專(zhuān)利名稱(chēng)：勃起機(jī)能的恢復(fù)方法
勃起機(jī)能的恢復(fù)方法
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及用于治療勃起機(jī)能障礙的組合物和方法，更具體地涉及用于將內(nèi)皮祖 細(xì)胞(EPC)施用到患者身體的組合物和方法。每年有超過(guò)600，000美國(guó)中年男性經(jīng)歷某種程度的勃起機(jī)能障礙(ED)或陽(yáng)萎，造 成約2000到3000萬(wàn)美國(guó)男性在一生的某個(gè)時(shí)期患有ED。醫(yī)生估計(jì)多達(dá)85%的ED病例是 由醫(yī)學(xué)問(wèn)題或身體問(wèn)題引起的，例如糖尿病、高血壓、血管疾病、前列腺和泌尿生殖器區(qū)的 外科手術(shù)、脊髓損傷、多發(fā)性硬化、內(nèi)分泌障礙或藥物治療。例如，約35-75%的患糖尿病的 男性受到ED的折磨，這類(lèi)患者在美國(guó)ED病例中占約30%。目前用于治療ED所采用的方法包括外置設(shè)備，性治療，內(nèi)置假體的手術(shù)植入，將 藥物直接注射到陰莖內(nèi)，口服藥(例如，西地納非、酚妥拉明、前列腺素)和局部應(yīng)用的藥 物。這些方法中沒(méi)有一種是完全有效的，且都具有多種副作用，包括頭痛、腹瀉、發(fā)紅、血 壓過(guò)低、色覺(jué)障礙、疼痛或者窘迫。此外，這些治療方法的使用在給藥的同時(shí)誘導(dǎo)暫時(shí)勃 起，因而只能提供ED的暫時(shí)減輕。此外，采用現(xiàn)有用于ED的口服藥物對(duì)患有心血管疾病 的男性是危險(xiǎn)的，這是由于這些藥物能夠影響血壓。根據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)(AmericanHeart Association)，患有二型糖尿病的男性的ED可能是心臟病的預(yù)警體征。因此，許多受ED折 磨的男性可能也患有心臟病且并沒(méi)有認(rèn)識(shí)到服用口服藥的危險(xiǎn)。因此，存在對(duì)用于改善ED的改進(jìn)方法的需求。特別地，存在對(duì)具有最小副作用的 ED長(zhǎng)期治療的需求。發(fā)明概述本發(fā)明提供了采用內(nèi)皮祖細(xì)胞用于改善勃起機(jī)能障礙的方法和組合物。特別地， 公開(kāi)了用于保持海綿體內(nèi)壓和改善由糖尿病導(dǎo)致的勃起機(jī)能障礙的方法。機(jī)能障礙的內(nèi)皮細(xì)胞是一氧化氮釋放減少的原因，一氧化氮釋放減少致使進(jìn)入身 體組織的動(dòng)脈流入量降低。本發(fā)明證明了從外周血獲得的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)能夠用來(lái)獲得 治療性?xún)?nèi)皮細(xì)胞，在糖尿病模型中，當(dāng)被注射進(jìn)入患病體內(nèi)，這些細(xì)胞能夠恢復(fù)正常勃起機(jī) 能。該基于細(xì)胞的技術(shù)能夠作為用于患有勃起機(jī)能障礙的糖尿病患者的治療方式使用。一方面，本發(fā)明公開(kāi)了用于在有此需求的受試者中改善勃起機(jī)能障礙(ED)的方 法，包括分離內(nèi)皮細(xì)胞，將內(nèi)皮細(xì)胞注入身體組織和使該細(xì)胞結(jié)合到該組織中并提高一氧 化氮的局部組織濃度，以及在體內(nèi)保持該細(xì)胞從而在刺激時(shí)改善海綿體內(nèi)壓?？梢詮耐庵?血或骨髓中分離EPC。該細(xì)胞可以是同種異體的。在一些優(yōu)選實(shí)施方式中，該細(xì)胞為自體 的。可以離體分化內(nèi)皮祖細(xì)胞以產(chǎn)生內(nèi)皮細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞可以被分離并培養(yǎng)擴(kuò)增。擴(kuò)增的 細(xì)胞能夠被直接注入到海綿體內(nèi)。每次注射能夠移植約10萬(wàn)到約1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。采用的 細(xì)胞濃度可以根據(jù)ED在受試者中存在的程度而改變。如必要的話，可以重復(fù)注射。該方法可以在患有糖尿病或二型糖尿病的受試者中使用。為了保持該細(xì)胞治療的 最大效果，同時(shí)可以建議受試者控制血糖水平。理想情況下，血糖水平被保持在對(duì)受試者而 言的正常范圍內(nèi)。在某些實(shí)施方式中，可采 用平滑肌細(xì)胞來(lái)恢復(fù)平滑肌機(jī)能。在其它實(shí)施方式中，EPC和肌祖細(xì)胞(MPC)能夠結(jié)合并注入到身體組織中以加強(qiáng)身體組織機(jī)能。該EPC和MPC 都能夠從外周血中分離。該細(xì)胞能夠從體細(xì)胞或干細(xì)胞中獲得。在本發(fā)明的另一方面，利用期望細(xì)胞群的至少一種物理特性或者至少一種細(xì)胞特 異性親和部分，能夠從如外周血的體液中，分離用于注射到受試者體內(nèi)的期望細(xì)胞群。所述 物理特性可包括根據(jù)大小過(guò)濾或通過(guò)熒光標(biāo)記或磁性標(biāo)記進(jìn)行活性細(xì)胞 分選。吸引期望細(xì) 胞群的有用的親和部分可包括，例如抗體、蛋白配體、核酸或肽。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，細(xì) 胞特異性親和部分包括細(xì)胞特異性抗體。在某些實(shí)施方式中，采用本發(fā)明的方法能夠分離 祖細(xì)胞。例如，可以選擇對(duì)祖細(xì)胞特異性表面標(biāo)記物具有密切親和力的親和部分，所述特異 性表面標(biāo)記物如⑶133、⑶31、⑶34、sca-Ι、血管性血友病因子(vWF)或c_kit。這使得用 于擴(kuò)增和/或分化的大量外周祖細(xì)胞在施用到受試者之前得以純化。細(xì)胞分離技術(shù)的更多 細(xì)節(jié)可見(jiàn)共同持有、同時(shí)待審的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)No. 61/022，028，該專(zhuān)利申請(qǐng)于2008年1 月18日遞交，題為“分離和純化用于治療的細(xì)胞的方法”，此處全文引用作為參考。