分是突出的(圖19)。因?yàn)槊總€(gè)比率獲自相同動(dòng)物的兩種治療的關(guān)節(jié)，所以比率=1將表明兩種治療是同樣有效的。然而，對(duì)于比率>1，可以說MPC+HA治療更有利。如從圖19可以明顯看到的，在BTM后36周，針對(duì)股骨軟骨獲得的比率的平均值比整體(unity)顯著更高(1.71)，雖然兩種治療的脛骨軟骨比率(1.12)僅稍微有利于MPC+HA注射組(圖19)。接著我們檢查了隨時(shí)間治療對(duì)Mankin評(píng)分的影響。發(fā)現(xiàn)，在半月板切除術(shù)后24和36周，即注射后12和24周，在MPC+HA與僅HA治療方式(arms)之間，在隨時(shí)間對(duì)股骨軟骨的影響方面存在顯著差異(圖20)。在接受MPC+HA的組中，在24和36周的平均評(píng)分逐漸低于在12周的基線。這是由于降低的評(píng)分和在24周細(xì)胞克隆的改善(P=0.01)，以及在36周細(xì)胞數(shù)(P=0.04)和蛋白聚糖(PG)的區(qū)間甲苯胺藍(lán)染色(P=0.04)的改善，其是相對(duì)于12周未治療組(圖20)。在僅HA組，沒有觀測(cè)到這樣的改善。對(duì)于任何組或關(guān)節(jié)內(nèi)治療，在滑膜病理評(píng)分之間沒有觀測(cè)到顯著差異。在BTM后36周，利用分析的組織形態(tài)測(cè)量方法，作為來自注射關(guān)節(jié)的股骨髁的3個(gè)區(qū)(內(nèi)、中以及外)的PG含量的指數(shù)，TB染色的軟骨厚度、面積以及強(qiáng)度的分析示在圖21中。到BTM后36周時(shí)，治療組之間的顯著差異是明顯的。與HA注射關(guān)節(jié)的相應(yīng)軟骨相比，來自MPC+HA注射關(guān)節(jié)的股骨軟骨顯著更厚(圖21A)并占據(jù)顯著更大的面積(圖21B)。來自MPC+HA注射關(guān)節(jié)的股骨軟骨的更大體積伴隨更高含量的蛋白聚糖，如由TB染色切片的整合的灰度密度所確定的(圖21C)。用基于時(shí)間的分析再次比較這些參數(shù)，發(fā)現(xiàn)，在半月板切除術(shù)后24和36周，即注射后12和24周，在MPC+HA與僅HA治療方式之間，在隨時(shí)間對(duì)股骨軟骨的影響方面的顯著差異。利用相同的組織形態(tài)測(cè)量方法，我們能夠證明，與僅HA相比，半月板切除術(shù)后12周給予的MPC+HA注射導(dǎo)致12和24周以后(S卩，在BTM后24和36周)逐步更大的富蛋白聚糖的股骨軟骨生長(zhǎng)或再生(圖22至圖24)。因此，與在半月板切除術(shù)后12周未治療關(guān)節(jié)的基線值相比，在BTM后24和36周，來自在12周注射有MPC+HA的半月板切除術(shù)母羊的關(guān)節(jié)的股骨軟骨顯著更厚(圖22)，并且通常具有更大的面積(圖23)。從來自HA注射關(guān)節(jié)的股骨軟骨的切片掃描的相應(yīng)區(qū)未能證明相對(duì)于12周未治療對(duì)照的統(tǒng)計(jì)顯著的變化(圖22和圖23)。相對(duì)于來自BTM后未治療12周組的關(guān)節(jié)的相同軟骨區(qū)，對(duì)于HA和MPC+HA注射關(guān)節(jié)來說，作為股骨軟骨切片的PG含量的度量的整合灰階密度顯著更高，但MPC+HA誘導(dǎo)變化的大小顯著大于單獨(dú)的HA(圖24)。而與基線相比，在36周，MPC+HA組發(fā)展幾乎60%更大的富蛋白聚糖股骨組織(P<0.001)，并且軟骨生長(zhǎng)的這種速率還沒有達(dá)到穩(wěn)定期(plateauphase)，僅HA組已達(dá)到穩(wěn)定期并且發(fā)展僅約30%更大的組織。這表明，相對(duì)于單獨(dú)HA治療的基線和任何時(shí)間效應(yīng)，在隨后的24周期間(即，軟骨的生長(zhǎng)和/或再生)，用MPC+HA進(jìn)行的治療會(huì)刺激富蛋白聚糖的軟骨的顯著更大的增加。