專利名稱：調節(jié)癌癥的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及調節(jié)癌癥的方法。特別地，本發(fā)明涉及抑制細胞癌性生長的方法。本發(fā)明還提供了預防或治療癌癥的方法。本發(fā)明還涉及鑒別能抑制細胞癌性生長的藥物的方法。
背景技術：
癌癥描述了由于機體細胞失調生長所致的一類疾病。惡性癌癥可由于這種失調生長而產(chǎn)生并隨后通過血流或淋巴系統(tǒng)分散于全身，這個過程稱為轉移。上皮組織的惡性腫瘤是癌癥最常見的形式并且是西方工業(yè)化國家中多數(shù)癌癥相關死亡的原因。根據(jù)澳大利亞健康與福利協(xié)會(Australian Institute of Health and Welfare，AIHW)的報告，平均每三個男性及平均四個女性中就有一人在75歲之前將發(fā)生癌癥(1)。男性中最常見的是前列腺癌，腸癌和肺癌，女性中最常見的是乳腺癌，腸癌和黑素瘤。鑒別在腫瘤組織中特異性表達而在正常組織中不表達的基因并分析其作用，用于鑒別癌癥治療中的新的靶位。
一些基因與許多癌癥相關。例如，已知癌基因編碼細胞生長因子如表皮生長因子的受體。ras基因是一種癌基因，確信其與直至90％的人胰腺癌，50％的人結腸癌，40％的肺癌和30％的白血病相關。突變的癌基因可以成為致癌基因。這種突變的癌基因編碼觸發(fā)失控的細胞生長的蛋白質如蛋白激酶和蛋白磷酸化酶。EphB4是已知最大的受體蛋白酪氨酸激酶家族的一個最近鑒別的成員。已經(jīng)鑒別了Eph受體家族成員參與許多細胞過程，包括神經(jīng)發(fā)育，血管發(fā)生及血管網(wǎng)匯集(vascular network assembly)(2-5)。作為與其配體ephrin相互作用的結果，它們介導接觸依賴性細胞相互作用，調節(jié)細胞功能如接觸抑制，細胞骨架組構及細胞遷移(6，7)。
盡管已經(jīng)研發(fā)了許多抗癌藥物包括生長抑制分子如細胞毒性化合物嘗試治療癌癥，但仍需要調節(jié)癌癥的有效方法。
發(fā)明概述本發(fā)明基于令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，即可結合EphB4蛋白一特定區(qū)域的抗體可通過引起癌細胞死亡而有利地抑制癌細胞癌性生長。
因此，本發(fā)明第一個方面提供了一種抑制細胞癌性生長的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基的區(qū)域內，或者位于與該區(qū)域有至少85％優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQID NO1)的第220-230位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，該序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明第二個方面還提供了一種誘導癌細胞死亡的方法，所述方法包括將所述細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明第三個方面提供了一種在患者中治療或預防患者癌癥的方法，所述方法包括給予患者有效量的至少一種抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQID NO1)的第220-230位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的一個序列內。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ IDNO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明另一方面提供了一種鑒別抑制細胞癌性生長的藥物的方法，所述方法包括評價所述藥物與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400殘基的區(qū)域內或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的EphB4多肽的結合能力。優(yōu)選地，所述方法包括評價所述藥物與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245殘基的區(qū)域內或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的EphB4多肽的結合能力。優(yōu)選地，所述方法包括評價所述藥物與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244殘基的區(qū)域內或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的EphB4多肽的結合能力。最優(yōu)選地，所述方法包括評價所述藥物與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230殘基的區(qū)域內或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的EphB4多肽的結合能力。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明還提供了通過上述方法鑒別的一種藥物。
本發(fā)明另一個方面提供了一種純化的EphB4抗體，其結合具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基有至少85％相同性，優(yōu)選與EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基有至少90％相同性的序列的多肽。優(yōu)選地，所述純化的EphB4抗體結合具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基有至少85％相同性，優(yōu)選與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基有至少90％相同性的序列的多肽。純化的EphB4抗體優(yōu)選結合具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基有至少85％相同性，優(yōu)選與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基有至少90％相同性的序列的多肽。最優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種純化的EphB4抗體，其結合位于EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基內一個表位。本發(fā)明的純化的EphB4抗體優(yōu)選結合在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)的多肽。優(yōu)選地，純化的EphB4抗體是一種單克隆抗體。
附圖簡述

圖1示出使用特異性針對EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)，在三種不同的結腸癌和匹配的正常粘膜中EphB4表達的免疫組織化學定位。來自生物素酰化的二級抗體的黑色染色表示EphB4蛋白。核用Harris蘇木精染色。圖中示出了三種不同的腺癌(高分化的，中等分化的及分化不良的)及其匹配的正常粘膜的高倍(100×)放大圖像。針對每個樣品組示出了腫瘤組織的強染色及正常組織的非常弱的彌漫染色。與單獨的二級抗體無交叉反應性(結果未示出)。
圖2示出在5對腫瘤(T)/正常組(N)中EphB4(1187bp)和內在18SrRNA(489bp)的相對RT-PCR對比表達。LM-來自患者5的肝轉移癌；NL-來自患者5的正常肝臟；C1-結腸癌細胞系LIM2405；C2-結腸癌細胞系SW480；RT-RT陰性對照；P-PCR陰性對照；M-pUC19/HpaII標記。
圖3示出于2ml DMEM中的鋪滿單層細胞用特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的1/500稀釋的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)處理(O.4ng/μl終濃度)。將細胞與抗體保溫在24-48小時之間產(chǎn)生明顯應答。細胞以易碎片狀脫離培養(yǎng)皿的底部，其通過輕輕攪動而易于破壞。培養(yǎng)基顏色的改變是由于死亡細胞的細胞內容物滲出所致的0.5pH單位的改變而引起的。
圖4示出特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)劑量的增加在48小時后在體外對MCF-7細胞生長的作用的圖示。
圖5示出臺盼藍排除分析以確定特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)的劑量依賴性。在暴露于三種不同稀釋的EphB4抗體48小時后(X-軸)，存活細胞數(shù)目降低(×100000)(Y-軸)。在添加1μg/ml 72小時后及在添加2μg/ml 48小時后，無存活細胞殘存。
圖6示出Caspase-3分析。在所有稀釋的特異靶向EphB4(SEQID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)(X-軸)應用之后，每100000個細胞的caspase-3活性的相對量增加(Y-軸)。由于應用1/200稀釋液(1μg/ml)72小時后及應用1/100(2μg/ml)稀釋液48小時后無存活的細胞，因此未測定caspase-3活性。