在本發(fā)明的又一方面，可以封裝被施用到身體組織的細(xì)胞群。在一個(gè)實(shí)施方式中， 可以以微球的形式進(jìn)行封裝，例如海藻酸鹽_聚-L-賴(lài)氨酸膠囊，該膠囊使得營(yíng)養(yǎng)物到達(dá)受 免疫保護(hù)的細(xì)胞，同時(shí)使得該細(xì)胞分泌的血管生成調(diào)節(jié)因子蛋白進(jìn)入到周?chē)M織中。該微 球保護(hù)包被的細(xì)胞不受宿主免疫環(huán)境的攻擊。此外，如上文提到的，該細(xì)胞也能夠被工程改 造從而產(chǎn)生進(jìn)一步增強(qiáng)一氧化氮的產(chǎn)生和/或調(diào)節(jié)血糖水平的因子。細(xì)胞分離技術(shù)的更多 細(xì)節(jié)可見(jiàn)共同持有、同時(shí)待審的美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)Ser. No. 10/766，642，該申請(qǐng)于2004年1月 28日(公開(kāi)號(hào)US2005-0002915)遞交，題為“采用產(chǎn)生生長(zhǎng)因子的工程改造的細(xì)胞促進(jìn)移 植的血管生成”，此處也全文引用作為參考。


圖1為表示正常勃起機(jī)能生理學(xué)的示意圖；圖2為表示實(shí)施例中所述的總體研究設(shè)計(jì)圖，證明來(lái)源于祖細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞治療 可以用于治療勃起機(jī)能障礙；圖3為血糖隨時(shí)間變化圖，顯示糖尿病組和細(xì)胞治療組之間的對(duì)比情況；圖4A為來(lái)自海綿體的結(jié)果圖，顯示正常大鼠的海綿體內(nèi)壓；圖4B為來(lái)自海綿體的結(jié)果圖，顯示糖尿病大鼠的海綿體內(nèi)壓圖4C為來(lái)自海綿體的結(jié)果圖，顯示糖尿病大鼠經(jīng)用內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療后 12周的海綿體內(nèi)壓；圖5為ICP (海綿體內(nèi)壓)/MAP (平均動(dòng)脈壓)的比率隨時(shí)間變化圖，圖中比較了 在進(jìn)行糖尿病誘導(dǎo)后4周，以下四組的海綿體內(nèi)壓結(jié)果糖尿病組(DB)，用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì) 胞治療的糖尿病組(CT)，用胰島素治療的糖尿病組(Insulin)以及用內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治 療和用胰島素治療的糖尿病組(CT+Insulin)；圖6為MAP(平均動(dòng)脈壓)/ICP(海綿體內(nèi)壓)的比率相對(duì)神經(jīng)刺激的曲線圖，圖 中比較了經(jīng)糖尿病誘導(dǎo)后8周的糖尿病組和正常組的海綿體測(cè)試結(jié)果；圖7為MAP(平均動(dòng)脈壓)/ICP(海綿體內(nèi)壓)的比率隨時(shí)間變化圖，圖中比較了進(jìn) 行了 8周的糖尿病誘導(dǎo)后糖尿病組(DB)和用內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療的糖尿病組(DB+CT) 的海綿體測(cè)試結(jié)果；和
圖8為ICP (海綿體內(nèi)壓)/MAP (平均動(dòng)脈壓)的比率圖，圖中比較了正常大鼠，糖 尿病大鼠(DM)，和用內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療后12周的糖尿病大鼠(DM+CT)的結(jié)果。發(fā)明詳述為了更易于理解本發(fā)明，首先對(duì)某些術(shù)語(yǔ)進(jìn)行定義此處使用的術(shù)語(yǔ)“分離”或“分離的”指分級(jí)分離細(xì)胞的方法或已被分級(jí)分離成為 亞群的細(xì)胞，從該亞群中可以獲得細(xì)胞集合(elements)。其也可采用細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域技術(shù)人 員采用的用于細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)完成。此處使用的術(shù)語(yǔ)“分化”或“分化的”指祖細(xì)胞的成熟或一種比其來(lái)源的祖細(xì)胞更 成熟的細(xì)胞。此處使用的術(shù)語(yǔ)“受試者”意為包括體內(nèi)可引發(fā)免疫應(yīng)答的活的生物體。優(yōu)選的 受試者為哺乳動(dòng)物。受試者的例子包括但不限于，人，猴，狗，貓，小鼠，大鼠，牛，馬，豬，山羊 和綿羊。I勃起機(jī)能障礙(ED)ED是持續(xù)沒(méi)有能力獲得或保持足夠進(jìn)行性行為的勃起。在放松狀態(tài)下，勃起體的血液流入和流出之間存在一種平衡。正常勃起機(jī)能需要一組復(fù)合的神經(jīng)和血管動(dòng)態(tài)相互作 用。陰莖勃起可以由多種機(jī)制引發(fā)(例如，中樞心因性的和反射產(chǎn)生的)。這些機(jī)制在正常 性活動(dòng)過(guò)程中相互作用。心因性刺激包括聽(tīng)覺(jué)的、視覺(jué)的、嗅覺(jué)的或想象的刺激，而反射產(chǎn) 生的刺激涉及陰莖上引起體和副交感神經(jīng)傳出動(dòng)作的感受器。一經(jīng)喚醒，副交感神經(jīng)行為引發(fā)一系列活動(dòng)，以釋放一氧化氮開(kāi)始，以細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié) 因子環(huán)鳥(niǎo)苷酸(cGMP)的水平上升結(jié)束。cGMP的上升引起陰莖血管和小梁平滑肌的松弛， 導(dǎo)致流入海綿體的血液增加。海綿體空間迅速充盈，壓縮小靜脈，造成靜脈外流量減少(例 如，體靜脈閉塞機(jī)制)。內(nèi)流量上升和外流量減少相結(jié)合，迅速提高海綿體內(nèi)壓，導(dǎo)致漸進(jìn)性 陰莖堅(jiān)硬和完全勃起。圖1顯示正常勃起機(jī)能示意圖。