對(duì)來自注射關(guān)節(jié)的髕骨軟骨的壓印研究的結(jié)果未能說明對(duì)于兩種治療的軟骨生物力學(xué)性能的任何差異，但相對(duì)于半月板切除術(shù)后流逝的時(shí)間和BTM后未治療12周組確定了變化。在半月板切除術(shù)后24周，來自MPC+HA的髕骨軟骨的剛度顯著高于12周(P=0.05)和36周(P<0.01)(數(shù)據(jù)未示出)。然而，與還低于未治療12周對(duì)照(P=0.01)的24周(P=0.001)相比，在36周兩種治療均產(chǎn)生更厚的髕骨軟骨。在24和36周，對(duì)于兩個(gè)治療組來說，髕骨軟骨相位滯后均高于未治療12周對(duì)照(P=0.001)(數(shù)據(jù)未示出)。討論本研究已表明，在切除卵巢的母羊中雙側(cè)內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)會(huì)在3個(gè)月以后誘導(dǎo)關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的病理變化，其與發(fā)展的和嚴(yán)重的OA是一致的。因此，對(duì)于股骨和脛骨軟骨的總的形態(tài)學(xué)評(píng)分是最高評(píng)分的87-70%。有趣的是，與針對(duì)切除卵巢的雌性所觀測(cè)到的相比，經(jīng)受相同外科手術(shù)并在相同時(shí)間(12周)被處死的閹割雄性顯示更小嚴(yán)重的軟骨病變。軟骨病理特征的程度還反映在針對(duì)該組所觀測(cè)到的較高的總計(jì)的改進(jìn)Mankin組織病理學(xué)評(píng)分中，其與早期OA的賦值(分配)是一致的(Littleetal.，1997)。雖然先前的研究已確定了在絕經(jīng)后雌性中OA的強(qiáng)關(guān)聯(lián)，其是通過雌激素從循環(huán)的消耗加以解釋(Roosetal.，2001；Pelletieretal.，2007以及Nevittetal.，1996)并得到對(duì)切除卵巢的母羊的研究的支持(Parkeretal.，2003以及Cakeetal.，2004)，但其它更為最近的研究表明，脂肪衍生激素、瘦素在介導(dǎo)軟骨破裂和0A中可以起更重要的作用(Dumondetal,2003以及Teichtahletal.，2005)。因此BTM后3個(gè)月期間被作為起點(diǎn)來評(píng)價(jià)在給予這些藥劑以后12和24周，關(guān)節(jié)內(nèi)注射HA或MPC+HA對(duì)軟骨病理特征的進(jìn)展速率的相對(duì)效應(yīng)。該研究的結(jié)果表明，將分散在2mLHA和2mLProfreeze(—種商用冷凍保護(hù)齊U)中的100兆MPC單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射到具有確立的嚴(yán)重的0A的關(guān)節(jié)中，可以在24周的干預(yù)期間減慢關(guān)節(jié)病理特征的進(jìn)展以及增強(qiáng)富蛋白聚糖的軟骨的生長(zhǎng)和/或再生到比2mLHA的單次注射更大的程度。令人驚訝地，觀測(cè)到由MPC介導(dǎo)的生長(zhǎng)/再生和軟骨保護(hù)效應(yīng)，在大多數(shù)檢查的參數(shù)中，在給予后的24周比給予后的12周更顯著，這表明發(fā)展的效應(yīng)，其還沒有達(dá)到穩(wěn)定期。該發(fā)現(xiàn)的原因目前是不清楚的，然而，可能的是，生長(zhǎng)因子如TGF-0超家族的成員，例如由MPC釋放的BMP(Ahrensetal.,1993；Aggarwaletal.，2005)支持軟骨的合成代謝(補(bǔ)償)相，以致改變了通過內(nèi)側(cè)半月板切除術(shù)并通過關(guān)節(jié)施加的機(jī)械應(yīng)力。