圖7示出了在用如下5種不同的EphB4抗體處理65小時后，乳腺癌細胞的存活力百分率(1)靶向小鼠EphB4的羧基末端第825-991位氨基酸殘基的EphB4多克隆抗體(Swiss)(Dr Andrew Ziemiecki，University of Bern提供)；(2)靶向EphB4氨基酸序列的N末端前19個氨基酸的多克隆N末端EphB4抗體(N-19 Santa CruzBiotechnology)，所述19個氨基酸很可能是成熟EphB4(SEQ ID NO1)的第16-34位氨基酸殘基；(3)靶向相應于由EphB4(SEQ ID NO1)的第615-874位氨基酸殘基組成的酪氨酸激酶結構域的羧基末端的多克隆EphB4 C末端抗體(C-16 Santa Cruz Biotechnology)；(4)特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)；及(5)特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200(old)-Santa Cruz Biotechnology-Lot number B141batch)。將細胞用1/100稀釋的原種抗體(200μg/ml)處理，然后用臺盼藍染色(染色死亡的細胞)。對每種處理的4個不同等份計算未染色的(存活)與染色的(未存活的)細胞比率。對照-未加入抗體。CLM-補體限制培養(yǎng)基(complement limited medium)。FCS-10％胎牛血清加入培養(yǎng)基中。補體在特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)的細胞死亡作用中不起作用。這通過在具有正常蛋白質活性的培養(yǎng)基中生長的細胞中加入抗體后(FCS實驗)與在其中補體蛋白通過加熱至55℃30分鐘而滅活的培養(yǎng)基中生長的細胞(CLM實驗)對比存活力百分率而表明。
圖8示出所給出的正常人體組織及一種代表性的結腸腫瘤(腫瘤)的Western分析。(A)使用特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)鑒別EphB4蛋白。推定的野生型蛋白是120kDa，用箭頭指示。(B)考馬斯藍染色的一式兩份凝膠。指出了分子量標記的大小。
圖9示出野生型EphB4受體的結構域與剪接變體EphB4v1和EphB4v2的推定結構對比示意圖。缺失的區(qū)域用*標示。
圖10示出用1/100稀釋的特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)處理65小時(處理組)或者未加處理(對照組)的EphB4基因和PBGD(管家基因對照)在乳腺癌細胞系MDA-MB-231(231)、MDA-MB-468(468)、Hs578t、MCF7和T47D中的表達。RT-ve是僅作為對照的反轉錄試劑。標記1-Spp1/EcoR1，標記2-pUC19/Hpa11。
圖11示出設計為跨靶EphB4序列的前125個氨基酸(以黑體字示出)的6個重疊肽的序列[以SEQ ID NO2(肽1)至SEQ ID NO7(肽6)表示]。數(shù)字是指成熟EphB4蛋白(圖18中示出的SEQ ID NO1)中氨基酸的位置。
圖12示出臺盼藍排除分析，對比對照細胞(未處理的)，只用特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)處理的細胞(只用Ab)，或者用抗體和肽混合物(Ab+所有肽)處理的細胞的存活力。一式兩份進行測試。
圖13示出在對照細胞(未處理的)，只用特異靶向EphB4(SEQ IDNO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)處理的細胞(只用Ab)，或者用抗體和肽混合物(Ab+所有肽)處理的細胞中caspase-3活性的相對水平對比分析。一式兩份進行測試。
圖14示出在用有或無5μl的指定肽時用1/500稀釋的特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)處理鋪滿的SW480單層細胞48小時后，進行的臺盼藍排除分析的結果。肽1和肽2呈現(xiàn)從Ab介導的細胞死亡中拯救大約50％的細胞。
圖15示出肽1(SEQ ID NO2)或肽2(SEQ ID NO3)的濃度增加(至10μl)能從特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)介導的細胞死亡中充分拯救細胞，并且肽1和2組合具有同樣作用(每個5μl)。
圖16示出能阻斷特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)對培養(yǎng)物細胞的作用的兩個重疊肽的序列[以SEQ IDNO2(肽1)和SEQ ID NO3(肽2)表示]，及為進一步縮小反應序列而針對核心序列GSCVV設計的三個肽的序列[以SEQ ID NO8(肽7)至SEQ ID NO10(肽9)表示]。數(shù)字是指成熟EphB4蛋白中氨基酸的位置(黑體字示出的序列)。
圖17示出肽7(SEQ ID NO8)能從Ab介導的細胞死亡中充分拯救細胞，并且與肽2(SEQ ID NO3)的作用相同。將1μl特異靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)(0.2μg/ml)和10μl的10mg/ml肽原種一起在冰上預保溫2小時，之后加入具有500μl DMEM的24孔微滴定平板中的鋪滿單層細胞中。
圖18示出SEQ ID NO1的氨基酸序列。SEQ ID NO1是成熟人(Homo sapiens)Ephrin B型受體4(EphB4)的氨基酸序列。
圖19示出具有不同的多克隆抗體(N-19，H-200和C-16)所靶向的結構域區(qū)域(用黑括號標示)的EphB4受體的模型。球形結構域(ephrin受體配體結合結構域)相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基29-197。半胱氨酸富集區(qū)域(Giardia變體特異性表面蛋白)相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基255-313。纖連蛋白III型結構域1相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基324-414。纖連蛋白III型結構域相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基437-517?？缒そY構域相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基540-560。酪氨酸激酶結構域相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基615-874。SAM(無菌α基序)結構域相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基904-971。PDZ結構域相應于EphB4(SEQ ID NO1)的殘基985-987。
這些結構域相對于EphB4氨基酸序列的放置基于取自NCBI登記號NP004435的最近報道的信息。N-19抗體作圖為很可能是成熟EphB4(SEQ ID NO1)的第16-34位氨基酸殘基的序列N末端前19個氨基酸。C-16抗體靶向酪氨酸激酶結構域。H-200抗體特異性靶向跨半胱氨酸富集區(qū)域和纖連蛋白結構域的胞外結構域中EphB4(SEQID NO1)的殘基201-400。
圖20示出被設計為包括提議的表位序列的肽11的序列(SEQ IDNO12)，及肽10的序列(SEQ ID NO11)，其中攜帶這個野生型序列中一個電荷的氨基酸天冬氨酸(D)被具有相似側鏈結構的不帶電荷的氨基酸天冬酰胺(N)取代。黑體字所示數(shù)字和序列是指成熟EphB4蛋白中氨基酸的位置。
發(fā)明詳述本發(fā)明第一方面提供了一種抑制細胞癌性生長的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內或位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ IDNO1)的第201-245位殘基內或位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內或位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
所述抗體或其抗原結合部分優(yōu)選特異性結合具有由EphB4(SEQID NO1)的第200-400位殘基組成的序列的一種多肽。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合具有由EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基組成的序列或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的一種多肽。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合具有由EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基組成的序列或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的一種多肽。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合具有由EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基組成的序列或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的一種多肽。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分是多克隆或單克隆抗體。所述方法優(yōu)選導致細胞死亡。
所述抗體或其抗原結合部分優(yōu)選特異性結合一種多肽，所述多肽具有與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基及EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基或EphB4(SEQ IDNO1)的第220-230位殘基的序列有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽優(yōu)選包括具有特定氨基酸的至少一種取代、缺失或添加的多肽變體。這種多肽變體特別是如果它們保留抗原性性質則也適于本方法。例如，多肽變體可被設計為保留抗原性性質并改良多肽的產(chǎn)生和/或溶解性。