盡管ED可以有心因性或器官上的原因，絕大多數(shù)病例至少具有某些器官上的原 因，例如血管性的、神經(jīng)性的和激素的原因?；继悄虿〉哪行灾屑s有35-75%受ED的折磨， 占美國(guó)ED病例中的約30%?；继悄虿〉哪行缘腅D在病因?qū)W上為多因素的，且與內(nèi)皮細(xì)胞 機(jī)能障礙，神經(jīng)病，血管疾病，內(nèi)分泌障礙，糖尿病控制和藥物治療相關(guān)聯(lián)。特異性機(jī)制和相 關(guān)的損傷包括，例如，能夠造成彈性纖維糖基化和海綿體無(wú)法松弛的高血糖，可造成一氧化 氮釋放降低和血管舒張減弱的竇內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮機(jī)能障礙，以及能夠造成動(dòng)脈和小動(dòng)脈流 入量減少的外周血管疾病。在本發(fā)明的一個(gè)方面，公開(kāi)了采用細(xì)胞治療改善ED的方法。表明注射到身體組織 內(nèi)的外周祖細(xì)胞(EPC)具有有助于改善ED的長(zhǎng)期作用?？梢圆捎帽景l(fā)明的方法來(lái)提高局部 一氧化氮的濃度。所述EPC可以從外周血中獲得，優(yōu)選從要被治療的患者處獲得。在另一個(gè) 實(shí)施方式中，可以采用間充質(zhì)干細(xì)胞。在再一個(gè)實(shí)施方式中，可以將不同細(xì)胞類(lèi)型的組合注 射到身體組織中。例如，如下文所述，可以采用EPC和平滑肌細(xì)胞。在又一個(gè)實(shí)施方式中， 細(xì)胞可以與生長(zhǎng)因子相結(jié)合，例如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)，纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)， α和β-轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)和血小板源生長(zhǎng)因子(PDGF)。本發(fā)明的方法為患ED的男性提供了長(zhǎng)期治療。例如，細(xì)胞治療后長(zhǎng)達(dá)12周可見(jiàn) 改善。在糖尿病患者中，如血糖得到控制(例如，通過(guò)采用如胰島素的藥物治療、飲食和運(yùn)動(dòng))，已證明本發(fā)明的細(xì)胞治療方法具有更長(zhǎng)期的作用。注射細(xì)胞的量基于疾病程度、和病情以及要治療的受試者的體重而改變。例如，每 次注射可以將約30萬(wàn)到約1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞注射到海綿體中。如有需要，可以重復(fù)注射。II培養(yǎng)細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞可以從來(lái)自同一物種的同種異體的細(xì)胞群中或者從源自受試者自身組 織的同源的細(xì)胞群中分離。該細(xì)胞也可以是異種的，即細(xì)胞群來(lái)源于不同于受試者的哺乳 動(dòng)物物種。例如，組織細(xì)胞可以來(lái)自哺乳動(dòng)物，例如猴，狗，貓，小鼠，大鼠，牛，馬，豬，山羊和綿羊。分離的細(xì)胞優(yōu)選為從來(lái)自受試者自身組織的外周血樣品或活體組織切片中獲得 的細(xì)胞?；铙w組織切片可以在局部麻醉下采用活體檢查穿刺針獲得，這使得該過(guò)程快速而 簡(jiǎn)單。隨后小活體組織切片可以被分化并培養(yǎng)擴(kuò)增從而獲得該組織細(xì)胞。經(jīng)適當(dāng)?shù)拿庖咭?制，也可以采用來(lái)自親屬或同一物種的其它供體的細(xì)胞。Freshney《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)技術(shù)手冊(cè)》(Culture of Animal Cells. AManual of Basic Technique)第 2 版，A. R. Liss, Inc.，New York, 1987，Ch. 9，pp. 107-126 討論了 用于細(xì)胞分離和培養(yǎng)的方法?？刹捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知技術(shù)分離細(xì)胞。例如，可以將組 織切成片，機(jī)械分解和/或用消化酶和/或鰲合劑處理，削弱相鄰細(xì)胞之間的連接，使得將 該組織分散成為單個(gè)細(xì)胞的懸浮液而沒(méi)有明顯細(xì)胞破損成為可能。如果必要的話，可以通 過(guò)切碎組織，采用多種消化酶中的任何一種單獨(dú)或組合處理切碎的組織，完成酶分解。這些 酶包括但不限于胰蛋白酶、糜蛋白酶、膠原酶、彈性蛋白酶、和/或透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核 酸酶、鏈霉蛋白酶和分散酶。也可以采用多種方法完成機(jī)械分解，方法包括但不限于刮擦組 織的表面、使用研磨器、攪拌器、篩子、均質(zhì)器，壓力傳感器，或超聲波細(xì)胞破碎儀等。可采用的細(xì)胞類(lèi)型包括但不限于，如人體內(nèi)皮細(xì)胞的內(nèi)皮細(xì)胞，從外周血或骨髓 中分離的可以被誘導(dǎo)分化成不同細(xì)胞的祖細(xì)胞，干細(xì)胞，定向干細(xì)胞和/或分化的細(xì)胞。在 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方式中，內(nèi)皮祖細(xì)胞為自體地來(lái)自外周血。同樣，依據(jù)形成的組織和器官的類(lèi)型，可以采用特異類(lèi)型的定向干細(xì)胞。例如，成 肌細(xì)胞可于用于構(gòu)建多種肌肉結(jié)構(gòu)。其它類(lèi)型的定向干細(xì)胞可用于形成器官或器官樣組 織，例如心臟，腎，肝，胰腺，脾，膀胱，尿管和尿道。其它細(xì)胞包括但不限于內(nèi)皮細(xì)胞，肌肉細(xì) 胞，平滑肌細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成骨細(xì)胞，成肌細(xì)胞，成神經(jīng)細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，成膠質(zhì)細(xì)胞； 生殖細(xì)胞，肝細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞，心肌細(xì)胞，結(jié)締組織細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì) 胞，激素分泌細(xì)胞，免疫系統(tǒng)細(xì)胞，神經(jīng)元，來(lái)自心臟、腎、肝、胰腺、脾、膀胱、尿管和尿道的 細(xì)胞等。