這種觀點(diǎn)得到組織形態(tài)測(cè)量數(shù)據(jù)的支持，其證明了，與在BTM后12周開始治療時(shí)相比，在MPC注射組中存在蛋聚糖的更大容積和更強(qiáng)烈染色。這些基質(zhì)變化與增加的軟骨細(xì)胞生物合成一致。顯著地，通常發(fā)現(xiàn)合成代謝參數(shù)的大小在接受MPC+HA的動(dòng)物的軟骨中比在僅接受HA的動(dòng)物的軟骨中更大。MPC保護(hù)并且甚至增強(qiáng)這種軟骨對(duì)機(jī)械超載的反應(yīng)的能力與對(duì)由0A的許多傳統(tǒng)治療(包括許多類固醇和非留體抗炎藥(NSAID))所介導(dǎo)的對(duì)軟骨細(xì)胞代謝的已知的抑制效應(yīng)形成對(duì)比(McKenzieetal.，1976；Ghosh,1988；Brandt,1993and1993a；Huskissonetal.,1995)。多次關(guān)節(jié)內(nèi)HA注射已用作一種用于管理膝OA多于30年的療法。雖然共識(shí)是這種形式的治療能提供臨床癥狀緩解，但最近的綜述和發(fā)表的HA臨床試驗(yàn)的元分析已質(zhì)疑該結(jié)論的有效性，其是基于與關(guān)節(jié)內(nèi)注射相關(guān)的更強(qiáng)的安慰劑效應(yīng)、盲研究者的困難以及出版偏見(Brandtetal.,2000；Loetal.，2003)。關(guān)節(jié)內(nèi)HA是否呈現(xiàn)任何軟骨保護(hù)或軟骨再生活性還是有爭(zhēng)議的。然而，廣泛的動(dòng)物研究已表明，在由單側(cè)和雙側(cè)半月板切除術(shù)以及在狗中前交叉韌帶橫切誘導(dǎo)的0A的兔和綿羊模型中HA確實(shí)呈現(xiàn)鎮(zhèn)痛、抗炎以及疾病改善效應(yīng)。已綜述了這些數(shù)據(jù)以及基于用不同分子量的HA進(jìn)行的臨床前和實(shí)驗(yàn)室臨床研究(Ghoshetal.，2002)。在本研究中，僅評(píng)估了HA的單次關(guān)節(jié)內(nèi)注射(單獨(dú)或連同MPC—起)?；谖覀冏约旱臄?shù)據(jù)，我們的結(jié)論是，由MPC+HA組合提供的長(zhǎng)期生長(zhǎng)和再生、以及軟骨保護(hù)效應(yīng)是由MPC介導(dǎo)的。在這方面，重要的是應(yīng)當(dāng)注意，本研究的設(shè)計(jì)便于每只動(dòng)物作為它本身的對(duì)照，因?yàn)橐粋€(gè)關(guān)節(jié)接受HA而對(duì)側(cè)關(guān)節(jié)接受相同量在冷凍保護(hù)劑，profreeze中的HA加MPC。因?yàn)閮蓚€(gè)膝關(guān)節(jié)在本研究中均被手術(shù)去穩(wěn)定并且在相同時(shí)間被注射，所以我們確信作用于關(guān)節(jié)軟骨的負(fù)重機(jī)械應(yīng)力的大小和特性對(duì)于兩個(gè)關(guān)節(jié)是相同的。根據(jù)本研究，我們的結(jié)論是，將MPC+HA單次關(guān)節(jié)內(nèi)給予患有預(yù)先存在的嚴(yán)重OA的綿羊關(guān)節(jié)會(huì)導(dǎo)致富蛋白聚糖的軟骨的生長(zhǎng)或再生，如相對(duì)于治療前基線和相對(duì)于HA注射對(duì)照，在治療后24周增加的軟骨細(xì)胞外基質(zhì)所表明的。_9]實(shí)施徹丨4mpc講行的綿羊盤再牛研究方法36只年齡匹配的美利奴閹羊(大約18至24月齡)用于本研究。在所有36只羊中，三個(gè)鄰近的腰椎盤(L3-L4、L4-L5、L5-L6)注射有在大約0.1ml無菌生理鹽水中的1.0IU軟骨素酶(chondroitinase)ABC(SeikagakuCorporation,日本)，以分解和除去NP的PG。剩余的腰椎盤(L1-L2和L2-L3)并不注射有軟骨素酶ABC并用作對(duì)照。