例如，抗原性預測程序提示帶電荷的氨基酸Asp(D)對表位功能也是重要的，因為這是序列中唯一的帶電荷的殘基。由EphB4蛋白(SEQ ID NO1)的氨基酸殘基220-244組成的肽11如圖20所示設計。在EphB4蛋白(SEQ ID NO1)的第226位殘基有一個Asn(N)取代的肽10也如圖20所示設計。肽10和肽11的氨基酸序列如下肽10 SEQ ID NO11AGSCVVNAVPAPGPSPSLYCREDGQ肽11 SEQ ID NO12AGSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQAsp和Asn的側鏈非常相似，Asp的羥基是Asn中的胺，并將其從負電荷氨基酸轉變?yōu)橹行园被帷?br> 本發(fā)明第二方面還提供了一種誘導癌細胞死亡的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明的第三方面提供了一種在患者中治療或預防患者癌癥的方法，所述方法包括給予患者有效量的至少一種抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
所述癌癥優(yōu)選選自乳腺癌，前列腺癌，腸癌，膀胱癌，結腸癌，卵巢癌，肺癌，黑素瘤，淋巴瘤和白血病。所述方法優(yōu)選導致患者體內癌細胞死亡。
本發(fā)明的另一方面提供了一種鑒別抑制細胞癌性生長的藥物的方法，所述方法包括評價該藥物與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400殘基區(qū)域內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內EphB4多肽的結合能力。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述藥物結合包含在EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述藥物結合包含在EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。最優(yōu)選地，所述藥物結合包含在EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明還提供了通過上述方法鑒別的一種藥物。
在本說明書中，術語“抗體”以其最廣泛含義應用，并特別包括單克隆抗體，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙重特異性抗體)，及抗體片段。術語“表位”是指由抗體或其抗原結合部分識別的多肽的表位區(qū)域。
抗體是指由4個多肽鏈組成的免疫球蛋白分子，這4個鏈是由二硫鍵內在連接的兩個重鏈(H)和兩個輕鏈(L)。每個重鏈均由一個重鏈可變區(qū)(HCVR或VH)和一個重鏈恒定區(qū)組成。重鏈恒定區(qū)由三個結構域CH1、CH2和CH3組成。每個輕鏈均由一個輕鏈可變區(qū)(LCVR或VL)和一個輕鏈恒定區(qū)組成。輕鏈恒定區(qū)由一個結構域CL組成。VH和VL區(qū)可進一步再分為高度可變區(qū)，稱為互補決定區(qū)(CDR)，中間散布著更保守的稱為構架區(qū)(FR)的區(qū)域。每個VH和VL均由三個CDR和四個FR組成，以如下順序從氨基末端至羧基末端排列FR，CDR1，F(xiàn)R2，CDR2，F(xiàn)R3，CDR3，F(xiàn)R4。
本文所用術語抗體的“抗原結合部分”(或“抗體部分”)是指保留特異性結合抗原能力的一或多個抗體片段。已經(jīng)示出抗體的抗原結合功能可以通過全長抗體的片段進行。術語抗體的“抗原結合部分”涵蓋的結合片段的實例包括(I)Fab片段，由VL、VH、CL和CHI結構域組成的單價片段；(ii)F(ab′)2片段，包含在鉸鏈區(qū)通過二硫鍵連接的兩個Fab片段的二價片段；(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的一個臂的VL和VH結構域組成的Fv片段；(v)由VH結構域，或者VL結構域(9)組成的dAb片段(8)；及(vi)分離的互補決定區(qū)(CDR)。另外，盡管Fv片段的兩個結構域，VL和VH是由獨立的基因編碼的，但可以使用重組方法通過一個合成接頭將它們連接，使它們成為一個單一的蛋白質鏈，其中VL和VH區(qū)組對形成單價分子(稱作單鏈Fv(scFv)(10)，(11)。這種單鏈抗體也涵蓋在術語抗體的“抗原結合部分”中。其它形式的單鏈抗體如二抗體(diabody)或三抗體(triabodys)也涵蓋在其中。二抗體是二價的雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在多肽單鏈上表達，但使用一個接頭，該接頭太短以至于使得同一鏈上的兩個結構域之間不能配對，從而使得該結構域與另一個鏈的互補結構域配對，產(chǎn)生兩個抗原結合位點(12，13)。優(yōu)選地，抗體是EphB4(H-200)兔多克隆Ig G抗體，Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California。
更優(yōu)選地，抗體是單克隆抗體或其片段，并且特別選自結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位的單克隆抗體或其片段。優(yōu)選地，所述單克隆抗體或其片段結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述單克隆抗體或其片段結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。最優(yōu)選地，所述單克隆抗體或其片段結合位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明的另一方面提供了一種純化的EphB4抗體，其結合具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基有至少85％相同性，優(yōu)選與EphB4(SEQ ID NO1)的第20l-245位殘基有至少90％相同性的序列的多肽。優(yōu)選地，所述純化的EphB4抗體結合具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基有至少85％相同性，優(yōu)選與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基有至少90％相同性的序列的多肽。純化的EphB4抗體優(yōu)選結合具有與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基有至少85％相同性，優(yōu)選與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基有至少90％相同性的序列的多肽。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種純化的EphB4抗體，其結合位于EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基內的一個表位。本發(fā)明的純化的EphB4抗體優(yōu)選結合在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)的多肽。更優(yōu)選地，純化的EphB4抗體是一種單克隆抗體。
本文所用術語“單克隆抗體”是指得自一群基本同源的抗體的抗體，即這群中的各個抗體除了可能天然發(fā)生的突變之外是相同的，突變可以是少量存在的。單克隆抗體是高度特異性的，靶向單一的抗原性位點。另外，與典型包括靶向不同決定簇(表位)的不同抗體的常規(guī)(多克隆)抗體制品相反，每個單克隆抗體均靶向抗原上的一個單一決定簇。修飾語“單克隆”表明抗體的特征，其得自基本同源的抗體群，并且不是通過任何特殊方法根據(jù)抗體的所需產(chǎn)生而構建的。例如，本發(fā)明中應用的單克隆抗體可以通過雜交瘤方法生產(chǎn)，分離自噬菌體抗體文庫，或者可以通過重組DNA方法產(chǎn)生。這種技術包括但非限于雜交瘤技術(14)，三瘤(trioma)技術，人B細胞雜交瘤技術(15)，及EBV雜交瘤技術以產(chǎn)生人單克隆抗體(16)。另外，人源化的單克隆抗體可以根據(jù)美國專利6,090,382所述方法產(chǎn)生，該專利的全文及所引用的參考文獻在此均并入?yún)⒖?。該文獻提供了表達重組人抗體的合適的宿主細胞及合成重組人抗體的方法。另外，合適的人抗體可以使用轉基因動物產(chǎn)生，使用例如Oncology 29(Supp 4)47-50(2002)所述技術進行。本發(fā)明的抗體也可以得自商業(yè)來源。
也可以使用本領域已知的多種方法產(chǎn)生結合一種多肽的多克隆抗體，該多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400殘基的序列或者與其有至少85％相同性，優(yōu)選至少90％相同性的序列。為產(chǎn)生抗體，多種宿主動物可以通過注射與一種合適的載體結合的EphB4蛋白質或EphB4多肽片段而免疫。合適的載體可包括但非限于BSA(牛血清白蛋白)，KLH(匙孔血藍蛋白)，OVA(卵清蛋白)，THY(甲狀腺球蛋白)和RSA(兔血清白蛋白)。宿主動物優(yōu)選用包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的EphB4多肽免疫。優(yōu)選地，宿主動物可通過注射包含EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的EphB4蛋白或多肽而免疫。優(yōu)選地，宿主動物可通過注射包含EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的EphB4蛋白或多肽而免疫。最優(yōu)選地，宿主動物可通過注射包含EphB4(SEQID NO1)的第220-230位殘基或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的EphB4蛋白或多肽而免疫。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
合適的宿主動物包括但非限于兔，小鼠，大鼠等。根據(jù)宿主物種可以使用不同佐劑以增加免疫應答，佐劑包括但非限于Freud′s(完全和不完全)佐劑，礦物質凝膠如氫氧化鋁，表面活性物質如溶血卵磷脂，多聚醇，聚陰離子，肽，油乳狀液，二硝基苯酚，和潛在用于人體的佐劑如卡介苗(Bacillus Calmette-Guerin，BCG)和小棒桿菌(Corynebacterium parvum)?？贵w和抗體片段可以通過標準技術大量生產(chǎn)(例如在組織培養(yǎng)物或者無血清使用發(fā)酵器進行)并使用親和柱如蛋白A(例如針對鼠Mab)、蛋白G(例如針對大鼠Mab)或MEPHYPERCEL(例如針對IgM和IgG Mab)純化。