在某些實(shí)施方式中，不必對(duì)要采用的干細(xì)胞的類(lèi)型進(jìn)行預(yù)選，因?yàn)槎喾N類(lèi)型的干細(xì) 胞一旦被傳送到特定器官，就能夠被誘導(dǎo)以一種器官特異性的形式分化。例如，僅僅把傳送 到肝的干細(xì)胞放在肝的生化環(huán)境中，該干細(xì)胞就能夠被誘導(dǎo)成為肝細(xì)胞。例子還包括已基因工程改造過(guò)的細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞和永生細(xì)胞。在本發(fā)明中有用的 基因工程細(xì)胞的一個(gè)例子為制造和分泌一種或多種期望分子的基因工程細(xì)胞。當(dāng)基因工程 細(xì)胞被移植到生物體內(nèi)，所產(chǎn)生的分子能夠產(chǎn)生局部作用或全身作用，且可以包括上文確 定為可能的物質(zhì)的分子。細(xì)胞可能產(chǎn)生具有以下作用的物質(zhì)抑制或刺激炎癥；幫助愈合；抗免疫排斥；提 供激素替代；取代神經(jīng)遞質(zhì)；抑制或破壞癌細(xì)胞；促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；抑制或刺激血管形成；填充組織；和補(bǔ)充或取代下列組織、神經(jīng)元、皮膚、滑液、腱、軟骨、韌帶、骨、肌肉、器官、硬腦 (脊)膜、血管、骨髓和細(xì)胞外基質(zhì)。培養(yǎng)物中還可添加其它因子和分化誘導(dǎo)物以促進(jìn)特異 類(lèi)型細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)組織已被分解成單個(gè)細(xì)胞的懸浮液時(shí)，該懸浮液能夠被分級(jí)分離成為亞群，從 亞群中能夠獲得該細(xì)胞集合。這也可采用用于細(xì)胞分離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)達(dá)到，所述用于細(xì)胞分 離的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)包括但不限于特異性細(xì)胞類(lèi)型的克隆和篩選，多余細(xì)胞的選擇性破壞(負(fù)選 擇)，基于在混合群中分化細(xì)胞的可凝集性的分離，冷凍_解凍步驟，混合群中細(xì)胞的分化 黏附特性，過(guò)濾，常規(guī)和區(qū)帶離心，離心淘析(逆流離心)，按單位比重分離，反流分配，電 泳和熒光激活細(xì)胞分選(見(jiàn)如 Freshney，(1987) Culture of Animal Cells. A Manual of BasicTechniques, 2d Ed. , A. R. Liss, Inc. , New York, Ch. Iland 12, pp. 137-168)。例如， 通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選可富集唾液細(xì)胞。也可以采用磁分選。細(xì)胞分級(jí)分離也可能是可取的，例如，當(dāng)供者患有如癌癥或腫瘤的疾病時(shí)。細(xì)胞群 可被分選，從而將癌癥或腫瘤細(xì)胞和正常非癌細(xì)胞分開(kāi)。以一種或多種分選技術(shù)分離出來(lái) 的正常非癌細(xì)胞，隨后可用于組織重建。可以向培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)因子和調(diào)節(jié)因子，從而在分離出的細(xì)胞培養(yǎng)物中增強(qiáng)、 改變或調(diào)節(jié)增殖和細(xì)胞成熟和分化。培養(yǎng)的細(xì)胞的生長(zhǎng)和活性可以被多種生長(zhǎng)因子的影 響，所述生長(zhǎng)因子例如生長(zhǎng)激素、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)素、集落刺激因子、促紅細(xì)胞生成素、表皮生長(zhǎng)因 子、肝促紅細(xì)胞生長(zhǎng)因子(肝細(xì)胞生長(zhǎng)素)等。調(diào)節(jié)增殖和/或分化的其它因子包括前列 腺素、白介素和天然存在的抑素?？梢栽隗w外培養(yǎng)分化的細(xì)胞，從而增加可用于注射的細(xì)胞的數(shù)量。已經(jīng)被擴(kuò)增的 分化的細(xì)胞也可以進(jìn)行一次額外的分離步驟以獲得一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞群。為了避免細(xì)胞移植 后的免疫應(yīng)答，可采用免疫抑制劑治療受試者，免疫抑制劑例如環(huán)孢菌素或Π(506?？捎煤怂嵝蛄修D(zhuǎn)染分化的細(xì)胞。有用的核酸序列可為，例如，在宿主中減少或消除 免疫應(yīng)答的基因序列。例如，可抑制細(xì)胞表面抗原的表達(dá)，如I類(lèi)和II類(lèi)組織相容性抗原。 此外，轉(zhuǎn)染也可用于基因送遞?？稍诩?xì)胞接種到生物相容性替代物上之前用特異基因轉(zhuǎn)染 細(xì)胞。因此，培養(yǎng)的細(xì)胞可以被工程改造從而表達(dá)將產(chǎn)生有助于改善特殊障礙的期望蛋白 的基因產(chǎn)物。培養(yǎng)的細(xì)胞可被基因工程改造，以產(chǎn)生有利于移植的基因產(chǎn)物，例如抗炎因子，如 anti-GM-CSF、anti-TNF、anti-IL-l和anti_IL_2?；蛘?，該內(nèi)皮細(xì)胞可被基因工程改造以 “敲除”促進(jìn)炎癥的天然基因產(chǎn)物的表達(dá)，例如GM-CSF、TNF、IL-I和IL-2，或?yàn)榱私档团懦?的風(fēng)險(xiǎn)“敲除”MHC的表達(dá)。