在給予軟骨素酶ABC以后15周(士3周)，將與相等容積的透明質(zhì)酸(Euflexxa,(FerringPharmaceuticals))混合的在ProFreezeTMFreezingMedium(NA0)或僅ProFreezeTMNAO(LonzaffalkersvilleLtd.)中的注射液MPC(0.5X106個(gè)細(xì)胞直接給予到椎間盤的軟骨素酶ABC治療的髓核中，其示意性地確定在圖25中。在3個(gè)和6個(gè)月以后處死各實(shí)驗(yàn)組，如在表1中總結(jié)的。表1.研究設(shè)計(jì)總結(jié)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>組I編號(hào)I盤I15±3周前I第O天基線I處死在處死時(shí)的分析~基線L^L6軟骨素酶HA和NAO6個(gè)月成分/組織學(xué)動(dòng)物具有側(cè)平(清晰)X光照片(射線照片)，其是在誘導(dǎo)麻醉下并在以下時(shí)間點(diǎn)獲自腰脊柱第0天(注射軟骨素酶ABC(SeikagakuCorporation,日本))，測(cè)試制品(testarticle)給予日(在誘導(dǎo)腰椎盤變性以后15士3周)，以及在注入測(cè)試制品以后3個(gè)月和6個(gè)月。利用椎間高度指數(shù)(DHI)來評(píng)價(jià)X光照片，其中椎間高度指數(shù)通過如下來計(jì)算平均來自IVD的前、中以及后部分的測(cè)量結(jié)果，然后除以鄰近椎間體高度的平均值，如由(Masudaetal.，2004)所描述的。MRI是在誘導(dǎo)麻醉下并在以下時(shí)間點(diǎn)獲自腰脊柱第0天(注射軟骨素酶ABC[SeikaguCorpJapan])，測(cè)試制品給予日(在誘導(dǎo)腰椎盤變性以后15+3周)，在注入測(cè)試制品以后3個(gè)月和6個(gè)月。根據(jù)MRI掃描并利用Pfirrmarm分類系統(tǒng)(Pfirrmarmetal.,2001)對(duì)腰椎盤進(jìn)行分級(jí)。用于組織化學(xué)和生化分析的脊柱運(yùn)動(dòng)節(jié)段(區(qū)段MSpinalmotionsegments)通過利用骨鋸切割靠近軟骨終板的顱和尾椎體加以分離。將這些脊柱切片全部固定在Histochoice中56小時(shí)并在5%中性緩沖福爾馬林中的10%甲酸的一些變化中脫鈣兩周并不斷攪拌直到利用FaxitronHP43855AX射線小室(HewlettPackard,McMinnville,USA)證實(shí)了完全脫鈣。通過標(biāo)準(zhǔn)組織學(xué)方法并借助于梯度乙醇溶液(gradedethanolsolutions)使脫鈣樣品的多個(gè)矢狀片(sagittalslices)(大約5mm厚)脫水并包埋在石蠟中。將4μπι厚的石蠟切片封固在SuperfrostPlus顯微鏡蓋玻片(Menzel-Glaser)上，在85°C下干燥30分鐘，然后在55°C下過夜。然后在二甲苯(4次變化X2分鐘)中對(duì)切片進(jìn)行去石蠟化并通過梯度乙醇洗滌(100-70%v/v)至自來水加以再水化。用蘇木精和伊紅對(duì)來自由矢狀片制備的所有塊的一個(gè)切片進(jìn)行染色。由獨(dú)立的組織病理學(xué)家檢查編碼的切片，其中組織病理學(xué)家比較僅經(jīng)受酶注射那些水平與被酶注射并隨后接受MPC的那些水平的組織學(xué)特性。四點(diǎn)半定量分級(jí)系統(tǒng)用來評(píng)估整個(gè)盤的微觀特征，如表2所示。還制備了包括阿辛藍(lán)(用于一般的糖胺聚糖物質(zhì))和番紅0(專用于硫酸軟骨素物質(zhì))的另外的染色劑，以說明盤基質(zhì)合成的程度。