合適的抗體可包括抗體片段，包括可結合具有EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基序列或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽的抗原結合部分?？贵w的抗原結合部分優(yōu)選包括EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的獨特型。優(yōu)選地，抗體片段包括可結合具有EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基序列或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽的抗原結合部分。優(yōu)選地，抗體片段包括可結合具有EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基序列或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽的抗原結合部分。最優(yōu)選地，抗體片段包括可結合具有EphB4(SEQID NO1)的第220-230位殘基序列或與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽的抗原結合部分。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
這種抗體片段可通過本領域已知的技術產(chǎn)生。例如，這種片段包括但非限于F(ab′)2片段，其可以通過胃蛋白酶消化抗體分子而產(chǎn)生；Fab′片段，其可以通過還原F(ab′)2片段的二硫鍵而產(chǎn)生；Fab片段，其可以通過用木瓜蛋白酶和一種還原劑處理抗體而產(chǎn)生；及Fv片段。在進一步的技術中，特異于一種多肽的重組抗體可以被工程化并在廣泛的細胞類型中異位表達，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基，優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基，優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基，更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基發(fā)氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明方法中使用的抗體可包括“人源化”形式的非人(例如鼠)抗體，其是免疫球蛋白，免疫球蛋白鏈或其片段(如抗體的Fv，F(xiàn)ab，F(xiàn)ab′，F(xiàn)(ab′).sub.2片段或者其它抗原結合亞序列)，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小限度的氨基酸殘基。就其大部分而言，人源化抗體是人免疫球蛋白(接受體(recipient)抗體)，其中來自接受體的互補決定區(qū)(CDR)的殘基由來自具有希望的特異性、親和性和容量的非人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的殘基置換。在一些情況中，人免疫球蛋白的Fv構架區(qū)(FR)殘基被相應的非人FR殘基置換。此外，人源化抗體可包含在接受體抗體和輸入的CDR或構架序列中均未發(fā)現(xiàn)的殘基?？梢赃M行這些修飾以進一步改進和最佳化抗體性能。
本文所用術語“EphB4蛋白”包括全長EphB4蛋白或包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽片段。優(yōu)選地，EphB4蛋白包括包含EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽片段。優(yōu)選地，EphB4蛋白包括包含EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽片段。最優(yōu)選地，EphB4蛋白包括包含EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽片段。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
EphB4變體蛋白可以在氨基酸水平修飾，并可以包括不影響蛋白質功能性的氨基酸添加或缺失或置換，如保守氨基酸取代。EphB4蛋白也可以包括一種截短的EphB4蛋白。EphB4蛋白可以是天然的或重組的。EphB4蛋白可以來自任何動物物種，優(yōu)選EphB4蛋白來自人。
適于本發(fā)明方法的抗體或其抗原結合部分優(yōu)選能通過抑制EphB4蛋白的活性而抑制細胞的癌性生長。在本說明書中，術語“癌性生長”是指細胞的異常和不可控制的分裂和生長。典型地，這種細胞被鑒定為癌細胞，其能侵入并破壞其它組織并具有波及到機體其它部位的潛力。細胞的癌性生長可導致腫瘤形成，這個腫瘤可以是良性或惡性的。
在本說明書中，術語“細胞”是指包括任何細胞。優(yōu)選地，所述細胞衍生自哺乳動物物種，例如但非限于人，小鼠，牛，綿羊或家畜。優(yōu)選所述細胞選自但非限于前列腺細胞，乳腺細胞，結腸細胞，成纖維細胞，表皮細胞，胎盤，肝，腎，胰，心，神經(jīng)細胞或肌細胞，或者癌細胞或腫瘤細胞。所述細胞可以是正常細胞，患病細胞，成年細胞或胚胎細胞。所述細胞可以是單個細胞，培養(yǎng)細胞或組織的一部分。所述細胞可以是遺產(chǎn)修飾的重組細胞，如轉基因細胞。優(yōu)選地，所述細胞表達EphB4。所述細胞可以是整個動物的一部分。所述細胞還可以衍生自一種細胞系。優(yōu)選地，來自細胞系的細胞衍生自但非限于前列腺，乳腺，結腸或卵巢細胞系。所述細胞系優(yōu)選選自結腸SW480，結腸SW620，結腸LIM1215，乳腺MCF7，乳腺T47-D，乳腺MDA-MB-231，乳腺MDA-MB-453，膀胱J82，膀胱T24，膀胱RT119和膀胱5637。更優(yōu)選地，細胞系選自乳腺癌細胞系MCF-7和結腸癌細胞系SW480。
本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分優(yōu)選可抑制一或或種癌細胞的癌性生長，所述癌細胞選自乳腺癌細胞，前列腺癌細胞，腸癌細胞，膀胱癌細胞，結腸癌細胞，卵巢癌細胞，肺癌細胞，黑素瘤細胞，淋巴瘤細胞和白血病細胞。
抗體或其抗原結合部分優(yōu)選特異性結合一種多肽，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗體或其抗原結合部分特異性結合一個表位，該表位包含于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ IDNO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內。
本說明書中術語“特異性結合”應理解為是指抗體或其抗原結合部分獨特地結合一種多肽的結合特性，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。抗體或其抗原結合部分優(yōu)選是多克隆或單克隆抗體，其特異性結合一種多肽，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ IDNO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。優(yōu)選地，所述抗體是特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400位的EphB4多克隆抗體(H-200-SantaCruz Biotechnology)。
本發(fā)明提供了一種抑制細胞癌性生長的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分結合一個表位，該表位位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQID NO1)的第220-230位殘基內，或者位于與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
優(yōu)選地，至少一種抗體或其抗原結合部分結合一種多肽，該多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第201-400位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一種EphB4蛋白，該蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一種EphB4蛋白，該蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。更優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分結合一種EphB4蛋白，該蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被被取代為Asn(N)。
本文所用術語“抑制細胞的癌性生長”是指細胞的癌性生長基本上被降低或預防。在本發(fā)明中，將細胞與結合一種多肽的至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，以導致與未處理的細胞相比抑制細胞的癌性生長，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。所述方法優(yōu)選導致細胞死亡。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
本發(fā)明還提供了一種誘導癌細胞死亡的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸，所述抗體或其抗原結合部分結合具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，至少一種抗體或其抗原結合部分結合包含于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，至少一種抗體或其抗原結合部分結合包含于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。更優(yōu)選地，至少一種抗體或其抗原結合部分結合包含于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