能夠采用的用于基因工程改造細(xì)胞的方法例如采用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、腺病毒載 體、腺相關(guān)病毒載體、聚乙二醇，或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其它方法。這些方法包括采用 轉(zhuǎn)運(yùn)核酸分子并在細(xì)胞中表達(dá)核酸分子的表達(dá)載體。(IGeoddel5Gene Expression Technology :Methods in Enzymology 185, AcademicPress, San Diego, CA(1990))。通過(guò)常規(guī)轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)將載體DNA引入到原核或真核細(xì)胞中。轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿 主細(xì)胞的適合的方法可以見(jiàn) Sambrook 等 Molecular Cloning =ALaboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)，和其它實(shí)驗(yàn)室教科書(shū)。本發(fā)明的細(xì)胞可被用于多種 用途。例如，內(nèi)皮細(xì)胞可以被移植到受試者體內(nèi)以取代或填充現(xiàn)有組織。可以監(jiān)測(cè)受試者移植內(nèi)皮細(xì)胞后其障礙的改善情況?？梢泽w外使用該細(xì)胞，針對(duì)藥物、化學(xué)試劑、生長(zhǎng)/調(diào)節(jié)因子的效用和細(xì)胞毒性對(duì) 多種化合物進(jìn)行篩選?？梢栽隗w外保持該培養(yǎng)物并與要檢驗(yàn)的化合物相接觸?？梢酝ㄟ^(guò)細(xì) 胞毒性化合物損傷或殺死培養(yǎng)物中細(xì)胞的能力測(cè)定所述細(xì)胞毒性化合物的活性。采用活體 染色技術(shù)可容易地對(duì)此進(jìn)行評(píng)定?？赏ㄟ^(guò)分析注射后細(xì)胞含量評(píng)價(jià)生長(zhǎng)/調(diào)節(jié)因子的作 用，例如，通過(guò)總細(xì)胞計(jì)數(shù)和分化細(xì)胞計(jì)數(shù)。其可采用標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞學(xué)和/或組織學(xué)技術(shù)完成， 包括采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)，該技術(shù)應(yīng)用限定了種類(lèi)特異性的細(xì)胞抗原的抗體?？稍u(píng)價(jià)多 種藥物對(duì)人工組織中培養(yǎng)的正常細(xì)胞的作用?？紤]到此處公開(kāi)的本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)和實(shí)施，對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本發(fā)明的其 它實(shí)施方式和應(yīng)用是明顯的。本文出于任何原因提及的所有的美國(guó)專(zhuān)利和其它參考文獻(xiàn)明 確結(jié)合于本文作為參考。在權(quán)利要求書(shū)說(shuō)明的本發(fā)明的實(shí)際范圍和精神下，說(shuō)明書(shū)和實(shí)施 例應(yīng)被理解為只是示例性的。 實(shí)施例實(shí)施例1材料除另有說(shuō)明，所有化學(xué)藥品購(gòu)自Sigma (St. Louis, MO)。ECL緩沖液和 1251-Sodium 購(gòu)自 PerkinElmer NEN(Boston，ΜΑ)。II 型膠原酶(lmg/ml)購(gòu)自 Boehringer Marmheim (Marrnheim， Germany) 。(EBM—2) _ 自 Cambrex Bio Science (Walkersville，MD)。PCR試劑和引物、M199培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和青霉素 購(gòu)自Life Technologies (Gaithersburg, MD)。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)為來(lái)自 Judith Abraham, (Scios Nova, CA)的贈(zèng)品。FITC-標(biāo)記的單克隆抗人CD31抗體購(gòu)自Santa Cruz (Santa Cruz，CA)。兔多克隆抗血管性血友病因子(vWF)、抗平滑肌肌動(dòng)蛋白抗體和 FITC標(biāo)記的抗兔IgG抗體購(gòu)自DAKO(Glostrup，Denmark)。單克隆抗人⑶31、山羊多克隆 抗VE鈣黏著蛋白(VE-Cad)、山羊抗vWF和兔多克隆抗Flk-I抗體購(gòu)自SantaCruz (Santa Cruz, CA)。FITC和生物素標(biāo)記的荊豆凝集素I購(gòu)自Sigma (St. Louis, MO)。生物素標(biāo)記的 山羊抗小鼠IgG和生物素標(biāo)記的小鼠抗山羊IgG購(gòu)自Santa Cruz (Santa Cruz，CA)?？?CD 105抗體購(gòu)自BD Pharmingen (SanDiego, CA)。FITC-接合的抗生物素蛋白購(gòu)自Vector Laboratories(Burlingame, CA)。實(shí)施例2用于改善勃起機(jī)能障礙的內(nèi)皮祖細(xì)胞的注射此項(xiàng)研究證明了從外周血中獲得的EPC能夠被用于獲得成熟的內(nèi)皮細(xì)胞。在糖尿 病大鼠模型中，注射到患病體內(nèi)的內(nèi)皮細(xì)胞能夠恢復(fù)正常的勃起機(jī)能。這一基于細(xì)胞的技 術(shù)可成為用于患勃起機(jī)能障礙的糖尿病患者的可行的治療方法。通過(guò)腹膜內(nèi)注射鏈脲酶素(50mg/Kg)創(chuàng)建糖尿病模型。那些具有超過(guò)300mg/dl 的血糖水平的動(dòng)物，被認(rèn)為是患有糖尿病并被用于此項(xiàng)研究。從供體大鼠的外周血中分離 EPC0該細(xì)胞被培養(yǎng)、擴(kuò)增并誘導(dǎo)成為內(nèi)皮細(xì)胞系。采用細(xì)胞特異性標(biāo)記物(CD31、CD34、 vWF, CD133)對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)行表征。培養(yǎng)擴(kuò)增的內(nèi)皮細(xì)胞用紅色熒光染料(PKH26)進(jìn)行標(biāo) 記，并被直接注射到機(jī)能障礙體內(nèi)，追蹤這些動(dòng)物達(dá)12周。通過(guò)陰莖內(nèi)壓對(duì)勃起機(jī)能進(jìn)行 評(píng)估，且回收身體組織用于組織學(xué)和免疫組織化學(xué)分析。圖2表示總體研究設(shè)計(jì)的示意圖。(i)糖尿病誘導(dǎo)、治療和麻醉