還利用Sequenza盒和一次性Coverplate免疫染色系統(tǒng)來進(jìn)行免疫組織化學(xué)程序，如先前描述的(Melroseetal.,2003；Melroseetal.,2002；Melroseetal.,2000；Melroseetal.,2002a；Melroseetal.,1998；Panjabietal.,1985；Raceetal.,2000；Smit，2002)。通過用3%H2O2溫育組織切片來最初阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。然后用在20mMTris-乙酸鹽緩沖液pH8.0中的軟骨素酶ABC(0.25U/ml)在37°C下1小時(shí)、在磷酸鹽緩沖液PH5.0中的牛睪丸透明質(zhì)酸酶1000U/ml在37°C下1小時(shí)的組合來對(duì)它們進(jìn)行預(yù)消化，接著在室溫下在20mMTris-HClpH7.20.5MNaCl(TBS)或蛋白酶K(DAK0S3020)中三次洗滌6分鐘，以暴露抗原表位。然后在20%正常豬血清中封閉組織1小時(shí)，并用大量一抗探測(cè)較大和較小的蛋白聚糖和膠原(表3)。還處理陰性對(duì)照切片，其中省去一抗或用不相關(guān)的同型匹配的一抗代替感興趣的真實(shí)的一抗。商用(DAKO)同型匹配的小鼠IgG(DAK0CodeX931)或IgM(DAK0CodeX942)對(duì)照抗體(適當(dāng)時(shí))用于該步驟。DAKO產(chǎn)物X931和X942是小鼠單克隆IgG^克隆DAK-G01)和單克隆IgM(克隆DAK-G08)抗體，其指向(靶向)黑曲霉葡糖氧化酶，一種在哺乳動(dòng)物組織中既不存在或也不是可誘導(dǎo)的酶。辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶軛合二抗用于檢測(cè)，其中使用0.05%的3，3‘-二氨基聯(lián)苯胺二鹽酸鹽和0.03%的H2O2(在TBS中)、NovaRED、氮藍(lán)四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/碘硝基四唑紫(NBT/BCIP/INT)或新品紅作為底物。借助于明視場(chǎng)顯微鏡來檢查染色的載玻片并利用LeicaMPS60照相顯微鏡數(shù)碼相機(jī)系統(tǒng)加以拍照。表2在下腰椎間盤(BEP骨終板、CEP軟骨終板)中組織學(xué)變化的分級(jí)系統(tǒng)<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>表3.對(duì)于蛋白聚糖和膠原核心蛋白質(zhì)表位的一抗<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>纖維環(huán)和髓核的樣品解剖自經(jīng)處理的精細(xì)切成的塊并且將已知濕重的組織區(qū)的代表性部分冷凍干燥至恒重。在110°c下，將一式三份(l-2mg)的干燥組織在6MHCl中水解16小時(shí)，然后測(cè)定等分部分的中和消化物的羥脯氨酸，作為組織膠原含量的度量(Sakaietal.，2005)。還用木瓜蛋白酶消化一式三份的干燥組織(約2mg)，然后利用異染性染料1，9-二甲基亞甲藍(lán)來測(cè)定等分部分的可溶性組織的硫酸化糖胺聚糖，作為PG的度量(Sakaietal.，2005)。運(yùn)動(dòng)節(jié)段被包裹在鹽水浸泡紗布中，用雙厚度聚乙烯袋密封，并在-30°C下冷凍直到進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。這種治療未顯示出改變了組織的生物力學(xué)特性(Panjabietal.,1985)。進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試，以在接近生理負(fù)荷的規(guī)定的計(jì)算機(jī)控制的條件下測(cè)量每個(gè)盤在軸向壓縮、撓曲、延伸、側(cè)向彎曲以及軸向扭轉(zhuǎn)時(shí)的剛度(Panjabietal.,985；Raceetal.,2000；Smit,2002；Wilkeetal.