短語“誘導癌細胞死亡”是指癌細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分接觸導致細胞死亡，所述抗體或其抗原結合部分結合具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ IDNO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽。優(yōu)選地，所述抗體是特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)。
癌細胞的死亡可以通過許多分析加以評估。例如認為caspase-3激活在細胞死亡期間起始細胞事件中起關鍵作用。量化caspase-3活性的許多不同的試劑盒是可商購的。線粒體膜去極化通常與細胞死亡的早期階段相關。推測膜電勢的改變是由于線粒體通透性轉換孔(transition pore)的開放所致，這也許在編程性細胞死亡中起關鍵作用。去極化可以通過許多不同的分析檢測，包括使用羅丹明123，在活性線粒體中積累的綠色熒光陽離子染料，其具有高膜電勢，使得可以快速及易于檢測細胞的破壞。乳酸脫氫酶(LDH)是存在于所有細胞中一種穩(wěn)定的細胞質酶。當細胞質膜破壞時，其快速釋放入細胞培養(yǎng)上清中。LDH活性可以使用可商購試劑盒用分光光度平板讀數(shù)器通過單點(single point)分析在培養(yǎng)上清中測定。培養(yǎng)基中LDH增加表明細胞壞死(死亡)。
可以分析細胞的形態(tài)以評價細胞死亡情況。例如，編程性細胞死亡是程序化細胞死亡，其特征在于一系列典型的形態(tài)學事件，如細胞皺縮及片段化為膜結合的凋亡小體(17)。這些可以使用光學顯微鏡觀測到。另外，可以檢測細胞對與細胞死亡相關的基因的表達。另外，對比EphB4抗體處理的和未處理的來自4種不同乳腺癌細胞系的細胞的RT-PCR分析示出在處理的細胞中EphB4基因表達被下調。
本發(fā)明的另一方面提供了一種治療或預防患者癌癥的方法，所述方法包括給予患者有效量的至少一種抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分結合具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ IDNO1)的第226位的氨基酸殘基Asp(D)被取代為Asn(N)。所述方法優(yōu)選導致患者體內癌細胞死亡。
所述癌癥優(yōu)選選自乳腺癌，前列腺癌，腸癌，膀胱癌，結腸癌，卵巢癌，肺癌，黑素瘤，淋巴瘤和白血病。
通過本發(fā)明的方法治療的患者可以選自但非限于人，綿羊，家畜，馬，牛，豬，家禽，狗和貓。
在本發(fā)明方法中，給予患者有效量的至少一種抗體或其抗原結合部分，所述抗體或其抗原結合部分結合具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，至少一種抗體或其抗原結合部分結合包含于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。所述抗體或其抗原結合部分優(yōu)選特異性結合具有包含EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽。最優(yōu)選地，所述抗體或其抗原結合部分是多克隆抗體或單克隆抗體。
術語“有效量”是指足以治療或預防要被治療或預防的癌癥的劑量。這根據(jù)患者及癌癥的類型加以變化。本發(fā)明方法中應用的至少一種抗體或其抗原結合部分的有效量可以根據(jù)給予方式，治療動物的狀況加以變化，最后由主治學者，醫(yī)生或獸醫(yī)確定。用于治療或預防患者的抗體或其抗原結合部分的量也根據(jù)特定抗體或其抗原結合部分的性質和特性加以變化。
抗體或其抗原結合部分優(yōu)選通過本領域技術人員已知的合適方式給予患者。優(yōu)選地，抗體或其抗原結合部分可通過許多方式與細胞接觸，包括例如通過靜脈內給予。
優(yōu)選地，本發(fā)明的抗體或其抗原結合部分與一種合適的藥物可接受的載體或稀釋劑組合，形成可適于給予人或動物患者的藥物組合物。合適的載體或稀釋劑包括等滲鹽溶液，例如磷酸鹽緩沖鹽水。包括至少一種抗體或其抗原結合部分的藥物組合物可以針對非腸道、肌內、靜脈內、皮下、眼內、口服或經(jīng)皮給予而配制?？贵w可以根據(jù)患者的體重以合適劑量給予。然而，應理解所述給予途徑和劑量僅是作為指導，因為本領域技術人員能易于確定針對任何特定患者和癌癥的最佳給予途徑和劑量。
本發(fā)明方法中應用的抗體或其抗原結合部分可以與合適的賦形劑組合，所述賦形劑如乳化劑，表面活性劑，穩(wěn)定劑，染料，滲透增強劑，抗氧化劑，水，鹽溶液，醇，聚乙二醇，明膠，乳糖，硬脂酸鎂和硅酸?？贵w或其抗原結合部分優(yōu)選配制為無菌水溶液?？贵w或其抗原結合部分可以與抗體活性相容的佐劑成分組合。本發(fā)明方法中應用的抗體或其抗原結合部分可以優(yōu)選用于互補現(xiàn)有的癌癥治療方法。例如，本發(fā)明的方法也用于與傳統(tǒng)的癌癥治療方法組合，如組合放療，化療(例如使用蒽環(huán)類(anthracycline)，5FU，拓撲異構酶抑制劑，順鉑(Cisplatin)和卡鉑(Carboplatin))，或者激素治療或者利用激素修飾劑(例如Catamoxifen)治療。
本發(fā)明的另一方面提供了一種鑒別抑制細胞癌性生長的藥物的方法，所述方法包括評估該藥物結合一種多肽的能力，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，所述藥物結合包含于EphB4(SEQ IDNO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列內的一個表位。優(yōu)選地，所述藥物結合一種EphB4蛋白，該蛋白具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。
在本說明書中，術語“藥物(agent)”包括可結合(相互作用)EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ IDNO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的任何分子，化合物或蛋白質。合適的藥物可優(yōu)選包括結合一種多肽的抗體或其抗原結合部分，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。最優(yōu)選地，所述藥物是一種多克隆或單克隆抗體的抗體或其抗原結合部分。所述方法優(yōu)選包括評估所述藥物誘導癌細胞死亡的能力。所述藥物優(yōu)選是EphB4配體，如優(yōu)選特異于EphB4蛋白的抗體或其抗原結合部分，并可以商業(yè)研發(fā)或獲得以在體外或體內系統(tǒng)中測試其抑制細胞癌性生長的能力。
例如，可以測試靶向EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的特異性表位的抗體或其抗原結合部分抑制細胞癌性生長及優(yōu)選誘導細胞死亡的能力。可以繪制評估抗體的IC50的劑量應答曲線以測試每個抗體的效力。另外，可以進行抗體/受體-配體結合研究以評估抗體預防配體結合的能力。在抗體結合后EphB4受體的酪氨酸磷酸化可以通過受體與各自的抗體的免疫沉淀而評估，隨后通過用抗磷酸酪氨酸抗體進行Western分析以證實EphB4受體被失活?？梢赃x擇在最低50％抑制濃度(IC50)抑制酪氨酸磷酸化和體外細胞生長并預防配體與EphB4受體結合方面具有最佳中和活性的抗體進行另外的體內測試。
例如，可以使用免疫缺陷的NOD-SCID(非肥胖性糖尿病的組合免疫缺陷)小鼠轉移和腫瘤生長的體內模型測試推定的藥物作為抗癌藥物的效力，所述推定的試劑可結合具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列的多肽。優(yōu)選地，所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。另外，可獲得的許多不同的腫瘤細胞系可用于體外測試，其中大多數(shù)可以作為異種移植物生長，這些包括人乳腺癌細胞系MCF-7和結腸癌細胞系HT29。異種移植腫瘤在皮下注入(在此其以塊狀生長)或者在注入尾靜脈后使得模擬轉移的血源傳播導致在其它器官中繼發(fā)性沉積(secondary deposits)而可以在小鼠模型中生長。一旦確定針對每個細胞系的合適的移入時期和接種劑量，可使用該模型測試結合一種多肽的多種藥物，所述多肽具有包含EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基、更優(yōu)選EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的序列，或者與其有至少85％，優(yōu)選至少90％相同性的序列。細胞也可以用等同于IC50和IC75的亞致死劑量的選擇的EphB4抗體處理以評價與未處理的細胞相比處理的細胞的移入。這樣將評價EphB4的功能性表達降低對腫瘤細胞系的建立和轉移的作用。
也可以使用體內模型在前臨床階段評價治療EphB4陽性腫瘤細胞系的新療法的潛力。皮下注入的應用使得可以檢測已經(jīng)存在不同時期的腫瘤。這可以用于確定一種藥物，如抗體或其抗原結合部分，與載體對照相比消除新發(fā)生的及完全建立的腫瘤的能力。尾靜脈注入的應用可用于確定用抗體或其抗原結合部分處理是否減少由于血源傳播所致的轉移形成的數(shù)目。通過本發(fā)明的方法鑒別的藥物可用于治療或預防癌癥。本發(fā)明還提供了通過上述方法鑒別的一種藥物。
在本說明書中，術語“包含”應理解為包括指定的元素、整體或步驟，或元素、整體或步驟組，但不排除任何其它元素、整體或步驟或元素、整體或步驟組。
本發(fā)明通過如下非限制性附圖和實施例在下文進一步描述實施例1EphB4的免疫化學定位使用特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)分析EphB4蛋白在腫瘤和正常組織中的定位。當與匹配的正常組織對比時，結腸和乳腺組織示出這個蛋白質在腫瘤上皮細胞中的水平明顯增加(如圖1所示)。EphB4在兩種最常見的癌癥中在腫瘤上皮細胞上高度表達的實證提示EphB4對這些腫瘤的進展很關鍵。