84只體重約200_250g的雄性Lewis大鼠繁殖和飼養(yǎng)于維克森林大學(xué)。這些動(dòng)物 可自由獲取食物和水，并受到用于糖尿病動(dòng)物的特殊照料。所有實(shí)驗(yàn)步驟都經(jīng)過(guò)了維克森 林大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)(the Wake ForestUniversity Institutional Animal Care and Use Committee, IA⑶C)的審核和批準(zhǔn)，并且這些實(shí)驗(yàn)步驟都按照《動(dòng)物福利 法》(the Animal Welfare Act)和《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用指南》(the Care and Use of Laboratory Animals)的規(guī)定進(jìn)行。將這些動(dòng)物安置在維克森林大學(xué)的具有12小時(shí)光照周 期的動(dòng)物設(shè)施內(nèi)。通過(guò)腹膜內(nèi)注射50mg/Kg鏈脲酶素(STZ)誘導(dǎo)糖尿病，該鏈脲酶素溶解于0. 2M磷 酸鈉和0. IM檸檬酸的無(wú)菌緩沖溶液中。注射之前，測(cè)定尾部血糖以獲得基礎(chǔ)值。注射后，為了確定高血糖癥，連續(xù)三天測(cè) 定尾部血糖。如果大鼠在第一次STZ注射后沒(méi)有成為糖尿病大鼠，那些大鼠在下一周接受 第二次STZ注射。具有300mg/dL或更高的血糖水平的動(dòng)物被認(rèn)為是糖尿病動(dòng)物，并被用于 隨后的實(shí)驗(yàn)中。每周使用葡萄糖檢測(cè)試劑盒監(jiān)測(cè)血糖水平和體重，監(jiān)測(cè)8-11周，并且這些 糖尿病大鼠被分成四組組I 糖尿病 Lewis 大鼠(η = 20)。 組II 進(jìn)行細(xì)胞治療的糖尿病Lewis大鼠(η = 20)。組III 進(jìn)行胰島素治療的糖尿病Lewis大鼠(η = 20)。組IV 進(jìn)行胰島素治療和細(xì)胞治療的糖尿病Lewis大鼠(η = 20)。此外，將10只年齡匹配的Lweis大鼠用作正常對(duì)照。所有動(dòng)物在下一個(gè)12周的 過(guò)程中接受了為每組確立的治療。圖3為糖尿病標(biāo)準(zhǔn)化曲線，顯示糖尿病組和進(jìn)行細(xì)胞治 療的糖尿病組血糖隨時(shí)間變化圖。(ii) EPC 的分離通過(guò)采用histopaque 1077 (Sigma)進(jìn)行的密度梯度離心從IOmL同源供體 Lewis大鼠的外周血中分離單核細(xì)胞。分離后，立刻將該單核細(xì)胞接種到由人纖連蛋白 (Sigma)包被的6孔培養(yǎng)皿上，每孔細(xì)胞濃度為5xl06，采用內(nèi)皮細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基(EBM， CellSystems)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中補(bǔ)充了 EGMSingleQuots，其含有2%的胎牛血清、人VEGF-1、 人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2 (FGF-2)、人表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、胰島素樣生長(zhǎng)因子_1 (IGF-I) 和抗壞血酸，在37°C、5% CO2和濕度彡95%的條件下孵育兩天。兩天后，收集未附著細(xì)胞，在纖連蛋白包被的24孔培養(yǎng)皿上以IxlO6的細(xì)胞濃度 培養(yǎng)，并再孵育3天，從而使內(nèi)皮細(xì)胞集落形成。這些離體擴(kuò)增得到的細(xì)胞中絕大多數(shù)屬于內(nèi)皮細(xì)胞系，且就其本身而言，它們組 成了離體擴(kuò)增得到的富含EPC的部分。這些細(xì)胞被分離、培養(yǎng)、分化和擴(kuò)增，直到獲得用于移植的足夠數(shù)量的細(xì)胞(8 周)。移植的細(xì)胞處在7、8和9代。(iii)體外檢驗(yàn)以1 20的稀釋度檢驗(yàn)細(xì)胞表面標(biāo)記物⑶31、⑶34、vffF和⑶133的表達(dá)，從而 進(jìn)行細(xì)胞表征。采用抗生物素蛋白-生物素檢測(cè)試劑盒(Vectastain elite ABC, Vector Laboratories Inc，Bulingame, CA)和通過(guò)稀釋度為1 200的第二抗體的免疫熒光進(jìn)行 免疫標(biāo)記。