，1999)。測(cè)試方案的全部細(xì)節(jié)在別處證明(Panjabietal.,1985；Raceetal.,2000；Smit,2002；Wilkeetal.，1999)。用于測(cè)試的試樣(功能脊柱單位，F(xiàn)SU)包括兩個(gè)鄰近的椎骨、中介盤(介入盤，interveningdisc)以及伴隨的韌帶。測(cè)試了三個(gè)FSU/脊椎僅單獨(dú)用C-ABC降解的水平，其中盤用C-ABC降解并且其隨后僅用透明質(zhì)酸治療的水平，以及中心水平，其用C-ABC降解并且其隨后用透明質(zhì)酸和用MPC加以治療。每個(gè)FSU被封固在兩個(gè)鋁合金杯中并用三個(gè)螺栓和冷固化聚甲基丙烯酸甲酯牙粘固粉加以固定(VertexSCSelfCuring,DentimexBV，Zeist，荷蘭)。要小心以確保水平定位椎間盤的中線。通過使銷子(殼板釘)通過椎管而進(jìn)入杯之一的孔中，而使運(yùn)動(dòng)節(jié)段位于杯的中心。所有測(cè)試在保持在37°C的鹽水浴中進(jìn)行。在開始測(cè)試以前，每個(gè)FSU將被預(yù)加載至0.5MPa的應(yīng)力，直至達(dá)到水化的重現(xiàn)狀態(tài)。這被用作在每個(gè)測(cè)試以前的基線。0.5MPa的預(yù)加載應(yīng)力模擬放松站立并且是基于椎間盤內(nèi)壓力的體內(nèi)測(cè)量結(jié)果。利用Model8511動(dòng)態(tài)伺服液壓材料試驗(yàn)機(jī)(INSTR0NPtyLtd,HighWycombe,UK)進(jìn)行機(jī)械試驗(yàn)，上述試驗(yàn)機(jī)裝備有‘6個(gè)自由度’的測(cè)力傳感器(測(cè)壓儀)以便于同時(shí)監(jiān)測(cè)和控制在所有三個(gè)平面中的力。該試驗(yàn)機(jī)通過個(gè)人計(jì)算機(jī)和定制設(shè)計(jì)的軟件加以控制，其中上述軟件還記錄和分析數(shù)據(jù)。在軸向負(fù)荷或扭轉(zhuǎn)控制的最后5個(gè)正弦0.IHz加載循環(huán)的穩(wěn)定滯后中獲得測(cè)試數(shù)據(jù)。進(jìn)行的測(cè)試是純軸向壓縮、左和右側(cè)向彎曲、組合撓曲/延伸以及純軸向扭轉(zhuǎn)。在FSU中借助于很少或沒有彎曲或撓曲(伴隨載荷)產(chǎn)生純軸向壓縮至200N。利用在顱杯表面上的點(diǎn)接觸進(jìn)行所有壓縮試驗(yàn)。彎曲的中性軸(NAB)通過鋁合金杯(其保持試樣以實(shí)現(xiàn)微不足道的彎曲)上的點(diǎn)將循環(huán)荷載施加至關(guān)節(jié)來確定。這種試錯(cuò)(嘗試錯(cuò)誤)方法使得可以盡可能接近純軸向壓縮，其中使用剛性點(diǎn)負(fù)載接觸。盡管在試樣之間存在輕微可變性，但發(fā)現(xiàn)該點(diǎn)是在矢狀面上，大約在椎管以前10mm，但稍微在盤心的后面。將標(biāo)記置于NAB前后IOmm并且置于NAB左右，以定位用于彎曲測(cè)試的偏移負(fù)載(偏置負(fù)荷)。將200N的最大壓縮負(fù)荷施加于每點(diǎn)以產(chǎn)生2Nm的彎曲和200N的軸向壓縮。選擇保守的彎曲和壓縮載荷以確保盤、后元件(posteriorelements)、終板以及其它韌帶結(jié)構(gòu)不會(huì)受到損傷。利用這種加載方法不會(huì)產(chǎn)生純彎曲。相反，彎曲和軸向壓縮的組合用于組合撓曲/延伸和側(cè)向彎曲測(cè)試。我們認(rèn)為，這被證明是正確的，因?yàn)轶w內(nèi)加載將很少產(chǎn)生純彎曲而是壓縮和彎曲的組合。在任何一種載荷(加載)情況下，所有載荷被一致地施加于每個(gè)試樣，從而便于直接比較力學(xué)響應(yīng)。對(duì)于扭轉(zhuǎn)試驗(yàn)，將施加5Nm的純軸向扭轉(zhuǎn)。這是在其它研究中施加的和估計(jì)的扭矩的生理范圍內(nèi)。