實施例2EphB4的RT-PCR表達使用逆轉錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)對比EphB4(1187bp)和內部18SrRNA(489bp)在5對腫瘤(T)/正常組織(N)中的表達(結果示于圖2)。分析來自60個患者的63個結腸癌表明EphB4在80％的患者的腫瘤組織中過表達，提示可廣泛用作治療靶位(圖2)。在腫瘤細胞和正常組織中的不同表達提示抗EphB4腫瘤治療對結腸(及其它)腫瘤具有優(yōu)先作用。
對比EphB4與已經(jīng)在臨床試驗中被靶向的其它受體蛋白酪氨酸激酶(HER2，EGFR和VEGFR)的表達譜提示EphB4在正常組織中表達程度較低。來自EST數(shù)據(jù)庫的信息提示EphB4在腎，卵巢和胎盤中低水平表達，在心，肺，外周神經(jīng)和血管組織中極低水平表達。因此期望靶向EphB4治療與靶向其它受體酪氨酸激酶的治療相比產(chǎn)生較少的副作用。
實施例3EphB4特異性抗體研究在體外論證了特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)的直接殺腫瘤作用。將完全鋪滿單層的結腸癌細胞系SW480和SW620與1/500稀釋的EphB4抗體H-200(Santa CruzBiotechnology-Lot numbers B141和F182)溫育導致細胞脫離培養(yǎng)瓶底部并死亡(圖3)。這是當處理結腸癌細胞系包括SW480，SW620，LIM1215，乳腺癌細胞系MCF-7，T47-D，MDA-MB-453，MDA-MB-231和Hs578t，膀胱癌細胞系J82，RT119，5637和T24時觀測到的常見應答。
將乳腺癌細胞系MCF-7和結腸癌細胞系SW480與三種不同濃度的抗體(2μg/ml，1μg/ml和0.2μg/ml)一起保溫導致劑量依賴形式的細胞死亡(見圖4和圖5)。這種作用在將內皮細胞系HUVEC-C暴露于EphB4抗體時未觀測到。對caspase-3活性進行分析提示細胞死亡不是通過編程性細胞死亡(圖6)。這些結果提示通過與膜受體交聯(lián)或結合，抗體可以模擬或調節(jié)受體活性，而且這些抗體產(chǎn)生的跨膜信號可導致編程性細胞死亡或生長抑制(18)。誘導細胞死亡的另外可能機制包括ras介導的非編程性細胞死亡或間隙連接胞內通訊(GJIC)的恢復，GJIC是已知通過Eph受體信號化防止的直接細胞-細胞通訊途徑(19)。
特異于EphB4的多克隆抗體已經(jīng)揭示并可商購，以在體外和體內系統(tǒng)中測試這些抗體。圖7示出在用如下述5種EphB4抗體處理后，乳腺癌細胞的存活百分率(1)靶向小鼠EphB4的羧基末端氨基酸殘基825-991的EphB4多克隆抗體(Swiss)；(2)靶向EphB4氨基酸序列N末端前19個氨基酸的多克隆N末端EphB4抗體(N-19 Santa Cruz Biotechnology)，該前19個氨基酸可能是成熟EphB4(SEQ ID NO1)的氨基酸殘基16-34；(3)靶向相應于由EphB4(SEQ ID NO1)的氨基酸殘基615-874組成的酪氨酸激酶結構域的羧基末端的多克隆EphB4C末端抗體(C-16 Santa Cruz Biotechnology)；(4)特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)；(5)特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200(old)-Santa CruzBiotechnology-Lot number B141 batch)。
在用特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的H-200抗體處理中觀測到細胞死亡作用。細胞在有或無活性補體蛋白的培養(yǎng)基中的生長對比示出補體在Ab介導的細胞死亡中不起作用(見圖7)。
細胞死亡的機制可通過使用微陣列技術，在與亞致死劑量的H-200EphB4抗體保溫后，通過體外癌細胞中誘導的基因表達的改變而進一步分析。
實施例4EphB4在人體組織中的表達來自EST數(shù)據(jù)庫的信息和正常人體組織的Northern分析(20)提示EphB4在腎，卵巢和胎盤中低水平表達，在心，肺，外周神經(jīng)和血管組織中極低水平表達，在腦中不表達。為確定基因表達與實際翻譯的蛋白質水平是否相關，使用這些組織利用特異性靶向EphB4(SEQ IDNO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)進行Western分析。通過對比單一結腸腫瘤樣品，示出基因表達水平與這些組織中產(chǎn)生的EphB4蛋白的量不相關(圖8)。在腫瘤細胞與正常組織之間不同的表達提示抗EphB4腫瘤治療對結腸腫瘤具有優(yōu)先作用。
使用Western印跡分析獲得一些雜交條帶(數(shù)據(jù)未示出)。然而，特異于腫瘤樣品及為所有測試的腫瘤樣品所共有的這些蛋白質條帶的特性仍需確定，但可以相應于剪接變化。鑒別了兩種EphB4剪接變體(稱為EphB4v1和EphB4v2)。EphB4基因結構的確定示出EphB4v1得自缺少由完整外顯子16編碼的53個氨基酸(圖9)。如果EphB4v1被翻譯，則所得蛋白質缺少激酶和SAM這兩個結構域的一部分，這兩個蛋白質結構域已知在將信號傳輸至胞內靶位中起作用。EphB4v2是通過框內缺失完整外顯子6而產(chǎn)生，這導致缺少111個氨基酸。EphB4v2編碼缺少第一個纖連蛋白III型重復的蛋白質。纖連蛋白III型重復的作用還未知，同時除去這些重復之一的作用也未知。
實施例5EphB4的RT-PCR分析由于EphB4在血管發(fā)生中的可能作用，因此使用RT-PCR在內皮細胞中進行EphB4表達。觀測到EphB4的低水平表達。然而，當這些細胞在存在特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)的情況中生長時，甚至在最高濃度的抗體情況中細胞生長或形態(tài)學也沒有明顯改變。也測試了EphB4抗體對NIH3T3細胞的生長和形態(tài)的作用。沒有形態(tài)學或生長應答(數(shù)據(jù)未示出)。對從36歲的患有乳腺纖維囊性病(fibrocystic breast disease)的高加索患者的乳腺組織建立的非致腫瘤性乳腺細胞系MCF10A(21)也加以了測試，觀測到低水平表達EphB4，但對抗EphB4抗體無應答(數(shù)據(jù)未示出)。當與從人體正常組織的Western分析獲得的結果(實施例5)一起考慮時，這些結果提示示出高水平EphB4表達的組織將受到EphB4抗體的負面影響。
這些結果表明在用特異性靶向EphB4(SEQ ID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400的EphB4多克隆抗體(H-200-Santa CruzBiotechnology)處理后，EphB4基因被下調(圖10)。這與大多數(shù)抗體在阻斷配體-受體相互作用并抑制配體誘導的RTK信號化之后增加RTK下調及受體的內在化(internalisation)的發(fā)現(xiàn)一致。這是因為某些抗體可通過改變所靶向的腫瘤細胞內部胞內信號化模式而影響腫瘤生長。分析Ab處理的細胞與未處理的細胞中基因表達的整體改變可鑒別參與EphB4相關信號化的基因。
實施例6EphB4抗體-表位作圖來自Santa Cruz的可商購的EphB4H-200多克隆Ab是對抗相應于EphB4人受體(SEQ ID NO1)的第201-400位氨基酸的重組蛋白而產(chǎn)生的。該序列包括半胱氨酸富集結構域和第一個纖連蛋白III型重復，并因此期望可識別一些不同的抗原性區(qū)域。針對EphB4蛋白(SEQ ID NO1)的特異性氨基酸殘基設計6種25個氨基酸的阻斷肽(重疊5個氨基酸，20個氨基酸不重疊)，如圖11所示。阻斷肽具有如下氨基酸序列肽1 SEQ ID NO2TVNLTRFPETVPRELVVPVAGSCVV肽2 SEQ ID NO3GSCVVDAVPAPGPSPSLYCREDGQW肽3 SEQ ID NO4EDGQWAEQPVTGCSCAPGFEAAEGN肽4 SEQ ID NO5AAEGNTKCRACAQGTFKPLSGEGSC
肽5 SEQ ID NO6GEGSCQPCPANSHSNTIGSAVCQCR肽6 SEQ ID NO7VCQCRVGYFRARTDPRGAPCTTPPS測試肽在與EphB4多克隆抗體(H-200-Santa Cruz Biotechnology)預先保溫后防止細胞死亡的能力，所述抗體特異性靶向EphB4(SEQID NO1)的胞外結構域氨基酸殘基201-400。開始時測試所有肽的混合物，使用臺盼藍排除(圖12)和caspase-3活性分析(圖13)確定其成功地防止細胞死亡。然后單獨測試肽，觀測到肽1(SEQ ID NO2)和肽2(SEQ ID NO3)部分拯救(見圖14)。肽1和肽2重疊5個氨基酸殘基(GSCVV，指定為SEQ ID NO13)，表明這個相應于EphB4(SEQ ID NO1)的第221-225位殘基的氨基酸序列可能是反應性表位的核心。
由于最初用肽混合物進行的實驗有效地含有兩倍摩爾量的GSCVV(SEQ ID NO13)序列(即EphB4(SEQ ID NO1)的第221-225位殘基)，將另一個阻斷實驗(其中肽1(SEQ ID NO2)和肽2(SEQID NO3)均為兩倍量)與起始量的肽進行對比。所有處理均通過EphB4多克隆抗體(H-200，來自Santa Cruz)而成功地防止腫瘤細胞死亡(見圖15)。
基于EphB4蛋白(SEQ ID NO.1)的特異性氨基酸殘基商業(yè)性產(chǎn)生跨GSCVV(SEQ ID NO13)核心表位序列的不同長度的三種新肽(肽7-9)，如圖16所示。阻斷肽具有如下氨基酸序列肽7SEQ ID NO8AGSCVVDA肽8SEQ ID NO9VAGSCVVDAV肽9SEQ ID NO10LVVPVAGSCVVDAVPA然而，由于肽8和9中疏水性氨基酸的數(shù)目較多，因此這些肽在可用于細胞的任何溶液中均不可溶，因此阻礙進一步測試。然而，肽7(SEQ ID NO.8)具有相應于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-227位殘基的氨基酸序列，可用于阻斷實驗中并能從通過只加入EphB4抗體(H-200，來自Santa Cruz)所致細胞死亡作用中拯救細胞(見圖17)。
上述所有出版物在此均以全文并入?yún)⒖肌?br> 本說明書中包括的文獻，法案，材料，設備，論文等的任何討論僅是為本發(fā)明提供上下文的聯(lián)系。其不應被認為是承認這些資料的任一或全部構成了現(xiàn)有技術的一部分，或者在本申請每一權利要求的優(yōu)先權日之前在澳大利亞或任何其它國家存在的與本發(fā)明相關領域的公知常識。