(iv)用 PKH26 標(biāo)記采用細(xì)胞連接蛋白試劑盒(PKH26，Sigma, Saint Louis, MI)，根據(jù)廠商指導(dǎo)，用紅 色熒光PKH26-紅對(duì)EC，s進(jìn)行標(biāo)記。簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，將IOuM染料溶液添加到PBS里的細(xì)胞中并 輕輕混合。在25°C條件下孵育5分鐘后，加入FBS以終止染色反應(yīng)。通過(guò)用PBS反復(fù)沖洗 去除染色溶液。用顯微方法觀察到熒光形成之后，將細(xì)胞置于冰上直到注射。(V)EPC 的移植 采用麻醉工作站(VetEquip，Inc.Pleasanton,CA)用混合了 3L/min O2 的 1-2%吸 入的異氟烷(Abbott)麻醉大鼠。將大鼠以仰臥的姿勢(shì)放置在溫度已調(diào)節(jié)的外科手術(shù)臺(tái)上。 用電動(dòng)剃須刀對(duì)腹壁和會(huì)陰部進(jìn)行剃毛，并用聚維酮碘進(jìn)行清潔。通過(guò)采用無(wú)菌技術(shù)在會(huì) 陰部形成中線切口。經(jīng)鈍性切割切開(kāi)海綿體并使之暴露出來(lái)。通過(guò)采用連接于微升注射器 的30號(hào)針將稀釋于20μ 1EGM-2中的1_2χ106個(gè)細(xì)胞注射進(jìn)海綿體中。來(lái)自糖尿病對(duì)照組 (組I)的大鼠只接受了作為載體的0. 2mL的EGM-2。(vi)采用胰島素治療來(lái)自組III和組IV的糖尿病大鼠每天接受皮下注射5-10UI的胰島素(EliLilly， Indianapolis, IN, U. S. Α.)的治療，其目的在于將血糖水平保持在正常范圍內(nèi)。(vii)結(jié)果正常大鼠和糖尿病大鼠的陰莖內(nèi)壓。就評(píng)估陰莖內(nèi)壓的外科技術(shù)而言，在治療后4、8和12周，采用腹膜內(nèi)注射戊巴比 妥鈉(35mg/kg)對(duì)每組中5只大鼠進(jìn)行麻醉。在實(shí)驗(yàn)流程的過(guò)程(2-3小時(shí))中保持麻醉， 如有必要，需通過(guò)隨后每45-60分鐘注射戊巴比妥(5-10mg/kg)保持麻醉。頸部、腹壁和會(huì) 陰部用電動(dòng)剃須刀剃毛并用聚維酮碘清潔。通過(guò)頸部前正中線切口暴露出頸動(dòng)脈，插入裝滿生理鹽溶液的19fr聚乙烯導(dǎo)管， 并且連接到壓力傳感器從而連續(xù)監(jiān)測(cè)平均動(dòng)脈壓(MAP)。每次實(shí)驗(yàn)前都要以CmH2O校準(zhǔn)壓力傳感器。形成通過(guò)下腹部的較低的中線切口， 并識(shí)別出膀胱和前列腺。識(shí)別位于前列腺兩側(cè)的后側(cè)的下腹下叢(即骨盆叢或主要骨盆神 經(jīng)節(jié))、骨盆神經(jīng)和海綿體神經(jīng)，將不銹鋼雙極帶線電極放置在這些結(jié)構(gòu)周?chē)脕?lái)進(jìn)行電刺 激。通過(guò)測(cè)定海綿體壓力進(jìn)行大鼠“勃起”的確定。在人和動(dòng)物中，所述壓力開(kāi)始時(shí)非常低 (約5-10mmHg)，而在勃起過(guò)程中所述壓力上升到全身血壓的60-90% (取決于物種和針的 放置情況)。隨后去除陰莖皮膚；通過(guò)去除部分覆蓋的坐骨海綿體肌肉將腳(海綿體)暴露出 來(lái)。為監(jiān)測(cè) ICP，將連接到聚乙烯-50 導(dǎo)管(Intramedic, Becton Dickinson, CA, USA)的 20-G插管裝滿250U/mL的肝素溶液，并插入到右側(cè)海綿體中。在每次實(shí)驗(yàn)前以CmH2O校準(zhǔn) 該壓力傳感器。兩側(cè)壓力線都連接到壓力傳感器上，之后通過(guò)傳感器放大器(ΕΤΗ 401)連接到具 有實(shí)時(shí)顯示并記錄ICP的數(shù)據(jù)采集板(PowerLab. Chart 5，ADInstruments)上。如前所述，用連接到多接線鉗的細(xì)不銹鋼雙極勾狀電極直接對(duì)海綿體神經(jīng)進(jìn)行電 刺激。每個(gè)探針直徑為0.2mm，兩極直接分開(kāi)1mm。用信號(hào)發(fā)生器(定制的且?guī)в姓w恒流 放大器)(Grass, Astro Med, Inc. W. Warwick, RI, U. S. A.)傳遞單相矩形脈沖。該刺激參數(shù) 為20Hz，脈沖寬度0. 22ms，持續(xù)時(shí)間1分鐘；采用1、2、4和6mA的上升電流。刺激時(shí)間間隔為10分鐘。這些參數(shù)記錄在多道(生理)記錄儀上，且采用軟件計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)讀 取和對(duì)導(dǎo)出參數(shù)的計(jì)算(見(jiàn)圖4A-C上部平均動(dòng)脈壓(MAP)，底部海綿體內(nèi)壓(ICP))。圖5為ICP (海綿體內(nèi)壓)/MAP (平均動(dòng)脈壓)的比率隨時(shí)間變化圖，圖中比較了 所有四組經(jīng)糖尿病誘導(dǎo)后4周的隨時(shí)間變化的海綿體內(nèi)壓，四組為糖尿病組(DB)，用內(nèi)皮 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療的糖尿病組(CT)，用胰島素治療的糖尿病組(胰島素)以及用內(nèi)皮祖細(xì) 胞進(jìn)行細(xì)胞治療和胰島素治療的糖尿病組(CT+胰島素)。圖6為MAP (平均動(dòng)脈壓)/ICP (海綿體內(nèi)壓)的比率相對(duì)于神經(jīng)刺激的曲線圖， 圖中比較了糖尿病誘導(dǎo)后8周的糖尿病組和正常組的海綿體測(cè)試結(jié)果。圖7顯示MAP/ICP隨時(shí)間變化的曲線圖，圖中比較了進(jìn)行了 8周的糖尿病誘導(dǎo)后， 糖尿病組(DB)和用內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞治療的糖尿病組(DB+CT)的海綿體測(cè)試結(jié)果。細(xì) 胞治療組的MAP/ICP在注射后12周中有持續(xù)的改善，表明了治療的長(zhǎng)期作用。在研究最后(EPC注射后12周)，比較了正常組、糖尿病組(DM)和進(jìn)行細(xì)胞治療的 糖尿病組(DM+CT)用不同量神經(jīng)刺激的ICP/MAP的比率，表示于圖8 (結(jié)果以平均值士 sem 表示，相對(duì)于正常組*P < 0. 05)。在細(xì)胞治療后12周之后，該DM+CT非常類(lèi)似于正常組結(jié) 果。該結(jié)果表明了內(nèi)皮祖細(xì)胞治療的長(zhǎng)期作用。組織學(xué)和免疫熒光。海綿體測(cè)試后，將陰莖從根部切下，并去除龜頭和陰莖周?chē)慕Y(jié)締組織，進(jìn)行組織 學(xué)研究。將回收的組織樣品放置在Tissue-Tek 0. C. Τ. Compound4583 (Sakura )中并冷 凍于液氮中。采用恒冷切片機(jī)(Model CM 1850，LeicaMicrosystems, Bannockbum, IL)將 冷凍塊切成6μπι的薄切片。