一種新的專門設(shè)計(jì)的扭轉(zhuǎn)測(cè)試系統(tǒng)將用來對(duì)每個(gè)FSU施加純扭轉(zhuǎn)。該系統(tǒng)使用滾珠絲桿/止推板機(jī)構(gòu)以將Instron致動(dòng)器的軸向位移轉(zhuǎn)換成純旋轉(zhuǎn)。X_Y定向表(bearingtable)確保在測(cè)試期間FSU并不具有對(duì)它施加的旋轉(zhuǎn)的固定中心。這是重要的，因?yàn)樵谳S向旋轉(zhuǎn)期間旋轉(zhuǎn)中心并不是恒定的。下杯被固定至扭矩傳感器，而上杯則被固定至X-Y定向表和滾珠絲桿/止推板機(jī)構(gòu)。最初用完整的FSU進(jìn)行所有測(cè)試。在完成以后，通過切割通過后元件(利用較小的弓鋸條，其通過神經(jīng)孔)和向后切割來分離盤。該切割通過關(guān)節(jié)突間關(guān)節(jié)以及棘突間和棘突上韌帶，留下完整的椎間盤、后和前縱韌帶。這種切割以向后增加的楔形方式進(jìn)行，以確保在關(guān)節(jié)突關(guān)節(jié)之間沒有接觸。然后用分離的盤進(jìn)行所有測(cè)試。數(shù)據(jù)分析包括參數(shù)如在第五個(gè)加載周期期間線性區(qū)中的剛度、滯后和應(yīng)變能以及中性區(qū)的范圍。來自對(duì)照水平的數(shù)據(jù)與變性/MPC注射的水平相比較，并且對(duì)每個(gè)生物力學(xué)參數(shù)進(jìn)行方差的重復(fù)度量分析。結(jié)果在MPC注射組中的所有動(dòng)物保持正常體重并且在實(shí)驗(yàn)期間沒有顯示不良副作用的證據(jù)。在軟骨素酶ABC注射盤中，這種酶對(duì)PG的消耗導(dǎo)致在3個(gè)月以后在所有注射盤中盤高度指數(shù)(DHI)38%的減小。盤高度的這種喪失證實(shí)了在治療以前髓核的變性狀態(tài)并且迄今為止被稱作MPC前DHI。相對(duì)于MPC前DHI，HA或MPC+HA注射到變性盤中以后三個(gè)月沒有產(chǎn)生DHI的任何顯著的增加(圖26)。然而，到治療后6個(gè)月時(shí)，相對(duì)于相應(yīng)的3個(gè)月評(píng)分，注射有MPC+HA的盤顯示DHI的52%的平均增加(第1組)(圖26和表4)。相反，僅注射有HA的盤在相同時(shí)期僅顯示23.的DHI評(píng)分的平均改善(圖26和表4)。顯著地，較低MPC+HA注射盤的平均DHI在治療后6個(gè)月類似于非軟骨素酶ABC注射(S卩，非變性)對(duì)照盤的DHA評(píng)分(圖26)。HA或MPC+HA注射后6個(gè)月與3個(gè)月的DHI的統(tǒng)計(jì)分析示在表4中。在本實(shí)驗(yàn)中，將綿羊MPC連同適宜的載體，如高分子量透明質(zhì)酸(HA)給予到實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的變性IVD的髓核中已顯示可以加速盤細(xì)胞外基質(zhì)的再生，如通過盤高度的恢復(fù)放射影像上評(píng)估的。這種解釋是基于以下假設(shè)在加載脊柱中，盤高度通過在NP和內(nèi)環(huán)內(nèi)存在高濃度的基質(zhì)蛋白聚糖來保持，基質(zhì)蛋白聚糖連同它們結(jié)合的水分子一起為這種結(jié)構(gòu)賦予高膨脹壓力。確實(shí)，在這些實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，軟骨素酶ABC用來誘導(dǎo)盤變性是依賴于這種酶從NP細(xì)胞外基質(zhì)降解和除去大多數(shù)蛋白聚糖的能力。迄今為止獲得的數(shù)據(jù)表明，由MPC介導(dǎo)的治療效果是相對(duì)緩慢的過程。在本研究中，0.5XIO6MPC的劑量是特別有效的。