本領域技術人員意識到在不偏離廣泛描述的本發(fā)明的精神或范圍的前提下，可對本發(fā)明進行多種改變和/或修改。因此現(xiàn)有的實施方案僅是例證了本發(fā)明而無限制之意。
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370 375 380Leu Val Glu Pro Trp Val Val Val Arg Gly Leu Arg Pro Asp Phe Thr385 390 395 400Tvr Thr Phe Glu Val Thr Ala Leu Asn Gly Val Ser Ser Leu Ala Thr405 410 415Glv Pro Val Pro Phe Glu Pro Val Asn Val Thr Thr Asp Arg Glu Val420 425 430Pro Pro Ala Val Ser Asp Ile Arg Val Thr Arg Ser Ser Pro Ser Ser435 440 445Leu Ser Leu Ala Trp Ala Val Pro Arg Ala Pro Ser Gly Ala Val Leu450 455 460Asp Tyr Glu Val Lys His Glu Lys Gly Ala Glu Gly Pro Ser Ser Val465 470 475 480Arg Phe Leu Lys Thr Ser Glu Asn Arg Ala Glu Leu Arg Gly Leu Lys485 490 495Arg Gly Ala Ser Tyr Leu Val Gln Val Arg Ala Arg Ser Glu Ala Gly500 505 510Tyr Gly Pro Phe Gly Gln Glu His His Ser Gln Thr Gln Leu Asp Glu515 520 525Ser Glu Gly Trp Arg Glu Gln Leu Ala Leu Ile Ala Gly Thr Ala Val530 535 540Val Gly Val Val Leu Val Leu Val Val Ile Val Val Ala Val Leu Cys545 550 555 560Leu Arg Lys Gln Ser Asn Gly Arg Glu Ala Glu Tyr Ser Asp Lys His565 570 575Gly Gln Tyr Leu Ile Gly His Gly Thr Lys Val Tyr Ile Asp Pro Phe580 585 590Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Glu Ala Val Arg Glu Phe Ala Lys Glu Ile595 600 605Asp Val Ser Tyr Val Lys Ile Glu Glu Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe610 615 620Gly Glu Val Cys Arg Gly Arg Leu Lys Ala Pro Gly Lys Lys Glu Ser625 630 635 640Cys Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Gly Gly Tyr Thr Glu Arg Gln Arg645 650 655Arg Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ser Ile Met Gly Gln Phe Glu His Pro660 665 670Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Val Thr Asn Ser Met Pro Val Met675 680 685Ile Leu Thr Glu Phe Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Ser Phe Leu Arg690 695 700Leu Asn Asp Gly Gln Phe Thr Val Ile Gln Leu Val Gly Met Leu Arg705 710 715 720Gly Ile Ala Ser Gly Met Arg Tyr Leu Ala Glu Met Ser Tyr Val His725 730 735Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val Cys740 745 750Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Phe Leu Glu Glu Asn Ser Ser755 760 765Asp Pro Thr Tyr Thr Ser Ser Leu Gly Gly Lys Ile Pro Ile Arg Trp770 775 780Thr Ala Pro Glu Ala Ile Ala Phe Arg Lys Phe Thr Ser Ala Ser Asp785 790 795 800Ala Trp Ser Tyr Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Ser Phe Gly Glu805 810 815Arg Pro Tyr Trp Asp Met Ser Asn Gln Asp Val Ile Asn Ala Ile Glu820 825 830Gln Asp Tyr Arg Leu Pro Pro Pro Pro Asp Cys Pro Thr Ser Leu His835 840 845Gln Leu Met Leu Asp Cys Trp Gln Lys Asp Arg Asn Ala Arg Pro Arg
850 855 860Phe Pro Gln Val Val Ser Ala Leu Asp Lys Met Ile Arg Asn Pro Ala865 870 875 880Ser Leu Lys Ile Val Ala Arg Glu Gly Gly Ala Ser His Pro Leu Leu885 890 895Asp Gln Arg Gln Pro His Tyr Ser Ala Phe Gly Ser Val Gly Glu Trp900 905 910Leu Arg Ala Ile Lys Met Gly Arg Tyr Glu Glu Ser Phe Ala Ala Ala915 920 925Gly Phe Gly Ser Phe Glu Leu Val Ser Gln Ile Ser Ala Glu Asp Leu930 935 940Leu Arg Ile Gly Val Thr Leu Ala Gly His Gln Lys Lys Ile Leu Ala945 950 955 960Ser Val Gln His Met Lys Ser Gln Ala Lys Pro Gly Thr Pro Gly Gly965 970 975Thr Glv Glv Pro Ala Pro Gln Tyr980<210>2<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>2Thr Val Asn Leu Thr Arg Phe Pro Glu Thr Val Pro Arg Glu Leu Val1 5 10 15Val Pro Val Ala Glv Ser Cvs Val Val20 25<210>3<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>3Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro Ser1 5 10 15Leu Tyr Cys Arg Glu Asp Gly Gln Trp20 25<210>4<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>4Glu Asp Gly Gln Trp Ala Glu Gln Pro Val Thr Gly Cys Ser Cys Ala1 5 10 15Pro Glv Phe Glu Ala Ala Glu Glv Asn20 25<210>5<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>5Ala Ala Glu Gly Asn Thr Lys Cys Arg Ala Cys Ala Gln Gly Thr Phe1 5 10 15Lys Pro Leu Ser Gly Glu Gly Ser Cys
20 25<210>6<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>6Gly Glu Gly Ser Cys Gln Pro Cys Pro Ala Asn Ser His Ser Asn Thr1 5 10 15Ile Gly Ser Ala Val Cys Gln Cys Arg20 25<210>7<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>7Val Cys Gln Cys Arg Val Gly Tyr Phe Arg Ala Arg Thr Asp Pro Arg1 5 10 15Glv Ala Pro Cys Thr Thr Pro Pro Ser20 25<210>8<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<400>8Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala1 5<210>9<211>10<212>PRT<213>Homo sapiens<400>9Val Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val1 5 10<210>10<211>16<212>PRT<213>Homo sapiens<400>10Leu Val Val Pro Val Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val Pro Ala1 5 10 15<210>11<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>11Ala Gly Ser Cys Val Val Asn Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro1 5 10 15Ser Leu Tyr Cys Arg Glu Asp Gly Gln