固定所述薄切片并用蘇木精和伊紅(Η&Ε)染色。通過(guò)熒光顯微技術(shù)，采用550nm的激發(fā)波長(zhǎng)識(shí)別PKH26標(biāo)記的細(xì)胞。以不同的放 大倍數(shù)獲取數(shù)字影像(Zeiss Axio Imager MlMicroscope, CarlZeiss, Thornwood,NY) 在 4、8和12周后，在組織體中可以檢測(cè)到PKH26標(biāo)記的移植細(xì)胞，說(shuō)明了這些細(xì)胞的長(zhǎng)期存 活。來(lái)源于EPC的內(nèi)皮細(xì)胞可以成功地被分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增。用細(xì)胞特異性抗體，采用 免疫組織化學(xué)確定了內(nèi)皮祖細(xì)胞和分化的內(nèi)皮細(xì)胞的表型。注射了細(xì)胞的動(dòng)物表現(xiàn)出其海 綿體內(nèi)壓有了實(shí)質(zhì)性改善，且它們的勃起機(jī)能被恢復(fù)到正常水平。從組織學(xué)方面來(lái)看，標(biāo)記 了熒光染料示蹤劑PKH26的移植的細(xì)胞存活并結(jié)合到注射區(qū)域的身體組織中。
權(quán)利要求
一種改善受試者勃起機(jī)能障礙(ED)的方法，其包括注射能夠增加身體組織中一氧化氮產(chǎn)生的細(xì)胞群，和在體內(nèi)維持所述細(xì)胞以提高一氧化氮的局部組織濃度，從而能夠改善刺激的情況下的海綿體內(nèi)壓。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞群包含內(nèi)皮細(xì)胞。
3.權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述細(xì)胞群還包含平滑肌細(xì)胞。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞群包含內(nèi)皮祖細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4所述的方法，其中，所述細(xì)胞群還包括平滑肌祖細(xì)胞。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法還包括使所述細(xì)胞結(jié)合到身體組織上。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法還包括從樣品中分離所述細(xì)胞的步驟。
8.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括從外周血樣品中分離所述細(xì)胞的步驟。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述細(xì)胞為自體的。
10.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括分離祖細(xì)胞的步驟。
11.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括分離內(nèi)皮祖細(xì)胞的步驟。
12.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括分離平滑肌祖細(xì)胞的步驟。
13.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括在注射前離體擴(kuò)增分離到的細(xì)胞。
14.權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述方法還包括分化分離到的細(xì)胞的步驟。
15.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述方法還包括將分離到的細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞 的步驟。
16.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述方法還包括將分離到的細(xì)胞分化成平滑肌細(xì) 胞的步驟。
17.權(quán)利要求14所述的方法，其中，所述方法還包括在注射前離體擴(kuò)增分化的細(xì)胞。
18.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述注射方法還包括將細(xì)胞注射到海綿體中。
19.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述注射步驟還包括每次注射中注射的細(xì)胞為約30 萬(wàn)-約1000萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。
20.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述受試者患有糖尿病。
21.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法還包括控制受試者的血糖水平。
22.權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述方法還包括施用有效劑量的胰島素。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種改善受試者勃起機(jī)能障礙(ED)的方法，其通過(guò)注射能夠增加身體組織中一氧化氮產(chǎn)生的細(xì)胞群，和在體內(nèi)維持該細(xì)胞以提高一氧化氮的局部組織濃度，從而能夠改善在刺激情況下的海綿體內(nèi)壓。
文檔編號(hào)A61M1/00GK101848746SQ200880102193
公開(kāi)日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2008年6月13日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月13日
發(fā)明者A·阿塔拉, J·柳 申請(qǐng)人:維克森林大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院