雖然本實(shí)驗(yàn)在MPC被注入到盤中以后6個(gè)月被終止，但發(fā)現(xiàn)針對(duì)低劑量MPC注射獲得的盤高度恢復(fù)的水平接近于針對(duì)非軟骨素酶ABC注射的內(nèi)部對(duì)照所觀察到的值，這表明在該期間達(dá)到了最大程度的NP重建。本領(lǐng)域技術(shù)人員將明了，在不偏離如廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行許多變化和/或改進(jìn)，如在具體實(shí)施方式中所示。因此，本發(fā)明的實(shí)施方式是說明性的而不是限制性的。本文討論和/或提及的所有出版物均全部結(jié)合于本文。包括在本說明書中的文獻(xiàn)、法令、材料、裝置、制品等的任何討論僅用于提供本發(fā)明的范圍。不應(yīng)視為承認(rèn)，任何或所有這些內(nèi)容構(gòu)成現(xiàn)有技術(shù)基礎(chǔ)的一部分或是與本發(fā)明有關(guān)的領(lǐng)域中的常見的一般知識(shí)，因?yàn)樗嬖谟诒旧暾?qǐng)的每項(xiàng)權(quán)利要求的優(yōu)先權(quán)日期以前。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>0232參考文獻(xiàn)Ahrensetal.(1993)DNACellBiol.12871-880.Allcocketal.(1977)Macromolecule10824.Ansethetal.(2002)J.ControlRelease78199-209.Appleyardetal.(1999)OsteoarthritisandCartilage7:281-294.Appleyardetal.(2003)OsteoarthritisCartilage11:65-77.Arnoczkyetal.InInjuryandrepairofthemusculoskeletalsofttissues.Eds,WooSL-YandBuckwalter.AmericanAcademyofOrthopaedicSurgeons,ParkRidge,111:1988,pp.487-537.Bellamyetal.(2006)CochraneDatabaseSystRev2006(2):CD005321Brandt(1993)AgentsandActions40:232-234.Brandt(1993a)RheumaticDiseaseClinicsofNorthAmerica.19:29-44.Brandtetal.(2000)ArthritisRheum.431192-1203.Bregnietal.，Blood80:1418—22.Burkhardtetal.(2001)OsteoarthritisCartilage9:238-47.Cakeetal.(2000)OsteoarthritisCartilage8:404-411.Cakeetal.(2003)OsteoarthritisandCartilage11:872-8.Cakeetal.(2004)OsteoarthritisandCartilage12:974—81·Cakeetal.(2005)OsteoarthritisCartilage13:1066—75·Cakeetal.ClinicalandExperimentalRheumatology2008(inpress).Dumondetal.(2003)ArthritisRheum.48:3009-12.Englund(2004)ArthritisRheum50:2811—9.Ghoshetal.(1983)JOrthopResI:153-173.Ghoshetal.(1983a)JSurgRes35:461_473.Ghosh(1988)In:Bailliere'sClinicalRheumatology,InternationalPracticeandResearch.Ed.PBrooks,Tindal1,Saunders,London,UK,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