20 25<210>12<211>25<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Ala Gly Ser Cys Val Val Asp Ala Val Pro Ala Pro Gly Pro Ser Pro1 5 10 15Ser Leu Tyr Cys Arg Glu Asp Gly Gln20 25<210>13<211>5<212>PRT<213>Homo sapiens<400>13Gly Ser Cys Val Val1 權利要求
1.一種抑制細胞的癌性生長的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分相接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內的表位結合。
2.權利要求1的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內的表位結合。
3.權利要求1或2的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內的表位結合。
4.權利要求1-3任一項的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內的表位結合。
5.一種抑制細胞的癌性生長的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分相接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分與一個表位結合，該表位位于與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少85％相同性的序列內。
6.權利要求5的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與一個表位結合，該表位位于與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQID NO1)的第220-244位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少90％相同性的序列內。
7.權利要求1-6任一項的方法，其中所述序列在EphB4(SEQID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
8.一種誘導癌細胞死亡的方法，所述方法包括將所述細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分相接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內的表位結合。
9.權利要求8的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內的表位結合。
10.權利要求8或9的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內的表位結合。
11.權利要求8-10任一項的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內的表位結合。
12.一種誘導癌細胞死亡的方法，所述方法包括將細胞與至少一種抗體或其抗原結合部分相接觸，其中所述抗體或其抗原結合部分與一個表位結合，該表位位于與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少85％相同性的序列內。
13.權利要求12的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與一個表位結合，該表位位于與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQID NO1)的第220-244位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少90％相同性的序列內。
14.權利要求8-13任一項的方法，其中所述序列在EphB4(SEQID NO1)的第226位的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
15.一種在患者中治療或預防癌癥的方法，所述方法包括給予患者有效量的至少一種抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內的表位結合。
16.權利要求15的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基內的表位結合。
17.權利要求15或16的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基內的表位結合。
18.權利要求15-17任一項的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基內的表位結合。
19.一種在患者中治療或預防癌癥的方法，所述方法包括給予患者有效量的至少一種抗體或其抗原結合部分，其中所述抗體或其抗原結合片段與一個表位結合，該表位位于與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少85％相同性的序列內。
20.權利要求19的方法，其中所述抗體或其抗原結合部分與一個表位結合，該表位位于與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基、EphB4(SEQID NO1)的第220-244位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少90％相同性的序列內。
21.權利要求15-20任一項的方法，其中所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
22.一種鑒別抑制細胞的癌性生長的藥物的方法，所述方法包括評估該藥物與EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基區(qū)域內的EphB4多肽的結合的能力。
23.權利要求22的方法，其中所述方法包括評估該藥物與EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基區(qū)域內的EphB4多肽的結合的能力。
24.權利要求22或23的方法，其中所述方法包括評估該藥物與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基區(qū)域內的EphB4多肽的結合的能力。
25.權利要求22-24任一項的方法，其中所述方法包括評估該藥物與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基區(qū)域內的EphB4多肽的結合的能力。
26.一種鑒別抑制細胞的癌性生長的藥物的方法，所述方法包括評估該藥物與一種多肽的結合能力，所述多肽包含與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少85％相同性的一個序列。
27.權利要求26的方法，所述方法包括評估該藥物與一種多肽的結合能力，所述多肽包含與選自EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基、EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基和EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基的殘基有至少90％相同性的一個序列。
28.權利要求22-27任一項的方法，其中所述序列在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
29.一種通過權利要求22-28任一項的方法鑒別的抑制細胞的癌性生長的藥物。
30.一種純化的EphB4抗體，其結合一種多肽，所述多肽的序列與EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基有至少85％相同性。
31.權利要求30的一種純化的EphB4抗體，其中所述多肽的序列與EphB4(SEQ ID NO1)的第201-245位殘基有至少90％相同性。
32.一種純化的EphB4抗體，其結合一種多肽，所述多肽的序列與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基有至少85％相同性。
33.權利要求32的純化的EphB4抗體，其中所述多肽的序列與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-244位殘基有至少90％相同性。
34.一種純化的EphB4抗體，其結合一種多肽，所述多肽的序列與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基有至少85％相同性。
35.權利要求34的純化的EphB4抗體，其中所述多肽的序列與EphB4(SEQ ID NO1)的第220-230位殘基有至少90％相同性的序列。
36.權利要求30-35任一項的純化的EphB4抗體，其中所述抗體與位于EphB4(SEQ ID NO1)的第200-400位殘基內的表位結合。
37.權利要求30-36任一項的純化的EphB4抗體，其中所述抗體結合一種多肽，所述多肽在EphB4(SEQ ID NO1)的第226位殘基的氨基酸Asp(D)被取代為Asn(N)。
38.權利要求30-37任一項的純化的EphB4抗體，其中所述抗體是單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明提供了使用與EphB4多肽的表位結合的抗體或其抗原結合部分抑制細胞的癌性生長的方法。本發(fā)明還提供了EphB4的純化抗體。本發(fā)明還提供了預防或治療癌癥的方法。本發(fā)明還涉及鑒別可抑制細胞的癌性生長的藥物的方法。
文檔編號C07K16/28GK1694902SQ03825167
公開日2005年11月9日 申請日期2003年9月16日 優(yōu)先權日2002年9月16日
發(fā)明者薩莉-安妮·斯蒂芬森 申請人:伊麗莎白女王醫(yī)院研究基金會公司